Orientador: Helio Langoni / Resumo: O gênero Mycoplasma inclui mais de 200 espécies responsáveis por causar doenças nos animais. Apresenta células de tamanho reduzido e em formatos variáveis. Ocasiona mastite em bovinos, podendo também, estar relacionado a outras manifestações como artrite e pneumonia em bezerros e novilhas. Neste estudo, objetivou-se o isolamento de espécies de micoplasmas a partir de amostras de leite de mastite clínica bovina, bem como, a detecção de Mycoplasma (M.) bovis pelas técnicas moleculares de PCR convencional e PCR em tempo real. Um total de 1166 amostras de leite de casos de mastite clínica, provenientes de nove propriedades leiteiras da região da bacia leiteira ABCW – Paraná e de uma propriedade situada na região de São Pedro – São Paulo foram avaliadas para a presença do DNA de Mollicutes. Desse total, em 100 amostras de leite que foram positivas à PCR para a classe Mollicutes, realizou-se a PCR para detecção de M. bovis obtendo-se positividade de 13% (13/100). Na análise pela PCR em tempo real obteve-se 11% (11/100) de amostras positivas para M. bovis. No cultivo microbiológico, obteve-se 6% (6/100) de crescimento ao se utilizar o meio Hayflick e, 11% (11/100) de crescimento ao se utilizar o meio SP4 (incluindo as positivas ao primeiro). A partir desses isolados em caldo PPLO, nove deles foram positivos à PCR convencional para M. bovis e dois, negativos. Na análise filogenética dos isolados, a partir dos resultados do sequenciamento, obteve-se 100% de M. bovis para todos os isol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Mycoplasma genus includes more than 200 species responsible for causing diseases in animals. It presents cells of reduced size and in variable shapes. It may cause mastitis in cattle, and may also be related to other manifestations such as arthritis and pneumonia in calves and heifers. The objective of this study was to isolate mycoplasma species from bovine clinical mastitis milk samples, as well as the detection by molecular techniques of conventional PCR and real-time PCR of M. bovis. A total of 1166 milk samples from clinical mastitis cases from nine dairy farms in the ABCW - Paraná dairy region and from a property located in the São Pedro region - São Paulo were evaluated for the presence of Mollicutes DNA. From this total, 100 milk samples that were PCR positive for the Mollicutes class, the PCR was performed to detect the M. bovis, obtaining 13% positivity (13/100). Real-time PCR analysis yielded 11% (11/100) of positive samples for M. bovis. In the microbiological culture, 6% (6/100) of growth was obtained when using the Hayflick medium and 11% (11/100) growth when using SP4 medium (including positive ones in the first one). From these isolates in PPLO broth, nine of them were positive to conventional PCR for M. bovis and two, negative. In the phylogenetic analysis of the isolates, from the results of the sequencing, 100% of M. bovis was obtained for all the isolates. In view of the results obtained, the importance of further studies for the elucidation of other s... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Sintomas típicos de infecção por fitoplasmas foram encontrados em plantas de gergelim cultivadas comercialmente. Estes sintomas se caracterizavam pela intensa proliferação de ramos, presença abundante de folhas levemente cloróticas e de tamanho menor que as normais, além de pétalas de coloração verde. A partir de plantas afetadas foi extraído o DNA total, o qual foi usado em reações de duplo PCR, visando detectar fitoplasmas nos tecidos vegetais. Fragmentos genômicos de 1,2 Kb da região do 16S rDNA foram amplificados demonstrando a constante associação entre fitoplasmas e plantas doentes. Através de duplo PCR usando primers específicos, foi identificado um fitoplasma pertencente ao grupo 16SrI em todas as amostras sintomáticas analisadas. Com base no sequenciamento desta região genômica e na digestão in sílico, as análises virtuais de RFLP revelaram que um dos fitoplasmas presentes nas amostras de gergelim era afiliado ao subgrupo 16SrI-B. No entanto, os padrões de restrição apresentados pelo outro fitoplasma mostraram que o mesmo era distinto dos demais representantes dos subgrupos que constituem o grupo 16SrI. Os valores calculados de coeficientes de similaridade e os mapas putativos de restrição confirmaram os resultados da análise de RFLP, indicando que este fitoplasma era representante de um novo subgrupo. A árvore filogenética, construída a partir das sequências nucleotídicas do 16S rDNA de diversos fitoplasmas evidenciou que este novo fitoplasma emergia de um ramo distinto, considerando as ramificações dentro do grupo 16SrI. A filodia do gergelim foi anteriormente relatada em vários países, sendo associada com fitoplasmas dos grupos 16SrI, 16SrII e 16SrVI. O presente trabalho revelou a ocorrência de dois fitoplasmas associados à filodia, sendo um deles pertencente ao subgrupo 16SrI-B e outro caracterizado como representante de um novo subgrupo, aqui denominado 16SrI-X. / Typical symptoms commonly induced by phytoplasmas were found in sesame plants grown in commercial fields. These symptoms were characterized by shoot proliferation, leaves of reduced size exhibiting light chlorosis, and green petals. Total DNA extracts were obtained from diseased plants and used as template in nested PCR, in order to detect phytoplasmas in the tissues of the hosts. Genomic fragments of 1.2 kb corresponding to the 16S rDNA region were amplified demonstrating the association of phytoplasmas and diseased plants. Using nested PCR with specific primers, a phytoplasma belonging to group 16SrI was identified in all symptomatic samples. Based on the sequencing of 16S rDNA and in silico digestion, the virtual RFLP analysis allowed identify the presence of a phytoplasma affiliated with the subgroup 16SrI-B. This analysis also revealed a second phytoplasma distinct of all representatives of the subgroups within the group 16SrI. Similarity coefficients values and analysis of putative restriction sites confirmed the results obtained from virtual RFLP analysis indicating that this phytoplasma was representative of a new subgroup. A phylogenetic tree generated by the 16S rDNA sequences belonging to diverse phytoplasmas evidenced that this new phytoplasma emerged from a distinct branch, within of the 16SrI group. The sesame phyllody was previously reported in various countries in association with phytoplasmas belonging to 16SrI, 16SrII, and 16SrVI groups. The present study revealed the association of the phyllody with a phytoplasma affiliated with 16SrI-B and a phytoplasma representative of a new subgroup here named 16SrI-X.

Made available in DSpace on 2016-04-28T14:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Nilda Zulema Albornoz Jimenez.pdf: 3921402 bytes, checksum: d5048800eafffe468986f88461f460e8 (MD5) Previous issue date: 2008-10-07 / Phytoplasmas are wall-less prokaryotes associated with diseases in numerous plant species worldwide. In nature they are transmitted by phloem-sucking insects. Since phytoplasmas cannot be cultured in vitro, molecular techniques are needed for their diagnosis and characterization. In Brazil, chayote witches broom is a disease associated with ChWBIII phytoplasma, which can reduce the quality of chayote fruits. ChWBIII has other natural plant hosts, in the family Cucurbitaceae, and bitter melon (Momordica charantia) is the major alternative host. The present work aimed at (a) determine the transmissibility of ChWBIII to periwinkle (Catharanthus roseus) through experimental methods; (b) study the symptomatology exhibited by C. roseus infected with ChWBIII phytoplasma; (c) evaluate two different strategies of plant tissue dehydration, to detect phytoplasma in naturally diseased plants of chayote, bitter melon and periwinkle; (d) study the putative presence and transmission of ChWBIII phytoplasma to seeds of M. charantia; and (e) verify phytoplasma variability in corn, passionfruit, poinsetia and C. roseus. Pathogenicity and transmissibility of ChWBIII through dodder and grafting was verified by the symptomatology developed in C. roseus, and by PCR with universal primer pairs specific to phytoplasmas 16S rDNA. Afterwards, the identity of ChWBIII in donor plants of bitter melon, in dodder and in C. roseus was confirmed by sequences analyses. Samples from diseased plants of bitter melon, periwinkle and chayote, that were submitted to desiccation with silica gel showed phytoplasmal 16S rDNA that was amplified with P1/P7 in PCR and reamplified in nested PCR with F2n/R2 yielding products of approximately 1.2 kb. Molecular assays demonstrated the presence of ChWBIII phytoplasma in seeds of symptomatic fruits of M. charantia, collected from plants with witches broom symptoms. The use of primers specific to 16SrIII group confirmed the identification of the phytoplasma associated with seeds as belonging to this group, what was further confirmed through sequencing. Sequences analyses revealed that the phytoplasma associated with bitter melon seeds is ChWBIII. The presence of phytoplasmas in symptomatic plants of corn, passionfruit, poinsetia and C. roseus was detected by PCR and nested PCR with universal primer pairs. Phytoplasmas isolated from passionfruit, poinsetia and C. roseus were classified as belonging to 16SrIII group, according to nested PCR with primers specific to this group. Analysis of the sequences of the phytoplasmas from passion fruit and C. roseus confirmed the identity of these organisms, revealing 99% homology with ChWBIII. The results determined are the following: (a) the transmissibility of ChWBIII to the experimental host C. roseus by inverse transmission through dodder, as well as by graft transmission; (b) the symptomatology exhibited by C. roseus infected with ChWBIII phytoplasma; (c) the viability of preserved tissue from chayote, bitter melon and periwinkle to detect phytoplasma, indicating the possible use of this kind of sample, for other botanical species infected with phytoplasmas; (d) the presence of phytoplasma in seeds of symptomatic fruits, from plants of bitter melon infected with ChWBIII, what suggests the putative transmission of the phytoplasma from the mother plants to the seeds; (e) the diversity of phytoplasma host plants, that was verified in corn, passionfruit, poinsetia and C. roseus. The results obtained in the present study lead to a better epidemiolgical understanding of the diseases caused by phytoplasmas, and may help to search for insect vectors and alternate plant hosts, enabling the design of effective disease management strategies. / Fitoplasmas s?o procariotos sem parede celular associados com in?meras enfermidades de esp?cies de plantas no mundo. Esses pat?genos na natureza s?o transmitidos por insetos que se alimentam do floema das plantas. Como os fitoplasmas n?o podem ser cultivados in vitro empregam-se t?cnicas moleculares para sua diganose e caracteriza??o No Brasil, o superbrotamento do chuchuzeiro ? uma doen?a associada ao fitoplasma ChWBIII, que pode causar redu??o da qualidade de frutos de chuchu. O ChWBIII tem outras esp?cies hospedeiras naturais, da fam?lia Cucurbitaceae, sendo a principal dessas, mel?o-de-S?o-Caetano (Momordica charantia). O presente trabalho teve como objetivos: (a) determinar a transmissibilidade do ChWBIII por m?todos experimentais para vinca (Catharanthus roseus); (b) estudar a sintomatologia exibida por C. roseus infectado com o fitoplasma ChWBIII; (c) avaliar duas diferentes estrat?gias de desidrata??o de tecido vegetal para a detec??o de fitoplasmas de plantas naturalmente doentes de chuchuzeiro, mel?o-de-S?o-Caetano e vinca; (d) estudar a poss?vel presen?a e a transmiss?o do fitoplasma ChWBIII ?s sementes de M. charantia; e, (e) verificar a variabilidade de fitoplasmas em milho, maracuj?, poins?tia e C. roseus. A patogenicidade e a transmissibilidade do ChWBIII, mediante Cuscuta e enxertia, foi verificada pela sintomatologia em C. roseus e por PCR usando primers universais espec?ficos para o 16S rDNA de fitoplasmas. Posteriomente, a identidade do ChWBIII em plantas doadoras de mel?o-de-S?o-Caetano, em Cuscuta e em C. roseus foi confirmada por an?lise de seq??ncias. Amostras de plantas doentes de mel?o-de-S?o-Caetano, vinca e chuchuzeiro submetidas ? desseca??o com s?lica gel, continham 16S rDNA de fitoplasma, o qual foi amplificado por PCR com primersP1/P7 e reamplificado em nested PCR com os primers F2n/R2, fornecendo produtos de aproximadamente 1.2 kb. Testes moleculares demonstraram a presen?a do fitoplasma ChWBIII em sementes de M. charantia de frutos sintom?ticos, obtidos de plantas com superbrotamento do mel?o-de-S?o- Caetano . O emprego de primers espec?ficos ao grupo 16SrIII confirmou a identifica??o do fitoplasma associado ? sementes como pertencente a esse grupo, o que foi corroborado atrav?s do seq?enciamento. A an?lise das seq??ncias revelou que o fitoplasma associado a sementes de mel?o-de-S?o-Caetano ? o ChWBIII. A presen?a de fitoplasmas em plantas sintom?ticas de milho, maracuj?, poins?tia e C. roseus foi detectada atrav?s de PCR e nested PCR com iniciadores universais. Os fitoplasmas isolados de maracuj?, poins?tia e C. roseus foram inseridos no grupo 16SrIII, de acordo com nested PCR com primers espec?ficos a esse grupo. An?lise das seq??ncias dos fitoplasmas de maracuj? e de C. roseus confrrmou a identidade dos mesmos, revelando 99% de homologia com o ChWBIII. Com a presente pesquisa determinou-se: (a) a transmissibilidade de ChWBIII mediante a transmiss?o inversa por Cuscuta para a hospedeira experimental C. roseus e, tamb?m mediante a indexa??o biol?gica; (b) a sintomatologia exibida por C. roseus infectado com o fitoplasma ChWBIII; (c) a viabilidade do uso de tecidos preservados de chuchuzeiro, mel?o-de-S?o-Caetano e vinca, para a detec??o de fitoplasmas, indicando a possibilidade de uso desse tipo de amostras para outras esp?cies bot?nicas afetadas por fitoplasmoses; (d) a presen?a de fitoplasmas nas sementes de frutos sintom?ticos provenientes de plantas de mel?o-de-S?o-Caetano infectadas com o ChWBIII, o que sugere a poss?vel transmiss?o do fitoplasma da planta m?e para as sementes; (e) a diversidade de plantas hospedeiras de fitoplasmas no Brasil, que foi verificada em milho, maracuj?, poins?tia e C. roseus. Os resultados obtidos no presente estudo possibilitam o maior entendimento epidemiol?gico das enfermidades incitadas por fitoplasmas e podem auxiliar na descoberta de insetos vetores e de plantas hospedeiras alternativas, favorecendo o estabelecimento de estrat?gias de controle dessas doen?as.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

O melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) é uma cucurbitácea que ocorre em todas as regiões geográficas brasileiras. A espécie apresenta duas \"variedades\" distintas, comumente conhecidas por \"variedade silvestre\" e \"variedade cultivada\", esta última caracterizada por plantas de maior tamanho. Plantas da \"variedade selvagem\" são hospedeiras de um fitoplasma do grupo 16SrIII-J, que causa superbrotamento de ramos, nanismo generalizado, clorose, redução no tamanho de folhas e frutos. No entanto, não há informação da \"variedade cultivada\" ser hospedeira de fitoplasmas. Assim, no presente estudo, plantas sintomáticas desta \"variedade\" foram analisadas quanto à presença de fitoplasmas em seus tecidos, visando associar este tipo de patógeno à doença. Neste mesmo trabalho, os isolados do fitoplasma encontrados nas plantas sintomáticas da \"variedade cultivada\" foram molecularmente analisados em relação ao gene secY, atualmente usado como um marcador que permite identificar variações genéticas sutis. Buscou-se, com isto, identificar possíveis variantes entre os isolados. Amplificações de fragmentos de DNA a partir dos genes 16S rRNA (1,2Kb) e secY (1,6Kb) demonstraram a associação de fitoplasma do grupo 16SrIII com as plantas sintomáticas de melão-de-São-Caetano da \"variedade cultivada\". Nestas plantas, corpúsculos pleomórficos, típicos de fitoplasmas, foram visualizados no floema dos tecidos doentes, confirmando os resultados dos testes moleculares. Análises de RFLP virtual, conduzidas com o fragmento genômico correspondente ao gene secY e diversas enzimas de restrição, permitiram identificar o referido fitoplasma como pertencente ao subgrupo 16SrIIIJ. A análise filogenética evidenciou que o fitoplasma padrão do subgrupo 16SrIII-J emergiu do mesmo ramo que o fitoplasma identificado no melão-de-São-Caetano, confirmando que ambos estão estritamente relacionados. O emprego do gene secY como marcador para diferenciação fina entre fitoplasmas não apontou variabilidade genética entre os isolados do fitoplasma detectado tanto nas plantas da \"variedade cultivada\" como naquelas pertencentes à \"variedade selvagem\". Como conclusão, a \"variedade cultivada\" de M. charantia é hospedeira do mesmo fitoplasma encontrado na \"variedade selvagem\", o qual é afiliado ao subgrupo 16SrIII-J; por sua vez, o gene seY não distinguiu geneticamente os isolados do fitoplasma pertencente ao subgrupo 16SrIII-J, presentes nas plantas de melão-de-São- Caetano. / Momordica charantia is a species of the family Cucurbitaceae that occurs in all Brazilian geographic regions. This species presents two distinct \"varieties\", commonly called \"wild variety\" and \"cultivated variety\", whose plants are bigger than those belonging to the \"wild variety\". Plants of the \"wild variety\" are hosts of a phytoplasma of the group 16SrIII-J, which is associated with shoot proliferation, stunting, chlorosis, and small leaves and fruits. However, there is no information about the occurrence of phytoplasmas in plants of the \"cultivated variety\". Thus, in the present study, symptomatic plants belonging to this \"variety\" were analysed in order to associate phytoplasmas with the disease. In addition, strains of the phytoplasma found in symptomatic plants of the \"cultivated variety\" were molecularly analyzed in relation to the gene secY, which is currently used as a marker for identification fine of genetic diversity, aiming provide elements for construction of new schemes for classification of phytoplasmas. The objective was to identify distinct strains among the strains present in plants of the wild and cultivated varieties. Amplifications of DNA fragments from the genes 16Sr rRNA (1.2Kb) and secY (1.6Kb) demonstrated the association of a phytoplasma of group 16SrIII with the symptomatic plants belonging to \"cultivated variety\". These plants revealed the presence of pleomorphic bodies, typical of phytoplasmas, which was visualized in the phloem vessel from diseased tissues, confirming the results obtained by molecular assays. Virtual RFLP analysis, performed with the genomic fragment corresponding to the gene secY and various restriction enzymes, allowed to identify this phytoplasma as a member of the subgroup 16SrIII-J. Phylogenetic analysis revealed that the phytoplasma used as reference for 16SrIII-J subgroup and the phytoplasma identified in plants of M. charantia emerged from the same branch, confirming that both phytoplasmas are closely related. The gene secY, used as marker for fine differentiation of phythoplasmas, did not show genetic variability among the strains of the phytoplasma detected both plants belonging to \"cultivated variety\" and \"wild variety\". In conclusion, plants of the \"cultivated variety\" are hosts of the same phytoplasma found in the \"wild variety, which is affiliated with the 16SrIII-J subgroup; in addition, the gene secY did not distinguish isolates of the phytoplasma belonging to 16SrIII-J subgroup, present in plants of M. charantia.

A cultura da ameixeira vem despertando a atenção de produtores brasileiros, pois oferece alta rentabilidade, possibilita a prática da agricultura familiar, emprega mão de obra, recebe incentivos de programas oficiais e conta com um mercado altamente promissor. No entanto, a cultura ainda necessita de cultivares com melhor adaptação climática, qualidade de frutos e resistência às doenças. Atualmente, dentre as doenças, o \"amarelo das fruteiras de caroço\", associada a um fitoplasma, vem causando sérios problemas. Em 2013, em pomares comercias de ameixeira (Prunus salicina), instalados em Paranapanema (SP), foram observadas plantas portadoras de sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por superbrotamento de ramos, redução no comprimento de entrenós, além de amarelecimento, deformação e redução do tamanho de folhas. Nestas plantas foi identificado um fitoplasma pertencente ao grupo 16SrI-B (Candidatus Phytoplasma asteris). Visando aumentar os conhecimentos sobre este patossistema, o objetivo desse trabalho foi estudar a dinâmica da colonização de plantas comerciais de ameixa infectadas pelo fitoplasma. Para isso, em dois pomares, amostras da parte aérea e raiz de plantas sintomáticas, pertencentes às variedades Gulfblaze e Azteca, foram coletadas mensalmente, durante um ano. O DNA total foi extraído e submetido ao PCR em tempo real para quantificar o fitoplasma nos tecidos do hospedeiro. Nessas reações foram utilizados os iniciadores universais UniRNAForward/UniRNAReverse. O fitoplasma foi detectado em todas as amostras, tanto aquelas da parte aérea quanto de raízes, em ambas as variedades estudadas. A concentração do patógeno nos tecidos do hospedeiro variou de 5,3 x 103 a 4,54 x 106 e 3,28 x 103 a 1,28 x 106 número de cópias/100ng de DNA total, na parte aérea e nas raízes, respectivamente. Os resultados mostraram uma flutuação sazonal na concentração do fitoplasma, onde as maiores concentrações foram encontradas nas épocas mais quentes do ano, principalmente no mês de dezembro, e uma redução na concentração do patógeno foi observada nas épocas mais frias, embora o fitoplasma tenha permanecido na parte aérea da planta durante a fase de dormência do hospedeiro. A variedade Gulfblaze apresentou maior concentração do patógeno comparada com a variedade Azteca. O fitoplasma associado ao amarelo da ameixeira também foi encontrado em maior concentração na copa da planta. Com base nos resultados, amostras retiradas da parte aérea e nas épocas mais quentes do ano são as mais indicadas para os procedimentos de detecção do patógeno, visando uma diagnose mais confiável. / Plum is a crop that has aroused the attention of Brazilian growers due to high profitability, family farming, incentive arrangement and promising market. However the plum culture still need of varieties with good climate adaptation, best quality fruit, and disease resistance. Currently, among the diseases, stone fruit yellows, associated with a phytoplasma have caused serious problems. In 2013, in commercial orchards of plum (Prunus salicina) located in Paranapanema (SP), plants were observed exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by witches broom and shortened internodes. Besides, the leaves were yellowish, malformed, and reduced in size. In these plants was identified a phytoplasma belonging to the group 16SrI-B (Candidatus Phytoplasma asteris). The aim of the present work was to study the dynamics of colonization of commercial plants plum by the phytoplasma, in order to better understanding of the disease. Thus, in two orchards, samples from aerial parts and roots of symptomatic plants belonging to Gulfblaze and Azteca varieties were collected monthly, during a year. Total DNA was extracted and submitted to the Real Time PCR to quantify the phytoplasma in host tissues. In these reactions the universal primers UniRNAForward/UniRNAReverse were used. The phytoplasma was detected in all samples, both aerial parts and roots of the two varieties. The concentration of the pathogen in host tissues ranged from 5,3 x 103 to 4,54 x 106 and 3,28 x 103 to 1,28 x 106 number of copies/100 ng of total DNA in aerial parts and roots, respectively. The results showed a seasonal fluctuation in the concentration of phytoplasma. The highest concentrations were found in the warmer seasons of the year, especially in December, and a reduction in pathogen concentration was observed when the weather was milder, although the phytoplasma remained in aerial part of the plant during the dormant phase of the host. The Gulfblaze variety showed a higher concentration of the pathogen compared with the Azteca variety. In addition, the phytoplasma associated with the disease was found in highest concentration in the aerial part of plant. Based on the results, samples collected from the aerial part and in the warmer seasons of the year are the most recommended for pathogen detection procedures for safe diagnosis.

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.