La consommation excessive d’alcool est la première cause de cirrhose en France. L’atteinte hépatique débute par une stéatose (accumulation de triglycérides dans les hépatocytes) qui peut évoluer vers un état inflammatoire (hépatite alcoolique) lors d’une consommation chronique d’alcool. La maladie peut ensuite évoluer vers la fibrose, la cirrhose et jusqu'à l’hépatocarcinome. La mortalité des formes aiguës de l’hépatite alcoolique sévère est comprise entre 50 et 75%. La corticothérapie est le seul traitement qui peut améliorer le pronostic à court terme. D’autres facteurs que la seule consommation excessive d’alcool interviennent dans la genèse des lésions hépatiques. Ainsi, parmi les sujets ayant une forte consommation d’alcool à long terme, la majorité des patients développent une stéatose mais seulement 10 à 35% développeront une hépatite et 8 à 20% évolueront vers la cirrhose. La recherche de facteurs qui relient la consommation d’alcool et la nature et progression des lésions hépatiques est donc essentielle pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques améliorant la prise en charge de ces formes graves. Afin de rechercher quels sont ces facteurs, nous avons utilisé un modèle murin d’alcoolisation. Nous avons utilisé un régime Lieber de Carli (LDC) enrichi en graisses, additionné d’alcool ou non. Nous avons orienté notre projet vers un axe microbiote-inflammation hépatique en analysant l’évolution des populations bactériennes intestinales au cours de la surconsommation d’alcool chez la souris. Des résultats nous ont montré que les Bacteroides variaient grandement d’une animalerie à l’autre. L’objet de nos travaux était d’étudier l’effet de la modulation des Bacteroides sur l’apparition des lésions hépatiques lors de la maladie alcoolique du foie. / Excessive alcohol consumption in the first cause of liver cirrhosis in France. Liver damages begin with steatosis (accumulation of fat in hepatocytes), which can progress to an inflammatory state (alcoholic hepatitis) during a long-term chronic alcohol consumption. Then, the disease can degenerate in liver fibrosis, cirrhosis and reach the hepatocarcinoma state. The mortality rate of acute alcoholic hepatitis ranges from 50% to 75%. Treatment based on corticoids is the only available and efficient treatment to improve the short-term prognosis. Other factors than only excessive alcohol consumption play a role in the onset of hepatic damages. Among patients having a long-term alcohol excessive consumption, most of them will develop a steatosis, whereas only 10% to 35% will develop alcoholic hepatitis and only 8 to 20% a liver cirrhosis. Researching these factors linking alcohol consumption and the nature and onset of liver injuries is of the utmost importance in order to find new therapeutic targets improving the patient life expectancy.In order to research these actors, we used a mice alcoholization model. We used a Lieber DeCarli diet, enriched in fat, added with ethanol or not. We studied the link between intestinal microbiota composition and the onset of liver injuries, by analyzing bacterial populations during an excessive alcohol consumption in mice. We discovered that one of the major bacterial population composing the intestinal microbiota, Bacteroides, underwent differential modifications from one animal housing facility to the other. The aim of our work was to modulate the Bacteroides population and study its effects on liver injuries.

Considéré comme un cancer de l'âge mûr, l'incidence du cancer colorectal ne cesse d'augmenter avec l'allongement de la vie. Dans la majorité des cas, le cancer colique est associé à une mutation du gène suppresseur de tumeur Apc, contrôlant l’activation de la signalisation Wnt/β-caténine. Afin, d'identifier de nouveaux acteurs de la tumorigenèse colique, notre laboratoire a développé des modèles murins de mutation du gène Apc qui ont pour avantage de mimer la pathologie humaine (Colnot et al, 2004 ; Andreu et al, 2005). La création de ces modèles a permis à l’équipe de démontrer i) qu’une activation physiologique de cette voie contrôle la prolifération des cellules souches et des progéniteurs ainsi que leur différenciation et ii) qu’une activation aigüe est suffisante pour déclencher l’initiation tumorale intestinale (Andreu et al, 2005; Andreu et al, 2008). Les travaux antérieurs à mon arrivée ont permis d’identifier différents évènements moléculaires et cellulaires induits en cascade suite à l’activation pathologique de la voie Wnt/β-caténine. Parmi ceux-ci, une induction transcriptionnelle de gènes impliqués dans l'autophagie a été mise en évidence. Ce processus d'auto-cannibalisme cellulaire est associé à de nombreuses pathologies telles que les maladies neurodégénératives ou infectieuses. Cependant, le rôle de l'autophagie dans le cancer reste ambivalent et son implication dans le cancer colique demeure inconnue.Dans ce contexte, mon travail de doctorat a consisté à répondre aux questions suivantes :L’induction transcriptionnelle de gène Atg s’accompagne-t-elle d’une activation du processus d’autophagie à tous les stades de la progression tumorale intestinale murine et humaine?Des études de transcriptomique à haut débit nous ont permis d’identifier une induction transcriptionnelle de gènes clés du processus d’autophagie tels qu’Atg7. Cependant, l’activation fonctionnelle de l’autophagie n’est pas toujours associée à une augmentation de la transcription des acteurs de ce processus. Nous nous sommes donc intéressés aux marqueurs couramment décris dans la littérature et permettant d’établir l’état d’activation du flux autophagique. Ainsi, nous avons étudié le niveau d’expression de ces marqueurs par des expériences de western-blot et d’immuno-marquages sur des échantillons tumoraux humains et murins à différents stades de la progression du CRC. L’inhibition de l’autophagie impacte-t-elle la carcinogénèse colorectale?Dans ce contexte, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle et simultanée d'un allèle du gène Apc et des deux allèles du gène Atg7 (gène clé de l'autophagie) spécifiquement dans les cellules épithéliales intestinales. Afin de suivre l'apparition et l'évolution des tumeurs au cours du temps, nous avons mis au point une nouvelle méthode non-invasive de reconstruction tridimensionnelle de côlons de souris, issue d'imagerie échographique à haute résolution. Dans le but de caractériser l’impact de l’inhibition de l’autophagie, les modifications propres à la cellule déficiente en autophagie ont été explorées, notamment le statut énergétique ainsi que les changements dans l’environnement immunitaire et microbien de l’épithélium intestinal. Finalement, l’inhibition génétique de l’autophagie dans notre modèle murin, prédisposé au développement de tumeurs intestinales, nous a permis de caractériser l’implication de l’autophagie dans la carcinogénèse colique, ainsi que les mécanismes moléculaires et cellulaires liant l’auto-cannibalisme cellulaire à la pathologie tumorale. / Colorectal cancer is one of the major causes of cancer-related deaths. We took advantage of Apc mutant mice that mimic the adenomatous polyps that affect humans with an inactivated Apc gene, to gain insight into the critical events that affect the development of colorectal cancer. We show that autophagy, a catabolic pathway involved in the degradation of intracellular proteins and organelles, is activated in intestinal murine and human cancer and its inhibition has a crucial role in controlling tumorigenesis. We report that the in vivo conditional deletion of the essential autophagy gene Atg7 in intestinal epithelial cells inhibits the formation of pre-cancerous lesions resulting from Apc loss by enhancing immunosurveillance. The antibody-mediated depletion of CD8+ T cells demonstrated a critical role for CD8+ T cells in antitumoral responses resulting from the inhibition of autophagy. We used a broad-spectrum antibiotics treatment to show that the expansion of IFN-producing CD8+ T cells following the deletion of Atg7 is dependent on the intestinal microbiota and is associated with Paneth and goblet cell defects. In addition, the inhibition of autophagy affected tumor cell growth and restrained cancer growth for extended time periods. We demonstrate that the inhibition of autophagy in Apc tumor cells results in a stress response accompanied by metabolic defects, characterized by AMPK activation and p53 cell cycle arrest. This study suggests that autophagy inhibitors may suppress tumorigenesis in patients at high risk of developing colorectal cancer.

Les récents progrès des technologies de séquençage et des techniques de biologie moléculaire ont permis aux chercheurs de révéler l'ubiquité et la diversité des virus. Malgré ces progrès, la découverte des virus s'est surtout concentrée sur les virus de vertébrés. De plus, les virus connus sont très peu étudiés en terme d'écologie virale. Les arthropodes de par leur histoire évolutive ancienne représentent 80% de la diversité animale sur notre planète. L'omniprésence de l'endosymbiose chez les arthropodes et leur capacité d’héberger des symbiotes (parfois multiples) suggèrent que leurs interactions avec leurs virus pourraient également être de nature symbiotique, allant des interactions durables de type mutualiste à celles de type antagoniste. Dans ce contexte, mon travail de thèse s’est concentré sur un densovirus de moustiques, le Culex pipiens densovirus (CpDV), en étudiant leur prévalence et leur diversité dans les populations naturelles de moustiques Culex pipiens et leurs interactions avec les bactéries endosymbiotiques Wolbachia dans un système naturel hôte-bactérie-virus (Cx. pipiens -Wolbachia - CpDV), tant dans des populations naturelles que des colonies de laboratoire. Nous avons révélé une forte prévalence et une grande diversité de CpDV dans les populations mondiales de Cx. pipiens. De plus, le CpDV infecte de façon persistante les lignées de laboratoire et est transmis verticalement avec l'endosymbiote Wolbachia. Nous montrons une prévalence et une diversité élevées du CpDV en Turquie et en Tunisie, et nous nous sommes concentrés davantage sur ces deux pays pour étu-dier les interactions Wolbachia-CpDV dans les populations naturelles. En Tunisie, dans une zone de contact étroite où deux groupes de Wolbachia génétiquement distincts coexistent, ces différents groupes de Wolba-chia influencent la prévalence et la diversité du CpDV. Nous montrons également une corrélation positive entre la densité de Wolbachia et la densité de CpDV. D’une manière globale, nos résultats suggèrent que le système CpDV-Cx.pipiens -Wolbachia et plus généralement les densovirus sont de bons modèles pour étudier les interactions écologiques entre ces partenaires et leur évolution dans la nature et au laboratoire. / Virus discovery has long depended on the observation of outbreaks, and the research to understand their pathogenicity depended on their culture. The advances of sequencing technology and molecular biology tech-niques allowed researchers to discover the ubiquity and the diversity of viruses. Despite these advances, virus discovery remains mainly focused on vertebrate viruses. Furthermore, even the known diversity of these virus-es is poorly studied in term of virus ecology. Arthropods with their ancient evolutionary history represent 80% of animal diversity on our planet. The ubiquity of endosymbiosis in arthropods and their ability to support (sometimes multiple) symbionts suggest that their interactions with their viruses might be of symbi-otic nature, intimate long-term associations with outcomes ranging from mutualistic to antagonistic. In this context, this PhD dissertation focuses on a mosquito densovirus, Culex pipiens densovirus (CpDV), to in-vestigate their prevalence and diversity in natural populations of Culex pipiens mosquitoes and their inter-actions with endosymbiotic bacteria Wolbachia in a natural host-bacteria-virus system (Cx. pipiens -Wolbachia - CpDV) both in natural populations and laboratory colonies. We reveal a high prevalence and diversity of CpDV in worldwide Cx. pipiens populations. Moreover, CpDV persistently infects laboratory lines and are vertically transmitted along with their hosts’ endosymbiont Wolbachia. We reveal high CpDV prevalence and diversity in Turkey and Tunisia and further focus on these two countries to investigate Wolbachia-CpDV interactions in natural populations. In Tunisia, in a narrow contact zone where two ge-netically distinct Wolbachia groups coexist, different Wolbachia groups influences CpDV prevalence and diversity. Moreover, we show a positive correlation between Wolbachia density and CpDV density. Overall, our results suggests that CpDV-Cx.pipiens -Wolbachia system is a good model system to study the ecologi-cal interactions between these partners and their evolution together both in the nature and in laboratory conditions. Densoviruses with their diversity and long-term evolution with their hosts, and their easily ma-nipulated small genomes, are good models to study complex host-virus-bacteria interactions as well as virus ecology and evolution in a symbiotic context.

De nos jours, le changement de style de vie et la consommation excessive d'aliments riches en énergie sont associés avec l'augmentation majeure de l'incidence des maladies métaboliques comme l'obésité et le diabète de type 2. Le diabète de type 2 est caractérisé, entre autre, par une augmentation de la production hépatique de glucose responsable d'une hyperglycémie chronique. Durant ces 10 dernières années, plusieurs études ont suggéré que le microbiote intestinal pouvait être impliqué dans le développement des maladies métaboliques. Le microbiote intestinal est composé de plusieurs milliards de bactéries réparties en plus de 1000 espèces différentes qui colonisent le tractus digestif. Plusieurs études ont montré que certaines pathologies comme le diabète et l'obésité sont caractérisées par des altérations taxonomiques et fonctionnelles du microbiote intestinal. De plus, la colonisation de souris axéniques (i.e. dépourvues de microbiote) par un microbiote intestinal provenant de souris ou d'Hommes obèses/diabétiques est suffisante pour induire la pathologie. Ces résultats suggèrent que les modifications du microbiote intestinal retrouvées chez les patients obèses/diabétiques sont potentiellement impliquées dans le développement des maladies métaboliques. Cependant, l'absence de microbiote intestinal chez les souris axéniques induit des altérations structurelles et fonctionnelles de l'intestin comme une hyperperméabilité intestinale ou un système immunitaire atrophié. Dans ces conditions, il est possible de se demander si les effets délétères induits par la colonisation des souris axéniques avec un microbiote modifié peuvent être observés chez des souris conventionnelles. Pour répondre à cette question nous avons développé un nouveau protocole de transfert de microbiote intestinal dans un modèle de souris conventionnelles. Nous avons transféré le microbiote contenu dans le caecum de souris obèses (" microbiote obèse ") et celui contenu dans le caecum de souris minces (" microbiote mince ") dans des souris conventionnelles non traitées aux antibiotiques. De manière surprenante, le transfert du " microbiote obèse " a induit une diminution de la glycémie à jeun associée à une baisse de la néoglucogenèse hépatique chez les souris transplantées. A l'inverse, le transfert du " microbiote mince " n'a pas modifié la néoglucogenèse. De plus, le transfert du " microbiote obèse " a induit des modifications taxonomiques et fonctionnelles du microbiote intestinal des souris transplantées. De manière intéressante, une fois nourries avec un régime hyperlipidique les souris ayant reçu le " microbiote obèse " ont conservé une glycémie à jeun plus faible que les souris non transplantées. Encore une fois, ce phénotype résulte d'une diminution de la production hépatique de glucose caractérisée par une baisse de l'activité des enzymes néoglucogéniques phosphoenolpyruvate carboxykinase et glucose-6-phosphatase. Par ailleurs, ces souris sont également moins grasses que les souris non transplantées. En conclusion, nous avons montré que le transfert d'un " microbiote obèse " peut moduler le métabolisme hépatique et prévenir l'augmentation de la néoglucogenèse hépatique normalement induite par le régime hyperlipidique chez des souris conventionnelles. Ces travaux de thèse ont montré d'une part, que la modification du microbiote intestinal de souris conventionnelles est possible par transfert de microbiote caecal. D'autre part et contre toutes attentes, ces résultats mettent en lumière que, contrairement aux observations faites chez les souris axéniques, le transfert d'un " microbiote obèse " dans une souris conventionnelle n'induit pas les phénotypes caractéristiques des maladies métaboliques. Par ailleurs, ce modèle de transfert caecal pourrait être utile pour la compréhension du rôle des bactéries intestinales sur le développement des maladies métaboliques. / Nowadays, the change of lifestyle and increase in the consumption of high-calorie foods are associated with a marked rise of the prevalence of metabolic diseases, including obesity and type 2 diabetes. Type 2 diabetes is linked, at least in part, to an increase of hepatic glucose production responsible for a fasting hyperglycemia. In the past decade, an increasing body of evidence has proposed gut microbiota as a new factor contributing to these metabolic alterations. Gut microbiota consists of trillions of bacteria identifying more than 1000 different species that inhabit our intestine. A body of work has demonstrated that multiple pathologies such as type 2 diabetes and obesity are characterized by an altered proportion and activity of the gut microbiota. In addition, the colonization of germ-free mice with the gut microbiota from either obese/diabetic humans or obese/diabetic mice transfers the phenotype. These results suggest that the modifications of the gut microbiota found in obese/diabetic patients are a potential etiologic factor for those diseases. Nevertheless, the lack of microbiota in germ-free mice determines both structural and functional alterations such as gut hyperpermeability and the atrophy of the immune system. Therefore, we could wonder whether the detrimental effects of the gut microbiota from obese/diabetic patients observed in germ-free mice may also be observed in healthy conventional mice. To address this issue, we have developed a new gut microbiota transferring process from conventional mice to other mice. We have transferred the cecal microbiota harvested from either obese ("obese microbiota") or lean ("lean microbiota") mice in antibiotic-free conventional mice. Surprisingly, the mice which received the "obese microbiota" had a reduced fasted glycaemia compared to the mice which received the "lean microbiota". This diminution could be attributed to a decrease of the hepatic gluconeogenesis since conversion from pyruvate to glucose and phosphoenolpyruvate carboxykinase activity were lower in the liver of mice which received the "obese microbiota". Conversely, the transfer of the "lean microbiota" did not affect the hepatic gluconeogenesis. In addition, the transfer of the "obese microbiota" changed gut microbiota composition and the microbiome of recipient mice. Interestingly, mice which received the "obese microbiota" and fed a high-fat diet still exhibited reduced fed and fasted glycaemia. Once again, this phenotype was due to a decrease of hepatic gluconeogenesis characterized by a diminution of phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase activity. In addition, the mice which received the "obese microbiota" had less adiposity compared to the non-transferred mice. Finally, we reported that transferring the "obese microbiota" impact on hepatic metabolism and prevent HFD-increase hepatic gluconeogenesis. On the one hand, these thesis works, have demonstrated that it is possible to modify the gut microbiota by our caecal transferring process. On the other hand, our results suggest that the transfer of the "obese microbiota" in conventional mice does not induced some characteristics of metabolic diseases contrary to that it is observed in germ-free mice. Furthermore, this kind of gut microbiota transferring process may be useful for a better understanding of the etiology of metabolic diseases.

Acteur clé de la symbiose hôte-microbiote, les IgA sécrétoires modulent le microbiote et participe à l'homéostasie intestinale. Chez la souris, les IgA sont polyréactives, en reconnaissent diverses bactéries, elles régulent la composition du microbiote et réduisent l'inflammation intestinale. Ces observations ouvrent des perspectives thérapeutiques intéressantes. Cependant, les caractéristiques des IgA et leurs spécificités restent mal connues chez l'homme. L'objectif de ce travail a donc été d'étudier la spécificité de la réponse IgA, en distinguant IgA1 et IgA2. La mise au point d'une technique de production in vitro d'IgA monoclonales 100% humaines issues de l'intestin nous a permis de montrer le profil de polyréactivité des IgA. Chaque IgA interagit avec un spectre large mais défini de bactéries commensales. Par ailleurs, les IgA1 et les IgA2 ciblent la même fraction du microbiote. Les réponses IgA1 et IgA2 convergent aussi au niveau des épitopes polysaccharidiques reconnus. Si les IgA sécrétoires contribuent largement à l’homéostasie intestinale, des IgG sériques anti-microbiote jouent un rôle dans la relation symbiotique hôte-microbiote. Leur présence n’ayant pas encore été démontrée chez l’homme en condition physiologique, ce travail a eu pour objectif secondaire de les explorer. Le développement d’une technique de cytométrie bactérienne nous a permis de détecter des IgG ciblant les bactéries commensales dans le sérum des individus sains. Ces IgG anti-microbiote sont dirigées vers les bactéries déjà reconnues par les IgA sécrétoires, elles présentent des spécificités propres à chaque individu. / IgA, the dominant immunoglobulin produced in the gut, plays diverse roles ranging from toxin neutralization, immune functions regulation, intestinal homeostasis maintenance. It is now well established that polyreactive IgA, which target multiple bacteria, can modulate gut microbiota composition and have promising therapeutic effects. However, IgA features remain elusive in humans. We therefore determined the reactivity profile of native monoclonal antibodies from human colon and compared IgA1 and IgA2. We found that IgA are polyreactive and bind a diverse but restricted subset of gut commensals. Most commensals were dually coated by IgA1 and IgA2, yet IgA2 alone coated a distinct fraction of colonic bacteria. Besides their common microbial targets, IgA1 and IgA2 exhibited overlapping anti-carbohydrate repertoires. An essential link between IgA and IgG responses against microbiota has been recently demonstrated in mice. Nevertheless, it remains unclear whether symbiotic bacteria could induce systemic IgG under homeostatic conditions in humans. Hence, we characterized anti-microbiota IgG in serum of healthy donors by bacterial flow cytometry. We found that each individual harbored a diverse and private panel of anti-commensals IgG that converge with secretory IgA to cover a restricted fraction of the gut microbiota. Patients with IgA deficiency or common variable immunodeficiency (CVID) exhibited a distinct set of anti-commensals IgG suggesting that IgA replacement in addition to polyvalent IgG might be beneficial to treat gastro-intestinal symptoms in these patients.

Mes études ont pour but d'examiner les altérations métaboliques et comportementales dans des modèles de souris axéniques. Nous avons démontré que les souris axéniques présentent une augmentation de préférence et d'acceptation des solutions sucrées. Cette augmentation est corrélée à des changements des niveaux d'expression des récepteurs du goût sucré au niveau de l'épithélium lingual et la muqueuse intestinale; T1R2, T1R3, et le transporteur de glucose SGLT-1. De plus, elles ont une préférence pour des fortes concentrations de saccharose comparées aux souris normales. Cet effet est associé à une augmentation des niveaux d'expression de T1R3 et SGLT-1 dans l'intestin. Nous avons étudié si cette augmentation de consommation de sucre était similaire à celle de acide gras, étayé les effets d'une consommation des lipides sur les niveaux d'expression des récepteurs des acides gras "CD36" au niveau de l'épithélium lingual et la muqueuse intestinale ainsi que les niveaux d'expression et de sécrétion des peptides intestinales à vocation satiétogène chez les souris axéniques comparées aux souris normales. En effet, nous avons démontré que les souris axéniques affichent une consommation accrue et une préférence pour les acides gras à des fortes et faibles concentrations respectivement. Ces changements étaient associés à une diminution des niveaux d'expression des détecteurs gustatifs de gras (GPRs), des faibles taux d'expression et de sécrétion des peptides intestinales, une augmentation d'expression du récepteur des acides gras au niveau de l'épithélium lingual et une augmentation des taux circulants des acides gras. Ces modifications peuvent constituer des mécanismes d'adaptation à l'état énergétique appauvri des souris axéniques. Nous avons essayé de savoir si ces altérations étaient présentes chez le rat dépourvu axénique. En effet, nous avons constaté que les rats axéniques présentent un niveau similaire ou élevé de la masse grasse, avec une diminution de la lipogenèse et une augmentation de l'adipogenèse expliquant l'hyperphagie du tissu adipeux. En résumé, nous avons démontré que l'absence du microbiote intestinal chez la souris conduit à une augmentation de l'apport énergétique en augmentant la consommation de sucres et de gras. Ces effets sont associés à des altérations orales et post-orales des niveaux d'expressions des détecteurs gustatifs tandis que le microbiote intestinal du rat F344 ne joue pas un rôle central dans l'adiposité

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) reste la complication majeure de l’allogreffe de cellules soucheshématopoïétiques (allo-CSH). La GVHD résulte de l’activation de la réponse immunitaire et de la reconnaissanced’alloantigènes par les lymphocytes T (LT) du donneur, entrainant ainsi des lésions tissulaires principalement auniveau de la peau, des intestins et du foie. L’interleukine-22 (IL-22) est une cytokine sécrétée par les LT Th1,Th17 et les cellules de l’immunité innée (ILC). Compte tenu des propriétés de l’IL-22 dans les tissus cibles de laGVHD, nous avons évalué sa contribution dans la physiopathologie de la maladie à l’aide de modèlesexpérimentaux murins. Il apparaît que les souris qui reçoivent des lymphocytes T invalidés pour l’IL-22développent une maladie moins sévère, et leur mortalité est diminuée. L’IL-22 issue du greffon participe donc à lasévérité de la GVHD en favorisant l’inflammation systémique, mais aussi locale au niveau des organes cibles. Deplus, dans les intestins, l’IL-22 agit en synergie avec les interférons de type I pour amplifier l’inflammation de typeTh1 au cours de la GVHD. Chez l’homme, la GVHD est associée à une modification du microbiote intestinal.Nous avons montré que l’absence d’IL-22 semble favoriser la colonisation de lactobacilles au détriment declostridiums, ce qui pourrait également participer à la diminution de la GVHD intestinale. Enfin, nous avonsmontré que l’effet anti-tumoral est préservé malgré l’absence d’IL-22. Ces résultats permettent donc d’envisagerde nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la GVHD. / Graft-versus-host disease (GVHD) is still the major complication after allogeneic stem cell transplantation. GVHDresults from the activation of the immune response and the recognition by donor T cells of alloantigens leading totissue injury, especially in skin, gut and liver. Interleukin-22 (IL-22) is a cytokine secreted by CD4+ T cells Th1 andTh17 but also by innate lymphoid cells (ILC). Given that IL-22 functions in the GVHD target tissues, weinvestigated its contribution in GVHD physiopathology using mouse experimental models. We showed that IL-22deficiency in donor cells reduced the severity of GVHD by limiting systemic and local inflammation. Moreover, inthe large intestine, IL-22 acts in synergy with type I interferon to increase Th1-like inflammation. In humans,GVHD severity is associated with microbiotal modification in the intestine. We demonstrated that IL-22 deficiencyin donor cells seems to favor lactobacillus colonization instead of clostridium. These changes of microbiotacomposition may reduce the severity of intestinal GVHD. Finally, we showed that the antitumor effect is preservedeven in absence of IL-22 donor cells. Overall, our data support the design of new clinical approaches aiming totarget IL-22 pathways in GVHD patients.

Les microorganismes anaérobies représentent la population majoritaire de notre tube digestif et ont un impact remarquable sur notre santé. Leur culture demeure à ce jour longue, fastidieuse et coûteuse et nombreux sont ceux qui restent incultivables. Or la culture est un outil indispensable pour l'étude du microbiote digestif. Ainsi, le laboratoire dans lequel ma thèse s’est déroulée a créé un nouveau concept de culture « Microbial Culturomics » qui a permis d’isoler 193 nouvelles espèces bactériennes anaérobies. Un travail sur l’utilisation des antioxydants pour permettre la culture aérobie des bactéries anaérobies a également été amorcé : une optimisation des techniques de culture prometteuse autour de laquelle mes travaux ont vu le jour. Notre premier projet a consisté à développer un dispositif de culture innovant permettant la culture des archaea méthanogènes en aérobiose et en absence de source externe de dihydrogène. Notre deuxième projet a consisté à élaborer un flacon d’hémoculture unique dans lequel la croissance de toutes les bactéries, aérobies et anaérobies, pouvaient être détectées. Notre troisième projet quant à lui repose sur la comparaison du mode de culture anaérobie et de celui en aérobie avec les antioxydants à travers l’exemple de trois souches bactériennes strictement anaérobies. L’utilisation des antioxydants pour faciliter la culture des microorganismes anaérobies a donc apporter des résultats très prometteurs qui pourrait être utilisés, après validation par des études multicentriques dans les laboratoires de microbiologie clinique et environnementaux. / Anaerobic microorganisms are characterized by their ability to grow and survive in the absence of oxygen. Indeed free oxygen molecules are not used for their metabolism and can be toxic to varying degrees, sometimes leading to cell death. Although it is known that these microorganisms are the predominant in our digestive microbiota and that they have a great impact on our health, their culture remain long, fastidious, costly, and in most cases impossible. Becteria culture is an indispensable tool for isolating strains, performing studies from living models, and identifying new ones. Thus, the laboratory in which my thesis tooks place created a new concept of culture "Microbial Culturomics" which made it possible to isolate 193 new anaerobic bacterial species. A work based on the use of antioxidants to enable the aerobic culture of anaerobic bacteria was also initiated: a promising optimization of the culture techniques from which my work was born. Our first project consisted in developing an innovative culture device allowing the cultivation of methanogenic archaea in aerobic and without an external source of dihydrogen. In our second project, we performed a single culture bottle in which the growth of all bacteria, aerobic and anaerobic, could be detected. Our third project was based on the comparison of anaerobic and aerobic culture with antioxidants through the example of three strictly anaerobic bacterial strains.Therefore the use of antioxidants enable to facilitate anaerobic bacteria cultivation. These results are very encouraging for clinical and environmental microbiology laboratories.

Le microbiote intestinal joue un rôle majeur dans le développement des fonctions digestive, métabolique, immunitaire et neurologique de son hôte. Escherichia coli est un hôte commun de la microflore commensale intestinale de l'Homme et des animaux à sang chaud, et s'établit dans le tractus digestif dès les premières heures ou jours qui suivent la naissance. L'espèce E. coli, bactérie anaérobe facultative prévalente, peut être divisée en sept groupes phylogénétiques principaux. Le groupe phylogénétique B2 comprend le plus grand nombre de souches responsables d'infections extra-intestinales (méningites néonatales, infections urinaires, septicémies, ...) ou chroniques (cancers, maladie de Crohn, ...). Des études épidémiologiques récentes montrent que le portage de ces souches est en augmentation dans les pays industrialisés, au détriment du groupe ancestral A. L'objectif de mon projet de thèse était de déterminer les facteurs à l'origine de cette évolution. Une analyse génétique montre que les souches du groupe phylogénétique B2 ont développé une très grande capacité à acquérir le fer, notamment via les sidérophores. Les souches appartenant au groupe B2 sont aussi les seules capables de synthétiser une génotoxine, la colibactine. Celle-ci induit des cassures de l'ADN double brin dans les cellules eucaryotes, pouvant être à l'origine de cancers colorectaux ou d'un défaut de développement de la barrière intestinale. Les sidérophores et la colibactine appartiennent à la même famille de molécules, i.e. des hybrides polycétide-peptide non ribosomaux. Leur biosynthèse fait intervenir des enzymes multifonctionnelles qui doivent être activées par fixation covalente d'un groupement 4'-phosphopantethéïnyl (P-pant). Cette modification post-traductionnelle est catalysée par la 4'-phosphopantethéïnyl transférase (PPTase). La PPTase ClbA est impliquée dans la synthèse de colibactine. La PPTase impliquée dans celle des sidérophores est EntD. Récemment, notre équipe a montré que ClbA pouvait participer à la synthèse des sidérophores, et remplacer EntD. Ceci montrait pour la première fois une connexion entre les multiples voies nécessitant des PPTases et conduisant à la biosynthèse de métabolites secondaires fonctionnellement distincts dans un micro-organisme donné. Dans la mesure où l'expression de entD et la synthèse des sidérophores sont régulées par la disponibilité en fer, nous avons fait l'hypothèse que l'expression de clbA et synthèse de la colibactine étaient également régulées par la quantité de fer. / The intestinal microbiota, i.e. the microorganisms present in the intestinal tract, plays a major role in diverse host functions: digestive, metabolic, immune and neurologic. Escherichia coli is a normal inhabitant of the commensal intestinal microflora of the human and mammals, and colonizes the gut within few days after birth. E. coli can be classified into 7 major phylogenetic groups. The B2 group contains the highest number of strains responsible for chronic (cancers, Crohn's disease, ...) or extra-intestinal infections (neonatal meningitis, septicemia, urinary tract infections, ...). Epidemiologic studies demonstrated that the prevalence of the B2 strains increases in industrialized countries, to the detriment of the ancestral A group. The objective of this study was to determine the factors involved in this evolution. Genetic analysis showed that strains from the phylogenetic B2 group have high capacities to take up iron through numerous siderophores. Moreover, only B2 strains are able to produce the genotoxin colibactin, which induces double strand brakes DNA in eukaryotic cells, leading to colorectal cancers or to altered development of the intestinal barrier. Siderophores and colibactin belong to the same family of molecules, i.e. hybrid polyketide-non ribosomal peptide. Their biosynthesis involves multifunctional enzymes that need to be activated by the covalent binding of a 4'-phosphopantetheinyl moiety. This post-translational modification is catalyzed by 4'-phosphopantetheinyl transferase (PPTase). The PPTase involved in colibactin and in siderophore biosynthesis are ClbA and EntD respectively Our team has recently demonstrated that ClbA can sustain siderophores biosynthesis, and replaces EntD, highlighting a connexion between multiple pathways and leading to the biosynthesis of distinct secondary metabolites in a given micro-organism. Because entD expression and siderophores synthesis are regulated by iron availability, we hypothesized that ClbA and colibactin are also regulated by iron availability. In this study, we show that transcription of clbA and colibactin production decreased in presence of high iron availability, and this regulation occurred through two pathways: dependent and independent on the two major regulators of iron homeostasis, FUR (Ferric Uptake Regulator) and RyhB. This regulation could allow a fine tuning production of siderophores and colibactin, and give an advantage in the establishment of intestinal tract colonization. The potential role of the colibactin in the establishment of intestinal tract colonization by E. coli constitutes the second part of my work.

Le microbiote intestinal affecte la plupart des processus physiologiques de l’hôte, et plus particulièrement la digestion et le métabolisme. Cependant, les mécanismes moléculaires en jeu restent encore peu connus. Pour répondre à cette question, nous utilisons un modèle gnotobiotique simple : la larve de Drosophile monoassociée à un de ces symbiont naturel : Lactobacillus plantarum. Notre groupe a montré que L. plantarum promeut la croissance larvaire d’individus soumis à une carence en protéines. En effet, les larves monoassociées à L. plantarum se développent bien plus rapidement que des individus axéniques. Ainsi, L. plantarum tempère l’effet délétère de la carence nutritionnelle. Cette amélioration de la croissance repose en partie sur la hausse du niveau d’expression des protéases digestives de l’hôte ainsi que sur la modulation de la voie de signalisation TOR (Target Of Rapamycin) de la Drosophile par les bactéries symbiotiques. Notre travail s’est focalisé sur la recherche d’autres mécanismes génétiques impliqués dans l’interaction entre la Drosophile et L. plantarum au cours de la croissance larvaire. Nos résultats montrent que les variations génomiques naturelles de la Drosophile affectent l’intensité du bénéfice de croissance conféré par L. plantarum. En outre, les bases de notre étude ont permis de mettre en évidence que le microbiote intestinal a la capacité d'agir comme "tampon génétique" en compensant les défauts de croissance causés par le fond génétique des mouches. De plus, L. plantarum permet de diminuer la variation phénotypique de plusieurs caractères de la mouche tels que la croissance, la taille de certains organes et la durée du cycle larvaire. Nous avons également identifié le gène dawdle, codant un ligand de la voie TGF-β, comme acteur de l’interaction Drosophile-L. plantarum. De plus nous avons montré que Dawdle régule les protéases digestives de la Drosophile dans un contexte nutritionnel de carence en protéine, et cette régulation peut-être activatrice ou bien inhibitrice selon l’environnement microbien. / Intestinal microbiota can modulate virtually all aspects of their host physiology, and particularly, digestion and metabolism. However, the molecular mechanisms at play remain largely unknown. To tackle this question, we use a simple gnotobiotic model: Drosophila larvae monoassociated with one of its major natural symbiont, Lactobacillus plantarum. Previous work from our group showed that L. plantarum promotes the juvenile growth of larvae facing a protein scarcity, thereby dampening the deleterious effect of the nutrient deficiency on larval growth. This growth enhancement partially relies on the upregulation of intestinal proteases, as well as on the modulation of the host TOR (Target Of Rapamycin) pathway by the symbionts. My thesis work aimed at unraveling other host genetic mechanisms involved in the interaction between Drosophila and L. plantarum during growth. Our work showed that host natural genomic variations affect the fly physiologic response to L. plantarum. Furthermore, the bases of our work enabled to unveil a novel role of intestinal bacteria, revealing their ability to act as a genetic buffer to compensate the growth impairments due to the fly genetic background. In addition, L. plantarum decreases the phenotypic variations in various host fitness traits (growth, organ size, timing to pupariation) and it also confers robustness to organ patterning. Finally, we showed that the TGF-β ligand, Dawdle plays an important regulatory role on digestive enzymes in a protein-deficient nutritional context, and that this regulation can be inhibitory or activating depending on the microbial environment.