Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:21:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327527.pdf: 2578039 bytes, checksum: dd12014228982d5cf5e09f6658dc93fe (MD5) Previous issue date: 2014 / O diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica comum, caracterizada por um estado de hiperglicemia persistente, sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Durante um estado de hiperglicemia crônica como ocorre no DM, sabe-se que há o acúmulo de compostos carbonílicos reativos, como o metilglioxal (MG), o qual é o principal precursor de produtos terminais de glicação (AGEs). Os efeitos destes metabólitos gerados em situações de DM no sistema nervoso central (SNC) ainda permanecem desconhecidos, desta forma, neste trabalho foi investigado o efeito da hiperglicemia crônica e seus metabólitos, MG e AGEs, sobre a fisiologia e dinâmica mitocondrial no SNC. Para isso, a hiperglicemia crônica foi induzida em ratos Wistar pela injeção de uma dose única de estreptozotocina (STZ, 55 mg/kg, intraperitonealmente). Os animais com glicemia > 200mg/dL foram considerados hiperglicêmicos, sendo que alguns destes animais foram mantidos nestas condições por 60 dias (grupo STZ) e outros receberam injeção subcutânea de insulina (1,5 UI, 2 vezes ao dia; grupo STZ+INS), para a normalização da glicemia. Animais controle receberam injeção de veículo ao invés de STZ. Foi observado que a hiperglicemia crônica não alterou a dinâmica ou a biogênese mitocondrial em córtex cerebral de ratos. Entretanto, a administração de insulina causou um aumento na expressão de Tfam e no tamanho mitocondrial. Por outro lado, foi observado um grande aumento no número de mitocôndrias no bulbo olfatório de animais do grupo STZ. Com o objetivo de melhor compreender os efeitos dos metabólitos acumulados durante este estado hiperglicêmico crônico, analisou-se os efeitos da exposição ao MG e AGEs na dinâmica e fisiologia mitocondrial em cultura celular de astrócitos. Foi observado que a exposição a AGEs induziu uma reorganização mitocondrial, por reduzir o tamanho e aumentar o número de mitocôndrias em células C6 de astroglioma. Entretanto, esta característica que indica o aumento da fissão mitocondrial não foi acompanhada por uma alteração da proteína de fusão Mfn2 ou da proteína de fissão Drp1. Além disso, outro metabólito relacionado à hiperglicemia, o MG, provocou um aumento no consumo de oxigênio (respiração basal e estado IV) e diminuiu o controle respiratório nas células C6, indicando que este metabólito induziu o desacoplamento da mitocôndria. Em concordância com estes resultados, a exposição a AGEs induziu um redução do potencial demembrana mitocondrial em cultura celular primária de astrócitos corticais de rato, sugerindo que a alteração da dinâmica mitocondrial está intimamente relacionada com o efeito desacoplador do MG. Ainda, o aumento do conteúdo de mitocôndrias despolarizadas não estimulou a autofagia, indicando que organelas disfuncionais, as quais são geradoras de espécies reativas de oxigênio, permaneçam na célula neural. Em conclusão, a hiperglicemia crônica e seus metabólitos alteram a dinâmica e a fisiologia mitocondrial em células neurais. Este fenômeno pode levar a célula à morte e, além disso, contribuir para a maior predisposição que os pacientes diabéticos possuem para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.<br> / Abstract : Diabetes mellitus (DM) is a common metabolic disease characterized by a state of persistent hyperglycemia. The disorder is one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. It is known that chronic hyperglycemic conditions elicit the accumulation of the reactive carbonyl compound methylglyoxal (MG), which has been involved in the formation of advanced glycation end products (AGE). The impact of these compounds on the central nervous system (CNS) is virtually unknown. Therefore, the effect of chronic hyperglycemia and the related metabolites, MG and AGEs, was here investigated on mitochondrial physiology and dynamics in the CNS. For this, chronic hyperglycemia was induced in Wistar rats by injecting a single dose of streptozotocin (STZ, 55 mg/kg, intraperitoneally). Animals with glycaemia > 200mg/dL were considered hyperglycemic. Some animals were maintained in this condition for 60 days (STZ group), and others received daily injections of insulin (1.5 IU, twice a day; STZ+INS group) in order to normalize blood glucose levels. Controls animals received a single injection of vehicle instead of STZ. It was observed that chronic hyperglycemia did not change mitochondrial dynamics or biogenesis in cerebral cortex of rats. However, insulin administration elicited increased Tfam expression and mitochondrial size. In contrast, a marked increase in mitochondrial number was observed in olfactory bulb preparations from STZ-treated animals. In order to better understand the effect of the accumulating metabolites under this hyperglycemic state, we then analyzed the individual effect of MG and AGEs on mitochondria dynamic or physiology in cultured astrocytes. It was observed that AGEs treatment induced mitochondrial reorganization, by reducing the size and increasing the number of this organelle in C6 astroglioma cells. However, this phenomenon that points to increased mitochondria fission, was accompanied by unchanged content of Mfn2 (fusion protein) and Drp1 (fission protein) proteins. In addition, the other hyperglycemic-linked metabolite, MG, provoked increased oxygen consumption (basal respiration and respiring state IV) and reduced the mitochondrial respiratory control, indicating MG-induced uncoupling of mitochondria. In agreement, AGEs provoked reduced mitochondrial membrane potential on rat primary cortical astrocyte cell culture, suggesting that the altered mitochondrial dynamics is directly related to the MG uncoupling properties.Furthermore, the increased content of uncoupled mitochondria did not stimulate autophagy, indicating that dysfunctional reactive oxygen species-producing organelles are being accumulated in the nerve cell. In conclusion, chronic hyperglycemia and hyperglycemia-linked metabolites (MG and AGEs) disrupts mitochondrial dynamics and physiology in nerve cells. The phenomenon might induce cell death, and therefore, a higher predisposition for neurodegenerative disorders development in patients with DM.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-31T21:38:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Cristiane de Moura Freitas.pdf: 1366005 bytes, checksum: b5b694e2d987cd4150c02f8cb9d9cfa9 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-02T17:40:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Cristiane de Moura Freitas.pdf: 1366005 bytes, checksum: b5b694e2d987cd4150c02f8cb9d9cfa9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:40:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Cristiane de Moura Freitas.pdf: 1366005 bytes, checksum: b5b694e2d987cd4150c02f8cb9d9cfa9 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / CNPq / Evidências clínicas e experimentais demonstram que uma supernutrição no início da vida aumenta o risco para o desenvolvimento da obesidade e de doenças correlatas, como doenças cardiovasculares. Apesar disso, até o presente momento poucos são os estudos com o objetivo de avaliar a função mitocondrial e o balanço oxidativo no coração de ratos que foram supernutridos na lactação e submetidos ao insulto isquêmico. O presente estudo teve como objetivo investigar o efeito da supernutrição durante a lactação, avaliando a capacidade respiratória mitocondrial, produção de ERs, potencial elétrico de membrana mitocondrial, balanço oxidativo e expressão de UCP2 no coração de ratos machos submetidos ao insulto de isquemia e reperfusão. Utilizamos ratas Wistar, seguindo as recomendações do COBEA e aprovação do Comitê de Ética em Estudos com Animais do Centro de Biociências da Universidade Federal de Pernambuco (Processo nº 23076.017808/2014-51). Para a indução da supernutrição, após o nascimento, no primeiro dia de vida, todas as ninhadas foram normalizadas para nove neonatos por mãe, no terceiro dia de vida pelo fato da lactação estar totalmente estabelecida, o tamanho da ninhada foi reduzido para três filhotes por mãe, permitindo uma oferta significativamente maior de leite para os três filhotes. Para o grupo controle, o número de filhotes permaneceu em nove neonatos por mãe. Aos 60 dias de vida, os animais machos foram sacrificados e o tecido cardíaco foi retirado e submetido ao processo isquemia e reperfusão. Então foram realizadas as análises mitocondriais (respiração mitocondrial, potencial elétrico de membrana mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio), bioquímicas (nível de peroxidação lipídica, oxidação de proteínas, atividade de enzimas antioxidantes, e conteúdo total de tióis) e moleculares (quantificação da expressão gênica da UCP2 e do gene normalizador, B2M). Nossos resultados demonstraram que a supernutrição induziu uma redução de 43% da capacidade respiratória, com aumento na produção de espécies reativas de 144% e redução no potencial elétrico de 52%. Associado a isso, verificamos um aumento da oxidação de proteínas (32%) e diminuição na expressão de UCP2 (40%). Em relação ao sistema antioxidante verificamos uma redução significativa na atividade da enzima SOD (42,7%) e na quantidade totais de tióis (15%). No que se refere a injúria da isquemia-reperfusão, verificamos uma redução na capacidade respiratória tanto no controle (81%) como no obeso (62,5%), associado com uma tendência ao aumento da oxidação de proteínas. A I/R induz redução na expressão da UCP2 em ambos os grupos. Em relação à atividade antioxidante observamos redução apenas na quantidade total de tiois (22,3%). Nossos dados sugerem que o excesso de alimento no período crítico do desenvolvimento, promove uma desregulação nas funções mitocondriais e no balanço oxidativo cardíaco, e as injurias induzidas pelo insulto de isquemia-reperfusão são potencializados pela supernutrição precoce. / Clinical and experimental evidences have shown that early overnutrition increases the risk for the development of obesity and related diseases such as cardiovascular disease. However, to date, few studies have been conducted to evaluate the mitochondrial function and oxidative balance in rat heart heart of rats that were overnourished during lactation, and submitted to ischemic insult. The present study aimed to investigate the effect of overnutrition during the lactation period, evaluating mitochondrial respiratory capacity, ROS production, membrane mitochondrial potential, oxidative balance and UCP2 expression in the heart of male rats after I/R. We used Wistar rats, following the recommendations of Brazilian Animal Care Committee and approval of the Ethics Committee in Animal Studies of the Center of Biological Sciences of the Federal University of Pernambuco (Process nº 23076.017808 / 2014-51). For the induction of overnutrition, after birth, on the first day of life, all litters were normalized to nine puppies per dams, on the third day of life because the lactation was fully established, the size of the litter was reduced to three pups per, allowing a significant increase in milk supply to the three puppies. For the control group, the number of pups remained in nine neonates per dams. At 60 days of age, male animals were sacrificed and cardiac tissue removed and submitted to ischemia and reperfusion. Mitochondrial (mitochondrial respiration, membrane mitochondrial potential and production of reactive oxygen species), biochemical analyzes (quantification of lipid peroxidation, protein oxidation, antioxidant enzyme activity, and total thiol) and molecular analysis (quantification of gene expression of UCP2 and the normalizing gene, B2M). Our results showed that excess of food during lactation induce body weight increase in adulthood (18% higher), in addition to mitochondria dysfunction; overnutrition induces a reduction of 43% in respiratory capacity, an increase in ROS production of 144%, and a decrease in membrane mitochondrial potential (52%). Associated, we observed an increased oxidation of proteins (32%), and decrease in UCP2 expression (40%) in the overnourished group. In antioxidant defense, we observed a significant reduction in the activity of the SOD enzyme (42.7%) and total thiols (15%). Regarding the I/R injury, we observe a reduction in respiratory capacity in both control (81%) and overnourished groups (62.5%), associated with a tendency to increase protein oxidation. I/R injury induces reduction in UCP2 expression in both groups. Regarding antioxidant defense, we observed reduction in total thiols (22.3%). Our data suggest that excess of food during developmental period promotes dysregulation of mitochondrial functions and cardiac oxidative status and the injuries induced by I/R are potentiates by overnutrition during development.

Doctor en Bioquímica / El retículo endoplásmico (RE) y la mitocondria son organelos celulares que entablan una continua y dinámica conversación que permite a la célula responder coordinadamente a diversas situaciones fisiopatológicas. Datos previos de nuestro Laboratorio mostraron que ambos organelos incrementan los puntos de contacto físico durante la fase temprana del estrés de RE, permitiendo una mayor transferencia de Ca2+ desde el RE hacia la mitocondria y estimulando así el metabolismo de este último organelo y favoreciendo la sobrevida celular. El presente proyecto estudió la participación de proteína quinasa A (PKA) y caveolina-1 (Cav1) como agentes reguladores de esta interacción física y funcional entre el RE y la mitocondria. Como modelo de estudio se utilizaron células HeLa tratadas con tunicamicina como agente inductor de estrés de RE por 4 h. Primero, se investigó la participación de PKA en la fase temprana del estrés de RE. Esta quinasa se activó ante condiciones de estrés, medido por la fosforilación de DRP1 en Ser637 por Western blot y concomitante elongación mitocondrial (microscopía confocal). El inhibidor específico de PKA H89 previno estos cambios, comprobando que ambos son dependientes de PKA. Posteriormente, se estudió la participación de PKA en el acoplamiento RE-mitocondria a través de la medición de proximidad (microscopía confocal), contactos físicos (microscopía electrónica), transferencia de Ca2+ (microscopía de fluorescencia) y bioenergética mitocondrial (tasa de consumo de oxígeno). El papel de PKA en estos procesos se evaluó por modulación farmacológica con H89. Los resultados mostraron que la activación de PKA es necesaria para inducir la formación de contactos RE-mitocondria, y de esta forma, gatillar la respuesta adaptativa frente a estrés de RE. Luego se investigó el papel de Cav1 sobre la interface RE-mitocondria. La expresión de Cav1 abolió completamente la respuesta adaptativa frente a estrés de RE temprano, evidenciado mediante proximidad entre organelos, transferencia de Ca2+ y respiración mitocondrial. Además de alterar esta plasticidad organelar frente a condiciones de estrés, la expresión de Cav1 disminuyó significativamente la bioenergética mitocondrial basal, junto con inducir un remodelado basal de la interface RE-mitocondria medido por purificación de las membranas del RE asociadas a mitocondria (MAM). Finalmente, se determinó que la expresión de Cav1 antagonizó la señalización de PKA, impidiendo que ella fosforile a DRP1 y promueva la elongación mitocondrial en respuesta a estrés de RE. Más aún, mediante fraccionamiento subcelular, se estableció que Cav1 afectó la localización subcelular de PKA, evitando que se relocalice a las membranas microsomales en respuesta al estrés de RE. De este modo, Cav1 actúa como un regulador negativo de PKA, previniendo su activación frente a estrés de RE, evitando así la respuesta adaptativa celular / The endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria are two organelles that continuously communicate between one another. This organelle crosstalk allows mitochondria and ER to coordinate responses to a variety of physiological and pathophysiological situations. Data from a previous work show that during the early phase of ER stress, both organelles increase their contact sites, augmenting thereby calcium transfer from ER to mitochondria. This response boosts mitochondrial bioenergetics and ultimately promotes cell survival. Here, we sought to study the role of Protein Kinase A (PKA) and Caveolin-1 (Cav1) as regulators of such organelle crosstalk. As an experimental model, HeLa cells were treated with tunicamycin to induce ER stress. First, we observed that PKA was activated during early stages of ER stress, as assessed by increased phosphorylation of DRP1 at the inhibitory site Ser637 (Western blot), and that this event was followed by mitochondrial elongation (confocal microscopy). The specific PKA inhibitor H89 prevented these changes, thus confirming that they were due to PKA and not another kinase. Subsequently, we studied ER-mitochondria coupling by evaluating organelle proximity (confocal microscopy), physical contact sites (electron microscopy), Ca2+ transfer (fluorescence microscopy) and mitochondrial bioenergetics (oxygen consumption rate). PKA was again involved in these processes by pharmacological modulation using the inhibitor H89. Our results show that PKA activation is necessary to induce the formation of ERmitochondria contacts and to trigger the adaptive metabolic responses to ER stress. Next, we investigated the role of Cav1 as a modulator of the ER-mitochondria interface. Cav1 overexpression completely abolished the early adaptive response to ER stress, as assessed by evaluating the proximity between organelles, calcium transfer and mitochondrial respiration. In addition to altering organelle plasticity in response to stress conditions, Cav1 overexpression severely decreased baseline mitochondrial bioenergetics and induced basal remodelling of the ER-mitochondria interface, as determined by purification and analysis of mitochondria-associated ER membranes. Finally, we determined that Cav1 overexpression antagonizes PKA signalling, preventing PKA-dependent DRP1 phosphorylation and mitochondrial elongation in response to ER stress. Moreover, subcellular fractionation revealed that Cav1 affected PKA localization, prevented redistribution to microsomal membranes in response to ER stress, and altered the pattern of DRP1 phosphorylation. Thus, Cav1 functions as a negative regulator of PKA that precludes PKA activation during early ER stress and thereby prevents the adaptive cellular response / Fondecyt; Fondap;

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptiva a distintos estímulos que incrementan la demanda contráctil e involucran un aumento en la masa y tamaño del corazón. Se distinguen dos tipos de hipertrofia: fisiológica, de carácter reversible; y patológica, irreversible y generada por distintos estímulos, entre ellos la norepinefrina (NE). Por otro lado, la mitocondria es el organelo responsable de generar la energía necesaria para la contracción del cardiomiocito, formando una red dinámica cuya morfología y función dependen de procesos de fusión y fisión, procesos que son afectados en la hipertrofia inducida por NE, produciéndose un fenotipo mitocondrial fisionado. Angiotensina (1-9), es un péptido del sistema renina-angiotensina-aldosterona no canónico, con propiedades anti-hipertróficas frente al estimulo NE. Por lo tanto, el objetivo de este estudio consistió en determinar si Angiotensina-(1-9) modula la dinámica mitocondrial del cardiomiocito y previene la fisión mitocondrial inducida por el estimulo pro-hipertrófico de NE. Los resultados mostraron que Angiotensina (1-9) 100 μM promueve un aumento en la fusión mitocondrial a los tiempos 1, 3, 6 y 24 h, asociándose con una disminución en la migración de Drp1 hacia la mitocondria, sin modificar la masa de las proteínas relacionadas con la fusión, OPA1 y Mfn2. La preincubación por 6 h con Angiotensina (1-9) previno la fisión mitocondrial dependiente de NE (10 μM por 24 h). La preincubación con el antagonista del receptor MAS A779 no afectó la fusión mitocondrial inducida por angiotensina-(1-9). La pre-incubación con el antagonista del receptor AT2 PD 123.319 bloqueó la fusión mitocondrial inducida por angiotensina-(1-9). Por lo tanto, angiotensina (1-9) modula la dinámica mitocondrial de cardiomiocitos neonatos vía receptor AT2, fusionando y previniendo la fisión producida por el estimulo pro-hipertrófico NE / Cardiac hypertrophy is an adaptive response to several stimuli that raises contractile myocardial demand and involves increases in mass and size. Heart hypertrophy is classified in; a) physiological one (reversible) and b) pathological which is irreversible and generated by stimuli, including norepinephrine (NE). On the other hand, mitochondria are the organelle responsible for the generation of the necessary energy for cardiomyocyte contraction, forming a dynamic network whose morphology and function depend on fusion and fission processes. We have previously shown that NE induces cardiac hypertrophy with a concomitant mitochondrial fission.Angiontensin (1-9) is a novel anti-hypertrophic peptide of the non-classical renin-angiotensin system. The aim of this study was to determine whether Angiotensin (1-9) modulates mitochondrial dynamics and prevents NE-induced mitochondrial fission. The results showed that treatment or cardiomyocytes with Angiotensin (1-9) (100 M for 1 to 24 h) produced fusion associated with an decrease in Drp1 migration to mitochondria, without changes in the levels of the fusion proteins Opa1 and Mfn2. Parallel, mitochondrial fission generated by NE 10 μM 24 h was prevented by the pre-incubation (6 h) of cardiomyocytes with Angiotensin (1-9). Pre-incubation with MAS antagonist A779 did not affect the mitochondrial fusion induced by Angiotensin-(1-9). Pre-incubation with AT2 receptor antagonist PD 123.319 prevented mitochondrial fusion induced by Angiotensin-(1-9). In summary, Angiotensin-(1-9) modulates cardiomyocyte mitochondrial dynamics through AT2 receptor, fusing and preventing NE-induced mitochondrial fission / Fondecyt, Fondef, Mecesup

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:52:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 278174.pdf: 2952818 bytes, checksum: 5a722927ed3cdcddbd38fd89c539de64 (MD5) / A mitocôndria é a organela responsável pela maior produção líquida de energia na célula. Numerosos estudos já têm demonstrado seu envolvimento na fisiopatologia de vários processos neurodegenerativos, como nas doenças de Alzheimer, Parkinson e Hungtington. Além disso, sabe-se que ela é alvo de toxicantes, tanto exógenos quanto endógenos, como por exemplo, o contaminante ambiental metilmercúrio (MeHg) e as altas concentrações de leucina que acumulam da Doença do Xarope do Bordo (DXB). Sabe-se que o MeHg causa severos danos neurológicos tanto em animais quanto em humanos. A principal forma de intoxicação humana é através da ingesta de peixes contaminados, sendo que o MeHg acumula-se principalmente no sistema nervoso central. A leucina e seu derivado ?-cetoácido, ?-cetoisocaproato são os principais metabólitos acumulados na DXB, e estes parecem ser responsáveis pelos principais sintomas neurológicos, incluindo o prejuízo cognitivo, que os pacientes com esta patologia apresentam. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi de melhor entender os mecanismos patogênicos responsáveis pela neurotoxicidade induzida pela exposição à toxicantes exógenos e endógenos, principalmente em nível mitocondrial, em cérebro de roedores; visto que existe um grande número de evidências na literatura que demonstra que a gênese dos processos neurodegenerativos está intimamente relacionado com deficiências na produção energética mitocondrial. Observou-se que o MeHg causou estresse oxidativo e diminuiu a atividade dos complexos da cadeia respiratória, além de inibir severamente a enzima creatina cinase, tanto em sistemas in vivo como in vitro. Desta forma, o MeHg prejudica a produção de ATP no cérebro, podendo ser uma das causas da neurodegeneração desencadeada por este toxicante. Para proteger das alterações causadas pelo MeHg, compostos de selênio tem sido usados, pois sabe-se que possuem alta afinidade por este toxicante. Desta forma, administramos dois compostos contendo selênio para proteger contra os efeitos causados pelo MeHg, o difenil disseleneto ((PhSe)2) e o selenito de sódio (Na2SeO3), e verificamos que principalmente o (PhSe)2 foi capaz de proteger contra os efeitos do MeHg in vivo. Por outro lado, o Na2SeO3 na dose utilizada foi potencialmente tóxico. Os dois compostos foram capazes de reduzir a deposição do mercurial no cérebro, provavelmente pela formação de um complexo HgSe. Para a leucina, observamos que esta altera a função da cadeia respiratória mitocondrial e impede a formação de memória, este último verificado por análise do LTP no hipocampo de animais injetados intrahipocampalmente com leucina, possivelmente sendo um dos mecanismos responsáveis pelo déficit neurológico em pacientes com a doença da urina de xarope de bordo. Concluindo, podemos observar que tantos toxicantes endógenos como exógenos compartilham de mecanismos que levam ao prejuízo no sistema nervoso central, tendo com um dos alvos a mitocôndria e o metabolismo energético.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-13T04:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334859.pdf: 1237565 bytes, checksum: 2a4b58684807e6764131b33a58094409 (MD5) Previous issue date: 2015 / A doença de Parkison (DP) é uma doença progressiva crônico-degenerativa, considerada a segunda mais prevalente na população idosa. É caracterizada clinicamente por sintomas motores como tremor, rigidez, bradicinesia e instabilidade postural; e patologicamente pela perda de neurônios dopaminérgicos da substância nigra, redução da produção de dopamina, severo processo inflamatório e presença de corpos de Lewy. Embora a DP tenha sido considerada tradicionalmente por afetar indivíduos com idade superior a 50 anos, os sintomas também podem manifestar-se em pessoas com idade inferior aos 21 anos, sendo neste caso denominada de Parkinsonismo juvenil. Este tipo em especial ocorre esporadicamente ou como afecção hereditária autossômica associada com uma mutação no gene PARK2. Neste cenário o presente estudo teve como objetivo analisar a contribuição da neuroinflamação na fisiopatologia da doença de Parkinson juvenil em modelo genético por deleção do gene PARK2. Para este fim, camundongos C57BL/6 nocaute para PARK2 tiveram o estado neuroinflamatório induzido pela administração intraperitoneal de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS; 0,33 mg/kg). Quatro horas após a administração os animais realizaram testes comportamentais em campo aberto e interação social. Logo após os animais foram eutanasiados e o estriado foi coletado para posteriores análises.Nossos resultados mostram que o genótipo promove alteração cognitiva somente no parâmetro de memória social. No entanto, a administração aguda de LPS compromete a atividade locomotora e reduz a quantidade e a intensidade das visitas no teste de interação social. Ainda, o genótipo e a administração do LPS modulou a expressão gênica de importantes genes relacionados à síntese de BH4, ao metabolismo mitocondrial e plasticidade cerebral. Além disso, promoveu alterações morfológicas como aumento do número, redução da área e relocalização subcelular na distância das mitocôndrias em relação à membrana nuclear. A análise conjunta dos dados nos permite concluir que a deleção do gene PARK2 promove maior susceptibilidade ao desenvolvimento dos danos causados pela resposta inflamatória, além de promover importantes alterações morfológicas, bioquímicas e moleculares, as quais poderiam contribuir para fisiopatologia do Parkinsonismo juvenil.<br> / Abstract : Parkinson Disease (PD) is a chronic degenerative disease considered the second most prevalent in the elderly population. It is clinically characterized by motor symptoms such as tremor, rigidity, bradykinesia and postural instability; and pathologically by loss of dopaminergic neurons of the substantia nigra, reduction of the dopamine production, severe inflammation and presence of Lewy bodies. Although, PD has been considered to affect individuals with age above 50 years, the symptoms may manifest in people under the age of 21 years, being in this case called 'juvenile Parkinsonism. Juvenile PD occurs sporadically or as autosomal hereditary condition associated with a mutation on the gene PARK2. In this scenario, this study had as objective to analyze the contribution of the neuroinflammation in the pathophysiology of the juvenile PD in the genetic model with deletion of the PARK2 gene. For this, C57BL/6 and knockout for PARK2 mice had the neuroinflammatory state induced by intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide (LPS; 0.33 mg/kg). Four hours after the administration the animals were submitted to the behavioral tests namely, open field and social interaction. Afterwards, the animals were perfused for striatal collection to perform morphological and molecular analyzes. Our results showed that the genotype promotes cognitive impairment only in the social interaction paradigm. However, the acute administration of LPS compromised locomotor activity and reduced the number and intensity of the visits in the social interaction test. Still, the genotype and the administration of LPS modulated gene expression of important genes related to the synthesis of BH4, mitochondrial metabolism and brain plasticity. Moreover, the treatment and genotype promoted morphological mitochondrial alterations including, reduction of the area and subcellular relocation of mitochondria. In addition, the distance of mitochondria respect to the nuclear membrane was also reduced. Altogether, this work allows us to conclude that the deletion of PARK2 in addition to the inflammatory state promotes greater susceptibility for neurogeneration, mainly due to mitochondrial adaptations and reduced BH4 pathway flow, which could contribute to the pathophysiology of juvenile PD.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2012-10-26T09:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 302912.pdf: 973508 bytes, checksum: 7ff7f5380e31251e958c65a4ec8dd584 (MD5) / A exposição ao metilmercúrio (MeHg) causa danos neurológicos severos em animais e humanos, no entanto, a fisiopatogenia de tais alterações ainda não está completamente elucidada. Desta forma, investigou-se o efeito da exposição oral ao MeHg em roedores sobre parâmetros comportamentais e bioquímicos, incluindo a fisiologia e morfologia mitocondrial. A exposição repetida (21 dias) ao MeHg (20 e 40mg/L) provocou um comprometimento da memória a curto prazo do tipo discriminativa, fato que foi evidenciado pela habilidade reduzida dos animais em reconhecer um novo objeto no seu ambiente familiar. Este prejuízo cognitivo correlacionou-se com deficiências bioenergéticas no sistema nervoso central (córtex cerebral) e na periferia (plaquetas), as quais foram manifestadas com redução nas atividades da NADH desidrogenase e complexos II e II-III, bem como da creatina cinase mitocondrial (mtCK), no córtex cerebral, e com um aumento no consumo de oxigênio em plaquetas de sangue periférico. Por outro lado, a análise de microscopia eletrônica mostrou uma redução na quantidade de mitocôndrias no córtex cerebral de animais intoxicados. Ainda, foi observado um predomínio de organelas tubulares, sugerindo que a morfologia mitocondrial estaria sendo controlada pelo processo de fusão. Para melhor entender o efeito tóxico do MeHg sobre a função mitocondrial, preparações de córtex cerebral de camundongos foram expostas ao mercurial (0-1500 µM). Este tratamento provocou aumento na produção de H2O2, inibição da redução do MTT e da atividade da NADH desidrogenase, e aumento na formação de lactato, sugerindo que a produção energética cerebral estaria comprometida na presença de MeHg. Considerando que estes tratamentos, in vivo e in vitro com MeHg, induziram disfunção mitocondrial e estresse oxidativo (inibição da enzima mtCK), procurou-se investigar os efeitos da coadministração do composto neuroprotetor difenil disseleneto - (PhSe)2 - (administração subcutânea; 5 µmol/kg) em animais intoxicados com MeHg. O tratamento com (PhSe)2 preveniu as alterações ultraestruturais e o efeito inibitório do mercurial sobre a atividade da mtCK em camundongos expostos ao MeHg. Assim, estes dados em conjunto, indicam que a intoxicação por MeHg compromete a viabilidade celular provavelmente por induzir estresse oxidativo mitocondrial, que posteriormente estimularia o processo de fusão mitocondrial a fim de conservar o status energético cerebral. Adicionalmente, a partir deste trabalho, pode-se propor que, por um lado, o comprometimento do consumo de oxigênio em plaquetas é um marcador sensível e não invasivo do prejuízo energético cerebral induzido pela intoxicação por MeHg, e por outro, que o uso de (PhSe)2 poderia prevenir os efeitos tóxicos deste mercurial orgânico.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-25Bitstream added on 2014-06-13T19:02:42Z : No. of bitstreams: 1 gushi_lt_dr_botib.pdf: 860668 bytes, checksum: f4640ec40c34a33b45f1c604d7f189d2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença tropical negligenciada em expansão no Brasil, ocorrendo em áreas onde antes não havia registro. Seu agente etiológico e a Leishmania chagasi um protozoário pertencente à classe Kinetoplastida caracterizada por uma organela denominada cinetoplasto a qual possui um DNA organizado em uma rede contendo maxicírculos, responsáveis pelas funções respiratórias e minicírculos, envolvidos na pordução de RNAs-guia, os quais possuem um papel importante na edição dos RNAs dos maxicírculos. Os minicírculos são divididos em uma região convervada de aproximadamente 120 p.b. e uma região variável de aproximadamente 600 p.b. O foco desse estudo está na análise das seqüências da região variável a fim de entender sua distribuição nos diferentes estágios de vida da L. chagasi. As amostras foram coletadas de cães e pacientes sintomáticos por aspiração dos linfonodos e, em alguns casos, foram obtidas culturas primárias. A extração do DNA foi realizada com o kit comercial Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) seguindo as instruções do protocolo. O kDNA foi amplificado por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos LIN R4 - forward (5’-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) e LIN 19 - reverse (5’-GAA CGC CCC TAC CCG-3’), produzindo um fragmento de aproximadamente 720 p.b. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T de acordo com o protocolo do InsTAclone PCR cloning kit. As seqüências (aproximadamente 182) foram individualmente comparadas com as depositadas no GenBank, alinhadas com o software Clustal X2 e tiveram uma árvore filogenética construída utilizando o software MEGA 4.0 adotando o algoritmo UPGMA e escolhendo um bootstrap com 1000 replicatas. A distribuição entre os diferentes hospedeiros foi homogênea. A princípio, um lato polimorfismo é observado, mas... / American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a neglected tropical disease in expansion in Brazil currently occurring in areas where there has never been reports. Its etiologic agent is Leishmania chagasi, a protozoan belonging to the order Kinetoplastida characterized by an organelle named kinetoplast wich has a DNA organized in a network containing maxicircles, responsible for respiratory functions and minicircles, involved in the production of guide RNAs, which play a role in the RNA editing of maxicircles. The minicircles are divided into an approximately 120 b.p. conserved region and an approximately 600 b.p. variable region. The focus of this study is on the sequence analysis of the minicircles variable region in order to understand its distribution on different life stages of L. chagasi. Samples were collected from dogs and symptomatic patients by lymphonod aspiration and, in some cases, primary cultures were obtained. DNA extraction was carried out with the commercial kit Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) following its protocol. kDNA was amplified by PCR, using a pair of oligonucleotides LIN R4 - forward (5’-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) and LIN 19 - reverse (5’-GAA CGC CCC TAC CCG-3’), producing a fragment of 720 b.p. PCR products were cloned in pTZ57R/T vector according to the InsTAclone PCR cloning kit protocol. Sequences (182) were individually compared with the ones deposited at the GENBANK, aligned with Clustal X2 software and had a phylogenetic tree constructed utilizing MEGA 4.0 software adopting UPGMA algorithm and choosing bootstrap with 1000 replicates. Sequences distribution among different hosts was homogeneous. At first, high polymorphism is observed but, when analyzed in more detail, i.e. by branch, sequences proved to be conserved and minimal SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was found... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-08Bitstream added on 2014-06-13T18:31:18Z : No. of bitstreams: 1 zanoli_jcc_me_araca.pdf: 862916 bytes, checksum: 14a8c6ca70d93c05133bf28113b4bac8 (MD5) / Abamectina é uma lactona macrocíclica pertencente à família das avermectinas, utilizada mundialmente como agente antiparasitário em animais de criação e estimação, além do emprego agrícola como princípio ativo dos inseticidas e nematicidas. Mitocôndrias são responsáveis pela conversão da energia liberada pelo transporte de elétrons e armazenamento como energia de ligação na molécula de ATP, um componente metabólico essencial. Interferências em sua síntese ou utilização caracterizam mecanismos pelos quais os xenobióticos podem expressar toxicidade aguda ou crônica. Neste trabalho, os efeitos da abamectina na bioenergética de mitocôndrias isoladas de fígado de rato foram avaliados. Nas concentrações utilizadas (5 a 25 µM), abamectina causou inibição da cadeia respiratória, sem afetar a atividade das enzimas NADH desidrogenase, succinato desidrogenase e o potencial de membrana, comportando-se de maneira semelhante à oligomicina e ao atractilosídeo. A principal atuação da abamectina foi reduzir o potencial mitocondrial de fosforilação oxidativa, diminuindo os níveis de ATP provavelmente como resultado de sua ação direta sobre a FoF1-ATPase, uma vez que inibiu a atividade desta enzima, e/ou sobre o translocador de ADP/ATP. A inibição mais acentuada da atividade fosfohidrolase em mitocôndrias intactas desacopladas do que em mitocôndrias rompidas juntamente com a inibição da despolarização do potencial de membrana induzida pelo ADP sugerem que a abamectina atuou inibindo mais especificamente o translocador de ADP/ATP do que a FoF1-ATPase / Abamectin is a macrocyclic lactone belonging to the avermectin family, used worldwide as antiparasitic agent in farm animals and pets, and agricultural employment as the active ingredient of insecticides and nematicides. Mitochondria are responsible for converting the energy released by electron transport and storage as the binding energy molecule ATP, an essential metabolic component. Interference in its synthesis or utilization characterize mechanisms by which xenobiotics can express acute or chronic toxicity. In this study, the effects of abamectin in the bioenergetics of mitochondria isolated from rat liver were evaluated. At the concentrations used (5-25 mM), abamectin caused inhibition of the respiratory chain without affecting the activity of enzymes NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase and the membrane potential, behaving similarly to oligomycin and Atractyloside. The main activity of abamectin was to reduce the potential of mitochondrial oxidative phosphorylation, decreasing ATP levels probably as a result of its direct action on the Fo-F1 ATPase, since it inhibited the activity of this enzyme, and/or the ADP/ATP translocator. The more pronounced inhibition of the fosfohydrolase activity in intact uncoupled mitochondria than in disrupted mitochondria, in addition to the inhibition of the ADP-stimulated depolarization of mitochondrial membrane potential suggest that abamectin acted more specifically by inhibiting the ADP/ATP translocator than the FoF1-ATPase

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Hiro Goto / Banca: Jayme Augusto de Souza Neto / Banca: Cassiano Victória / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença tropical negligenciada em expansão no Brasil, ocorrendo em áreas onde antes não havia registro. Seu agente etiológico e a Leishmania chagasi um protozoário pertencente à classe Kinetoplastida caracterizada por uma organela denominada cinetoplasto a qual possui um DNA organizado em uma rede contendo maxicírculos, responsáveis pelas funções respiratórias e minicírculos, envolvidos na pordução de RNAs-guia, os quais possuem um papel importante na edição dos RNAs dos maxicírculos. Os minicírculos são divididos em uma região convervada de aproximadamente 120 p.b. e uma região variável de aproximadamente 600 p.b. O foco desse estudo está na análise das seqüências da região variável a fim de entender sua distribuição nos diferentes estágios de vida da L. chagasi. As amostras foram coletadas de cães e pacientes sintomáticos por aspiração dos linfonodos e, em alguns casos, foram obtidas culturas primárias. A extração do DNA foi realizada com o kit comercial Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) seguindo as instruções do protocolo. O kDNA foi amplificado por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos LIN R4 - forward (5'-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) e LIN 19 - reverse (5'-GAA CGC CCC TAC CCG-3'), produzindo um fragmento de aproximadamente 720 p.b. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T de acordo com o protocolo do InsTAclone PCR cloning kit. As seqüências (aproximadamente 182) foram individualmente comparadas com as depositadas no GenBank, alinhadas com o software Clustal X2 e tiveram uma árvore filogenética construída utilizando o software MEGA 4.0 adotando o algoritmo UPGMA e escolhendo um bootstrap com 1000 replicatas. A distribuição entre os diferentes hospedeiros foi homogênea. A princípio, um lato polimorfismo é observado, mas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a neglected tropical disease in expansion in Brazil currently occurring in areas where there has never been reports. Its etiologic agent is Leishmania chagasi, a protozoan belonging to the order Kinetoplastida characterized by an organelle named kinetoplast wich has a DNA organized in a network containing maxicircles, responsible for respiratory functions and minicircles, involved in the production of guide RNAs, which play a role in the RNA editing of maxicircles. The minicircles are divided into an approximately 120 b.p. conserved region and an approximately 600 b.p. variable region. The focus of this study is on the sequence analysis of the minicircles variable region in order to understand its distribution on different life stages of L. chagasi. Samples were collected from dogs and symptomatic patients by lymphonod aspiration and, in some cases, primary cultures were obtained. DNA extraction was carried out with the commercial kit Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) following its protocol. kDNA was amplified by PCR, using a pair of oligonucleotides LIN R4 - forward (5'-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) and LIN 19 - reverse (5'-GAA CGC CCC TAC CCG-3'), producing a fragment of 720 b.p. PCR products were cloned in pTZ57R/T vector according to the InsTAclone PCR cloning kit protocol. Sequences (182) were individually compared with the ones deposited at the GENBANK, aligned with Clustal X2 software and had a phylogenetic tree constructed utilizing MEGA 4.0 software adopting UPGMA algorithm and choosing bootstrap with 1000 replicates. Sequences distribution among different hosts was homogeneous. At first, high polymorphism is observed but, when analyzed in more detail, i.e. by branch, sequences proved to be conserved and minimal SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was found... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor