Orientador: Mara Correa Lelles Nogueira / Banca: Doroti de Oliveira Garcia / Banca: Aripuanã S. Aranha Watanabe / Banca: Nilton Erbet Lincopan Huenuman / Banca: Mânlio Tasso de Oliveira Mota / Resumo: O gênero Enterobacter compreende bactérias anaeróbias facultativas, fermentadores de glicose e ubíquo na natureza. Atualmente, existem 28 espécies de Enterobacter spp que podem ser identificadas por métodos bioquímicos, moleculares ou por espectrometria de massa. As infecções mais causadas por Enterobacter spp são de pele e tecidos moles, pneumonias e bacteremias, e, para o tratamento destas, os antimicrobianos mais utilizados são carbapênemicos, cefalosporinas e quinolonas. Entretanto, a resistência aos antimicrobianos tem aumentado no gênero Enterobacter, principalmente, devido à mecanismos enzimáticos codificados por genes plasmidiais. Os objetivos deste estudo foram avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, investigar genes de beta-lactamases (blaTEM-like, blaSHVlike, blaVEB-like, blaPER-like, blaGES-like, blaCTX-M-like), carbapenemases (blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaGES e blaOXA-48) e de enzimas que conferem resistência as quinolonas (qnrA, qnrB, qnrS, -Ib-cr e qepA) e determinar a similaridade genética entre os isolados de Enterobacter spp. Sessenta isolados de Enterobacter spp resistentes aos carbapenêmicos, cefalosporinas de terceira e quarta geração e quinolonas provenientes de pacientes admitidos em diferentes unidades de internação do Hospital de Base de São José do Rio Preto (HB) foram encaminhados ao laboratório CIM-Centro de Investigação de Microrganismos da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), onde foram realizadas a extração de DNA, a investigação dos genes por PCR e a tipagem molecular por ERIC-PCR. O gene de resistência blaKPC foi detectado em 22% dos isolados. Os genes blaTEM-like e blaCTX-Mlike em 82% e blaSHV-like em 3% dos isolados respectivamente. O grupo 1 de CTX-M foi detectado em 56,5%, do grupo 2 em 41,3% e do grupo 8/25 em 2,2% dos isolados. Os genes de resistência a quinolonas detectados foram qnrA, qnrB e qnrS em 40%, 22% 2% dos isolados... / Abstract: The Enterobacter genus comprises facultative anaerobic bacteria, glucose fermenters and ubiquitous in nature. Currently, there are 25 species of Enterobacter spp and two which can be identified by biochemical, molecular methods or by mass spectrometry. Infections caused by Enterobacter spp are skin and soft tissues, bacteremia and pneumonia, and for the treatment of these, the most commonly used antimicrobials are carbapenems, cephalosporins and quinolones. However, antimicrobial resistance has increased the Enterobacter spp mainly due to enzymatic mechanisms encoded by plasmid genes. The objectives of this study were to evaluate the antimicrobial susceptibility profile, investigate beta-lactamase genes (blaTEM-like, blaSHV-like, blaVEB-like, blaPER-like, blaGES-like, blaCTX-M-like), carbapenemases (blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaGES and blaOXA-48) and enzymes that confer resistance to quinolones (qnrA, qnrB, qnrS, aac (6') - Ib-cr and qepA) and determine the genetic similarity among isolates of Enterobacter spp. Sixty isolates of Enterobacter spp resistant to carbapenems, cephalosporins ( third and fourth generation) and quinolones from patients admitted to the Base Hospital (HB), were send Laboratory - Microorganisms Research Centre the School of Medicine of São José do Rio Preto (FAMERP), where DNA extraction, the investigation of genes and molecular typing by ERIC-PCR were carried out. The blaKPC resistance gene was detected in 22% of the isolates. The genes blaTEM-like and blaCTX-M-like 82%, blaSHV-like 3% of the isolates. The group 1 CTX-M was detected in 56.5%, of group 2 in 41.3% and 8/25 group at 2.2% of the isolates. The quinolone resistance genes qnrA, qnrB, and qnrS were detected in 40% 22% 2% of the isolates, respectively. The ERIC-PCR typing by genetic generated twelve groups (G1 to G12) for E. cloacae and one group (G1) for E. aerogenes, horizontal transfer of resistance genes in some groups was observed, but the ... / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:51Z : No. of bitstreams: 1 000864235_20180603.pdf: 404032 bytes, checksum: b266e22e2d4df6bf0f07ab059b407663 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-06-05T12:59:17Z: 000864235_20180603.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-06-05T13:00:21Z : No. of bitstreams: 1 000864235.pdf: 10314327 bytes, checksum: 5298ad6b602124ea408b4e80fcc3351c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O gênero Enterobacter compreende bactérias anaeróbias facultativas, fermentadores de glicose e ubíquo na natureza. Atualmente, existem 28 espécies de Enterobacter spp que podem ser identificadas por métodos bioquímicos, moleculares ou por espectrometria de massa. As infecções mais causadas por Enterobacter spp são de pele e tecidos moles, pneumonias e bacteremias, e, para o tratamento destas, os antimicrobianos mais utilizados são carbapênemicos, cefalosporinas e quinolonas. Entretanto, a resistência aos antimicrobianos tem aumentado no gênero Enterobacter, principalmente, devido à mecanismos enzimáticos codificados por genes plasmidiais. Os objetivos deste estudo foram avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, investigar genes de beta-lactamases (blaTEM-like, blaSHVlike, blaVEB-like, blaPER-like, blaGES-like, blaCTX-M-like), carbapenemases (blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaGES e blaOXA-48) e de enzimas que conferem resistência as quinolonas (qnrA, qnrB, qnrS, -Ib-cr e qepA) e determinar a similaridade genética entre os isolados de Enterobacter spp. Sessenta isolados de Enterobacter spp resistentes aos carbapenêmicos, cefalosporinas de terceira e quarta geração e quinolonas provenientes de pacientes admitidos em diferentes unidades de internação do Hospital de Base de São José do Rio Preto (HB) foram encaminhados ao laboratório CIM-Centro de Investigação de Microrganismos da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), onde foram realizadas a extração de DNA, a investigação dos genes por PCR e a tipagem molecular por ERIC-PCR. O gene de resistência blaKPC foi detectado em 22% dos isolados. Os genes blaTEM-like e blaCTX-Mlike em 82% e blaSHV-like em 3% dos isolados respectivamente. O grupo 1 de CTX-M foi detectado em 56,5%, do grupo 2 em 41,3% e do grupo 8/25 em 2,2% dos isolados. Os genes de resistência a quinolonas detectados foram qnrA, qnrB e qnrS em 40%, 22% 2% dos isolados... / The Enterobacter genus comprises facultative anaerobic bacteria, glucose fermenters and ubiquitous in nature. Currently, there are 25 species of Enterobacter spp and two which can be identified by biochemical, molecular methods or by mass spectrometry. Infections caused by Enterobacter spp are skin and soft tissues, bacteremia and pneumonia, and for the treatment of these, the most commonly used antimicrobials are carbapenems, cephalosporins and quinolones. However, antimicrobial resistance has increased the Enterobacter spp mainly due to enzymatic mechanisms encoded by plasmid genes. The objectives of this study were to evaluate the antimicrobial susceptibility profile, investigate beta-lactamase genes (blaTEM-like, blaSHV-like, blaVEB-like, blaPER-like, blaGES-like, blaCTX-M-like), carbapenemases (blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaGES and blaOXA-48) and enzymes that confer resistance to quinolones (qnrA, qnrB, qnrS, aac (6') - Ib-cr and qepA) and determine the genetic similarity among isolates of Enterobacter spp. Sixty isolates of Enterobacter spp resistant to carbapenems, cephalosporins ( third and fourth generation) and quinolones from patients admitted to the Base Hospital (HB), were send Laboratory - Microorganisms Research Centre the School of Medicine of São José do Rio Preto (FAMERP), where DNA extraction, the investigation of genes and molecular typing by ERIC-PCR were carried out. The blaKPC resistance gene was detected in 22% of the isolates. The genes blaTEM-like and blaCTX-M-like 82%, blaSHV-like 3% of the isolates. The group 1 CTX-M was detected in 56.5%, of group 2 in 41.3% and 8/25 group at 2.2% of the isolates. The quinolone resistance genes qnrA, qnrB, and qnrS were detected in 40% 22% 2% of the isolates, respectively. The ERIC-PCR typing by genetic generated twelve groups (G1 to G12) for E. cloacae and one group (G1) for E. aerogenes, horizontal transfer of resistance genes in some groups was observed, but the ...

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-07-31T15:27:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação- Mary Joyce Targino Lopes Magalhães.pdf: 1466870 bytes, checksum: 3202ba13f65ece33fb3c071651d2a444 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-08-04T15:21:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação- Mary Joyce Targino Lopes Magalhães.pdf: 1466870 bytes, checksum: 3202ba13f65ece33fb3c071651d2a444 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-08-04T15:28:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação- Mary Joyce Targino Lopes Magalhães.pdf: 1466870 bytes, checksum: 3202ba13f65ece33fb3c071651d2a444 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-04T15:28:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação- Mary Joyce Targino Lopes Magalhães.pdf: 1466870 bytes, checksum: 3202ba13f65ece33fb3c071651d2a444 (MD5) Previous issue date: 2013-07-26 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Pseudomonas aeruginosa is a leading bacterial cause of nosocomial infections. Possessing aquatic habitats, it presents a good indicator of water contamination. To verify that this bacterial species represents a potential source of contamination to the Mindu stream, we must carry out and analyze the following objectives: first, identify isolates of P. aeruginosa in samples of hospital effluent surface water obtained from the Mindu stream and second, to check whether the strains posses virulence factors as related mobility scourge, "twitching motility", biofilm formation and antimicrobial resistance, and finnaly, to assess the genetic similarity between isolates. Method: To identify the microbiological and biochemical composition, the 16S rRNA gene sequencing was used. For phenotype characterization we performed the following tests: first, we tested for mobility, using the scourge test "twithing motility", second we tested the biofilm formation and profile of antimicrobial resistance using the disk diffusion technique, the genetic similarity among isolates found was determined by PFGE. Results: We identified 17 isolates of P. aeruginosa in effluent water from the hospital. 8 isolates of the same species were in the surface water of the Mindu stream. The strains tested with mobility scourge; 100 % of the strains were found in water Mindu and 88 % of the strains were found in the hospital´s effluent samples were positive for " twitching motility ". All of the 25 isolates studied showed biofilm formation and more than 70 % of the strains found in hospital´s effluent water (raw and treated) had the phenotype of multidrug resistance.100 % of P. aeruginosa isolates found showed resistance to Ampicillin and 50 % of the strains were intermediately resistant to ceftriaxone. Among all the samples, there was genetic similarity; in the hospital´s effluent water and the hospital´s treated sewage, samples found in different seasonal periods, and among isolates found in hospital effluent and surface water of Mindu. Conclusion: The presence of P. aeruginosa containing virulence factors in surface water samples is indicative of the spread of nosocomial origin of microorganisms in the aquatic environment studied. There is strong evidence that the system of sewage treatment in the study is not efficient. Contaminants from P. aeruginosa containing multidrug resistance were in the samples of treated effluent water, and showed high genetic similarity among isolates of P. aeruginosa derived from raw wastewater. Therefore, it is necessary for action and more oversight on the part of health surveillance agencies with health services so that they meet the requirements of the laws in force in order to preserve the environment and people's health. / Pseudomonas aeruginosa é uma das principais bactérias causadora de infecções hospitalares, e por possuir habitat comumente aquático apresenta-se como boa indicadora de contaminação de águas, para verificar se essa espécie bacteriana representa uma fonte de contaminação em potencial para o igarapé do Mindu, o estudo se propôs a analisar os seguintes objetivos: identificar isolados de P. aeruginosa em amostras de efluentes hospitalares e água superficial do igarapé do Mindu; verificar se as cepas encontradas apresentavam fatores de virulência como, mobilidade ligada ao flagelo, “twitching motility”, formação de biofilme e resistência aos antimicrobianos, e avaliar a similaridade genética entre os isolados. Metodologia: Para a identificação microbiológica foram realizados testes bioquímicos e o sequenciamento do gene 16S rRNA dos isolados encontrados; Para a caracterização fenotípica foram realizados os seguintes testes: teste de mobilidade ligada ao flagelo, teste “twithing motility”, teste de formação de biofilme e perfil de resistência aos antimicrobianos pela técnica de disco-difusão; A similaridade genética entre os isolados de encontrados no estudo foi determinada por PFGE. Resultados: Foram identificados 17 isolados de P. aeruginosa em efluentes hospitalares e 8 isolados da mesma espécie na água superficial do igarapé do Mindu; Todas as cepas estudadas apresentaram mobilidade ligada ao flagelo; 100% das cepas encontradas na água do Mindu e 88% das cepas encontradas em amostras de efluentes hospitalares apresentaram “twitching motility” positivo; todos os 25 isolados estudados apresentaram formação de biofilme; mais de 70% das cepas encontradas nos efluentes hospitalares (brutos e tratados) apresentaram o fenótipo da multirresistência e 100% dos isolados de P aeruginosa encontrados na água do Mindu apresentaram resistência à Ampicilina e 50% dessas cepas apresentaram resistência intermediária a Ceftriaxona; houve similaridade genética entre isolados encontrados em efluente hospitalar bruto e efluente hospitalar tratado, entre isolados encontrados em diferentes períodos sazonais e entre isolados encontrados em efluentes hospitalares e água superficial do Mindu. Conclusão: A presença de P. aeruginosa contendo fatores de virulência, em amostras de água superficial, é indicativo de disseminação de microrganismos de origem nosocomial no ambiente aquático estudado. Há fortes indícios de que o sistema de tratamento de efluentes do estudo não está sendo eficiente, já que foram encontradas cepas de P. aeruginosa contendo fatores de virulência, inclusive a multirresistência em amostras do efluente tratado; e foi observada alta similaridade genética entre isolados de P. aeruginosa oriundos de efluente bruto e efluente tratado. Por isso, se faz necessário maior fiscalização por parte dos órgãos de vigilância sanitária junto aos serviços de saúde para que sejam cumpridas as exigências das legislações vigentes a fim de preservar o meio ambiente e a saúde da população.

Para determinar a prevalência e epidemiologia dos enteropatógenos bacterianos e parasitários na diarréia aguda infantil, foram estudadas 290 crianças menores de 24 meses com diarréia e 290 crianças controles, que procuraram o serviço de emergência do Hospital Infantil Arlinda Marques em João Pessoa, Nordeste do Brasil. Enteropatógenos foram identificados em 78,2% dos casos e em 12,4% dos controles; Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) foi o patógeno mais freqüente sendo detectada em 25% dos casos e em 8,3% dos controles; seguida por E. coli enteropatogênica (EPEC) em 11% dos casos (dos quais 9,3% foram cepas atípicas) e em 0,3% dos controles; E. coli Enterotoxigência (ETEC) em 10% dos casos e 2,8% dos controles; Salmonella sp em 7,9% dos casos; Shigella sp em 4,1% dos casos; E. coli enteroinvasora (EIEC) em 1,7% dos casos; Campylobacter sp em 2,4% dos casos e enteroparasitas foram detectados em 15,5% dos casos e 1,0% dos controles. Infecções mistas foram verificadas em 32 (11%) casos e em apenas 1 (0,3%) controle. A faixa etária mais atingida foi a dos menores de um ano e as associações mais frequentes ocorreram entre EAEC + Salmonella e EAEC + EPEC atípica. Neste estudo foram identificados fatores de risco associados com episódios de diarréia em crianças de acordo com o agente etiológico bacteriano. As análises estatísticas demonstram uma importante associação de EAEC com diarreia aguda infantil em João Pessoa, Brasil, sendo a ingestão de leite de vaca em pó e a exposição a aglomerados e creche os fatores de risco mais associados a diarreia causada por EAEC. / In order to determine the prevalence and epidemiology of enteropathogens in acute infantile diarrhoea, 290 infants younger than 24 months of age with diarrhoea and 290 age-matched control subjects who came to ER of the Hospital Infantil Arlinda Marques in João Pessoa, Northeastern of Brazil were studied. Enteropathogens were identified in 78,2% of case infants and 12,4% of controls. Enteroagregative Escherichia coli (EAEC) was the most frequently found pathogen and was detected in 25,0% of cases and 8,3% of controls. The second most frequent pathogen was Enteropathogenic E. coli (EPEC), in 11,0% of cases and 0,3% of controls, followed by Enterotoxigenic E. coli (ETEC) in 10% of cases and 2,7% of controls; Salmonella sp was found in 7,9% of cases, Shigella sp in 4,1% of cases, Enteroinvasive E. coli (EIEC) in 1,7% of cases and Campylobacter sp in 2,4% of cases. Enteroparasites were detected in 15,5% of cases and 1,0% of controls. Mixed infections (more than one pathogen) were found in 32 (11%) of cases and in only 1 (0,3%) control. The most affected age group was of those smaller than 1 year of age and the most frequent associations were of EAEC + Salmonella e EAEC + atypical EPEC. In this study risk factors associated with episodes of diarrhoea among infants by bacterial etiological pathogens were identified. Statistical analysis demonstrated a significant association of Enteroagregative E. coli (EAEC) with acute infantile diarrhoea in João Pessoa, Brazil. The risk factors most strongly associated diarrhoea caused by EAEC were the ingestion of powdered cow milk and exposure to crowds and day care centres.

Os dermatófitos são um grupo de fungos que têm a capacidade de invadir o tecido queratinizado (pele, pêlos e unhas) de seres humanos e animais para produzir uma infecção denominada de dermatofitose. O Trichophyton rubrum é o principal patógeno causador de dermatofitose. As lesões causadas por estas espécies são crônicas e de carater pouco inflamatória. A doença apresenta evolução lenta e pacientes cronicamente infectados não respondem bem a terapia antifúngica. Assim como na maioria dos patógenos, o sistema imune inato é determinante na resposta antifúngica. Neutrófilos, macrófagos e células dendríticas constituem as células efetoras do sistema imune. A resposta imune aos dermatófitos ainda não está bem elucidada. Atualmente é aceito que a resposta imune mediada por células é responsável pelo controle da infecção. Poucos estudos têm focado a resposta imune inata a esses fungos. Assim, fomos estudar a interação de células dendríticas de pacientes com dermatofitose com conídios de T. rubrum. Nossos resultados mostraram que células dendríticas derivadas de monócitos (CDDM) foram capazes de fagocitar conídios de T. rubrum e ainda verificamos que estas células permaneceram viáveis após fagocitose. Quando analisamos a viabilidade dos conídios de T. rubrum, após 24 e 48 horas de interação com CDDM, verificamos que após 48horas houve um aumento no número de conídios viáveis quando estes foram fagocitados por células de pacientes, mostrando que CDDM de paciente não conseguem matar os conídios após fagocitose. Avaliamos a liberação de óxido nítrico por CDDM e a análise dos resultados mostrou que não houve diferença significativa na liberação de NO pela CDDM na presença de conídio de T. rubrum. Analisamos a expressão de moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86, CD83, CD40 e HLA-DR em pacientes com dermatofitose e em indivíduos controle, observamos que não houve diferença na expressão dessas moléculas na presença de conídios de T. rubrum quando comparadas com culturas de CDDM sem conídios. Entretanto, houve uma diminuição do número de células de pacientes que expressam estas moléculas na presença de conídio de T. rubrum. Foi detectado um aumento significativo na secreção de TNF-α e de IL-12 pelas CDDM de pacientes quando em contato com conídio de T. rubrum. Avaliamos a capacidade das CDDM de indivíduos controle e pacientes pulsadas com concentrações crescentes de tricofitina em ativar linfócitos T CD4 e também verificamos o perfil de citocinas secretadas pelos linfócitos T CD4 após proliferação. Os resultados demonstraram que as CDDM foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos somente em pacientes com dermatofitose. Foi detectado um aumento significativo na secreção de IL-4 pelos LT CD4 de indivíduos controle. Nossos resultados sugerem uma diferença no perfil de secreção de citocinas em indivíduos controle e pacientes. Indivíduos controle não produzem IL-12 e estimulam preferencialmente linfócitos T CD4 secretores de IL-4. Por outro lado, células dendríticas de pacientes produzem IL-12 e induzem a ativação de linfócitos T produtores de IL-4 e IL-10 / The dermatophytes are a group of fungi that have the capacity to invade the keratinized tissue (skin, hair and nails) of humans and animals to produce an infection called dermatophytosis. The Trichophyton rubrum is the main causative pathogen of dermatophytosis. Injuries caused by these species are chronic inflammatory and little character. The disease shows slow evolution and chronically infected patients do not respond well to antifungal therapy. Like most pathogens, the innate immune system is crucial in the antifungal response. Neutrophils, macrophages and dendritic cells are the effector cells of the immune system. The immune response to dermatophytes is not yet well elucidated. Currently it is accepted that the immune response mediated by cells is responsible for controlling the infection. Few studies have focused on the innate immune response to these fungi. Thus, we study the interaction of dendritic cells from patients with dermatophytosis with conidia of T. rubrum. Our results showed that dendritic cells derived from monocytes (CDDM) were capable of phagocytosed conidia of T. rubrum and found that these cells remained viable after phagocytosis. When we analyze the viability of conidia of T. rubrum after 24 and 48 hours of interaction with CDDM shows that after 48hours an increase in the number of viable conidia when they were phagocytized by cells of patients, showing that CDDM not kill the patient after the conidia phagocytosis. Evaluated the release of nitric oxide by CDDM and analysis of results showed that there was no significant difference in the release of NO by CDDM in the presence of conidia of T. rubrum. We analyzed the expression of co-stimulatory molecules such as CD80, CD86, CD83, CD40 and HLA-DR in patients with dermatophytosis and in control subjects, we observed that there was no difference in expression of these molecules in the presence of conidia of T. rubrum compared with cultures of CDDM without conidia . However, there was a decrease in the number of cells of patients who express these molecules in the presence of conidia of T. rubrum. It was observed a significant increase in the secretion of TNF-α and IL-12 by CDDM of patients when in contact with conidia of T. rubrum. Evaluate the capacity of individuals to control and CDDM patients pulsed with increasing concentrations of trichophytin to activate CD4 T lymphocytes and also see the profile of cytokines secreted by CD4 + T lymphocytes after proliferation. The results showed that the CDDM were able to stimulate the proliferation of lymphocytes only in patients with dermatophytosis. We observed a significant increase in the secretion of IL-4 by CD4 L T to control individuals. Our results suggest a difference in the profile of secretion of cytokines in control subjects and patients. Control subjects did not produce IL-12 and preferentially stimulate CD4 T lymphocytes secreting IL-4. Furthermore, dendritic cells of patients produce IL-12 and induce the activation of T lymphocytes producing IL-4 and IL-10

O presente estudo teve como objetivo a caracterização genômica das espécies: Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum em amostras cervicais de gestantes. Cepas de Mycoplasma hominis e de Ureaplasma spp., foram identificadas através do cultivo e por PCR utilizando-se primers genéricos e específicos. Os achados na literatura são contraditórios quanto a participação dessas bactérias nas doenças humanas, especialmente quanto a participação destas em casos de infertilidade e alterações perigestacionais. Considerando a marcante heterogeneidade das cepas de Mycoplasma hominis, utilizamos a reação de RAPD com a finalidade de definir os perfis genômicos das cepas isoladas. A caracterização dos biótipos 1 e 2 do gênero Ureaplasma, respectivamente, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum, através da análise da MBA (Múltipla Banda Antigênica) por PCR, teve como finalidade determinar a predominância de cada uma dessas espécies. Foram estudadas amostras de material cervical de 163 gestantes em várias idades gestacionais. Os resultados obtidos neste trabalho foram: M. hominis foi detectado em 14,7% (24/163) das amostras, sendo a RAPO realizada em 7 das amostras positivas e puras de M. hominis. A reação RAPD demonstrou similaridade do perfil gênico entre as amostras 3 e 4 e entre as amostras 6 e 8, enquanto que as amostras 2, 5 e 7 demonstraram uma grande heterogeneidade. O gênero Ureaplasma foi isolado em 54,6% (89/163) das amostras, sendo 31,5% (28/89) cepas de U. urealyticum e 68,5% (61/89) U. parvum. Foram detectados 10,4% (17/163) casos de co-infecções M. hominis e Ureaplasma spp. O estudo da suscetibilidade das cepas isoladas frente a tetraciclina foi realizado com o intuito de se determinar a freqüência de cepas resistentes a essa droga. Considerando ser este antibiótico o de eleição no tratamento das micoplasmoses humanas e devido aos altos índices de resistência apresentados, resistência esta conferida pela presença do plasmídeo tetM, submetemos nossas amostras à pesquisa deste plasmídeo através da PCR. A presença do plasmídeo tetM foi detectada em 29,5% (7/24) das amostras positivas para Mycoplasma hominis e em 60,7% (54/89) das amostras positivas para Ureaplasma spp., sendo que dentre estas, 57,4% (31/54) foram detectados na espécie U. parvum e 42,6% (23/54) na espécie Ureaplasma urealyticum. O estudo da heterogeneidade intra-espécie das cepas de Mycoplasma hominis pela técnica de RAPD é inédito no Brasil. Da mesma maneira a caracterização das espécies do gênero Ureaplasma em U. parvum e U. urealyticum, através da PCR pela análise da MBA, foi pioneiramente realizada pelo nosso grupo de pesquisa. Esperamos com esse trabalho poder contribuir para um conhecimento melhor da freqüência dessas espécies na nossa população e tentar explicar as divergências das avaliações nas interações entre os micoplasmas e o hospedeiro. / The objective of this study was to characterize the species Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum in cervical samples from pregnant women. Strains of Mycoplasma hominis and Ureaplasma spp., were identified by means of culture and by PCR using generic and specific primers. The findings in the literature with regard to the involvement of these bacteria in human diseases are contradictory, especially regarding their involvement in cases of infertility and perigestational changes. In view of the strong heterogeneity among Mycoplasma hominis strains, we used RAPD to define the profiles of the strains isolated. Biotypes 1 and 2 of the genus Ureaplasma - Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum respectively - were characterized by means of MBA (Multiple Banded Antigenic) analysis using PCR to determine the predominance of each of these species. Samples of cervical material from 163 pregnant women at various stages of pregnancy were studied. The results obtained in this study were: M. hominis was detected in 14.7% (24/163) of the samples, and RAPD analyses carried out in 7 M. hominis strains. The RAPD similarly gene profile was showed: between strains 3 and 4, and between strains 6 and 8. The strains 2, 5 and 7 showed a pronounced heterogeneity in the gene profile. The genus Ureaplasma was isolated in 54.6% (89/163) of the samples, of which 31.5% (28/89) were U. urealyticum and 68.5% (61/89) U. parvum. Mycoplasma hominis and Ureaplasma spp., coinfection were detected in 10.4% (17/163) of the samples. The study of the susceptibility of the isolated strains to tetracycline was carried out with a view to determining the frequency of strains resistant to this drug. As this is the antibiotic of choice in the treatment of human mycoplasmoses, and in view of the high resistance indices observed, which are conferred by the presence of the \"tetM\" plasmid, we looked for this plasmid in our samples using PCR. The presence of the tetM plasmid, was detected 57,1% (4/7) of the Mycoplasma hominis - positive samples and in 40,2% (29/72) of the Ureaplasma spp - positive samples. Of the latter, 41,6% (25/72) were detected in the species U. parvum and 33,4% (4/12) were detected in the species Ureaplasma urealyticum. This is the first time that a study of the intraspecies heterogeneity of Mycoplasma hominis strains using RAPD has been carried out in Brazil. Characterization of the genus Ureaplasma species into U. parvum and U. urealyticum by means of PCR using MBA analysis was likewise pioneering effort by our research group. We hope that our work will contribute to a greater knowledge of the frequency of these species in our population and that it will help to explain differences in the assessment of the interaction between mycoplasma and the host.

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) e Shigella sp causam disenteria bacilar que é caracterizada pela invasão e destruição da mucosa do cólon humano. Amostras de EIEC possuem características bioquímicas, genéticas patogênicas semelhantes às espécies de Shigella, porém a doença causada por EIEC se apresenta numa forma mais branda e autolimitante. As células do epitélio intestinal participam ativamente da imunidade da mucosa, expressando e secretando uma série de mediad ores inflamatórios como citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e óxido nítrico. Para melhor entendimento da patogênese de EIEC, estudamos a resposta inflamatória modulada por este microrganismo em células epiteliais intestinais da linhagem Caco-2, comparando-a com Shigella flexneri. Células Caco-2 foram infectadas com EIEC ou S. flexneri por diferentes intervalos de tempo, para posterior analise da capacidade de invasão e disseminação bacterianas (UFC, PLAQUE ASSA Y), indução de morte celular (FACS), analise relativa de genes envolvidos no reconhecimento bacteriano e na resposta inflamatória (RT-PCR, RPA), dosagem de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (ELISA) e óxido nítrico (GRIESS). Neste trabalho foi possível observar que: (i) a capacidade de disseminação e (ii) a indução da morte celular em células Caco-2 foi significativamente maior na infecção por S. flexneri do que EIEC; (iii) há diferenças em relação à expressão relativa de genes das células Caco-2 envolvidos no reconhecimento das duas cepas bacterianas. Foi evidenciado o papel essencial dos receptores intracelulares no reconhecimento bacteriano das células Caco-2, sendo a expressão relativa do mRNA do receptor intracelular Nod1 foi maior para EIEC quando comparado com S. flexneri; (iv) há diferenças significativas na cinética de produção de NO pelas células Caco¬2 infectadas, em que EIEC induziu mais precocemente a produção de NO quando comparado com S. flexneri. Estes dados sinalizam que as células epiteliais intestinais reconhecem e respondem de forma diferente frente a essas duas espécies bacterianas, apresentando uma resposta inflamatória mais eficiente no controle da infecção induzida por EIEC. / Escherichia coli enteroinvasive (EIEC) and Shigella sp cause bacillary dysentery which is characterized by the invasion and destruction of the human colon mucosa. Samples of EIEC have characteristics biochemical, genetic and pathogenic similar to those of Shigella species, however the disease caused by EIEC is more lenient. The cells of the intestinal epithelium actively participate in the mucosal immunity by expression and production of several inflammatory mediators such as cytokines, chemokines, adhesion molecules and nitric oxide. For better understanding of the EIEC pathogenesis, we studied the inflammatory response modulated by this microorganism in intestinal epithelial cells Caco-2, comparing it with Shigella flexneri. Caco-2 cells were infected with EIEC or S. flexneri during different intervals of time and analyzed the invasiveness and spread bacteria capacity (CFU, PLAQUE ASSAY), induction of cell death (FACS), analysis of genes involved in the recognition of bacterial and inflammatory response (RT-PCR, RPA), production of pro-inflammatory cytokines and chemokines (ELISA) and nitric oxide (NO) (GRIESS). In this work was possible to observe that: (i) the ability to spread and (ii) the induction of cell death in Caco-2 cells was significantly higher in S. flexneri infection than EIEC, (iii) there are differences regarding the relative expression of genes of Caco-2 cells involved in the recognition of two bacterial strains. It was highlighted the essential role of intracellular receptors in recognition of bacterial by Caco-2 cells, and the expression of mRNA of the intracellular receptor Nod 1 was higher for EIEC when compared with S. flexneri, (iv) there are significant differences in the kinetics of NO production by Caco-2 infected cells, EIEC induced a early NO production when compared with S. flexneri. These data indicate that the intestinal epithelial cells recognize and respond in a different way to these bacterial species and induce an inflammatory response more efficient in control of the infection induced by EIEC.

Como entre 25-50% dos isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes à INH não apresentam mutações nos genes katG, inhA, ahpC e kasA que possam justificar sua resistência, foi proposta a influência de mutações específicas no gene nat nos mecanismos de resistência e atividade da NAT. Todos os isolados obtidos (n=125) foram identificados e caracterizados através da amplificação pela PCR da IS6110 e por MIRU-VNTR, respectivamente. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo método REMA. Após triagem de mutações nos genes caracteristicamente envolvidos com resistência pela PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento de DNA, foram selecionados 45 isolados para o estudo de mutações específicas (pela PCR e sequenciamento) e expressão gênica do mRNA do gene nat através da RT-PCR em tempo real. Confirmou-se que mutação no gene katG é a mais correlacionada com a resistência à INH, pois 68,4% das cepas resistentes apresentaram mutação neste gene. Mutações na região promotora do gene inhA, na região intergênica oxyR-ahpC e no gene kasA foram encontradas em 8,8%, 5,6% e 21,6% dos isolados, respectivamente. Mutações no gene nat, das quais 4 não haviam sido descritas previamente, foram encontradas em 40,0% dos isolados. Apesar dessas mutações causarem alterações na proteína, não foi observada uma relação direta com aumento na CIM. Também não foi observada relação entre a variação da expressão do mRNA do gene nat com os valores de CIM e com o número de mutações, tanto específicas do gene nat como em outros genes caracteristicamente relacionados com resistência à INH. / Since around 25-50% of the Mycobacterium tuberculosis strains resistant to INH do not present any mutation in katG, inhA, ahpC and kasA genes that could explain their resistance, we proposed to evaluate the influence of specific mutations in the nat gene in the mechanisms of resistance and in the activity of NAT. All strains were identified and characterized molecularly by the amplification by PCR of the IS6110 region and by MIRU-VNTR, respectively. The minimal inhibitory concentration (MIC) was performed using the REMA method. After screening of mutations in the resistant-related genes by PCR-SSCP followed by DNA sequencing, 45 strains were selected to be evaluated for specific mutations (by PCR and sequencing) and mRNA expression of nat by real time RT-PCR. It was showed that mutations in the katG gene were the most frequent and related to INH resistance since 68.4% of all resistant strains presented mutation in this gene. Mutations in the promoter region of inhA gene, oxyR-ahpC intergenic region and kasA gene were found in 8.8%, 5.6% and 21.6% of the strains, respectively. Mutations in the nat gene, four of them not previously described, were found in 40.0% of the strains. Although those mutations influence in the protein produced it was not observed a direct relation in an increase in CIM. It was also noted no relation between the expression of mRNA of nat gene neither with the MIC values nor with the number of mutations, both specific of nat gene as well in the other genes characteristically related to INH resistance.

Leptospirose é uma zoonose causada pela espiroqueta pertencente ao gênero Leptospira. LipL32 é um antígeno de superfície altamente conservado somente entre as espécies de leptospiras patogênicas e é expresso em altos níveis tanto in vitro com in vivo. HlyX é relatada como sendo uma proteína que possui um provável peptídeo sinal e cinco tetratricopeptídeos repetidos (TPR) em sua sequência de aminoácidos. Neste trabalho, mostrou-se que HlyX é expressa somente em cepas patogênicas, não sendo detectada a sua expressão na cepa saprofítica. HlyX foi reconhecida somente por soros de pacientes da fase convalescente da doença. Em constraste, LipL32 foi reconhecida por soros de pacientes colhidos tanto na fase aguda quanto na fase convalescente da infecção. Nossos resultados de immunoblot indicam que os domínios imunodominantes da proteína são os fragmentos C-terminal e intermediário. Uma resposta IgM foi detectada exclusivamente contra o fragmento C-terminal de LipL32 em ambas as fases da infecção. Com relação à capacidade de LipL32 e HlyX de interagir com componentes de matriz extracelular (CME), foi observada uma interação específica e dose-dependente de LipL32 e HlyX com colágeno tipo IV e fibronectina plasmática. O fragmento C-terminal de LipL32 é responsável por esta interação. Tanto a heparina quanto a gelatina foram capazes de inibir a ligação de LipL32 à fibronectina plasmática de forma dose-dependente, indicando que os domínios de ligação à heparina (30 kDa) e gelatina (45 kDa) da fibronectina estão envolvidos nesta interação. Por outro lado, apenas o domínio de ligação à heparina participa da interação da fibronectina com a proteína HlyX. A capacidade protetora das duas proteínas estudadas foi avaliada através de ensaios de imunização e desafio realizados em modelo animal (hamsters). A proteína HlyX induziu altos títulos de anticorpos IgG (1:128.000), mas somente a co-administração HlyX e LipL32 e a proteína LipL32 pura conferiram proteção, 100% e 80% respectivamente. HlyX não foi capaz de conferir proteção quando administrada apenas com o adjuvante Al(OH)3. Em conclusão, os resultados indicam que o domínio C-terminal de LipL32 é reconhecido desde o início da infecção e este domínio é responsável por mediar a interação de LipL32 com CME. Os dados obtidos com HlyX demonstram um possível papel desta proteína na patogênese, pelo fato de ser expressa e conservada em cepas patogênicas, e também por interagir com CME. Porém, apesar de HlyX apresentar altos títulos de anticorpos IgG, não conferiu atividade protetora quando administrada individualmente. / Leptospirosis, a spirochaetal zoonotic disease caused by Leptospira, has been recognized as na important emerging infectious disease. LipL32 is a surface lipoprotein which is highly conserved among pathogenic Leptospira species and is also expressed at high levels either during cultivation and natural infection. Regarding HlyX, it has been annotated as a protein containing a signal peptide and five tetratricopeptide repeats (TPR). Immunoblot analyses concerning HlyX distribution on Leptospira spp. indicate that this protein is expressed exclusively by pathogenic species. Moreover, HlyX was only recognized by sera of patients in the second week of leptospirosis infection. In contrast, LipL32 was recognized by acute and convalescent sera from leptospirosis patients. Our immunoblot results indicate that both the C-terminal and the intermediate domains of LipL32 are recognized by sera of patients. An IgM response was detected exclusively against the LipL32 C-terminus in both the acute and convalescent phases of illness. Concerning the capacity of LipL32 and HlyX to interact with extracellular matrix (ECM) components, a dose-dependent specific binding of LipL32 and HlyX to collagen IV and plasma fibronectin was observed. The LipL32 binding capacity could be attributed to the C-terminal portion of this molecule. Both heparin and gelatin could inhibit LipL32 binding to fibronectin in a concentration-dependent manner, indicating that the 30-kDa heparin- and the 45-kDa gelatin-binding domains of fibronectin are involved in this interaction. However, HlyX binding to fibronectin could only be inhibited by heparin in a concentration-dependent manner. We also evaluated whether HlyX and LipL32 could induce protective immunity against the challenge with a homologous serovar in hamsters. Although high anti-HlyX (IgG) titers (1:128,000) have been achieved upon immunization, no protection was observed. However, a combined HlyX and LipL32 immunization could induce a protective response (100%). The protection observed for LipL32 immunization was 80%. Altogether, the results provide evidence that the LipL32 C-terminus is recognized early in the course of infection and is the domain responsible for mediating interaction with ECM proteins. HlyX protein may contribute to the pathogenesis of the disease by interacting with host proteins. However, HlyX is not a protective antigen when administered alone.

A tuberculose continua sendo um grave problema de saúde pública mundial. O principal agente etiológico da doença é o Mycobacterium tuberculosis, infectando entre outras células, os macrófagos. A infecção pode manter-se latente por vários anos sem causar sintomas clínicos aparentes. Para esta pesquisa, foi proposto o estudo de indução de marcadores de resposta inflamatória em células THP-1 diferenciadas em macrófagos utilizando isolados micobacterianos sensíveis, uni ou multidrogas resistentes transfectados com o plasmídeo pFPCAGFP carreando o gene da proteína verde fluorescente, como marcador de infecção celular. Objetivou também avaliar a relação entre isolados clínicos de M.tuberculosis sensíveis ou com resistência a uma ou multidrogas e sua relação à virulência. Para isso, culturas da linhagem monocítica humana (THP-1) foram mantidas para posterior infecção por isolados clínicos, genotipicamente identificados pertencentes à nossa micobacterioteca. A expressão do RNAm foi quantificada e avaliada por RTPCR e posteriormente, PCR em tempo real foi realizado. Após infecção das células THP-1 diferenciadas em macrófagos, observou-se que houve um aumento na expressão das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e TLRs (TLR2 e TLR4) em relação ao controle da infecção. As análises estatísticas permitiram a correlação na expressão destas citocinas e TLRs, e através desses resultados, foi possível constatar que TLR2 regula a expressão das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e que os Isolados clínicos com maior resistência, sinalizam melhor a expressão das citocinas próinflamatórias e TLRs, ao passo que isolados clínicos sensíveis, possuem uma fraca sinalização. / Tuberculosis is the major causative of death and morbidity and still is a serious problem to the health in the world. Mycobacterium tuberculosis is the major causative agent of tuberculosis disease, infecting cells like macrophages. The infection can keep dormant for several years without any clinical symptoms. For this research, the study was proposed for induction of markers of inflammatory response in cells differentiated THP-1 in macrophages by clinical isolates from sensitive or multidrug resistant mycobacteria caring pFPCAGFP plasmid that contains green fluorescent protein gene, a marker of infection cell. Also objective assesses the relationship between clinical isolates of sensitive or with resistance to one or four drugs M.tuberculosis and its relationship to virulence. For this, cultures of monocitic lineage human (THP-1) were kept for subsequent infection by clinical isolates, genotypically identified belonging to our mycobacterioteca. The expression of mRNA was quantified and evaluated by RT-PCR and subsequently, real-time PCR was performed. After infection of the THP-1 differentiated cells in macrophages, it was observed that there was an increase expression of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and TNF-α) and TLRs (TLR2 and TLR4) compared to infection control. Statistical analyses allowed expression correlation of these cytokines and TLRs, and through those results, it was possible to see that TLR2 regulates pro-inflammatory cytokines (IL-1β , IL-6 and TNF-α) expression and those clinical isolates with four resistance have better signal of pro-inflammatory cytokines and TLRs expression, while sensitive clinical isolates, has a weak signal.