As ligações de hidrogênio (LH), fundamentais na determinação da estrutura da água, proteínas, etc., são muito importantes no reconhecimento molecular e nos mecanismos de reações enzimáticas. A determinação da energia das LHs intramoleculares em proteínas e intermoleculares entre uma proteína e o solvente água, porque fornece informações sobre a estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas. Um método para quantificar e qualificar as LHs foi desenvolvido utilizando critérios de distância, geométricos e energéticos a partir das trajetórias obtidas por simulações de dinâmica molecular. O método foi testado com o monômero de uma fosfolipase A2 homodimérica, sem atividade catalítica, isolada do veneno da Bothrops asper(BaspMT-II). No dímero, a análise das LHs mostrou que elas são também essenciais na manutenção da estrutura quaternária. Essa análise permitiu identificar movimentos do tipo dobradiça acompanhados da formação transitória, na interface dimérica, de LHs controladas pelo triptofano na posição 77. Esses movimentos podem estar associados à ação danosa às membranas, uma vez que podem promover a inserção da região C-terminal na membrana. Estudos prévios mostraram que o peptídeo sintético (3Y codificado pelos aminoácidos 115-129 da BaspMT-II) apresenta atividade bactericida e citolítica. Um outro peptídeo (3W), mutante de 3Y, no qual três resíduos tirosina são substituidos por triptofano, apresenta um aumento do dano às membranas e do efeito miotóxico. Os mecanismos de ação desses peptídeos e as suas estruturas foram estudados por dinâmica molecular, dicroísmo circular (DC), microscopia de fluorescência e monocamadas de Langmuir (Mlang). As adsorções dos peptídeos em monocamadas de ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) se processam por mecanismos diferentes ocasionados pelas diferentes naturezas físico-químicas dos resíduos tirosina e triptofano. A microscopia de fluorescência acoplada a Mlang de DMPA com 3W adsorvido mostra um aumento da fluidez da monocamada, enquanto que o 3Y modifica os domínios do DMPA para pequenas estruturas circulares. Foram realizadas simulações dos peptídeos 3Y e 3W em meio aquoso e nas regiões interfaciais água/n-hexano e água/bicamadas de DMPC. Os resultados confirmam os obtidos por Mlang, demonstrando que os peptídeos interagem diferentemente com as membranas por adotar conformações alternativas definidas previamente. Essas conformações, diferentes das observadas em meio aquoso, dependem da natureza da interface. As estruturas encontradas no final das simulaçoes corroboram o mecanismo proposto por Mlang, assim como as estruturas sugeridas por DC. Isso sugere que a atividade biológica reduzida do peptídeo 3Y ocorre porque os seus dois resíduos Leu se adsorvem na interface sem penetrá-la. Ao contrário de 3W, os resíduos carregados do peptídeo 3Y não estão localizados corretamente para promover uma interação suficientemente atrativa para permitir a sua inserção na membrana celular. / Hydrogen bonds (HB) are highly important in the determination of the structure of the water and proteins. They also play a important role in molecular recognition and in enzyme reaction mechanisms. The determination of protein/water intermolecular and protein intramolecular HB energies provide information with respect to the formation and stabilization of secondary, tertiary and quaternary protein structure. A method that quantifies and qualifies the properties of HB was developed using distance, geometric and energy criteria as applied to data obtained from the atomic trajectories generated by molecular dynamics simulations. The method was tested with a monomer of a catalytically inactive homodimeric phospholipase A2 from Bothrops asper(BaspMT-II) venom. HBs at dimmer interface are essential for maintaining the quaternary structure, and are highly conserved during hinge-like movements of the dimmer. HB formed by tryptophan residue at position 77 controls this movement. These motions can be associated to the membrane damaging action since they facilitate the insertion of the C-terminus into the cellular membrane. Previous studies have shown that synthetic peptide (3Y, coding the amino acids 115-129 of BaspMT-II ) presents bactericidal and cytolitic activities. A peptide variant ( 3W ), in which tyrosine residues were substituted by tryptophan residues, presents an enhanced membrane damaging activity increased miotoxic effect. The mechanism of action of the peptides and their structures were studied by molecular dynamics simulations, circular dichroism (CD), fluorescence microscopy and Langmuir monolayers (Mlang). The adsorption of the peptides on a monolayer composed of dimiristoyl phosphatidic acid (DMPA) and dimiristoylphosphatidyl choline (DMPC) occurs through different processes due to the differences in the physic-chemical nature of the tyrosine and tryptophan residues. Fluorescence microscopy together with Mlang of DMPA with adsorbed 3W indicates an increase of the membrane fluidity while small circular domains are formed with DMPA. Simulations were conducted with the 3Y and 3W peptides in aqueous media, is a water/n-hexane and water/DMPC bilayers. The results confirm the Mlang results, showing that the peptides interact differently with the membranes by adopting alternative previously defined conformations. These two conformations, both of which are different to those observed in water, are dependent of the nature of the interfaces. The final simulated configurations confirm the mechanism proposed by Mlang and the structures proposed by CD. It is suggest that the reduced biological activity of the 3Y peptide is due to the two Leu residues that only adsorb to the cellular membrane without penetrating the bilayer. In contrast to the 3W peptide, no charged residue is correctly located to promote the interaction and insertion of the 3Y peptide into the membrane.

Fosfolipases D (FLD) do veneno das aranhas do gênero Loxosceles são capazes de causar entre outros efeitos, uma forte agregação plaquetária cujo mecanismo ainda não foi elucidado. Portanto, para estudar o papel das FLDs nesta atividade, uma FLD recombinante de L. gaucho (LgRec1) foi fusionada com a proteína fluorescente verde (EGFP) e utilizada como uma sonda para detectar a interação de LgRec1 com plaquetas. Essa quimera, denominada EGFP-LgRec1, manteve as principais características da LgRec1. A microscopia confocal das plaquetas mostrou que LgRec1 não requer componentes plasmáticos para se ligar às plaquetas, embora estes sejam necessários para que a LgRec1 induza agregação. Além disso, foi observado que a ação da LgRec1 leva à exposição de fosfatidilserina. Contudo, esta exposição não está relacionada à morte celular. Portanto, este trabalho mostrou que uma FLD de Loxosceles se liga a plaquetas, promovendo a exposição de fosfatidilserina, possibilitando a ligação de fatores de coagulação e resultando na agregação plaquetária. / Phospholipases D (PLD) from spider venom of the genus Loxosceles are capable of causing, among other effects, a strong aggregation of platelets and its mechanism has not yet been elucidated. Therefore, to study the role of PLDs in this activity, a recombinant L. gaucho PLD (LgRec1) was fused with a green fluorescent protein (EGFP) and used as a probe to detect the interaction of LgRec1 with platelets. This chimera, named EGFP-LgRec1, remained the main activities of LgRec1. Platelet confocal microscopy has shown that LgRec1 does not require plasma components to bind to platelets, although these are required for LgRec1 to induce aggregation. In addition, it has been observed that the action of LgRec1 leads to exposures of phosphatidylserine. However, this exposure is not related to cell death. Therefore, this work showed that a Loxosceles PLD binds to platelets, promoting an exposure of phosphatidylserine, that may act as a scaffold for coagulation factors, resulting in platelet aggregation.

Este estudo investigou o efeito da glicose sobre a atividade e expressão da isoforma 1 do trocador Na+/H+ (NHE1) e da H+-ATPase do tipo vacuolar, em células MDCK (Mardin Darby Canine Kidney), linhagem derivada de rim de cão, que apresenta características similares às células principais e intercalares das porções distais do néfron. Por microscopia de fluorescência, se avaliou a velocidade de recuperação do pHi (dpHi/dt) e a capacidade tamponante (<font face=\"symbol\">bi). A partir desses parâmetros, se calculou o efluxo de H+ (JH+). Por Western blot, se avaliou a expressão de NHE1 e da subunidade E da H+-ATPase do tipo vacuolar. Resultados: Na condição controle o efluxo de H+ foi de 6.27 ± 0.51 mM/min (n = 9). O tratamento agudo com glicose (25 mM) aumentou o efluxo de H+ via NHE1, o qual foi modulado pela PI3 cinase. Na mesma condição, não se observou alterações na atividade da H+-ATPase. O tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu significante aumento do efluxo de H+, via NHE1 e H+-ATPase. O efeito estimulador da glicose sobre a atividade de NHE1 e H+-ATPase foi dependente da atividade da p38 MAP cinase. Além disso, o tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu fosforilação do sistema ezrin/radixin/moesin (ERM) e Akt. Conclusões: Nossos resultados indicam que no tratamento agudo com glicose (25 mM), o NHE1 foi modulado pela PI3 cinase. Contudo, no tratamento crônico com glicose (25 mM), a atividade do NHE1 foi modulada pelo sistema ERM/Akt e a atividade da H+-ATPase foi modulada pela p38 MAP cinase. / This study investigated the effect of glucose on the activity and expression of Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1) and vacuolar H+-ATPase, in Mardin Darby Canine Kidney (MDCK) cells from dog kidney, with similar characteristics to principal and intercalated cells of the distal nephron. The pHi recovery rate (dpHi/dt) and the buffering capacity (<font face=\"symbol\">bi) was evaluated through fluorescence microscopy. From these parameters the H+ efflux (JH+) was calculated. By Western blot, the NHE1 and H+-ATPase (E subunit) expression was evaluated. Results: In the control situation the H+ efflux was 6.27 ± 0.51 mM/pH units (n = 9). Acute treatment with glucose (25 mM) increased the H+ efflux via NHE1, which was modulated by PI3 kinase. In the same condition, the H+-ATPase activity did not change. Chronic treatment with glucose (25 mM) induced significant increase in H+ efflux via NHE1 and H+-ATPase. The stimulatory effect of glucose on the NHE1 and H+-ATPase activity was dependent on p38 MAP kinase activity. Furthermore, chronic treatment with glucose (25 mM) induced Ezrin/radixin/moesin (ERM) and Akt phosphorylation. Conclusions: Our results indicate that during the acute treatment with glucose (25 mM), the NHE1 is modulated by PI3 kinase. However, during chronic treatment with glucose (25 mM), NHE1 activity was modulated by the ERM/Akt system and of H+-ATPase activity was modulated by p38 MAP Kinase.

Os micro-organismos constituem um grande problema em termos econômicos para a indústria petrolífera. Estes são responsáveis pela produção de substâncias corrosivas e a formação de biofilmes, que causam deterioração dos materiais metálicos. Os principais grupos microbianos presentes em amostras ambientais da indústria do petróleo são as bactérias anaeróbias heterotróficas totais (BANHT) e as bactérias redutoras de sulfato (BRS). Atualmente, a quantificação desses grupos microbianos é realizada através da técnica do Número Mais Provável (NMP) que estima o resultado em aproximadamente 28 dias. Neste trabalho foi otimizada uma metodologia para a microscopia de fluorescência de amostras salinas provenientes de tanques de armazenamento de água/óleo. As condições testadas foram o tipo de óleo de imersão, o tipo de diluente, o volume do corante, o volume da amostra corada e a concentração do fixador (glutaraldeído) numa tentativa de correlacionar com resultados de quantificação de BANHT e BRS através da técnica convencional do NMP. Nesse caso, as células totais foram quantificadas por microscopia de fluorescência utilizando o corante fluorescente laranja de acridina (AO). Verificou-se que houve uma correlação entre os resultados da quantificação de células totais por microscopia de fluorescência e os resultados de BANHT pela técnica do NMP, devido a pouca variação de valores expressos em ambas as quantificações. Entretanto, não foi possível correlacionar os resultados da quantificação de células totais com os resultados de BRS por NMP devido à grande variação dos valores de quantificação de BRS. Na microscopia de fluorescência, foi possível, quantificar os micro-organismos em aproximadamente 30 minutos e através das fotografias, verificou-se ainda que as amostras apresentaram-se nítidas e os micro-organismos com uma boa fluorescência / Microbial cells constitute a severe problem, from the economic point of view, for the petroleum industry. They are responsible for the production of corrosive metabolites and for the formation of biofilms, causing deterioration in the surface of metallic materials. The main microbial groups present in environmental samples from the petroleum industry include total anaerobic heterothrophic bacteria (TANHB) and sulfate-reducing bacteria (SRB). Nowadays, the quantification of those microbial groups is performed through the use of the most probable number technique (MPN), providing the final quantification after 28 days. In the present work a new methodology, based on fluorescence microscopy, was optimized on saline samples from water/oil storage tanks. The conditions tested were the type of immersion oil, type of diluent, the volume of the dye, the stained sample volume and concentration of fixative (glutaraldehyde) in order to quantify total cells, in an attempt to correlate with TANHB and SRB quantification through MPN. In that case, total cells were quantified with the help of acrydine orange as fluorescent dye. It could be observed a clear correlation between the results obtained for total cells quantification by fluorescence microscopy and the results obtained for TANHB through MPN technique, due to the negligible differences observed in both quantifications. However, when a correlation with SRB cells was tried results of total cells through fluorescence microscopy did not fit entirely. With the use of fluorescence microscopy, it was possible to quantify microbial cells in around 30 minutes and with the help of photographic reports obtained, it could be observed that the samples were clearly observed and the microbial cells indicated a good fluorescence

Os micro-organismos constituem um grande problema em termos econômicos para a indústria petrolífera. Estes são responsáveis pela produção de substâncias corrosivas e a formação de biofilmes, que causam deterioração dos materiais metálicos. Os principais grupos microbianos presentes em amostras ambientais da indústria do petróleo são as bactérias anaeróbias heterotróficas totais (BANHT) e as bactérias redutoras de sulfato (BRS). Atualmente, a quantificação desses grupos microbianos é realizada através da técnica do Número Mais Provável (NMP) que estima o resultado em aproximadamente 28 dias. Neste trabalho foi otimizada uma metodologia para a microscopia de fluorescência de amostras salinas provenientes de tanques de armazenamento de água/óleo. As condições testadas foram o tipo de óleo de imersão, o tipo de diluente, o volume do corante, o volume da amostra corada e a concentração do fixador (glutaraldeído) numa tentativa de correlacionar com resultados de quantificação de BANHT e BRS através da técnica convencional do NMP. Nesse caso, as células totais foram quantificadas por microscopia de fluorescência utilizando o corante fluorescente laranja de acridina (AO). Verificou-se que houve uma correlação entre os resultados da quantificação de células totais por microscopia de fluorescência e os resultados de BANHT pela técnica do NMP, devido a pouca variação de valores expressos em ambas as quantificações. Entretanto, não foi possível correlacionar os resultados da quantificação de células totais com os resultados de BRS por NMP devido à grande variação dos valores de quantificação de BRS. Na microscopia de fluorescência, foi possível, quantificar os micro-organismos em aproximadamente 30 minutos e através das fotografias, verificou-se ainda que as amostras apresentaram-se nítidas e os micro-organismos com uma boa fluorescência / Microbial cells constitute a severe problem, from the economic point of view, for the petroleum industry. They are responsible for the production of corrosive metabolites and for the formation of biofilms, causing deterioration in the surface of metallic materials. The main microbial groups present in environmental samples from the petroleum industry include total anaerobic heterothrophic bacteria (TANHB) and sulfate-reducing bacteria (SRB). Nowadays, the quantification of those microbial groups is performed through the use of the most probable number technique (MPN), providing the final quantification after 28 days. In the present work a new methodology, based on fluorescence microscopy, was optimized on saline samples from water/oil storage tanks. The conditions tested were the type of immersion oil, type of diluent, the volume of the dye, the stained sample volume and concentration of fixative (glutaraldehyde) in order to quantify total cells, in an attempt to correlate with TANHB and SRB quantification through MPN. In that case, total cells were quantified with the help of acrydine orange as fluorescent dye. It could be observed a clear correlation between the results obtained for total cells quantification by fluorescence microscopy and the results obtained for TANHB through MPN technique, due to the negligible differences observed in both quantifications. However, when a correlation with SRB cells was tried results of total cells through fluorescence microscopy did not fit entirely. With the use of fluorescence microscopy, it was possible to quantify microbial cells in around 30 minutes and with the help of photographic reports obtained, it could be observed that the samples were clearly observed and the microbial cells indicated a good fluorescence

Fosfolipases D (FLD) do veneno das aranhas do gênero Loxosceles são capazes de causar entre outros efeitos, uma forte agregação plaquetária cujo mecanismo ainda não foi elucidado. Portanto, para estudar o papel das FLDs nesta atividade, uma FLD recombinante de L. gaucho (LgRec1) foi fusionada com a proteína fluorescente verde (EGFP) e utilizada como uma sonda para detectar a interação de LgRec1 com plaquetas. Essa quimera, denominada EGFP-LgRec1, manteve as principais características da LgRec1. A microscopia confocal das plaquetas mostrou que LgRec1 não requer componentes plasmáticos para se ligar às plaquetas, embora estes sejam necessários para que a LgRec1 induza agregação. Além disso, foi observado que a ação da LgRec1 leva à exposição de fosfatidilserina. Contudo, esta exposição não está relacionada à morte celular. Portanto, este trabalho mostrou que uma FLD de Loxosceles se liga a plaquetas, promovendo a exposição de fosfatidilserina, possibilitando a ligação de fatores de coagulação e resultando na agregação plaquetária. / Phospholipases D (PLD) from spider venom of the genus Loxosceles are capable of causing, among other effects, a strong aggregation of platelets and its mechanism has not yet been elucidated. Therefore, to study the role of PLDs in this activity, a recombinant L. gaucho PLD (LgRec1) was fused with a green fluorescent protein (EGFP) and used as a probe to detect the interaction of LgRec1 with platelets. This chimera, named EGFP-LgRec1, remained the main activities of LgRec1. Platelet confocal microscopy has shown that LgRec1 does not require plasma components to bind to platelets, although these are required for LgRec1 to induce aggregation. In addition, it has been observed that the action of LgRec1 leads to exposures of phosphatidylserine. However, this exposure is not related to cell death. Therefore, this work showed that a Loxosceles PLD binds to platelets, promoting an exposure of phosphatidylserine, that may act as a scaffold for coagulation factors, resulting in platelet aggregation.

Uma infecção pulpar pode resultar na colonização microbiana de todo sistema de canais radiculares incluindo os túbulos dentinários. Estes microorganismos e seus produtos tóxicos são responsáveis pelo desenvolvimento e persistência da periodontite apical de origem endodôntica. O presente estudo objetivou avaliar a viabilidade de E. faecalis e C. albicans em túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2%, hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 2% e soro fisiológico, através da análise por cultura microbiológica e microscopia de fluorescência. Para tanto 120 raízes de dentes humanos foram padronizadas e autoclavadas, sendo posteriormente divididas em 2 grupos (n= 60) para contaminação com E. faecalis e C. albicans por 21 dias. Em seguida, foram divididas em 8 grupos (n= 15) para aplicação das substâncias antimicrobianas nos canais radiculares e posterior incubação em estufa por 14 dias. Amostras da dentina radicular na extensão de 0 - 100 µm e de 100 - 200 µm foram coletadas e submetidas à cultura microbiológica através do plaqueamento em meios de cultura. Após 48 horas de incubação promoveu-se a avaliação das UFC. Paralelamente, as amostras foram processadas para análise em microscopia de fluorescência com auxílio de marcadores fluorescentes específicos, a fim de se determinar a proporção de microorganismos viáveis e não viáveis. Outros 6 espécimes foram preparados para análise em MEV. Os resultados mostraram uma maior capacidade de penetração intratubular para E. faecalis quando comparado a C. albicans. A aplicação de medicação intracanal resultou em significativa redução da viabilidade dos microorganismos quando comparado ao grupo controle independente da medicação aplicada e em ambas as porções da dentina radicular avaliadas. Entretanto, ao compararmos individualmente as medicações, observamos o melhor desempenho da clorexidina gel 2 % e da associação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sem diferença significante entre elas. O hidróxido de cálcio apresentou os piores resultados para desinfecção dos canais radiculares contaminados com E. faecalis e C. albicans. Estes achados foram confirmados tanto pela cultura microbiológica quanto pela microscopia de fluorescência. A cultura microbiológica e a microscopia de fluorescência são métodos adequados e complementares para avaliação da viabilidade de E. faecalis e C. albicans e a eficácia da clorexidina gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% justificam seu uso em endodontia como medicação intracanal. / A pulp infection can result in a microbial colonization of the entire root canals system, including dentinal tubules. These microorganisms and their toxic product are responsible for the development and persistence of apical periondontitis from endodontic source. The present study aimed to evaluate E. faecalis and C. albicans viability in dentinal tubules after the application of calcium hydroxide, chlorhexidine gel 2%, calcium hydroxide associated to chlorhexidine gel 2% and physiological solution, through the analysis by microbiological culture and fluorescence microscopy. For that, 120 human teeth root were standardized and submitted to autoclave, and after ere divided into 2 groups (n=60) for E. faecalis and C. albicans contamination for 21 days. Following this, they were divided into 8 groups (n=15) for application of antimicrobial substances in the root canals and subsequent incubation for 14 days. Samples from root dentin with 0 - 100 µm and 100 - 200 µm of extension were collected and submitted to microbiological culture.After 48 hours of incubation, it was performed the evaluation of colony-forming units (CFU). At the same time, the samples were processed for fluorescence microscopic analysis with the assistance of specific fluorescent markers, in order to determine the proportion of viable and non-viable microorganisms. Other 6 specimens were prepared for the analysis of scanning electron microscopy. Results demonstrated a higher capacity of penetration in the tubules for E. faecalis than for C. albicans. The application of intracanal medication resulted in significant reduction of microorganisms viability when compared to the control groups independently of the medication used and in both evaluated portions of root dentin. However, when one compares individually the medications, it was observed a better performance of chlorhexidine gel 2% and the association of calcium hydroxide with chlorhexidine gel 2% without a significant difference between them. Calcium hydroxide had the worst results for disinfection of root canal contaminated with E. faecalis and C. albicans. These findings were confirmed for the microbiological culture as well as for the fluorescence microscopy. The microbiological culture and the fluorescence microscopy are adequate methods and complementary for the evaluation of E. faecalis and C. albicans viability and the efficacy of chlorhexidine gel 2% and the association of calcium hydroxide with chlorhexidine gel 2% warrant their use in Endodontics as an intracanal medication.

As ligações de hidrogênio (LH), fundamentais na determinação da estrutura da água, proteínas, etc., são muito importantes no reconhecimento molecular e nos mecanismos de reações enzimáticas. A determinação da energia das LHs intramoleculares em proteínas e intermoleculares entre uma proteína e o solvente água, porque fornece informações sobre a estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas. Um método para quantificar e qualificar as LHs foi desenvolvido utilizando critérios de distância, geométricos e energéticos a partir das trajetórias obtidas por simulações de dinâmica molecular. O método foi testado com o monômero de uma fosfolipase A2 homodimérica, sem atividade catalítica, isolada do veneno da Bothrops asper(BaspMT-II). No dímero, a análise das LHs mostrou que elas são também essenciais na manutenção da estrutura quaternária. Essa análise permitiu identificar movimentos do tipo dobradiça acompanhados da formação transitória, na interface dimérica, de LHs controladas pelo triptofano na posição 77. Esses movimentos podem estar associados à ação danosa às membranas, uma vez que podem promover a inserção da região C-terminal na membrana. Estudos prévios mostraram que o peptídeo sintético (3Y codificado pelos aminoácidos 115-129 da BaspMT-II) apresenta atividade bactericida e citolítica. Um outro peptídeo (3W), mutante de 3Y, no qual três resíduos tirosina são substituidos por triptofano, apresenta um aumento do dano às membranas e do efeito miotóxico. Os mecanismos de ação desses peptídeos e as suas estruturas foram estudados por dinâmica molecular, dicroísmo circular (DC), microscopia de fluorescência e monocamadas de Langmuir (Mlang). As adsorções dos peptídeos em monocamadas de ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) se processam por mecanismos diferentes ocasionados pelas diferentes naturezas físico-químicas dos resíduos tirosina e triptofano. A microscopia de fluorescência acoplada a Mlang de DMPA com 3W adsorvido mostra um aumento da fluidez da monocamada, enquanto que o 3Y modifica os domínios do DMPA para pequenas estruturas circulares. Foram realizadas simulações dos peptídeos 3Y e 3W em meio aquoso e nas regiões interfaciais água/n-hexano e água/bicamadas de DMPC. Os resultados confirmam os obtidos por Mlang, demonstrando que os peptídeos interagem diferentemente com as membranas por adotar conformações alternativas definidas previamente. Essas conformações, diferentes das observadas em meio aquoso, dependem da natureza da interface. As estruturas encontradas no final das simulaçoes corroboram o mecanismo proposto por Mlang, assim como as estruturas sugeridas por DC. Isso sugere que a atividade biológica reduzida do peptídeo 3Y ocorre porque os seus dois resíduos Leu se adsorvem na interface sem penetrá-la. Ao contrário de 3W, os resíduos carregados do peptídeo 3Y não estão localizados corretamente para promover uma interação suficientemente atrativa para permitir a sua inserção na membrana celular. / Hydrogen bonds (HB) are highly important in the determination of the structure of the water and proteins. They also play a important role in molecular recognition and in enzyme reaction mechanisms. The determination of protein/water intermolecular and protein intramolecular HB energies provide information with respect to the formation and stabilization of secondary, tertiary and quaternary protein structure. A method that quantifies and qualifies the properties of HB was developed using distance, geometric and energy criteria as applied to data obtained from the atomic trajectories generated by molecular dynamics simulations. The method was tested with a monomer of a catalytically inactive homodimeric phospholipase A2 from Bothrops asper(BaspMT-II) venom. HBs at dimmer interface are essential for maintaining the quaternary structure, and are highly conserved during hinge-like movements of the dimmer. HB formed by tryptophan residue at position 77 controls this movement. These motions can be associated to the membrane damaging action since they facilitate the insertion of the C-terminus into the cellular membrane. Previous studies have shown that synthetic peptide (3Y, coding the amino acids 115-129 of BaspMT-II ) presents bactericidal and cytolitic activities. A peptide variant ( 3W ), in which tyrosine residues were substituted by tryptophan residues, presents an enhanced membrane damaging activity increased miotoxic effect. The mechanism of action of the peptides and their structures were studied by molecular dynamics simulations, circular dichroism (CD), fluorescence microscopy and Langmuir monolayers (Mlang). The adsorption of the peptides on a monolayer composed of dimiristoyl phosphatidic acid (DMPA) and dimiristoylphosphatidyl choline (DMPC) occurs through different processes due to the differences in the physic-chemical nature of the tyrosine and tryptophan residues. Fluorescence microscopy together with Mlang of DMPA with adsorbed 3W indicates an increase of the membrane fluidity while small circular domains are formed with DMPA. Simulations were conducted with the 3Y and 3W peptides in aqueous media, is a water/n-hexane and water/DMPC bilayers. The results confirm the Mlang results, showing that the peptides interact differently with the membranes by adopting alternative previously defined conformations. These two conformations, both of which are different to those observed in water, are dependent of the nature of the interfaces. The final simulated configurations confirm the mechanism proposed by Mlang and the structures proposed by CD. It is suggest that the reduced biological activity of the 3Y peptide is due to the two Leu residues that only adsorb to the cellular membrane without penetrating the bilayer. In contrast to the 3W peptide, no charged residue is correctly located to promote the interaction and insertion of the 3Y peptide into the membrane.

Este estudo investigou o efeito da glicose sobre a atividade e expressão da isoforma 1 do trocador Na+/H+ (NHE1) e da H+-ATPase do tipo vacuolar, em células MDCK (Mardin Darby Canine Kidney), linhagem derivada de rim de cão, que apresenta características similares às células principais e intercalares das porções distais do néfron. Por microscopia de fluorescência, se avaliou a velocidade de recuperação do pHi (dpHi/dt) e a capacidade tamponante (<font face=\"symbol\">bi). A partir desses parâmetros, se calculou o efluxo de H+ (JH+). Por Western blot, se avaliou a expressão de NHE1 e da subunidade E da H+-ATPase do tipo vacuolar. Resultados: Na condição controle o efluxo de H+ foi de 6.27 ± 0.51 mM/min (n = 9). O tratamento agudo com glicose (25 mM) aumentou o efluxo de H+ via NHE1, o qual foi modulado pela PI3 cinase. Na mesma condição, não se observou alterações na atividade da H+-ATPase. O tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu significante aumento do efluxo de H+, via NHE1 e H+-ATPase. O efeito estimulador da glicose sobre a atividade de NHE1 e H+-ATPase foi dependente da atividade da p38 MAP cinase. Além disso, o tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu fosforilação do sistema ezrin/radixin/moesin (ERM) e Akt. Conclusões: Nossos resultados indicam que no tratamento agudo com glicose (25 mM), o NHE1 foi modulado pela PI3 cinase. Contudo, no tratamento crônico com glicose (25 mM), a atividade do NHE1 foi modulada pelo sistema ERM/Akt e a atividade da H+-ATPase foi modulada pela p38 MAP cinase. / This study investigated the effect of glucose on the activity and expression of Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1) and vacuolar H+-ATPase, in Mardin Darby Canine Kidney (MDCK) cells from dog kidney, with similar characteristics to principal and intercalated cells of the distal nephron. The pHi recovery rate (dpHi/dt) and the buffering capacity (<font face=\"symbol\">bi) was evaluated through fluorescence microscopy. From these parameters the H+ efflux (JH+) was calculated. By Western blot, the NHE1 and H+-ATPase (E subunit) expression was evaluated. Results: In the control situation the H+ efflux was 6.27 ± 0.51 mM/pH units (n = 9). Acute treatment with glucose (25 mM) increased the H+ efflux via NHE1, which was modulated by PI3 kinase. In the same condition, the H+-ATPase activity did not change. Chronic treatment with glucose (25 mM) induced significant increase in H+ efflux via NHE1 and H+-ATPase. The stimulatory effect of glucose on the NHE1 and H+-ATPase activity was dependent on p38 MAP kinase activity. Furthermore, chronic treatment with glucose (25 mM) induced Ezrin/radixin/moesin (ERM) and Akt phosphorylation. Conclusions: Our results indicate that during the acute treatment with glucose (25 mM), the NHE1 is modulated by PI3 kinase. However, during chronic treatment with glucose (25 mM), NHE1 activity was modulated by the ERM/Akt system and of H+-ATPase activity was modulated by p38 MAP Kinase.

O fungo Pleurotus ostreatus pertence ao grupo de basidiomicetos que degradam madeira. Este cogumelo cultivado em todo mundo apresenta grande rusticidade e produtividade, e pode ainda ser usado em processos de biorremediação e biopolpação. Devido a seu potencial biotecnológico, torna-se interessante a compreensão da interação deste com outros microrganismos. Neste sentido, recentemente foi observada a presença de bactérias associadas a P. ostreatus em culturas in vitro, que apresentavam grande pleomorfismo. A partir desta observação foram elaborados ensaios que visaram a confirmação da presença de bactérias. Para tanto, foi utilizada a estratégia do “Ciclo Completo de Análise do rRNA” (full-cycle rRNA analysis) empregada em microrganismos não cultiváveis ou de crescimento fastidioso, além do emprego de técnicas de microbiologia básica, e de estudos de ultraestrutura. Os estudos de microbiologia básica indicaram que se tratava de um microrganismo fastidioso e que se desenvolvia melhor na presença do fungo em sistema de co-cultivo em meios contendo Tween 80 ou Tween 20. Por sua vez, a análise de ultraestrutura demonstrou a presença de estruturas pleomórficas, tanto internamente como externamente à hifa. Em relação ao “Ciclo completo de Análise do rRNA” este se iniciou pela amplificação e seqüenciamento de parte do rDNA bacteriano, que revelou a proximidade desta bactéria com o Complexo Burkholderia cepacia (CBC). A partir desta seqüência, foi realizado um estudo de bioinformática que indicou sondas específicas para este grupo de bactérias. Completando o Ciclo completo de Análise do rRNA, foram realizados ensaios de hibridização in situ fluorescente (FISH) para a confirmar a relação entre as estruturas bacterianas e a seqüência obtida. Este método comprovou a presença das bactérias no interior das hifas de P. ostreatus. Este trabalho constitui o primeiro relato de bactérias pleomórficas pertencente ao complexo B. cepacia associados a P. ostreatus. / The fungus Pleurotus ostreatus, which belongs to white rot basidiomycete group, is a widely cultivated mushroom; this species has high productivity and rusticity, besides its use in biobleaching and bioremediation processes. This biotechnological potential justifies microbial interaction studies between this fungi and others microorganisms. In P. ostreatus mycelia, it has been observed pleomorphic bacteria growing on agar media. This research describes several assays to confirm bacterial presence in this sample. Therefore, the full-cycle rRNA analysis (described for unculturable or fastidious microorganism), ultrastructure and basic microbiology approaches were employed. Basic microbiology approaches indicated slow growing bacteria, which grown faster near to fungi colonies in solid media amended with Tween 80 or Tween 20 (co-culture system). Ultrastructure studies confirm the presence of intracellular and extracellular pleomorphic bacteria. The full-cycle rRNA analysis started with 16S rDNA amplification and sequencing. This approach demonstrated a relation between these bacteria with Burkholderia cepacia complex. By bioinformatics analysis was determinate which DNA probes can be use to identified this bacterial group. The last step for full-cycle rRNA analysis was applying fluorescent in situ hybridization (FISH). This technique confirmed the relationship between 16S rDNA bacterial sequence and bacterial forms. This is the first time that a pleomorphic bacteria from B. cepacia complex is found associated with P. ostreatus.