Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

As tartarugas marinhas são répteis existentes ao longo da costa brasileira, principalmente em áreas de alimentação e anidação. Por possuírem comportamento migratório, estudos ecológicos sobre esses animais são muito difíceis de realizar e muitas questões sobre sua biologia permanecem obscuras. A biologia molecular é uma importante ferramenta, que auxilia os pesquisadores na obtenção de informações valiosas a respeito de estrutura populacional, filogeografia e genealogia de populações naturais. Assim, este trabalho teve como objetivo analisar populações de tartarugas verdes (Chelonia mydas) que freqüentam a região de Cananéia, SP, com base na variedade haplotípica das seqüências gênicas correspondentes ao tRNA-Pro+D-loop do DNA mitocondrial. A área de estudo foi descrita como uma área de alimentação para juvenis de tartarugas verdes, Chelonia mydas, sendo caracterizada pela presença de um estoque misto, composto por animais provenientes de pelo menos seis diferentes áreas de desova analisadas durante quatro anos. A variabilidade haplotípica e nucleotídica é intermediária em relação às demais áreas de alimentação estudadas no Oceano Atlântico, sendo a amostra composta principalmente por indivíduos dos haplótipos CM-08 (63%) e CM-05 (26%). Os demais haplótipos foram relativamente raros, apresentando-se em frequências menores que 5% (CM-01, CM-06, CM-09, CM-10, CM-24, CM-32, CM-36, CM-45). Foi detectada diferença significativa entre as amostras anuais (p < 0.05) e não houve diferença entre as amostras sazonais (p >0.05). Análises indicam que Cananéia encontra-se conectada com as demais áreas de desova e alimentação estudadas no Oceano Atlântico, dependendo destas para o equilíbrio de populações saudáveis e necessitando de atenção, visto o grau atual de ameaça que sofrem. A importância da incorporação de parâmetros ecológicos que contribuam para o entendimento da dinâmica populacional da região, às análises genéticas, é imprescindível para que esses dados sejam validados e tenham utilidade e aplicação direta na proteção das tartarugas marinhas. As informações obtidas através deste trabalho foram utilizadas na elaboração de um documento que será anexado ao plano de manejo do Parque Estadual Ilha do Cardoso e contribuirão para a elaboração do plano de manejo da Área de Proteção Ambiental de Ilha Comprida, de modo que a região de Cananéia seja considerada prioritária na preservação das tartarugas verdes. / The green turtle, Chelonia mydas, is an endangered marine reptile that nests and forages along the Brazilian coast and oceanic islands, among other tropical areas. Due to the highly migratory and oceanic nature of these animals, ecological studies are many times difficult to carry out, and many questions about their biology remain. Molecular genetic analysis is a powerful tool for bridging these gaps, providing valuable information about population structure, phylogeography, and genealogy. This study analyzes mitochondrial DNA sequences (tRNA-Pro + D-loop) from green sea turtles of the Cananéia regional juvenile feeding ground over a four-year period. Significant differences were found between annual samples (p<0.05), however no significant differences were found between seasons (p>0.05). The sample was composed primarily of individuals of haplotypes CM-08 (63%) and CM-05 (26%). All other haplotypes (n = 8) were relative rare, with frequencies lower than 5%. The analysis revealed the area to be a mixed stock, composed of animals drawn from at least six different nesting areas. Because Cananéia is connected to other nesting and feeding grounds throughout the Atlantic Ocean, the health of these populations is interdependent, and threats in one area will likely impact connected sites. This connectivity underscores the importance of understanding regional population dynamics using genetic analysis, with conservation applications. These data will be included in the management plans for the Ilha do Cardoso State Park and the Environmental Protection Area of Ilha Comprida, so that Cananéia will be considered a priority area for the preservation of green sea turtles in Brazil.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Diversos estudos tÃm evidenciado que a principal funÃÃo da proteÃna desacopladora mitocondrial de plantas (pUCP) està relacionada a regulaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs). AnÃlises in silico sugerem a existÃncia de famÃlias multigÃnicas para a codificaÃÃo de pUCPs, porÃm novos estudos ainda sÃo necessÃrios para estabelecer o perfil de expressÃo gÃnica das pUCPs, assim como a quantidade de genes em cada espÃcie e suas relaÃÃes filogenÃticas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar, analisar filogeneticamente e avaliar o perfil de expressÃo da famÃlia multigÃnica da pUCP em diferentes tecidos durante o desenvolvimento da soja [Glycine max (L.) MERR.] e em condiÃÃes de estresse. Foi realizada uma anÃlise in silico no genoma da soja e de outras leguminosas disponÃveis no banco de dados WGS, revelando uma famÃlia multigÃnica codificadora da pUCP, UCP1 e 2 com nove Ãxons, UCP 3 com 2 Ãxons, e UCP 4 e 5 com apenas um Ãxon. Dentre as leguminosas analisadas a soja se destacou com o maior nÃmero de genes, 10 genes no total, sendo quatro genes GmUCP1, uma GmUCP2, uma GmUCP3, dois GmUCP4 e dois GmUCP5, alÃm da presenÃa de um splicing alternativo no gene GmUCP1b1. Primers especÃficos foram desenhados para cada membro da GmUCP a fim de analisar os perfis de expressÃo em diferentes tecidos (semente seca e embebida, flores, vagens, cotilÃdones, folhas unifolioladas e trifolioladas, raÃzes, hipocÃtilos e epicÃtilos) durante o desenvolvimento da soja. Para os ensaios em condiÃÃes de estresse foram utilizadas folhas e raÃzes de soja com treze dias apÃs a semeadura (DAS) que foram submetidas a estresse osmÃtico promovido pela aplicaÃÃo de polietileno glicol (PEG) e estresse biÃtico atravÃs de Ãcido salicÃlico (AS). O RNA total de cada amostra foi extraÃdo para a realizaÃÃo de RT-qPCR. Os valores de ct foram obtidos pelo programa realplex e analisados pelo programa GeNorm. O perfil de expressÃo gÃnica mostrou que todos os genes GmUCP foram expressos em todos os tecidos/ÃrgÃos analisados durante o desenvolvimento da soja, com exceÃÃo de alguns genes em semente seca e epicÃtilo. Os diferentes perfis de expressÃo de cada gene durante o desenvolvimento de cada tecido/ÃrgÃo sugerem que ocorra uma regulaÃÃo gÃnica espacial/temporal entre os membros da GmUCP. Os perfis de expressÃo dos genes GmUCP em soja durante as condiÃÃes de estresses foi diversificado, visto que 2 genes apresentaram expressÃo estÃvel em ambos tecidos/estresse, 7 genes apresentaram queda do perfil de expressÃo, enquanto apenas 4 genes apresentaram aumento dos nÃveis de transcritos. / Several studies have evidenced that the main function of the mitochondrial uncoupling protein in plants (pUCP) is related to reactive oxygen species (ROS) regulation. In silico analysis suggests the existence of multigenic families to pUCPs codification, however further studies are yet needed to establish the pUCPs genetic expression profile, just like the gene amount in each species and their phylogenetic relations. The current work had as objective to characterize, analyze phylogeneticly and evaluate the expression profile of the pUCP multigenic family in different tissues during the soybean development [Glycine max (L.) MERR.] and in stress conditions. It has been performed an in silico analysis on the soybean genome and on other legumes available in the database WGS, revealing a codifier multigenic family for pUCP, UCP1 and 2 with 9 exons, UCP3 with 2 exons, and UCP4 and 5 with only 1 exon. Amongst the legumes analyzed, the soybean stood out with the greater number of genes, 10 genes in total, giving four GmUCP1 genes, one GmUCP2, one GmUCP3, two GmUCP4 and two GmUCP5, along with the presence of an alternative splicing on GmUCP1b1 gene. Specific primers have been designed for each GmUCP member in order to analize the expression profiles in different tissues (dry and doused seed, flowers, pods, cotyledons, unifoliate and trifoliate leaves, roots, hypocotyl and epicotyl) during the soybean development. For the assays in stress conditions have been used soybean leaves and roots with thirteen days after sowing (DAS) which have been subjected to osmotic stress caused by the application of polyethylene glycol (PEG) and biotic stress caused by salicylic acid (SA). The total RNA from each sample has been extracted in order to perform the RT-qPCR. The ct values have been obtained through the realplex program and analyzed through the GeNorm program. The genetic expression profile has shown that all genes were expressed in every tissue/organ analyzed during the soybean development, with the exception on some genes in dry seeds and epicotyl. The different expression profiles of each gene during the development of each tissue/organ suggest that occurs a spatial/temporal gene regulation among the GmUCP members. The expression profiles of the GmUCP genes in soybean during the stress conditions have varied, once 2 genes have shown steady expression in both tissues/ stress, 7 genes have shown a drop in the expression profile, while only 4 genes have shown an increase of the transcript levels.

Grande parte da flora tropical brasileira é polinizada por abelhas, com destaque àquelas pertencentes à tribo Meliponini (abelhas sem ferrão). A espécie Tetragonisca angustula, conhecida popularmente como jataí, tem sido o alvo principal dos meliponicultores dada a sua abundância, fácil manejo, docilidade e pureza do mel. Contudo as práticas de divisão de ninho nos meliponários podem aumentar a estruturação genética e o isolamento populacional, assim como o endocruzamento. Isso causa a diminuição da heterozigose populacional e da variabilidade genética. Populações naturais desta espécie já foram estudadas, contudo a variabilidade genética de amostras de meliponários ainda não foi avaliada. O objetivo deste trabalho foi analisar a variabilidade genética de Tetragonisca angustula provenientes de nove meliponários, fazendo uma correlação dessa variabilidade com as práticas de meliponicultura. O acesso a variabilidade genética foi realizado por meio da análise de nove lócus de microssatélites e o sequenciamento parcial de dois genes mitocondriais. Um total de 430 indivíduos (um por ninho) foram amostrados em: Pedreira (PED), Amparo (AMP), ambos em São Paulo; Marechal Cândido Rondon (MCR1 e MCR2), São Miguel do Iguaçu (SMI), Santa Helena (SHE1 e SHE2), Entre Rios do Oeste (ERO) e Curitiba (CUR), todos no Paraná. Cem indivíduos (SSB e PNI) coletados na natureza foram usados como controle da variabilidade genética. Os resultados mostraram alta diferenciação genética entre as amostras do Paraná e São Paulo, mas baixa se comparadas \"intra-estado\". Para o DNA mitocondrial (DNAmt) as amostras controle se mostraram diferenciadas em relação aos meliponários. A variabilidade genética nuclear foi alta e a mitocondrial foi baixa para a maioria dos meliponários. Não houve evidências de endocruzamento nos meliponários. A alta variabilidade genética nuclear, ausência de endocruzamento e a baixa diferenciação populacional são explicadas por fluxo gênico através de machos. A moderada diversidade genética mitocondrial em PED e AMP pode ser devido a ausência de práticas de meliponicultura. Em CUR esse mesmo resultado pode ser explicado pelo transporte artificial de colônias para esse meliponário. Para o restante dos meliponários a baixa variabilidade genética mitocondrial pode ser explicada pela prática de divisão de colônias. Esses resultados são importantes para a meliponicultura, pois indicam que as práticas de divisão de ninhos não afetam a variabilidade genética nuclear. Assim os problemas inerentes a baixa variabilidade genética nuclear e a estruturação populacional como endocruzamento e produção de machos diploides são mínimos ou inexistentes. Para isso sugerimos que a implementação do meliponário deva ser feita o mais próximo da mata e o local deve ficar dentro da distribuição da espécie escolhida para garantir o fluxo gênico através de machos / Most of the Brazilian tropical flora is pollinated by bees, especially by those belonging to the tribe Meliponini (stingless bees). Tetragonisca angustula has been aim of Meliponini beekeepers, especially for its well valued honey and easy keeping and abundance. The practices of nest division in meliponaries can increase the genetic structure and population isolation as well as inbreeding, that leads to a decreasing in population heterozygosity and genetic variability. Natural populations of T. angustula have already been studied nonetheless the genetic variability of Meliponaries samples has not been assessed yet. This project aimed to measure the genetic variability of T. angustula maintained in nine meliponaries, correlated it to Meliponini beekeeping practices. The genetic variability will be assessed by nine microsatellite loci analysis and two partial mitochondrial gene sequencing (COI and CytB). A total of 430 individual (one per nest) were sampled in: Pedreira (PED), Amparo (AMP), both in São Paulo state, Marechal Cândido Rondon (MCR1 and MCR2), São Miguel do Iguaçu (SMI), Santa Helena (SHE1 and SHE2), Entre Rios do Oeste (ERO) and Curitiba (CUR), all in Paraná state. A hundred individuals (SSB and PNI) collected from nature were used for comparison. It was found high population differentiation between Paraná and São Paulo samples, but low by \"intra-state\" comparison. High mitochondrial genetic differentiation was found between control samples and meliponaries. The nuclear genetic variability was high and the mitochondrial was low for most of meliponaries. No inbreeding was detected in meliponaries. The high nuclear genetic variability, absence of inbreeding and low population differentiation can be explained by gene flow through males. The moderated mitochondrial genetic diversity in PED and AMP may be related to absence of the Meliponini beekeeping practices. CUR presented the same result that can be explained by artificial transportation of colonies to this meliponary. The low mitochondrial genetic variability detected on rest of the meliponaries may be related to colony division practices. These results are important for meliponiculture, because indicate that colony division practices do not affect the nuclear genetic variability. Thus the issues related to low nuclear genetic variability and population structure as inbreeding and diploid males production are almost absent. For this, we suggest that the meliponary implementation must be done as closest as possible of the forest and this location must be according to geographic distribution of the chosen species, in order to ensure the gene flow through males

A espécie Aedes scapularis é um dos culicídeos de grande importância médica. Está distribuída nas Américas e tem grande competência vetora para diversos arbovírus. No estado de São Paulo, há ocorrência de Ae. scapularis em vários municípios, como em Pariquera-Açu e São Paulo. O objetivo desse trabalho foi testar se há diferenciação genética - morfológica entre essas populações, podendo diagnosticar existência de espécies crípticas em Aedes scapularis. As populações estudadas foram Pariquera-Açu (PAR), Parque Ecológico do Tietê em São Paulo (PET) e Butantã (BUT). Os parâmetros utilizados foram: Morfometria geométrica da asa (forma e tamanho), estudo do gene mitocondrial COI, análise dos espaçadores internos transcritos ITS2 e análise morfológica de ovos. Com os resultados obtidos, podemos concluir que a divergência populacional é atestada por padrões geográficos de forma alar, gene mitocondrial COI e razão comprimento e largura dos ovos, mas extensões de estudos em outras áreas precisam ser feitos para poder atestar espécies crípticas em Aedes scapularis. / The species Aedes scapularis is a culicidae of medical importance. It is distributed in the Americas and has a high vector competence for many arboviruses. In state of São Paulo, have occurrence of Ae. scapularis in many cities, such as Pariquera-Acu and the city of São Paulo. The aim of this study was to determine differentiation genetic- morphology among these populations, being able to diagnose the existence of cryptic species in Aedes scapularis. The populations studied were Pariquera-Acu (PAR), the Tietê Ecological Park in Sao Paulo (PET) and Butantã (BUT). The parameters used were: wing geometric morphometry (shape and size), study of mitochondrial gene COI, analysis of internal transcribed spacers ITS2 and morphological analysis of eggs. With these results, we conclude that divergence population is attested by the geographical patterns of wing shape, and COI mitochondrial gene length and width ratio of eggs, but extensions of studies in other areas need to be made in order to attest cryptic species in Aedes scapularis.

Em sua distribuição autóctone, as abelhas Apis mellifera apresentam diversas diferenciações morfológicas, comportamentais e ecológicas, que as possibilitam habitar os mais variados ambientes, apresentando grande diversidade de subespécies adaptadas a cada região. Com a introdução das abelhas africanas Apis mellifera scutellata no Brasil, em 1956, surgiram populações polí-hibridas denominadas Africanizadas, sendo que essas abelhas se tornaram interessantes para várias atividades econômicas e essenciais para a apicultura no Brasil. Um local que se apresenta como um bom candidato para o entendimento da dinâmica populacional das abelhas Africanizadas é o Nordeste brasileiro, que, recentemente, tem apresentado grandes avanços na área da apicultura. A análise do DNA mitocondrial tem se mostrado muito útil por permitir a obtenção de polimorfismos genéticos diretamente do DNA, resultando em um rápido e preciso estudo da variabilidade existente. Evidências morfométricas também têm sido utilizadas para estimar a composição genética destas abelhas. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo avaliar a variabilidade de abelhas Africanizadas em diferentes localidades do Nordeste brasileiro. Foram coletadas 10 operárias por colônia em várias localidades dentro dos Estados do Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Paraíba e Sergipe. Foram feitas análises de DNA Mitocondrial do gene COI e análises do padrão de venação da asa através de Morfometria Tradicional e Geométrica utilizando as localidades e os climas das regiões amostradas como marcadores. Para as análises de morfometria foram utilizadas cinco abelhas por colônia epara a análise molecular, foi utilizada uma abelha por colônia. Foram obtidos fragmentos de 624 pb e identificados 11 diferentes haplótipos, correspondentes a 9 sítios variáveis. Os resultados das análises morfométricas e moleculares quando classificados por localidade corroboram entre si, indicando ausência de estruturação populacional na área amostrada. Essa falta de estruturação populacional provavelmente está relacionada ao alto fluxo gênico entre as populações, que tem como principal fator as altas taxas de enxameação durante os períodos de seca no Nordeste. Outros fatores que provavelmente também estão envolvidos são a apicultura migratória existente na região e, em menor escala, o comercio de compra e venda de rainhas e enxames. Os resultados da análise morfométrica usando como classificador o clima da região amostrada, mostra certa estruturação entre os três climas amostrados (Tropical, Litorâneo Úmido e Semiárido), sugerindo grupos relativamente adaptados a estas condições ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles. Outra explicação para tal fato pode ser a influência do ambiente na formação das características das asas. / In its native distribution, Apis mellifera exhibit various morphological, behavioral and ecological differences that allow them to inhabit various environments and show great diversity of subspecies adapted to each region. With the introduction of African bees Apis mellifera scutellata to Brazil in 1956, emerged hybrid populations called Africanized honey bees, and, overtime, these bees have become important for various economic activities and essential for beekeeping in Brazil. A good candidate for the understanding of population dynamics on Africanized bees is the Brazilian Northeast, which recently has made great advances in the field of beekeeping. The analysis of mitochondrial DNA has proved to be very useful for allowing obtaining genetic polymorphisms directly from DNA, resulting in a fast and accurate method to studies of variability. Morphometric evidence has also been used to estimate the genetic profile of these bees. In this context, this work aims to evaluate the variability of Africanized bees in different localities of Brazilian Northeast. Ten workers per colony were collected at various locations in the states of Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Sergipe and Paraiba. Mitochondrial DNA analysis of the COI gene and analysis of the venation pattern of the wing were made through Traditional and Geometric Morphometrics using as markers the localities and climates of the sampled regions. For the analyzes of morphometry were used five bees per colony and for molecular analysis one bee colony was used. Fragments of 624 bp were obtained and 11 different haplotypes were identified, corresponding to 9 variable sites. The results of morphometric and molecular analyzes by location corroborate each other, indicating the absence of population structuration in the sampled area. This is probably related to high gene flow among populations, whose main factor is probably the high rate of swarming during periods of drought in the Northeast. Other factors are probably also involved are migratory beekeeping existing in the region and, to a lesser extent, the trade of buying and selling queens and swarms. The results of morphometric analysis using classifier as the climate of the survey area, showing some structure between the three sampled climates (Tropical, Coastal Humid and Semiarid), suggesting relatively groups adapted to these environmental conditions, although there is gene flow between them. The influence of the environment in shaping the characteristics of the wings is also a possible explanation.

Estudos recentes relataram oncogenes induzindo a reprogramação metabólica no câncer. Essa reprogramação é fundamental para que as células cancerosas tenham nutrientes e biomoléculas suficiente para manter sua alta taxa proliferativa. A mitocôndria tem um papel central no metabolismo energético da célula e alterações no seu genoma, tanto em relação a mutações como em número de cópias, já foram bastante observados em vários tipos tumorais. Além disso, deficiência no fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fundamental para a transcrição e estabilidade do mtDNA, já foi associada com o crescimento tumoral. Diante disso, nosso estudo teve como objetivo avaliar o papel da instabilidade do genoma mitocondrial no metabolismo energético e crescimento do melanoma. Para isso, nós medimos a instabilidade do mtDNA utilizando como parâmetros: o acúmulo de mutações no mtDNA, alterações no mtDNAcn e a expressão do TFAM. O impacto da instabilidade do mtDNA foi avaliado em três modelos diferentes de melanoma: um modelo in vitro de linhagens celulares, dados de expressão gênica de tumores de melanoma metastático proveniente do TCGA e um modelo murino induzível de melanoma (BrafV600E/Ptennull), adicionado a um background alternativo de deficiência para o TFAM/mtDNAcn. Esse modelo murino também nos permitiu avaliar a deficiência do TFAM limitada a células tumorais (Tfamflox) e tanto em células tumorais, como no seu microambiente (Tfam+/-). Nas análises in vitro, nós observamos correlações positivas entre o mtDNAcn e a expressão do TFAM com a taxa de consumo de glicose e produção de ATP, indicando um impacto desses parâmetros na bioenergética celular. Análises de expressão gênica, utilizando tanto as linhagens de melanoma como tumores de melanoma metastático, nos sugeriram que o TFAM regula genes indutores de angiogênese, a resposta imunológica humoral e vias metabólicas de aminoácidos. Nas análises in vivo, nós observamos um aumento dos tumores em camundongos Tfam+/-, indicando que a deficiência de TFAM/mtDNAcn em células tumorais e no seu microambiente induz a tumorigênese, o que confirma os dados de expressão gênica encontrados com linhagens e tecido de melanoma. Além disso, análises de metabolômica e transcriptômica combinadas nos sugeriram que as células de melanoma com deficiência no TFAM/mtDNAcn são mais dependentes do metabolismo de glutamina. Diante disso, nós concluímos que a deficiência do TFAM/mtDNAcn tem um papel importante no crescimento do melanoma, induzindo a expressão de genes pro-tumorigênicos e aumentando o consumo da glutamina para suprir as necessidades proliferativas das células cancerosas. Esses dados são relevantes e podem nos ajudar a entender melhor o papel da mitocondrial na progressão do melanoma. / Recent studies have shown many oncogenes triggering metabolic reprogramming in cancer. The metabolic switch in cancer cells is necessary to supply the high demand for nutrients and biomolecules for proliferative cells. In this context, mitochondria play a central role in the energetic metabolism of the cell and changes in its genome, such as an increased load of mutations and alterations in mtDNA content, have been reported in several cancers. In addition, deficiency in the Mitochondrial Transcription Factor A (TFAM), responsible for transcription and maintenance of mtDNA stability, was previously associated with tumor growth. Based on that, our goal was to evaluate the impact of the mitochondrial genome instability in the energetic metabolism and melanoma growth. mtDNA instability was inferred measuring mtDNA mutations load and content, as well as TFAM expression. Its impact was evaluated in three different melanoma models: an in vitro model using melanoma cell lines, gene expression data from metastatic melanoma tumors, publicly available at TCGA, and an inducible murine model of melanoma (BRAFV600E/PTENnull), crossed onto different TFAMdeficient backgrounds. The murine model also provides us a tractable model to examine the consequences of mtDNA instability limited to cancer cells (Tfamflox) and in both cancer cells and tumor microenvironment (Tfam+/-). In vitro analysis showed us a positive correlation between mtDNA copy number (mtDNAcn) and TFAM expression with glucose consumption and ATP production, pointing an impact of these parameters in cellular bioenergetics. Further gene expression analysis, using both cell lines and metastatic melanoma data, suggested that TFAM could regulate the expression of angiogenesis genes, humoral immunity and amino acid metabolism. In vivo analysis confirmed the gene expression data, and revealed a higher melanoma growth in Tfam+/-. Also, combined metabolomics and transcriptomics data suggested that TFAM/mtDNAcn deficient melanoma cells rely mostly on glutamine metabolism to supply their energetic requirements. In conclusion, these data indicate that TFAM/mtDNAcn influences melanoma growth by triggering pro-tumorigenic signals and inducing metabolic reprogramming towards glutamine metabolism. These results are relevant and might help us understand how mitochondria affect melanoma progression.

O câncer de pele pode ser do tipo melanoma ou não melanoma, sendo comum em pessoas acima de 40 anos, de pele clara ou com doenças cutâneas prévias. A incidência do melanoma é baixa, porém, é considerado o mais agressivo e mortal devido ao seu alto poder metastático. A cirurgia ainda é a forma de tratamento mais empregada para a doença, sendo muito invasiva e, portanto, terapias coadjuvantes estão sendo empregadas a fim de melhorar a qualidade de vida dos pacientes, como o laser de baixa potência (LBP). Sabe-se que o LBP pode desencadear efeito bioestimulatório em culturas celulares crescidas sob déficit nutricional, porém em linhagens tumorais sua ação é controversa. Dessa forma, o objetivo desse estudo consiste em investigar os efeitos inibitórios do LBP no comportamento de células de melanoma murino B16F10 e humano SKMEL 37 utilizando um laser de emissão infravermelha (&lambda; = 780 nm) com diferentes densidades de energia. Foram adotados 4 grupos experimentais: G0 (grupo controle), G30 (30 J.cm-2), G90 (90 J.cm-2) e G150 (150 J.cm-2) a fim de verificar a viabilidade celular, através do ensaio de MTT e vermelho neutro; o comportamento de invasão celular, obtido através do ensaio de invasão transwell; e o papel do LBP na expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), verificado através do ensaio imunoenzimático ELISA. Os resultados mostraram que a densidade de energia de 30 J.cm-2 estimulou o comportamento de invasão da linhagem celular B16F10. Por outro lado, o LBP não exerceu influência na expressão do fator de crescimento endotelial vascular, na viabilidade celular, e na atividade mitocondrial de ambas as linhagens celulares, em nenhuma das densidades de energia utilizadas, em comparação ao controle. / Skin cancer can be melanoma or non-melanoma type, being usual in people over 40 years of age, caucasian and with previous skin diseases. Its incidence is low, however, it is considered the most aggressive and fatal due to its great capacity of metastasis. Surgery is the most commonly treatment, nonetheless is highly invasive and therefore coadjuvant therapies, such as low level light (LLL) are being employed to improve patients quality of life. It is known that LLL has a biostimulatory effect in cell cultures growing in nutritional deficit, however in tumor cell lines its effects remain controversial. Thus, the aim of this study is to evaluate the inhibitory effect of LLL on the behavior of murine and human melanoma cells using an infrared LLL (&lambda; = 780nm) delivering different energy densities. For this purpose, four experimental groups were designed: G0 (control group), G30 (30J/cm2), G90 (90J/cm2), G150 (150J/cm2) to verify cell viability by MTT and neutral red assay; the cell invasion behavior, obtained through the transwell invasion assays; and the role of LLL in the vascular endothelial growth factor expression, as verified by the enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the lowest energy density stimulated the invasion behavior of B16F10 cells. On the other hand, LLL had no influence in the vascular endothelial growth factor expression, cell viability or in the metabolic activity of both cell lines in any energy density used when compared to control group.

Mag?ster en ciencias m?dicas menci?n gen?tica

Els resultats que es recullen a la memòria tracten sobre 4 malalties humanes i la seva associació amb alteracions al DNA mitocondrial (mtDNA). Les malalties són: atròfia òptica de Leber (LHON), ambliopia alcohol-tabac (TAA), síndrome de Wolfram (WS) i lipodistròfia associada a teràpia antiretroviral (LD).S'han estudiat 31 persones amb atròfia òptica i 18 familiars de les mateixes. En els pacients s'ha detectat una proporció de mutacions al mtDNA tipus LHON primàries del 29%, a diferència d'altres estudis mundials als quals ~90% de les persones diagnosticades amb LHON tenen alguna mutació primària. Podrien existir altres mutacions (mitocondrials o nuclears) responsables de l'atròfia òptica patida per aquests afectes. També s'ha observat recuperació visual espontània en una persona amb la mutació primària 14484C; i la penetració incompleta en familiars de malalts que són homoplàsmics per a la mateixa mutació que el pacient, i no pateixen l'atròfia òptica.Quant a la TAA, vam estudiar si l'atròfia òptica en un grup de malalts estava causada pel consum d'alcohol i/o tabac elevat, per un estat nutricional deficient, o per la presència de mutacions al mtDNA. Els pacients ambliòpics es van comparar amb dos grups control: persones alcohòliques sense alteracions visuals, i persones no alcohòliques. Els pacients amb ambliopia estaven en un estat nutricional comparable al del grup control alcohòlic. El percentatge de pacients ambliòpics amb una mutació primària LHON o >1 secundària era clarament superior al mateix percentatge en els dos grups control. La predisposició genètica deguda a la presència de les mutacions mitocondrials LHON juntament amb un consum elevat d'alcohol poden ser els responsables de l'atròfia òptica patida per molts d'aquests casos ambliòpics.En 22 pacients amb la WS vam detectar 11 mutacions al gen nuclearWFS1. Una d'aquestes mutacions (425ins16, exó 4) es va identificar al 41% dels pacients i al 50% de les famílies amb mutacions a aquest gen. En 4 i 6 famílies es van identificar delecions múltiples i mutacions puntuals tipus LHON al mtDNA, respectivament. Pensem que no s'han detectat més delecions al mtDNA perquè no s'ha disposat de mostres de teixits afectats per la síndrome (pàncrees, cervell). Únicament s'han estudiat sangs, teixit no alterat en aquesta malaltia.Quant a la LD, hem estudiat individus amb LD, un grup de persones també HIV-positives sense LD, i un segon grup control format de persones no infectades pel virus. Existeixen alteracions mitocondrials a tots els pacients amb LD, les quals no s'han detectat als controls. Les alteracions mitocondrials són conseqüència de l'aplicació de teràpies antiretrovirals altament actives, però no podem establir encara si les alteracions bioquímiques i genètiques en els mitocondris dels pacients són un pas previ i necessari en el desenvolupament de la LD. / This thesis contains results about 4 different human diseases and their association to mitochondrial DNA (mtDNA) abnormalities. The diseases studied are: Leber's hereditary optic atrophy (LHON), tobacco-alcohol amblyopia (TAA), Wolfram syndrome (WS) and antiretroviral therapy-related lipodystrophy (LD).Thirty-one individuals suffering optic atrophy and 18 relatives were studied. The proportion of primary LHON mutations among patients was 29%, in contrast to previous data on European and worldwide patients which showed that almost 90% of individuals diagnosed with LHON harboured a primary LHON mutation. Some other mutations (either in the nuclear or the mitochondrial genes) must account for the optic atrophy experienced by these patients.We also studied if the optic atrophy in a group of individuals with TAA was caused by a poor nutritional status, the abuse in toxic substances, or the presence of LHON mutations in the mtDNA. We found that the percentage of patients with TAA that had one primary mutation or more than one secondary mutation was significantly higher than such a percentage in two control groups: one group of alcoholic individuals not suffering visual abnormalities, and a second group of healthy non-alcoholic individuals. The genetic predisposition (due to the presence of mtDNA mutations) together with environmental factors (i.e., the abuse of alcohol and/or tobacco) can be the cause of the optic atrophy in these alcoholic patients.Eleven mutations in the nuclear gene WFS1 were detected in 22 WS patients. One 16-base pair insertion in exon 4 was identified in 41% of patients. This mutation has not been detected in other European WS patients. Six families had point mtDNA mutations (LHON mutations), but only four had mtDNA deletions in blood samples. WS typical symptoms strongly suggest a mitochondrial disorder, and we cannot discard such a hypothesis since the only available material for the study was blood, which is not an affected tissue in this syndrome. We believe that affected areas in WS patients (brain, pancreas) probably present high proportions of deleted mtDNA.Biochemical, genetic or structural abnormalities have been found in muscle mitochondria from seven HIV-positive individuals with LD who were under highly active antiretroviral therapies. These abnormalities were not detected in other HIV-positive individuals without LD, or in non-infected individuals. It remains to be determined if the mitochondrial disturbances are needed for the development of LD or whether both phenomena are separate consequences of highly active antiretroviral therapies.