Heart failure, predominately caused by myocardial infarction (MI), is the leading cause of death in the United States. Currently the only treatment for heart failure is cardiac transplantation, but studies show that progenitor cell, biomaterial, or combined therapies have improved cardiac function post-MI. The endogenous environment of CPCs is drastically different from commonly used culture conditions. Further the endogenous environment changes with age and disease state. We evaluated the behavior of CPCs cultured on a naturally-derived, cardiac extracellular matrix (cECM) as compared to the standard culture coating collagen I, that also mimics fibrotic tissue. In this study, CPCs cultured on cECM had improved cell numbers and cardiomyogenic maturation. However, the microenvironmental cues responsible for stimulating CPC activation are largely unknown. During development, aging and disease the myocardium changes in matrix composition and stiffness exposing endogenous cells to a wide variety of stimuli. In a combinatorial study, we evaluated the effect of cyclic strain and extracellular matrix composition on CPC behavior. The response of CPCs to signals from the microenvironment is complex, with more matrix-dependency observed at lower strains. Alignment, cell division and paracrine signaling are extracellular matrix and strain dependent. Extracellular matrix conditions affect CPC maturation and calcium signaling. Mechanotransduction pathways, including focal adhesion kinase and extracellular signal-regulated kinase, are activated through adhesion and maintained under cyclic strain. Insights from this work will advance pragmatic cell therapy attempts to regenerate healthy myocardium post-MI.

Τα καρκινώματα του λάρυγγα και του λαρυγγοφάρυγγα αποτελούν τη συχνότερη κακοήθη νεοπλασία Κεφαλής & Τραχήλου. Οι προκαρκινικές βλάβες είναι ενδιάμεσοι σταθμοί της καρκινογένεσης, που καταλήγει στον καρκίνο. Παράλληλα με την καρκινογένεση συμβαίνει ενεργοποίηση κυττάρων του υποεπιθηλιακού στρώματος. Η χημειοπρόληψη είναι απόπειρα φαρμακολογικής ανακοπής της καρκινογένεσης. Ο πυρηνικός υποδοχέας PPARγ καταλήγει σε διαφοροποίηση αρκετών κυττάρων. Ο RXRα ετεροδιμερίζεται με τον PPARγ και άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB ενισχύει την κυτταρική επιβίωση και φλεγμονή. Ο μεμβρανικός υποδοχέας EGFR κινητοποιεί μιτογόνες διαδικασίες. Η COX-2 συνθέτει προσταγλανδίνες. Κατά την παρούσα εργασία, μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε τομές παραφίνης η έκφραση των πέντε μορίων στο φυσιολογικό λαρυγγικό επιθήλιο, προκαρκινικές βλάβες και καρκινώματα διαφόρων Grade, καθώς και το υποκείμενο στρώμα, σε ιστικά δείγματα λάρυγγα από 127 ασθενείς. Από τους PPARγ, NF-κB(υπομονάδα p65) και RXRα, που εμφάνισαν μεικτή υποκυττάρια εντόπιση, οι δύο πρώτοι αναγνωρίστηκαν κυρίως στο κυτταρόπλασμα και ο τρίτος στον πυρήνα. Οι EGFR και COX-2 παρουσίασαν μεμβρανική και κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα αντίστοιχα. Η έκφραση του υποδοχέα PPARγ συσχετίστηκε θετικά με την καλή διαφοροποίηση των όγκων. Ο RXRα ελαττώθηκε κατά την καρκινογένεση. Τα επίπεδα των παραγόντων NF-κB, EGFR και COX-2 παρουσίασαν αύξηση στην καρκινογένεση. Η COX-2 συσχετίστηκε αρνητικά με το Grade των όγκων. Στις υπόλοιπες συσχετίσεις μελετήθηκε η συνέκφραση των παραγόντων σε κάθε ασθενή. Παρατηρήθηκε στο φυσιολογικό και προνεοπλασματικό επιθήλιο, θετική σχέση της COX-2 με τους υπόλοιπους παράγοντες. Επιβεβαιώθηκε η συνέργεια των PPARγ & RXRα, ως προς την πρόκληση διαφοροποίησης στα καρκινικά κύτταρα. Διαπιστώθηκε κατασταλτική επίδραση του PPARγ στην καρκινογόνο δράση του NF-κB. Αποκαλύφθηκε συνεργιστική δράση της COX-2 στην PPARγ-εξαρτώμενη διαφοροποίηση, οφειλόμενη πιθανόν σε προσφορά της 15d-PGJ2, από το ένζυμο στον πυρηνικό υποδοχέα. Κατά την εκτίμηση του μικροπεριβάλλοντος, αξιολογήθηκε η έκφραση σε συνάρτηση με την ύπαρξη καρκινώματος και το βαθμό διαφοροποίησής του. Οι μυοϊνοβλάστες που περιβάλλουν καρκινώματα (CAFs), παρουσιάζουν επαγωγή των RXRα, NF-κB και COX-2. Μάλιστα η υψηλή έκφραση COX-2 στους CAFs, συνδυάζεται με υψηλό Grade. Ενεργοποίηση στους CAFs, συνδέεται με υπερ-δραστήρια NF-κB σηματοδότηση στο καρκίνωμα. Ο NF-κB υπερεκφράζεται στα λεμφοκύτταρα που διηθούν τους όγκους (TILs). Επίσης τα μακροφάγα γύρω από νεοπλάσματα (TAMs), περιέχουν υψηλό PPARγ. Η χρήση αγωνιστών των PPARγ, RXRα, με παράλληλη αναστολή των NF-κB, EGFR και COX-2, θα είχε πιθανότατα ευνοϊκό αποτέλεσμα στην αναστροφή της λαρυγγικής καρκινογένεσης. Το χημειοπροληπτικό σχήμα, θα ήταν ωφέλιμο να τροποποιείται ύστερα από εξατομικευμένη αξιολόγηση του δικτύου των πέντε παραγόντων. / Carcinomas of the larynx and laryngopharynx are the most common malignancies of the Head&Neck. The precancerous lesions are mid-points of carcinogenesis, which results in cancer. Carcinogenesis is accompanied by reactive initiation of stromal cells. Chemoprevention pursues the arrest of carcinogenesis, by pharmacological means. PPARγ, a nuclear receptor, promotes cellular differentiation. The nuclear receptor RXRα partners with PPARγ or other members of the superfamily. The transcription factor NF-κB enhances cell survival and inflammation. The receptor EGFR receives growth signals. The enzyme COX-2 perpetuates inflammation by means of prostaglandin synthesis. The present study, utilizing paraffin section immunohistochemistry, assessed expression of the five molecules in normal laryngeal epithelium, precancerous lesions and carcinomas, along with their adjacent stroma. Clinical samples were derived from 127 patients who had undergone biopsy or laryngectomy. Of the three molecules demonstrating mixed subcellular presence, PPARγ and NF-κB(p65 subunit) localized more frequently in cytoplasm, whereas RXRα expression was mainly nuclear. EGFR and COX-2 staining patterns were membranous and cytoplasmic, respectively. PPARγ correlated with high tumor differentiation. RXRα was diminished in dysplasia and cancer. NF-κB, EGFR and COX-2, were upregulated as tumorigenesis progressed. COX-2 showed an inverse relationship with tumor Grade. The remaining correlations are based on coexpression analysis of the aforementioned factors. COX-2 was positively associated in normal and preneoplastic epithelia with the four regulating proteins. The data verify the synergistic effect of PPARγ and RXRα, regarding potentiation of neoplastic cell differentiation. Suppressive influence of PPARγ on NF-κB–mediated carcinogenesis was manifested. COX-2 overexpression was shown to reinforce the beneficial role of PPARγ in cell differentiation, probably due to production of the receptor agonist 15d-PGJ2. Subepithelial stroma was examined with regard to immunoreactivity in relation to the presence of invasion as well as to tumor Grade. Carcinoma Associated Myofibroblasts (CAFs), manifested upregulation of RXRα, NF-κB and COX-2, which mediate in concert angiogenesis, inflammation, and tumor spread. Intense COX-2 expression in CAFs, correlated with poor tumor differentiation. CAF activation was associated with intense NF-κB signalling in cancer cells. NF-κB was overexpressed in Tumor Infiltrating Lymphocytes (TILs). Finally, in Tumor Associated Macrophages (TAMs), PPARγ was induced. PPARγ, RXRα agonists, combined with NF-κB, EGFR and COX-2 inhibitors, would likely restrain laryngeal carcinogenesis. Subtle variations in the chemopreventive regimen, based on personalized molecular profiling, would hopefully achieve a patient-tailored therapeutic approach.

Ο καρκίνος αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες μάστιγες της σύγχρονης ζωής. Η ιστολογική εξέταση των νεοπλασμάτων (τόσο στις πρωτοπαθείς εστίες όσο και στις δευτεροπαθείς εναποθέσεις) αποκαλύπτει ότι οι όγκοι αποτελούν ένα ετερογενές σύνολο άμορφων και έμμορφων στοιχείων. Η νεοπλασματική μάζα εκτός από τα καρκινικά κύτταρα, περιλαμβάνει ποικίλα κύτταρα (ινοβλάστες, κύτταρα αγγείων, μακροφάγα, φλεγμονώδη κύτταρα, λιποκύτταρα) και στοιχεία της εξωκυτταρίου ουσίας (κολλαγόνο, ελαστικές ίνες, πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας) τα οποία στη μεγάλη πλειοψηφία τους προσελκύονται, άμεσα ή έμμεσα, από τα κακοήθη κύτταρα. Τα κύτταρα του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος δεν αποτελούν αδρανείς παρατηρητές της καρκινικής διεργασίας αλλά συμμετέχουν ενεργά σε αυτή καθώς αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό, καταστέλλουν την απόπτωση, ευνοούν την επιβίωση, διευκολύνουν τη μετανάστευση και εξασφαλίζουν την επαρκή θρέψη και οξυγόνωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Η μελέτη των ποικίλων αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται στο καρκινικό μικροπεριβάλλον ανάμεσα στα καρκινικά κύτταρα και τα στοιχεία του ξενιστή αποκαλύπτει καινούργιους θεραπευτικούς στόχους στην αντικαρκινική θεραπεία και βοηθάει στην κατανόηση του μηχανισμού των μεταστάσεων, δημιουργώντας την ελπίδα της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης του καρκίνου. Στην παρούσα εργασία γίνεται μια συνολική αναφορά της συμμετοχής όλων των στοιχείων του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος στη νεοπλασματική εξεργασία. Επίσης καταβάλλεται προσπάθεια να τονιστούν οι σύνθετες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα καρκινικά κύτταρα και το μικροπεριβάλλον. / Cancer is a devastating disease. Histologic examination of neoplasms (in the primary sites and their metastases as well) reveals that tumors are composed of a heterogeneous population of cells (fibroblast, vascular cells, macrophages, inflammatory cells, lipocytes) and extracellular matrix proteins (ECM) (collagen, elastin fibers, other ECM proteins). Recruitment of non-neoplastic tissue (stromal cells and ECM) to the tumor microenvironment is mostly mediated, directly or indirectly, by the malignant cells. Stromal cells are not quiescent bystanders of the neoplastic process. Instead they have an active role since they promote the proliferation, growth and migration of the tumor cells, inhibit their apoptosis and support tumor supply of oxygen and nourishment. In addition, stromal cells and ECM network protect cancer cells from the host defense. Research on the evolving crosstalk between the different cell types and ECM molecules within the tumor mass can disclose new therapeutic targets and help elucidate the pathogenetic mechanisms underlying metastasis, thus leading to a more effective anticancer therapy. This study discusses the potential role of the different stromal compartments in cancer initiation and progression and emphasizes the complex crosstalk between cancer cells and their microenvironment.

Simultaneous optical imaging and MRI of a dorsal skin-fold window chamber mouse model is investigated as a novel methodology to study the tumor microenvironment. Simultaneous imaging with two modalities allows for cross-validation of results, integration of the capabilities of the two modalities in one study and mitigation of invasive factors, such as surgery and anesthesia, in an in-vivo experiment. To make this investigation possible, three optical imaging systems were developed that operated inside the MRI scanner. One of the developed systems was applied to estimate vascular kinetic parameters of tumors in a dorsal skin-fold window chamber mouse model with simultaneous optical and MRI imaging. The target of imaging was a molecular agent that was dual labeled with both optical and MRI contrast agents. The labeling of the molecular agent, characteristics of the developed optical systems, the methodologies of measuring vascular kinetic parameters using optical imaging and MRI data, and the obtained results are described and illustrated.

The tumor microenvironment is a tangled web of multiple cell types, extracellular matrix components, and a multitude of cell signaling pathways frequently contribute to poor outcomes, which make cancer the second leading killer in the United States. A better understanding of how these constituents interact will inevitably facilitate development of novel cancer therapeutics and diagnostics. To advance scientific discovery towards this goal, innovative experimental techniques are required. In this dissertation, new research methods for probing cell communication at a single to multi cell level within 3D models of the tumor microenvironment are presented. Optical trapping, composite nanocapsules (i.e., gold-coated liposomes), and 3D cell culture models were the foundation for the development of these research tools. The first aim of this dissertation was to optimize our ability to optically manipulate gold-coated liposomes for the purpose of delivering molecular content to cells. The second aim was to apply optical manipulation of gold-coated liposomes to quantitatively deliver signaling molecules into a single cell to activate communication. The third aim was to develop a 3D model of the tumor microenvironment and demonstrate cell communication within this physiologically accurate architecture. The basis for this work was gold-coated liposomes' strong plasmon resonance with visible to near infrared (NIR) wavelengths of light, which enabled photo-thermal conversion and optical trapping. To identify preferred conditions for optical manipulation of gold-coated liposomes for delivering content into cells, gold-coated liposomes made with different dielectric properties were optically trapped under various laser modulation schemes and thoroughly characterized, enabled by high speed (kHz) imaging. Application of this technique was realized by precise delivery of molecular agents into a single cell (i.e., optical injection). As a demonstration of optical injection, the NIR trapping beam was utilized to propel gold-coated liposomes encapsulating inositol trisphosphate (IP3) into a single cell to initiate calcium (Ca²⁺) signaling. In another method for intracellular delivery, cells were preloaded with similar gold-coated liposomes, internalized by macropinocytosis, and then exposed to on-resonant laser light to trigger on-demand release of IP3 to activate Ca²⁺ signaling. Lastly, a 3D cell culture model of ovarian cancer microenvironment was developed as a platform for interrogating cell signaling. The in vitro model comprised human ovarian cancerous epithelial cells grown upon a collagen and human fibroblast stroma recapitulating architecture of human tissue. Gold-coated liposomes encapsulating signaling molecules, optical manipulation, and a 3D model of ovarian cancer, a trio of versatile experimental tools opens new opportunities for studying the tumor microenvironment.

No description available.

Das Auftreten von Metastasen ist die Haupttodesursache bei Krebspatienten und kennzeichnet den Wendepunkt jeder Tumorerkrankung, nach dem eine Heilung nur noch in Ausnahmefällen erfolgen kann. Eine wesentliche neue Erkenntnis in der Erforschung innovativer Therapieansätze zur Prävention der Metastasierung war, dass eingewanderte Immunzellen nicht nur die ersten Schritte der Tumorprogression fördern, sondern auch im Prozess der Metastasierung von Bedeutung sind. In diesem Zusammenhang konnten vor allem die Makrophagen als Vermittler der Migration und Invasion von Tumorzellen und deren Kolonisation in einem entfernten Organ identifiziert werden. Bisphosphonate (BPs) sind bekanntermaßen sehr potente Inhibitoren von Makrophagen. Dennoch erklärt die Mehrzahl der Studien ihre Tumor hemmenden Eigenschaften mit direkten Effekten auf z.B. Migrations- und Invasionseigenschaften der Tumorzellen und berücksichtigt nicht die Auswirkungen auf das Tumorstroma. Diese Arbeit zeigt, dass Makrophagen sehr viel sensitiver gegenüber dem stickstoffhaltigen BP Zoledronat (ZA) sind als Mammakarzinom-Zelllinien. Weiterhin wird verdeutlicht, dass die Makrophagen-induzierte Invasion sowie die Mikroglia-assistierte Kolonisation von MCF-7 im Hirngewebe durch ZA gehemmt werden, während die Migrations- und Invasionseigenschaften der Tumorzellen nicht beeinflusst werden. Für einen weiteren Makrophageninhibitor, einen CSF-1 Antikörper (5A1), wird in dieser Arbeit gezeigt, dass er die Depletion von Knochenmarksmakrophagen (BMDMs) induziert, jedoch keine Auswirkung auf die Viabilität von Mikroglia hat. Während 5A1 die Mikroglia-induzierte Invasion von MCF-7 wenig hemmt, induziert er eine starke Hemmung der BMDM-induzierten Invasion. Neben den benignen Zellen des Tumorstromas können auch Eigenschaften der Tumorzellen die Metastasierung induzieren. So konnte vor einiger Zeit der Transkriptionsfaktor LEF1 als Faktor der zerebralen Metastasierung des Lungenadenokarzinoms identifiziert werden. Diese Arbeit verdeutlicht, dass die Expression von LEF1 in einer Subgruppe zerebraler Metastasen nachgewiesen werden kann und ebenfalls charakteristisch für invasive Mammakarzinom-Zelllinien ist. Während die Überexpression von LEF1 in der wenig invasiven MCF-7 keinen Einfluss auf die Proliferation, die Migration oder die Sensitivität gegenüber Chemotherapie oder Bestrahlung hat, steigert sie die Invasivität der Zellen und induziert die Angiogenese im Tumor. Diese Effekte sind unabhängig von der direkten Bindung des Transkriptionsfaktors an die DNA und scheinen durch einen β-Catenin-unabhängigen Mechanismus zu erfolgen.

This thesis describes the development of a high-throughput approach towards the encapsulation of cancer cells in biopolymer microgels with tunable mechanical properties. In particular, this thesis is focused on: i) the high-throughput generation of biopolymer microgels with tunable mechanical properties ii) the measurement of the mechanical properties of the microgels, and iii) the high-throughput encapsulation of a cancer cell line within biopolymer gels. The microgels will be generated by (i) introducing in a microfluidic device two distinct streams of biopolymer solutions; (ii) mixing the streams; (iii) emulsifying the biopolymer and (iv) using thermosetting to transform the droplets in situ into microgels. By applying a compression force to the hydrogel microbead and measuring its deformation, the Young’s modulus and relaxation time of the microgel can be examined. The properties of cells were examined within the gels using various spectroscopic techniques such as absorption (UV-Vis) and fluorescence microscopy (fluorescent microscopy, confocal microscopy).

This thesis describes the development of a high-throughput approach towards the encapsulation of cancer cells in biopolymer microgels with tunable mechanical properties. In particular, this thesis is focused on: i) the high-throughput generation of biopolymer microgels with tunable mechanical properties ii) the measurement of the mechanical properties of the microgels, and iii) the high-throughput encapsulation of a cancer cell line within biopolymer gels. The microgels will be generated by (i) introducing in a microfluidic device two distinct streams of biopolymer solutions; (ii) mixing the streams; (iii) emulsifying the biopolymer and (iv) using thermosetting to transform the droplets in situ into microgels. By applying a compression force to the hydrogel microbead and measuring its deformation, the Young’s modulus and relaxation time of the microgel can be examined. The properties of cells were examined within the gels using various spectroscopic techniques such as absorption (UV-Vis) and fluorescence microscopy (fluorescent microscopy, confocal microscopy).

The tumor microenvironment consists of multiple cells types, including endothelial cells that line the tumor vasculature. Tumor vasculature is often abnormal and results in development of tissue ischemia, another contributing factor to the tumor microenvironment. Previous studies have demonstrated that ischemia influences epigenetic programming, but the mechanisms remained unclear and required further investigation. First, we profiled DNA methyltransferase (DNMT) expression and activity in human colorectal cancer cells (HCT116) under hypoxia or hypoglycaemia (mimicking ischemia). We found that DNMT1 and DNMT3b were significantly downregulated by hypoxia and hypoglycaemia, and DNMT3a was downregulated by hypoglycaemia. However, DNMT1 downregulation was p53-dependent. To examine if the changes in DNMT expression and activity translated to changes in DNA methylation patterns, we used bisulfite sequencing and examined the promoter region of p16. Hypoglycaemia significantly demethylated this region in both p53 wild-type and p53-null cells. Next, we used a genome-wide approach to discover what additional genes are hypomethylated by ischemia. Methylated DNA was immunoprecipitated and analysed with an Affymetrix promoter array, in parallel with an expression array. Ingenuity pathway analysis software revealed that a significant proportion of genes which were hypomethylated and upregulated were involved in cellular movement, including PLAUR and CYR61. We believe that hypoxia and hypoglycaemia may be driving changes in DNA methylation through dysregulation of DNMTs, resulting in cells acquiring a more mobile phenotype in ischemic regions. DNMT and histone deacetylase inhibitors are commonly used in research and some cancer therapies. Modifying epigenetic patterning with these inhibitors has been widely studied in cancer cells, but only briefly explored in the tumor’s vascular endothelium. We profiled the effect of these inhibitors on endothelial cell (EC) behaviour, and tested if combining them with a targeted anti-angiogenic therapy would augment the inhibition of angiogenesis. When the DNMT inhibitor 5-aza-2’-deoxycytidine was combined with sunitinib, inhibition of EC proliferation was enhanced compared to treatment with sunitinib alone. EC migration was also inhibited by the combination of these two inhibitors, but not in an additive manner. These studies have improved our understanding of how altering epigenetic patterning with ischemia and therapeutic inhibitors can influence colorectal cancer and endothelial cell behaviour. / Canadian Cancer Society Research Institute. The Cancer Research Society.