O grupo Characidium lauroi pertence ao gênero Characidium e é formado por seis espécies, C. lauroi, Characidium sp. piabanha, C. japuhybense, C. oiticicai, C. schubarti, e Characidium sp. iguaçu, que se distribuem nas bacias do Rio Paraíba do Sul, Drenagens Costeiras da Baía de Ilha Grande, Rio Tietê, Rio Paranapanema e Rio Iguaçu, respectivamente. Os estudos disponíveis sobre as relações evolutivas entre as espécies que compõem esse grupo baseiam-se em dados morfológicos que, entretanto, não foram suficientes para resolver as relações entre C. oiticicai, C. schubarti e Characidium sp. iguaçu. Estudos citogenéticos ou moleculares não foram aplicados até agora às espécies do gênero Characidium com o intuito de verificar a existência do grupo C. lauroi. Técnicas que envolvem o uso de DNAmt, como PCR-RFLP, DNA barcoding e sequenciamento podem auxiliar na resolução dessa questão, uma vez que as espécies do gênero Characidium formam um grupo interessante para a aplicação dessas técnicas, principalmente por apresentar algumas espécies com limites taxonômicos muito próximos, como as espécies que compõem o grupo C. lauroi. No presente estudo, técnicas de citogenética clássica e molecular, assim como a técnica de PCR-RFLP, o uso do DNA barcoding e sequenciamento foram utilizados na tentativa de analisar e elucidar as relações filogenéticas entre as espécies do gênero Characidium, principalmente com enfoque nas relações entre as espécies do grupo C. lauroi. Os resultados citogenéticos encontrados indicam que esse grupo de espécies pode ser definido pela presença de cromossomos sexuais diferenciados do tipo ZZ/ZW portadores de cístrons ribossomais e pela presença de um cariótipo relativamente estável. No entanto, essas características não estão restritas ao grupo C. lauroi. Os resultados de PCR-RFLP, assim como os resultados obtidos por meio do DNA barcoding e sequenciamento, indicam que as espécies C. lauroi e C. sp. piabanha podem formar uma única espécie, da mesma forma que as populações de C. schubarti. No entanto, as espécies do grupo C. lauroi não formam um grupo monofilético. A relação entre as espécies do grupo C. lauroi com C. pterostictum e C. lanei pode indicar que essas espécies tenham passado por uma separação recente e que, não necessariamente essas duas espécies façam parte do grupo C. lauroi, mas sim que fazem parte de um grupo maior de espécies do gênero Characidium, o que é corroborado até por dados citogenéticos. Comparações entre as topologias encontradas com base em dados morfológicos e moleculares e suas implicações na delimitação e nas relações encontradas entre as espécies do grupo C. lauroi são discutidas. / The group Characidium lauroi belongs to the genus Characidium and consists of six species, C. lauroi, Characidium sp. piabanha, C. japuhybense, C. oiticicai, C. schubarti and Characidium sp. iguaçu; which are distributed in the basins of the Paraiba do Sul River, Drainage Coastal Bay of Ilha Grande, Tietê River, Paranapanema River and Iguaçu River, respectively. Available studies on the evolutionary relationships between species that make up this group are based on morphological data, however, were not sufficient to address the relationship between C. oiticicai, C. schubarti and Characidium sp. iguaçu. Cytogenetic and molecular studies have not been applied so far to the species of the genus Characidium in order to verify the existence of group C. lauroi. Techniques that involve the use of mtDNA, such as PCRRFLP, DNA barcoding and sequencing may help in resolving this issue, since the genus Characidium form an interesting group for the application of these techniques, mainly for some species with taxonomic boundaries very close, as the species that make up group C. lauroi. In this study, techniques of classical and molecular cytogenetics, as well as PCR-RFLP, the use of DNA barcoding and sequencing were used in an attempt to analyze and elucidate the phylogenetic relationships among species of the genus Characidium, mainly focusing on relations between species of group C. lauroi. The cytogenetic results obtained indicate that this group of species can be defined by the presence of sex chromosomes differentiated ZZ / ZW carrying ribosomal cistrons and the presence of a relatively stable karyotype. However, these features are not restricted to the group C. lauroi. The results of PCR-RFLP and the results obtained by barcoding DNA and the sequencing, indicate that C. lauroi and Characidium sp. piabanha may form a single species, in the same way that populations of C. schubarti. However, the species of group C. lauroi not form a monophyletic group. The relationship between species of group C. lauroi with C. pterostictum and C. lanei may indicate that these species have experienced a recent separation and, not necessarily these two species are part of group C. lauroi, but they are part of a larger group of species of the genus Characidium, which is supported even by cytogenetic data. Comparisons between the topologies found based on morphological and molecular data and its implications for delimitation and relationships found between species of group C. lauroi are discussed.

O gênero Noctilio pertence à superfamília Noctilionoidea, família Noctilionidae, e inclui atualmente duas espécies de distribuição Neotropical, N. leporinus e N. albiventris. Estas ocorrem em simpatria nas áreas de planície desde a costa pacífica do México até o Norte da Argentina e Uruguai. N. leporinus possui características morfológicas externas e funcionais que o tornam adaptado à piscivoria, apesar de trabalhos citarem para sua alimentação um consumo equivalente de insetos, crustáceos e aracnídeos. N. albiventris possui hábito insetívoro, apresentando características morfológicas externas que se assemelham muito a N. leporinus, sendo apenas de menor tamanho. As duas espécies apresentam variação morfológica ao longo de sua distribuição geográfica, com a descrição de subespécies para ambas. Dados moleculares foram utilizados recentemente para investigar as relações intragenéricas em Noctilio, indicando uma origem recente para N. leporinus e a parafilia de N. albiventris. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização genética intraespecífica e a determinação do padrão filogeográfico das espécies do gênero Noctilio, verificando a possibilidade de existência de mais que duas linhagens evolutivas para o táxon. A amostragem incluiu 63 indivíduos de N. leporinus distribuídos por 35 localidades, e 43 indivíduos de N. albiventris de 19 localidades distintas, tendo sido utilizados como marcadores moleculares o gene mitocondrial citocromo b e a região controle do DNAmit. Os resultados corroboraram a parafilia descrita para N. albiventris, além de evidenciarem níveis de divergência filogenética mais significativos do que o alcançado pelo estudo anterior. Foram encontrados em N. albiventris três filogrupos com alto suporte, igualmente distantes do filogrupo de N. leporinus, as quais apresentam uma correlação geográfica com as subespécies propostas. Os testes de desvio da neutralidade em N. leporinus foram significativos, indicando uma rápida expansão populacional após o surgimento da espécie. Estimativas para o cálculo do ACMR das linhagens evolutivas remetem ao período pleistocênico, tanto para o surgimento de N. leporinus como para os três clados encontrados em N. albiventris. A divergência observada entre estas linhagens variou entre 4,3 e 6,1%. O presente estudo permitiu a confirmação do surgimento recente da espécie N. leporinus a partir de uma linhagem de N. albiventris. A hipótese proposta para a origem da linhagem piscívora do gênero foi a colonização das pequenas Antilhas por uma população de N. albiventris durante os ciclos glaciais do Pleistoceno. Ali a população teria se diferenciado, originando N. leporinus, e posteriormente sofrido uma rápida expansão populacional devido à ocupação de um nicho inexplorado por morcegos neotropicais. / The genus Noctilio belongs to the Superfamily Noctilionoidea, Family Noctilionidae, and currently it includes two species with Neotropical distribution, N. leporinus and N. albiventris. Both species occurs simpatrically in lowland areas from western and eastern Mexico, southward to northern Argentina and Uruguay. N. leporinus have functional and external morphologic characteristics that enables it to piscivory, although many works describe an equivalent consume of arachnids, insects and crustaceans in its diet. N. albiventris is insectivore and resembles N. leporinus in most external and cranial features, but is a smaller species. Both species show morphological variation along their geographic range, congruent with the subspecies distribution. A recent study on molecular phylogeny suggested a recent origin for N. leporinus and to the paraphyly of N. albiventris. The main purpose of this work was the intraspecific genetic characterization and the description of phylogeographic patterns of both species of genus Noctilio, in attempt to investigate how many evolutionary lineages are included in the taxon. Sampling included 63 individuals of N. leporinus from 35 distinct localities and 43 individuals of N. albiventris from 19 localities. The mitochondrial gene cytocrome b and the control region from mtDNA were used as molecular markers. The results corroborate the paraphyly described for N. albiventris, and reveals more significant levels of phylogenetic divergence than previously observed. Three highly supported phylogroups were found within N. albiventris, all of them presenting similar phylogenetic distances to the lineage of N. leporinus. These phylogroups showed geographic structure congruent with the N. albiventris subspecies. The tests against neutrality hypothesis in N. leporinus were significant, suggesting a rapid population growth after the origin of the species. Estimates of the MRCA of the evolutionary lineages dates to the Pleistocene, for both the origin of N. leporinus and all three clades found for N. albiventris. Observed divergence between lineages varied from 4.3 to 6.1%. This study corroborates the recent origin of N. leporinus and its closest phylogenetic relationship with a N. albiventris lineage. The hypothesis for the piscivory in the genus Noctilio was the colonization of the Lesser Antilles by a population of N. albiventris during glacial cycles in the Pleistocene. This population may have differentiated, giving rise to N. leporinus, and then getting through a rapid expansion due to a trophic niche previously unexplored by any neotropical bat lineage.

As tartarugas marinhas são répteis existentes ao longo da costa brasileira, principalmente em áreas de alimentação e anidação. Por possuírem comportamento migratório, estudos ecológicos sobre esses animais são muito difíceis de realizar e muitas questões sobre sua biologia permanecem obscuras. A biologia molecular é uma importante ferramenta, que auxilia os pesquisadores na obtenção de informações valiosas a respeito de estrutura populacional, filogeografia e genealogia de populações naturais. Assim, este trabalho teve como objetivo analisar populações de tartarugas verdes (Chelonia mydas) que freqüentam a região de Cananéia, SP, com base na variedade haplotípica das seqüências gênicas correspondentes ao tRNA-Pro+D-loop do DNA mitocondrial. A área de estudo foi descrita como uma área de alimentação para juvenis de tartarugas verdes, Chelonia mydas, sendo caracterizada pela presença de um estoque misto, composto por animais provenientes de pelo menos seis diferentes áreas de desova analisadas durante quatro anos. A variabilidade haplotípica e nucleotídica é intermediária em relação às demais áreas de alimentação estudadas no Oceano Atlântico, sendo a amostra composta principalmente por indivíduos dos haplótipos CM-08 (63%) e CM-05 (26%). Os demais haplótipos foram relativamente raros, apresentando-se em frequências menores que 5% (CM-01, CM-06, CM-09, CM-10, CM-24, CM-32, CM-36, CM-45). Foi detectada diferença significativa entre as amostras anuais (p < 0.05) e não houve diferença entre as amostras sazonais (p >0.05). Análises indicam que Cananéia encontra-se conectada com as demais áreas de desova e alimentação estudadas no Oceano Atlântico, dependendo destas para o equilíbrio de populações saudáveis e necessitando de atenção, visto o grau atual de ameaça que sofrem. A importância da incorporação de parâmetros ecológicos que contribuam para o entendimento da dinâmica populacional da região, às análises genéticas, é imprescindível para que esses dados sejam validados e tenham utilidade e aplicação direta na proteção das tartarugas marinhas. As informações obtidas através deste trabalho foram utilizadas na elaboração de um documento que será anexado ao plano de manejo do Parque Estadual Ilha do Cardoso e contribuirão para a elaboração do plano de manejo da Área de Proteção Ambiental de Ilha Comprida, de modo que a região de Cananéia seja considerada prioritária na preservação das tartarugas verdes. / The green turtle, Chelonia mydas, is an endangered marine reptile that nests and forages along the Brazilian coast and oceanic islands, among other tropical areas. Due to the highly migratory and oceanic nature of these animals, ecological studies are many times difficult to carry out, and many questions about their biology remain. Molecular genetic analysis is a powerful tool for bridging these gaps, providing valuable information about population structure, phylogeography, and genealogy. This study analyzes mitochondrial DNA sequences (tRNA-Pro + D-loop) from green sea turtles of the Cananéia regional juvenile feeding ground over a four-year period. Significant differences were found between annual samples (p<0.05), however no significant differences were found between seasons (p>0.05). The sample was composed primarily of individuals of haplotypes CM-08 (63%) and CM-05 (26%). All other haplotypes (n = 8) were relative rare, with frequencies lower than 5%. The analysis revealed the area to be a mixed stock, composed of animals drawn from at least six different nesting areas. Because Cananéia is connected to other nesting and feeding grounds throughout the Atlantic Ocean, the health of these populations is interdependent, and threats in one area will likely impact connected sites. This connectivity underscores the importance of understanding regional population dynamics using genetic analysis, with conservation applications. These data will be included in the management plans for the Ilha do Cardoso State Park and the Environmental Protection Area of Ilha Comprida, so that Cananéia will be considered a priority area for the preservation of green sea turtles in Brazil.

Patologias causadas por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) constituem um importante grupo de doenças genéticas em humanos. Todavia, devido ao desconhecimento dos mecanismos que governam a herança mitocondrial, não existem métodos eficientes que permitam prever ou intervir na herança destas patologias. Estudos recentes indicam que mutações no mtDNA são seletivamente eliminadas na linhagem germinativa. O presente projeto investigou se o embrião é capaz de eliminar mitocôndrias disfuncionais durante o desenvolvimento pré-implantação. Para tanto, zigotos de camundongo foram tratados com clorometil-X-rosamina (MitoTracker Red CMXRos) e fotossensibilizados por 0, 2,5, 5, 10, 20 e 60 s. Houve diminuição da taxa de blastocisto, com bloqueio total do desenvolvimento quando a fotossensibilização foi realizada por período igual ou superior a 20 s. A fotossensibilização também resultou em disfunção mitocondrial, como indicado por diminuição do potencial de membrana mitocondrial. No entanto, a transferência de citoplasma de zigotos NZB/BINJ (NZB) fotossensibilizados por 20 s não afetou o desenvolvimento de embriões C57BL/6 (B6). A quantidade de mtDNA NZB também não diferiu entre os zigotos B6, independente de terem recebido citoplasma exposto ou não à fotossensibilização (30,6% ± 1,73 vs. 30,8% ± 1,73). Porém, a quantidade de mtDNA NZB foi menor (P = 0,008) nos blastocistos que receberam citoplasma fotossensibilizado (31,4% ± 1,43 vs. 24,7% ± 1,43). Como a quantidade total de mtDNA não diferiu entre os grupos, estes resultados sugerem que as mitocôndrias disfuncionais introduzidas foram destruídas. A análise de autofagossomos indicou, no entanto, que as mitocôndrias NZB não foram eliminadas por mitofagia. Diferente do esperado, o cultivo na presença de rapamicina reverteu o efeito causado pela introdução de citoplasma fotossensibilizado, resultando em níveis semelhantes de mtDNA NZB em comparação com os blastocistos que receberam citoplasma não fotossensibilizado. Concluiu-se que o embrião de camundongo é capaz de destruir mitocôndrias disfuncionais durante o desenvolvimento à blastocisto. Novos estudos deverão fornecer evidências adicionais e esclarecer os mecanismos moleculares que fundamentam esses achados. / Pathologies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) represent an important group of genetic diseases in humans. Nonetheless, due to our limited understanding of the molecular mechanisms of mitochondrial inheritance there are no efficient methods to predict or intervene in the inheritance of these diseases. Recent studies indicate that mutations in mtDNA are selectively eliminated in the germline. This project investigated the ability of the embryo to target and eliminate dysfunctional mitochondria during early development. To test that, mouse zygotes were treated with chloromethyl-X-rosamina (MitoTracker Red CMXRos) and photosensitized for 0, 2.5, 5, 10, 20 and 60 s. There was a decrease in the rate of blastocyst development and a developmental arrest when the photosensitization was performed for a period equal to or greater than 20 s. Photosensitization also resulted in mitochondrial dysfunction, as indicated by a decreased of mitochondrial membrane potential. However, cytoplasmic transfer from NZB/BINJ (NZB) zygotes photosensitized for 20 s resulted in no effect on development of C57BL/6 (B6) embryos. The amount of NZB mtDNA introduced also did not differ between B6 zygotes, regardless of whether they received or not photosensitized cytoplasm (30.6% ± 1.73 vs. 30.8 ± 1.73%). On the other hand, the amount of NZB mtDNA was lower (P = 0.008) in the blastocysts receiving photosensitized cytoplasm (31.4% ± 24.7% ± 1.43 vs. 1.43). Since the total amount of mtDNA was not different between the groups, these results suggest that dysfunctional mitochondria introduced by cytoplasmic transfer were destroyed. Analysis of autophagosomes indicated, however, that the NZB mitochondria were not eliminated by mitophagy. Different than expected, culture in the presence of rapamycin reversed the effect caused by introduction of photosensitized cytoplasm, resulting in similar levels of NZB mtDNA compared to blastocysts receiving cytoplasm not photosensitized. It was concluded that the mouse embryo may destroy dysfunctional mitochondria during development into blastocysts. Further studies should provide additional evidence and elucidate the molecular mechanisms underlying these findings.

Submitted by Gisele Nagai (giselenagai@gmail.com) on 2015-10-15T20:00:37Z No. of bitstreams: 2 EDVALDO PEREIRA MOTA.pdf: 35390779 bytes, checksum: 1eb9ae7e1bbaa359b29ae577a19ada44 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-15T20:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 EDVALDO PEREIRA MOTA.pdf: 35390779 bytes, checksum: 1eb9ae7e1bbaa359b29ae577a19ada44 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2010-12-02 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The species Phyllomedusa bicolor has biotechnological potential, since its secretion is rich in epidermal bioactive substance. This species, popularly known as the Indians Kambô cloth linguistic group, is used in healing rituais in preparation for hunting. It is a widely distributed species in the Amazon that lacks studies that focus on their evolutionary history and population structure. This study employed the use of mtDNA as a molecular tool to study 117 individuais of P. bicolor from eleven different locations in five states in the Brazilian Amazon. The database for the analysis population was composed of 117 nucleotide sequences, each with a total of 1037 base pairs (bp) which resulted in a database for the concatenated mtDNA (a fragment of 520 bp of 16S and a Control Region fragment of 517 bp). The sequences were aligned and edited in the BioEdit programo From these, we generated a data matrix that was used in the analysis population statistics implemented in the program ARLEQUIN. Analyses of Samovar and BAPS were used to determine the groupings of the populations later. Haplotype network, the data generated by the program GEODIS and interpretation of key Templeton were generated using the program ANECA. Verified the existence of 31 haplotypes for the mtDNA, and 21 are unique within the sample. The gene diversity (h) total was estimated at 0.884, and this value is high compared to the values of sites. The AMOVA test revealed that there is a strong genetic structure, which is significantly supported by the fixation index (<1>ST= 0.8166, P <0.001), where the bulk of ali genetic variation (81.66%) is distributed among the populations. Pairwise comparisons of gene flow show that populations of RF Adolpho Ducke, UFAM Rebio Uatumã and showed high values in the effective number of female migrants per generation (Nemf), which indicates that there is gene flow. The NCPA analysis defined six hierarchicallevels corresponding to c1ades, 1-7, 2-2, 2-7, 3-1, 3-2 and 4-1, where there is a rejection of the null hypothesis of no association between geographic distance and genetic divergence, most often indicating restricted gene flow. The value of K greater significance (K = 4) explains the formation of groups with the following configuration: group 1) UFAM, Adolfo Ducke Forest Reserve and Rebio Uatumã, group 2) Barcelos, PARNA Viruá and TNF Amapá, group 3 ) Altamira, group 4) Cruzeiro do Sul, Santa Isabel do Rio Negro, Tabatinga and Atalaia do Norte. On Bayesian analysis of population structure found that the best value of posterior probability for the formation of groups is a number equal to five. Four localities with high levels of genetic variability for mtDNA: RF Adolpho Ducke, Rebio Uatumã, UFAM and Acre. The segments of the 16S and Control Region (central part) were slightly conserved, which affect the number of segregating sites and reduced numbers of haplotypes found in populations of P. bicolor. By means of genetic distances, we find that there is a greater differentiation between pairs of localities in the Central Amazon, the Guyana Shield and the Brazilian Shield in relation to the western Amazonian localities. Therefore, our results indicate that possibly the populations of P. bicolor show a pattern of differentiation mediated by isolation by distance in view of the large geographic distances between locations found. However, additional sampling should be undertaken to provide more precise information on this pattern of differentiation. / epidérmica é rica em substância bioativas. Esta espécie, conhecida popularmente como kambô pelos índios do grupo linguistico pano, é usada em rituais de cura e na preparação para a caça. É uma espécie de ampla distribuição na Amazônia que carece de estudos que visem a sua história evolutiva bem como estrutura populacional. Neste estudo empregamos o uso do DNAmt como ferramenta molecular para estudar 117 indivíduos de P. bico/ar de onze diferentes localidades em 5 estados na Amazônia brasileira. O banco de dados para as análises populacionais foi composto de 117 sequéncias nucleotídicas, cada uma com um total de 1037 pares de bases (pb) que resultaram em um banco de dados concatenados para o DNAmt (sendo um fragmento de 16S de 520 pb e um fragmento da Região Controle de 517 pb). As sequências foram alinhadas e editadas no programa BIOEDIT. A partir destas, foi gerada uma matriz de dados que foi usada nas análises estatísticas populacionais implementadas no programa ARLEQUIN. As análises de SAMOVA e BAPS foram usadas para determinar os agrupamentos de populações a posteriore. A rede de haplótipos, os dados gerados pelo programa GEODIS e a interpretação da chave de Templeton foram gerados com o uso do programa ANECA. Verificou-se a existência de 31 haplótipos para o DNAmt, sendo que 21 são únicos dentro da amostragem. A diversidade gênica (h) total foi estimada em 0,884, sendo que este valor é elevado quando comparado aos valores das localidades amostradas. O teste de AMaVA revelou que há uma forte estruturação genética, a qual é apoiada significativamente pelo índice de fixação (<1>ST = 0.8166; P < 0,001), onde a maior parte de toda a variação genética (81,66%) está distribuída entre as populações. As comparações par a par do fluxo gênico mostram que as populações da R.F. Adolpho Ducke, UFAM e Rebio Uatumã apresentaram altos valores no número efetivo de fêmeas migrantes por geração (Nemf) , o que indica que existe fluxo gênico. As análises de NCPA definiram seis níveis hierárquicos correspondentes aos clados, 1-7, 2-2, 2-7, 3-1, 3-2 e 4-1, nos quais há a rejeição da hipótese nula da não associação entre distância geográfica e divergência genética, na maioria das vezes indicando fluxo gênico restrito. O valor de K com maior significância (K=4) explica a formação dos grupos com a seguinte configuração: grupo 1) UFAM, Reserva Florestal Adolfo Ducke e Rebio Uatumã; grupo 2) Barcelos, PARNA do Viruá e FLONA do Amapá; grupo 3) Altamira; grupo 4) Cruzeiro do Sul, Santa Isabel do Rio Negro, Tabatinga e Atalaia do Norte. Na análise bayesiana de estrutura de população verificamos que o melhor valor da probabilidade posterior para a formação de grupos corresponde a um número igual a cinco. Quatro localidades apresentaram altos níveis de variabilidade genética para o DNAmt: R.F. Adolpho Ducke, Rebio Uatumã, UFAM e Acre. Os segmentos do gene 16S e da Região Controle (parte central) mostraram-se ligeiramente conservados, o que influenciou na quantidade reduzida de sítios polimórficos e números de haplótipos encontrados nas populações de P. bico/ar. Por meio das distâncias genéticas, verificamos que há uma maior diferenciação entre pares de localidades da Amazônia Central, Escudo das Guianas e Escudo Brasileiro em relação às localidades do Oeste Amazônico. Portanto, nossos resultados indicam que possivelmente as populações de P. bico/ar apresentam um padrão de diferenciação mediado por isolamento por distância tendo em vista as grandes distâncias geográficas encontradas entre as localidades. Entretanto, coletas adicionais deverão ser realizadas para fornecer informações mais precisas sobre este padrão de diferenciação.

A diversidade da seqüência do DNA de oito populações de Octopus cf. vulgaris da costa brasileira e de uma população de Octopus vulgaris proveniente de Portugal foi investigada pelo uso do gene Citocromo oxidase subunidade I (COI) do DNA mitocondrial. Aproximadamente 600 pb do gene COImt foram amplificados por meio dos primers LCO1490 e HCO2198, purificados e seqüenciados. As seqüências foram alinhadas pelo método Clustal W. A árvore filogenética gerada pelo alinhamento das seqüências do COImt revelou dois conjuntos principais, formando clados monofiléticos sustentados por bootstraps superiores a 93%. Um clado contendo os indivíduos provenientes das regiões Sudeste e Sul, similares aos haplótipos de Portugal, que são classificados como Octopus vulgaris, e outro conjunto formado pelos indivíduos coletados em várias localidades das regiões Norte e Nordeste. O nível de diferenciação genética encontrado sugere a presença de duas espécies de Octopus. Quanto à estruturação populacional, os resultados encontrados pelo uso do DNA nuclear e do DNA mitocondrial indicam que as populações estão estruturadas geneticamente. / The diversity of the sequence of the DNA of eight vulgaris populations of Octopus cf. vulgaris of the Brazilian coast and a population of Octopus vulgaris proceeding from Portugal was investigated by the use of the mitochondrial Cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene. Approximately 600 bp of the mitochondrial COI gene were amplified by means of primers LCO1490 and HCO2198, purified and sequenced. The sequences were lined up by the ClustalW method. The phylogenetic tree generated by the alignment of the sequences of the COI revealed two main sets, forming monophyletic supported by bootstraps 93%. A clade containing the individuals proceeding from the Southeastern and South regions similar to the haplotypes of Portugal, which are classified as Octopus vulgaris, and another set formed by the individuals collected in several places of the North and Northeast regions. The level of the found genetic differentiation suggests the presence of two species of Octopus. As far as the population structure is concerned, the results found by the use of the nuclear DNA and the mitochondrial DNA indicates that the populations are genetically structured.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2012-09-21T18:18:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnalisesMolecularesRegiao.pdf: 1463887 bytes, checksum: ca32f1226f6858f28c34cb8da6ba8fc2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-09-28T15:14:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnalisesMolecularesRegiao.pdf: 1463887 bytes, checksum: ca32f1226f6858f28c34cb8da6ba8fc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T15:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnalisesMolecularesRegiao.pdf: 1463887 bytes, checksum: ca32f1226f6858f28c34cb8da6ba8fc2 (MD5) Previous issue date: 2012 / O câncer do sistema nervoso central representa 2% de todas as neoplasias malignas na população mundial e 23% dos casos de câncer infantil. No Brasil, estimam-se 4.820 casos deste câncer em homens e 4.450 em mulheres para o ano de 2012. Os gliomas são tumores do sistema nervoso central formados a partir de células da glia e somam mais de 70% do tumores cerebrais. A propriedade mais importante dos gliomas é sua capacidade de evasão imunológica. Idade, etnia, gênero e ocupação podem ser considerados fatores de risco para o surgimento de gliomas, e são duas vezes mais frequentes em afro-americanos. O astrocitoma é o tumor glial mais frequente, constituindo cerca de 75% dos casos de gliomas. Estes tumores são classificados em quatro graus, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. O DNA mitocondrial está relacionado com o desenvolvimento e a progressão de vários tipos de tumores. A mitocôndria é responsável pelo balanço energético celular e está envolvida no disparo da apoptose em resposta ao estresse oxidativo. Mutações na D-LOOP podem alterar a taxa de replicação do DNA e aumentar o risco do desenvolvimento do câncer. Neste estudo foram analisadas 29 amostras de astrocitoma classificados de acordo com a OMS. Nossos dados sugerem que os astrocitomas de baixo grau podem estar relacionados à herança genética, tornando portadores de alguns polimorfismos ou mutações específicas, mais suscetíveis ao risco de desenvolver a doença, e os de alto grau podem estar relacionados à exposição prolongada aos agentes carginógenos. Foram identificados polimorfismos e mutações onde alguns apresentaram relação com o risco do desenvolvimento de astrocitomas e com a progressão da doença. A inserção de dois ou mais nucleotídeos nas regiões de microssatélites pode causar sua instabilidade e contribuir com o surgimento do câncer. A deleção no sítio 16132 pode ser um marcador para astrocitoma de alto grau, assim como a inserção de duas ou mais citosinas no sítio 16190 pode ser um marcador específico para astrocitomas. As mutações heteroplásmicas podem ser determinantes para o surgimento e/ou progressão de astrocitomas de alto grau. / The central nervous system cancer represents 2% of all malignancies in the world population and 23% of cases of childhood cancer. In Brazil, an estimated 4,820 cases of cancer in men and women in 4450 to the year 2012. Gliomas are tumors of the central nervous system formed from glial cells, making up over 70% of brain tumors. The most important property of gliomas is the ability of immune evasion. Age, ethnicity, gender and occupation may be considered risk factors for the development of gliomas, and are twice as common in African-Americans. The astrocytoma is the most common glial tumor, constituting about 75% of cases of gliomas. These tumors are classified into four levels according to the World Health Organization. Mitochondrial DNA is related to the development and progression of various types of tumors. Mitochondrion is responsible for cellular energy balance and is involved in triggering apoptosis responding to oxidative stress. Mutations in DLOOP can change DNA replication rates and increase the developing cancer risk. We analyzed 29 samples astrocytoma classified according to the WHO. Our data suggest that low-grade astrocytomas may be related to genetic inheritance, making some patients with specific mutations or polymorphisms more susceptible to the risk of developing the disease, and high grade may be related to prolonged exposure to carcinogenics. Polymorphisms and mutations have been identified which correlate with some risk of developing astrocytomas and disease progression. The insertion of two or more nucleotides at microsatellite regions may cause instability and contribute to the cancer onset. Deletion at the site 16132 may be a high-grade astrocytoma marker, as well as insertion of two or more cytosines to the site 16190 can be an astrocytoma specific marker. Heteroplasmy may be decisive for the emergence and / or progression of high-grade astrocytomas.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2012-04-12T17:06:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AplicacaoRedesNeurais.pdf: 1147631 bytes, checksum: 0cc08fca626cf59a4b1641eb44f906fd (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos(edisangela@ufpa.br) on 2012-04-12T17:11:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AplicacaoRedesNeurais.pdf: 1147631 bytes, checksum: 0cc08fca626cf59a4b1641eb44f906fd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-12T17:11:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AplicacaoRedesNeurais.pdf: 1147631 bytes, checksum: 0cc08fca626cf59a4b1641eb44f906fd (MD5) Previous issue date: 2007 / Historicamente, o processo de formação das populações da Amazônia, assim como de todo território brasileiro, envolveu três grupos étnicos principais: o ameríndio, o europeu e o africano. Como conseqüência, estas populações possuem em geral constituição miscigenada do ponto de vista social e biológico. Desde o final do século passado, estudos do DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido desenvolvidos com o propósito de estimar a mistura interétnica presente nestas populações. Para isto, é de fundamental importância a classificação de uma determinada linhagem de mtDNA em um dos mais de 250 haplogrupos/subclados propostos na literatura. Com o objetivo de desenvolver um sistema automatizado, preciso e acurado de classificação de seqüências (linhagens) de mtDNA, o presente trabalhou lançou mão da técnica de Redes Neurais Artificiais (RNA’s) tendo como base os estudos de filogeografia. Para esta classificação, foram desenvolvidas quatro redes neurais artificiais diretas, com múltiplas camadas e algoritmo de aprendizagem de retropropagação. As entradas de cada rede equivalem às posições nucleotídicas polimórficas da região hipervariável do DNA mitocondrial, as quais retornam como saída a classificação específica de cada linhagem. Posterior ao treinamento, todas as redes apresentaram índices de acerto de 100%, demonstrando que a técnica de Rede Neural Artificial pode ser utilizada, com êxito, na classificação de padrões filogeográficos com base no DNA mitocondrial. / Historically, the process of formation of the populations of the Amazon, as well as from all Brazilian territory, involved three main ethnic groups: the Amerindian, European and African. As a result, these populations have in general admixed constitution the point of view of social and biological. Since the end of the last century, studies of mitochondrial DNA (mtDNA) has been developed for the purpose of estimating the mixture inter present in these populations. For this, it is of fundamental importance classification of a particular strain of mtDNA in one of more than 250 haplogroups/sub-clades proposed in the literature. With the goal of developing an automated system, precise and accurate classification of the sequences (strains) of mtDNA, this has worked hand of the art of Artificial Neural Networks (RNAs) on the basis of the studies of Philogeography. For this classification, four networks have been developed artificial neural direct, with multiple layers and the learning algorithm to backpropagation. The entries of each network equivalent positions at nucleotide polymorphic region's hipervariable of mitochondrial DNA, which returned as output classification specific to each lineage. Subsequent to the training, all the networks had indices of adjustment of 100%, demonstrating that the technique of Artificial Neural Network (ANN) can be used, with success, in the classification of standards Philogeography based on mitochondrial DNA.

O DNA está constantemente exposto a danos causados tanto por agentes endógenos quanto exógenos. Estes podem causar diferentes tipos de lesões incluindo modificações de bases e do açúcar, além de quebras de fitas simples ou duplas. As quebras de duplas fitas, quando comparadas às demais, constituem as mais citotóxicas e podem resultar em deleções no DNA e instabilidade genética. Deleções no DNA mitocondrial (mtDNA) causam diversas doenças e estão envolvidas no processo de envelhecimento. No núcleo, as quebras de duplas fitas no DNA podem ser reparadas por recombinação homóloga (HR), ligação de pontas não homólogas (NHEJ) e anelamento de fita simples (SSA). No entanto, em mitocôndrias de células de mamíferos, o reparo de quebras de duplas fitas ainda não foi completamente caracterizado. Experimentos in vitro usando extratos mitocondriais de células de roedores mostraram que estes são capazes de reparar essas quebras, no entanto pouco é sabido sobre quais proteínas são responsáveis por cada etapa de reparo, bem como sua implicação na manutenção da integridade do genoma mitocondrial. Sendo assim, nesse trabalho investigamos a localização e função mitocondrial das proteínas ATM, Rad51, Rad52, Ku70/86 e DNA-PKCs, que são sabidamente envolvidas em reparo de quebras de duplas fitas no núcleo. Para identificar essas proteínas em mitocôndrias de células de mamíferos, mitocôndrias foram isoladas a partir de células da linhagem HEK293T, usando centrifugação diferencial seguida por gradiente de Percoll. Para as proteínas de recombinação homóloga, ATM e Rad51, imunodetectamos isoformas semelhantes em todos os compartimentos celulares. Já para a proteína Rad52 o mesmo anticorpo imunodetectou duas bandas distintas na mitocôndria ao passo que no núcleo foram quatro. Além disso, verificamos que baixos níveis de proteína Rad52, induzidos pela expressão de shRNA (short hairping RNA) específico, resultam em diminuição do número de cópias de mtDNA bem como acúmulo de deleções no genoma mitocondrial. Para as proteínas de NHEJ, DNA-PKCs e a subunidade Ku70, identificamos isoformas semelhantes em todos os compartimentos celulares. Já para a subunidade 86 do heterodímero Ku70/86 o anticorpo detectou, somente em mitocôndrias, uma banda menor de 50 kDa, a qual difere na região N-terminal da subunidade detectada no núcleo (86 KDa). Experimentos de co-imunprecitação de proteínas mostraram que essa isoforma menor compõe o heterodímero mitocondrial juntamente com a subunidade 70 (mtKu70/50) e que esse interage com DNA ligase III mitocondrial. Nossos resultados também mostraram que a estabilidade proteica de mtKu70/50 é regulada por ATM. Tratamento das células com peróxido de hidrogênio, que induz quebras de duplas fitas, aumentou a associação do heterodímero mtKu70/50 com o mtDNA, de forma independente de aumento da concentração proteica intra-mitocondrial. Já a diminuição dos níveis proteicos de Ku, induzida através de shRNA, resultou em diminuição do número de cópias de mtDNA e acumulo de danos nesse genoma. Extratos mitocondriais de células knockdown para Ku apresentaram menor atividade de reparo NHEJ em um ensaio in vitro, sugerindo que o acúmulo de danos nestas células é provavelmente devido a deficiências na via de NHEJ. Em conjunto, nossos dados sugerem que tanto HR quanto NHEJ operam em mitocôndrias. Além disso, a via de NHEJ mitocondrial utiliza o heterodímero mitocondrial Ku70/50 o qual está envolvido na manutenção do mtDNA. Ademais, nossos resultados mostram uma grande conservação molecular e funcional entre as vias de reparo de NHEJ e HR no núcleo e na mitocôndria, o que reforça sua importância para a manutenção da estabilidade genômica mitocondrial e, provavelmente a função mitocondrial. / DNA is constantly exposed to damaging agents from both endogenous and exogenous sources. These can cause different types of DNA lesions that include base and sugar modifications and single and double strand breaks. DNA doublestrand breaks (DSBs) are among the most cytotoxic DNA lesions, which can result in deletions and genetic instability. Deletions in the mitochondrial DNA (mtDNA) cause numerous human diseases and drive normal aging. DSBs in the nuclear DNA are repaired by non-homologous DNA end joining (NHEJ), homologous recombination (HR) or Single Strand Annealing (SSA). Yet, repair of DSBs in mammalian mitochondria has not been fully characterized. Mitochondrial extracts from rodent cells are proficient in ligating DNA ends in vitro, but little is known about which proteins are responsible for each enzymatic step and its implication in mitochondrial genome maintenance. Thus, we investigated mitochondrial localization and function of DSBR (double strand break repair) proteins ATM, Rad51, Rad52, the Ku70/86 heterodimer and DNA-PKCs.To identify DSBR proteins in mammalian mitochondria, highly purified mitochondria from HEK293T cells were isolated using differential centrifugation followed by Percoll gradient. For HR proteins, we detected similar isoforms for ATM and Rad51 proteins in all cellular compartments. Two mitochondriaspecific isoforms of Rad52 were detected, while the same antibody detected four isoforms in the nucleus. In addition, lower Rad52 protein levels, induced by specific shRNA expression, result in decreased mtDNA copy number and accumulation of deleted mitochondrial genomes. For NHEJ proteins, similar isoforms of DNA-PKcs and the Ku70 subunit were detected in all cellular compartments. On the other hand, antibodies against the Ku86 subunit detected a smaller band in mitochondrial extracts (50 KDa), lacking the N-terminal region of the canonical isoform detected in the nucleus (86 KDa). The mitochondrial Ku70/50 heterodimer interacts with mitochondrial DNA ligase III, suggesting a role in DSBR. Moreover, stability of the mtKu heterodimer is regulated by ATM. Hydrogen peroxide treatment, which induces DSBs, increases mtKu70/50 association with the mtDNA and cells with reduced Ku levels, also induced by shRNA transfection, have lower mtDNA copy number and accumulate mtDNA damage. Moreover, mitochondrial extracts from Ku knockdown cells show lower NHEJ repair activity in an in vitro assay, suggesting that damage accumulation in these cells is likely due to deficiencies in NHEJ. Together, our data suggest that both HR and NHEJ operate in mitochondria. Also, mtNHEJ requires the Ku heterodimer and is involved in mtDNA maintenance. Moreover, our results indicate that there is a significant molecular and functional conservation between NHEJ and HR repair pathways in the nucleus and in mitochondria, which reinforces their importance for maintenance of mitochondrial genomic stability and, likely mitochondrial function.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos demostram que a hiperalimentação no período pós-natal causa obesidade, alterações cardiometabólicas e resistência à insulina em longo prazo. O objetivo do estudo foi investigar as consequências da hiperalimentação na lactação nos corações de camundongos filhotes e adultos ao longo do desenvolvimento. Para induzir a hiperalimentação na lactação, o tamanho da ninhada foi reduzida a 3 filhotes machos no terceiro dia, grupo hiperalimentado (GH). O grupo controle (GC) permaneceu com 9 filhotes da lactação ao desmame. Avaliamos a massa corporal, gordura epididimária e retroperitoneal, morfologia hepática e cardíaca, ultraestrutura dos cardiomiócitos, peso do PVE/CT, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, insulina plasmática e HOMA-IR. Analisamos o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução, atividade enzimática da PDH, CS e LDH no coração e glicogênio hepático. Biologia molecular, através das proteínas: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, complexos da CTE (I, II, III, IV e V), &#945;-tubulina, GP91 e VADC. Diferenças entre os grupos analisadas por Two-Way ANOVA, com significância p<0,05. O GH apresentou aumento da massa corporal, gordura epididimária, retroperitoneal e colesterol total em todas as idades; glicemia de jejum, insulina, índice de HOMA-IR e triglicerídeos aos 21 e 90 dias. Aumento do índice de Lee aos 60 e 90 dias. GH apresentou diminuição: do IR&#946; e GLUT4 aos 21 e 60 dias; aumento do IR&#946; aos 90 dias; aumento do IRS1, PTP1B, aos 21 e 90 dias e da AKT, pAMPK/AMPK e GLUT1 aos 21 dias; diminuição da pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/AKT aos 21 e 90 dias; diminuição da HKII aos 21 dias e aumento aos 60 e 90 dias; aumento da PDH aos 90 dias; aumento da LDH aos 21 dias e redução aos 60 dias; aumento da CS aos 21 dias e diminuição aos 60 e 90 dias; aumento da oxidação de carboidratos aos 21 dias e redução aos 90 dias; diminuição na oxidação de ácidos graxos aos 60 e 90 dias. Adicionalmente, aumento do desacoplamento mitocondrial entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP aos 60 e 90 dias. Diminuição da CPT1 e aumento da UCP2 aos 21 e 90 dias. Diminuição da PGC-1&#945; aos 60 e 90 dias; da FABPm e CD36 em todas idades. Aumento da 4HNE aos 21 e diminuição aos 90 dias. Diminuição na expressão do mRNA para CPT1 aos 21, 60 dias. Diminuição na expressão do mRNA para PPAR&#945; e aumento na expressão do mRNA para UCP2 aos 21 dias; diminuição na expressão do mRNA para UCP2 ao 60 dias. Alterações morfológicas cardíacas e hepáticas, assim como na ultraestrutura dos cardiomiócitos, em todas as idades, maior conteúdo de glicogênio hepático aos 21 e 90 dias. Concluímos que a hiperalimentação na lactação levou à obesidade, com aumento da oxidação de glicose, alterações no metabolismo energético associadas à diminuição da sensibilidade à insulina, redução da capacidade oxidativa mitocondrial, levando ao desacoplamento e alteração da morfologia e ultraestrutura dos cardiomiócitos do desmame até a idade adulta. / Recent studies have shown that overnutrition in the postnatal period lead obesity, cardiometabolic alterations, insulin resistance at long term. The objective of the study was to investigate the consequences of overnutrition lactation in the hearts of mice pups and adults throughout the development. To induce overnutrition during lactation, the litter size was reduced from three male pups at the third day, overnutrition group (OG). The control group (CG) remained with 9 pups per litter at lactation until weaning. We evaluated the body weight, epididymal and retroperitoneal fat, liver and cardiac morphology, ultrastructure of cardiomyocytes, left ventricle weight/ tibia length ratio, fasting glucose, triglycerides, total cholesterol, plasma insulin and HOMA-IR. The oxygen consumption of cardiac fibers was analyzed by high-resolution respirometry. We evaluated the enzymatic activity of PDH, CS and LDH and liver glycogen. Molecular biology, through: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, eletrons transport chain complex (I, II, III, IV and V), &#945;-tubulin, GP91 and VADC. Differences between groups analyzed by Two-way ANOVA, significance level p <0.05. The OG had increased body weight, epididymal and retroperitoneal fat and total cholesterol in all ages. Fasting glucose, insulin, HOMA-IR and triglyceride levels at 21 and 90 days. Increased Lee index at 60 and 90 days. OG showed a decrease: the IR&#946; and GLUT4 at 21 and 60 days; IR&#946; increased to 90 days; increased IRS1, PTP1B, at 21 and 90 days and AKT, pAMPK/ AMPK and GLUT1 to 21 days; decrease of pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/ AKT at 21 and 90 days; HKII decreased at 21 days and increased at 60 and 90 days; PDH increased to 90 days; increased LDH at 21 days and reduced to 60 days; CS increased at 21 days and decreased at 60 and 90 days; increased oxidation of carbohydrates to 21 days and reduced to 90 days; decrease in fatty acid oxidation at 60 and 90 days. Additionally, increased mitochondrial uncoupling oxidative phosphorylation and ATP synthesis at 60 and 90 days. We observed decrease in CPT1 and increased UCP2 at 21 and 90 days. Decreased PGC-1&#945; at 60 and 90 days and FABPm and CD36 in all ages. increased 4HNE at 21 and decrease at 90 days. However, we observed a decrease in the expression of mRNA for CPT1 to 21 and 60 days. Decrease in mRNA expression of PPAR&#945; and increased in mRNA expression of UCP2 at 21 days; decrease in mRNA expression of UCP2 at 60 days. Heart and liver morphological changes, as well as the ultrastructure of cardiomyocytes, in all ages, hepatic glycogen content at 21 and 90 days. We conclude that the overfeeding lactation led to obesity with increased glucose oxidation, changes in energy metabolism, associated with decreased insulin signaling, reduced mitochondrial oxidative capacity, leading to decoupling and changing the morphology and ultrastructure of cardiomyocytes from weaning to adulthood.