Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T15:47:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarcosTadeuNolascoda_D.pdf: 6274682 bytes, checksum: 8f5e7a38fc458fa958f10663a8995a6b (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A suscetibilidade das células da linhagem monocitária à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (IllV) pode resultar em deficiências de suas funções efetoras e reguladoras. Mesmo células não parasitadas podem ser afetadas pelas anormalidades de imunomodulação associadas à infecção. Estes mecanismos podem estar asssociados a algumas características da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) em pediatria, como a alta prevalência de infecções por patógenos intracelulares. A função monocitária de 33 crianças infectadas pelo HIV-I e 18 crianças expostas soro-reversoras foi avaliada por meio de um ensaio de fagocitose de monócitos para Zimosan (ZYM) e para hemácias de carneiro (EA), mediada pelos receptores CRI, CR3 e Fc, respectivamente. O ensaio para ZYM foi realizado com ZYM não-opsonizado, opsonizado com soro de indivíduos normais e de paciente. Foram determinados o índice fagocitário (porcentagem de células com fagocitose efetuada em uma lâmina) e a capacidade fagocitária (número de partículas.fagocitadas em 100 células). Simultaneamente à coleta de sangue para o ensaio de fagocitose, foram avaliados parâmetros hematológicos (hemograma completo), e imunológicos, ligados ao sistema T (subpopulações linfocitárias), ao sistema B (dosagem de imunogiobulinas), e à interação entre ambos (resposta à vacina anti-hepatite B). Os índices e capacidades fagocitários das crianças expostas ao IDV-I foram comparados a valores de um grupo de referência saudáveL Os resultados do ensaio de fagocitose mostraram uma redução da fagocitose mediada por CRI e CR3 em crianças infectadas, comparadas às soro-reversoras, e da fagocitose mediada por CRI, CR3 e Fc entre os grupos infectado e de referência. Comparadas ao grupo de referência, crianças soro-reversoras mostraram uma redução na fagocitose mediada por CRI, CR3 e Fc. No grupo de crianças infectadas, os seguintes fatores foram positivamente associados à intensidade da disfunção fagocitária: idade menor que 5 anos; início dos sintomas no I Q ano de vida; níveis mais elevados de linfócitos T CD4+ e CD8+; níveis mais elevados de carga viral sérica; níveis de IgG acima de 2.000 mg/dL. No ensaio de fagocitose mediada por CRI e CR3, a opsonização do ligante (ZYM) com soro de "pool" de indivíduos saudáveis não levou a uma atenuação da disfunção fagocitária. A detecção da disfunção fagocitária em crianças infectadas pelo mv -1 destaca a necessidade de uma compreensão mais detalhada das conseqüências imunopatogênicas, clínicas e terapêuticas da interação entre o mv e as células da linhagem monocitária na população pediátrica. As conseqüências da exposição precoce ao mv sobre a função imune das crianças soro-reversoras precisam ser melhor caracterizadas / Abstract: The uptake of human immunodeticiency virus (HIV) by the CD4 monocyte receptor may result in deticiencies of monocyte effector and regulatory functions. Even non infected cells may be affected by immunomodulatory abnormalities associated with HIV infection. These mechanisms may be associated with some clinical features of pediatric AIDS, such as the high prevalence of intracellular pathogen infections. Monocyte function was evaluated in 33 HIV -1-infected and 18 exposed seroreverter children with an assay of peripheral blood monocyte phagocytosis for Zymosan (ZYM) and sheep red blood cells (EA), mediated by the CRl,CR3 and Fc receptors, respectively. The ZYM assay was conducted with non-opsonized ZYM and opsonized ZYM with patient serum or serum ITom a normal blood donor pool. The phagocytic index (percentage of cells having phagocytosis on a slide) and the phagocytic capacity (number of phagocytized particles in 100 cells) were determined. Simultaneously with the collection of blood for the phagocytic assay, blood was collected for complete blood count, lymphocyte subsets determination (CD3+, CD4+, CD8+) and immunoglobulin levels (IgA, IgG, IgM). The response to Hepatitis B vaccine was also studied in infected children. The phagocytic indices and capacities of exposed children were compared to values ITom a healthy reference group. The results of the phagocytic assay sh~wed an impairment in CRI and CR3mediated phagocytosis between infected and seroreverter children, and in CRI, CR3 and Fcmediated phagocytosis between infected and reference groups. Compared to the reference group, seroreverter children had an impairment in CRI, CR3 and Fc-mediated phagocytosis. In the group of infected children, the factors positively associated with the severity of phagocyte disfunction were: age less than 5 year -old; begitJ11Íng of symptoms in the tirst year of life; higher levels of CD4+ and CD8+ T -lymphocytes; higher serum viral load; IgG levels higher than 2,000 mg I 100 rnL. In the assay for CRI and CR3-mediated phagocytosis, opsonization of the ligand (ZYM) with pooled serum ITom healthy adults did not improve phagocyte function. The detection of phagocyte dysfunction in HIV -l-infected children, warrants the need for a better understanding of the immunopathogenetical, clinical and therapeutical outcomes of HIV -monocyte / macrophage interactions in the pediatric population. The consequences of exposure to HIV -1 on the immune function of seroreverter children deserve more detailed studies / Doutorado / Doutor em Pediatria

Embora existam vários mecanismos propostos, o papel das moléculas de histocompatibilidade na susceptibilidade ao DM1 ainda não está totalmente esclarecido. Existem várias evidências de que o número de células apresentadoras de antígenos e a densidade de expressão das moléculas de histocompatibilidade nessas células pode influenciar o resultado da resposta imune. Assim, neste estudo, foram avaliadas as porcentagens das células CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ e CD14+, coexpressando as moléculas de histocompatibilidade de classe I e II, a densidade de expressão das moléculas de histocompatibilidade de classe I e II nessas populações linfomonocitárias e a correlação entre densidade de expressão dessas moléculas com o perfil imunogenético do DM1. Para esse fim, foram avaliados 20 pacientes com DM1, recentemente diagnosticados, metabolicamente compensados, sendo 12 do sexo masculino. Como controles, foram avaliados 20 indivíduos saudáveis, pareados com os pacientes em termos de idade, sexo e raça, procedentes da mesma região geográfica dos pacientes. A densidade de expressão das moléculas HLA nas diversas subpopulações linfomonocitárias foi avaliada por citometria de fluxo. Os marcadores imunogenéticos foram tipados utilizando-se iniciadores de oligonucleotídeos seqüência específicos. Os resultados foram analisados usando o teste não paramétrico de Mann Whitney U. Foi observado aumento da densidade de expressão das moléculas de histocompatibilidade de classe I em linfócitos T CD3+, CD4+ e CD8+ de pacientes com DM1 quando comparados aos controles. Em relação às moléculas HLA de classe II, o número e a porcentagem dos linfócitos T CD4+, coexpressando as moléculas HLA-DQ de pacientes estavam diminuídos em relação aos controles. Os resultados referentes à correlação do perfil genotípico dos pacientes revelam que pacientes portadores dos alelos HLA-DQB1*02 apresentaram diminuição no número e porcentagem das células CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ e CD14+ coexpressando as moléculas HLA-DQ, e ainda, o aumento da densidade de expressão da molécula HLA-DQ nas células CD19+, em relação aos pacientes sem esses alelos. Pacientes com o alelo HLA-DQB1*0302 apresentaram aumento do número de células CD14+ e CD19+ coexpressando as moléculas HLA-DQ, e ainda, o aumento da densidade de expressão dessas molécula nas células CD14+ em relação aos pacientes negativos para esse alelo. Além da instabilidade de ligação dos peptídeos com as moléculas de susceptibilidade ao DM1, este estudo reafirma a importância da densidade de expressão das moléculas de classe II na susceptibilidade ao DM1. / Althougth the role of MHC molecules in the susceptibility to DM1 has not been elucidated, the density of MHC molecules on cell surface may influence the outcome of the immune response. In this study, the number of CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ and CD14+ cells coexpressing MHC class I and II, and the correlation between the density of MHC molecules and the immunogenetic profile of DM1 patients were studied. A total of 20 recently diagnosed patients (12 males) and 20 control individuals matched to the patients in terms of age, sex and race were studied. MHC molecules on cell sufaces were evaluated using flow cytometry. MHC aleles were typed using sequence specific probes. Statistical analysis was performed by the non-parametric Mann Whitney-U test. Increased expression of MHC class I molecules was observed in patients T CD3+, CD4+ and CD8+ cells in relation to controls. The number and porcentage of double-positive CD4+/HLA-DQ+ cells were significantly decreased in patients. Compared to DM1 patients who were not typed as HLA-DQB1*02, DM1 patients typed as HLA-DQB1*02 exhibited decreased numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ and CD14+ cells expressing HLA-DQ molecules, whereas the density of HLA-molecules was increased in CD19+ cells. Compared to non-HLA-DQB1*0302 patients, those typed as HLA-DQB1*0302 presented increased number of CD14+ and CD19+ cells expressing HLA-DQ molecules. Besides the instability of peptide ligation with susceptibility molecules, this study stresses the relevance of the density of MHC class II molecules on the susceptibility to DM1.

A atividade física moderada regular apresenta uma série de efeitos benéficos para a fisiologia do organismo, particularmente no tocante à atividade do sistema imunológico. O exercício físico promove aumento da resistência a infecções por agentes virais e bacterianos, reduz a incidência de certos tipos de câncer, reduz enormemente os riscos de doenças cardiovasculares agudas e crônicas e melhora a qualidade de vida de uma maneira geral. Contudo, os mecanismos pelos quais o exercício físico regular melhora a performance do sistema imunológico não estão completamente elucidados. Particularmente em relação às alterações imunológicas observadas em sessões agudas de exercício moderado, pouco se sabe. Neste trabalho foi estudado o efeito de sessões agudas de exercício de natação em ratos (1 h, em água aquecida a 30ºC, com sobrepeso de 5% ligado à cauda) sobre a funcionalidade imunológica e inflamatória de macrófagos obtidos a partir de monócitos circulantes destes animais. Os resultados mostraram que o exercício induz uma intensa ativação na capacidade fagocitária (2,4 vezes maior que nos controles P = 0,0041), na produção basal de NO avaliada pelo acúmulo de NO3-, NO2- e NOx- total em macrófagos incubados por 1 h (até 95,5% de aumento P = 0,0220) e na produção de H2O2 estimulada pelo éster de forbol PMA (9,6 vezes maior que nos controles, P = 0,0022). O aumento na capacidade basal de produção parece estar associado à expressão da isoforma induzível da NO sintase (iNOS = NOS-2), já que o exercício provocou uma expressiva indução na expressão da enzima (P = 0,0319). Embora a indução da expressão da iNOS esteja relacionada à ativação da via do fator nuclear κB (NF-κB) o que, por sua vez, está normalmente associado ao estresse oxidativo, vários parâmetros sugerem que a ativação dos monócitos/macrófagos deva ter ocorrido localmente a despeito de qualquer alteração redox sistêmica, já que o exercício não levou a qualquer alteração na quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) plasmáticas ou no índice de estado redox eritrocitário, avaliado pela relação entre as concentrações intracelulares de dissulfeto de glutationa e glutationa. Também não houve alteração na expressão das proteínas de choque térmico da família das HSP70, o que sugere que o exercício não tenha provocado nenhuma sorte de estresse pronunciado sobre os macrófagos. Somados, os dados sugerem que o exercício agudo moderado possa desempenhar importante papel na ativação de certos mecanismos imunológicos e inflamatórios em monócitos/macrófagos e que algum fator neural ou humoral, que não o estresse oxidativo, possa mediar esta resposta.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-06-05T20:01:32Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado_Jamille Fernandes_versão PDF_completa (1).pdf: 1641289 bytes, checksum: 4b6203c0249095658c9990f2b42cc2af (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-07T13:42:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado_Jamille Fernandes_versão PDF_completa (1).pdf: 1641289 bytes, checksum: 4b6203c0249095658c9990f2b42cc2af (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T13:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado_Jamille Fernandes_versão PDF_completa (1).pdf: 1641289 bytes, checksum: 4b6203c0249095658c9990f2b42cc2af (MD5) / FAPESB / Estima-se que aproximadamente 334 milhões de pessoas sofrem de asma no mundo, e 5-10% dos indivíduos asmáticos tem asma grave caracterizada por uma resposta insatisfatória ao tratamento habitual. A imunopatogênese da asma está associada a um aumento da resposta do tipo 2, porém evidências também sugerem contribuições das citocinas Th1 e Th17 na gravidade da doença. Existem poucos estudos demonstrando o perfil imunológico de indivíduos com asma grave classificados de acordo com a sua resposta ao tratamento com doses elevadas de corticosteroides inalados. O objetivo deste estudo foi caracterizar os fenótipos dos linfócitos e monócitos de indivíduos com asma grave conforme sua resposta ao tratamento. Neste estudo foram avaliados 19 indivíduos com asma grave refratária ao tratamento (AGR), 21 com asma grave bem controlada/parcialmente controlada (AGC), em comparação a 23 com asma leve a moderada (ALM) e 10 controles sem asma (CSA). Os linfócitos e monócitos foram obtidos de CMSP e as frequências das diferentes moléculas foram realizadas utilizando a técnica de citometria de fluxo. A frequência de linfócitos T CD4 expressando CTLA-4 e TGF-β foi menor nos indivíduos com AGR em comparação aos indivíduos AGC e ALM. No grupo de indivíduos com AGR a frequência de células T CD4+CD25hi foi menor em relação aos indivíduos com AGC. Nos indivíduos com AGR, a frequência de células T CD4+CD25hiFoxP3+ e T CD4+IL-10+ foi menor quando comparada aos indivíduos com ALM. No entanto, a frequência das células T CD4 expressando IFN-γ e IL-17A foi maior nos grupos AGR e AGC em comparação ao grupo CSA. Quanto às subpopulações de monócitos, apesar de termos observado uma frequência maior dessas células expressando IL-10R e IL-10 nos grupos com asma grave (AGR e AGC), foi também observado que as subpopulações de monócitos de ambos os grupos expressavam mais as citocinas IL-13, IL-33 e TGF-β quando comparadas aos controles (ALM e CSA). Adicionalmente, a frequência das subpopulações de monócitos expressando os receptores IL-4Rα e IL-13Rα2 foi maior no grupo de AGR quando comparada aos grupos controles (ALM e CSA) e ao grupo AGC, respectivamente. A gravidade da asma está associada a um aumento das citocinas do perfil Th1 e Th17 pelos linfócitos e a refratariedade ao tratamento associada a uma diminuição de regulação por essas células. Entretanto, os monócitos de pacientes com AGR e AGC têm um papel importante na gravidade da doença por apresentarem perfis distintos associados com a produção de citocinas e expressão de receptores envolvidos na resposta imune Th2 e no remodelamento tecidual. / It is estimated that about 334 million people suffer from asthma in the world, and 5-10% of the asthmatic individuals have severe asthma characterized by unsatisfactory response to treatment. The immunopathogenesis of asthma is associated with increased type-2 response, but there is evidence of contributions of Th1 and Th17 cytokines to disease severity. There are few studies demonstrating the immunological profile of individuals with severe asthma categorised by their response to treatment with higher doses of inhaled corticosteroids. Thus, the objective of this study was to characterize the phenotypes of the lymphocyte and monocyte of indivduals with severe asthma classified according their response to treatment. In this study we evaluated 19 individuals with refractory severe asthma (RSA), 21 with severe asthma well controlled/partly controlled (CSA), 23 with mild to moderate asthma (MMA) and 10 controls with no asthma (CNA). Lymphocytes and monocytes were obtained from PBMC and the frequencies of the different molecules were performed using the technique of flow cytometry. The frequency of CD4+ T cells expressing CTLA-4 and TGF-β was lower in subjects with RSA in relation to individuals with CSA and MMA. In addition, in the group of individuals with RSA the frequency of CD4+CD25hi T cells was lower in individuals with CSA. We also observed that in individuals with RSA, the frequency of CD4+CD25hiFoxP3+ T and CD4+IL-10+ T cells was lower when compared to individuals with MMA. However, the frequency of CD4 T cells expressing IFN-γ and IL-17A was higher in the RSA and CSA groups in comparison to the CNA group. Concerning the monocyte subsets, although we observed a higher frequency of these cells expressing IL-10R and IL-10 in the severe asthma (RSA and CSA) groups, it was also observed that the monocyte subsets of both groups expressed more cytokines IL-13, IL-33 and TGF-β when compared to controls (MMA and CNA). In addition, the frequency of the monocyte subsets expressing the IL-4Rα and IL-13Rα2 was higher in the RSA group when compared to the control (MMA and CNA) and CSA groups, respectively. The severity of asthma is associated with an increase in Th1 and Th17 cytokines by lymphocytes and refractoriness to treatment associated with decreased regulation by these cells. However, monocytes from patients with RSA and CSA present differents profiles associated with cytokine production and expression of receptors involved in Th2 response and tissue remodeling.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-09-17T19:43:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Giovana Bergheme Franciscon.pdf: 3239549 bytes, checksum: d4cc72276fd2113b602703dc9ee6e1a0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso(pbarroso@ufba.br) on 2013-09-18T17:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Giovana Bergheme Franciscon.pdf: 3239549 bytes, checksum: d4cc72276fd2113b602703dc9ee6e1a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-18T17:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Giovana Bergheme Franciscon.pdf: 3239549 bytes, checksum: d4cc72276fd2113b602703dc9ee6e1a0 (MD5) / INCT – DT (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia – Doença Tropical) Processo Nº 573839/2008-5; CAPES. / INTRODUÇÃO: A hanseníase é uma doença de caráter granulomatoso e crônico causada pelo Mycobacterium leprae, o qual tem tropismo por nervos periféricos e pele. Apresenta-se de forma espectral e polarizada. Enquanto pacientes com a forma multibacilar (MB) da doença não montam uma resposta Th1 facilitando assim a multiplicação do Mycobacterium, indivíduos com a forma paucibacilar (PB) produzem IFN-gama em resposta a antígenos de M. leprae. Os monócitos são tipos celulares circulantes derivados da medula óssea que se diferenciam em macrófagos e células dendríticas no tecido. Recentemente, os monócitos circulantes foram classificados em clássicos (CD14++CD16-), intermediários (CD14++CD16+) e nãoclássicos (CD14+CD16++). O grau de ativação dessas células está associado à intensidade da resposta de linfócitos T. Objetivo: Determinar o grau de ativação das sub-populações de monócitos em pacientes com hanseníase antes e durante o tratamento e identificar o perfil do grau de incapacidade funcional apresentado pelos pacientes incluídos no estudo. Metodologia: Foram coletados 20 ml de sangue heparinizado de pacientes PB (n=22) e MB (n=12) e realizada a separação de células mononucleares e a caracterização e o grau de ativação dos monócitos foi determinado por citometria de fluxo através da marcação de CD14, CD16, MHC II, CD80, CD86 e CD40. Resultados: Os pacientes com a forma multibacilar apresentaram a frequência de monócitos não-clássicos aumentada. Não houve diferença na expressão de CD80 e MHC II entre monócitos de pacientes com a forma paucibacilar e multibacilar da hanseníase. No entanto, monócitos de pacientes com a forma paucibacilar apresentaram uma baixa expressão de CD86 antes de iniciar o tratamento, a qual foi restaurada durante o tratamento. A maioria dos pacientes apresentaram grau zero de incapacidade funcional. Conclusão: Pacientes com a forma paucibacilar da hanseníase apresentam uma diminuição do grau de expressão da molécula co-estimulatória CD86 a qual é restaurada durante o tratamento com a PQT. Todos os pacientes não apresentaram alteração no grau de incapacidade funcional devido à hanseníase. / Salvador

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / A tolerância ao lipopolissacarídeo (LPS) ocorre quando animais e células expostas ao LPS tornam-se hiporesponsivas a uma subseqüente dose de LPS. Acredita-se que esse mecanismo esteja envolvido na diminuição da resposta celular observada em pacientes com sepse grave e choque séptico. O objetivo do estudo foi avaliar a indução da tolerância em monócitos de voluntários sadios, em sangue total, após a exposição in vitro ao LPS, medido pela detecção de citocina intracelular e espécies reativas de oxigênio (EROs). Material e métodos: As células do sangue periférico foram condicionadas com pequenas dses de LPS por 18h e desafiadas com diferentes agonistas dos Toll-like receptors (lipopeptídeo ativador de macrófagos (MALP-2), flagelina e LPS) e bactérias gram-negativa (Pseudomonas aeruginosa) e gram-positiva (Staphylococcus aureus) mortas por calor ou condicionadas com pequenas doses de MALP-2 por 18h e desafiadas com MALP-2 ou LPS. Para detecção da interleucina-6 (IL-6) intracelular, amostras de sangue total foram estimuladas por 6h. Os monócitos foram identificados pelos parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral e positividade para CD14. As amostras foram marcadas para a verificação da produção de IL-6 intracelular nos monócitos por citometria de fluxo. Para indução de EROs, o sangue total foi estimulado por 30 minutos com LPS, P. aeruginosa, S. aureus. A produção de espécies reativas de oxigênio foi medida por citometria de fluxo pela detecção do 2’,7’ diclorofluoresceína-diacetato. Resultados: O condicionamento com doses crescentes de LPS resultou em menor detecção de IL-6 intracelular nos monócitos após desafio com LPS. Efeito similar foi observado com MALP-2, P. aerugionosa, S. aureus, mas não com a flagelina. O condicionamento com MALP-2 e desafio com MALP-2 ou LPS não resultou em menor detecção de IL- 6 intracelular nos monócitos. O condicionamento com 15ng/mL de LPS, por outro lado, resultou numa produção de EROs preservada ou aumentada nos monócitos após o desafio com LPS, P. aeruginosa, S. aureus. Conclusão: O fenômeno da tolerância envolve uma regulação complexa, na qual a produção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-6, está diminuída, enquanto a produção de EROS está preservada ou até aumentada. / Tolerance to lipopolyssacharide (LPS) occurs when animals or cells exposed to LPS become hyporesponsive to a subsequent challenge of LPS. This mechanism is believed to be involved in the down-regulation of cellular responses observed in patients with severe sepsis and septic shock. The aim of this investigation was to evaluate the induction of tolerance in monocytes of healthy volunteers, in whole blood, after LPS-exposition in vitro, assessed by intracellular cytokine detection and reactive oxygen species (ROS) generation. Material and Methods: Peripheral blood cells were conditioned with small doses of LPS for 18h and challenged with different agonists of Toll like receptors (Macrophage-activating lipopeptide-2 (MALP-2), Flagellin and LPS) and whole gram-negative (Pseudomonas aeruginosa) and gram-positive (Staphylococcus aureus) killed bacteria or conditioned with small doses of MALP-2 for 18h and challenged with MALP-2 or LPS. For detection of intracellular interleukin-6 (IL-6) samples of whole blood were stimulated for 6h. Monocytes were identified by forward scatter and side scatter parameters and CD14 positive staining. The samples were stained to verify the intracellular production of IL-6 on monocytes by flow cytometry. For induction of ROS, whole blood was stimulated for 30 minutes with LPS, P. aeruginosa and S. aureus. ROS production was measured by flow cytometry, using 2’,7’- dichlorfluorescein-diacetate detection. Results: The conditioning with increasing doses of LPS resulted in lower intracellular detection of IL-6 in monocytes after the challenge with LPS. Similar effect was observed with MALP-2, P. aeruginosa, and S. aureus, but not with Flagellin. The conditioning with MALP-2 and challenge with MALP-2 or LPS did not result in lower intracellular detection of IL-6 in monocytes. LPS conditioning with 15ng/mL of LPS, on the other hand, resulted in preserved or increased production of ROS in monocytes after challenge with LPS, P. aeruginosa and S. aureus. Conclusion: The phenomenon of tolerance involves a complex regulation, in which the production of pro-inflammatory cytokines such as IL-6 is diminished, whereas the production of ROS is preserved or even increased. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / A leptospirose constitui uma importante zoonose, encontrada em regiões de clima tropical, ocorrendo principalmente em épocas chuvosas. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento do microorganismo pelos receptores de reconhecimento de padrão de patógenos, os TLRs, presentes nas células do sistema imune inato do hospedeiro. A ativação dos TLRs é fundamental para o desencadeamento da resposta inflamatória, mediadora da resposta de proteção e de lesão no processo infeccioso. Objetivos: Avaliar a expressão dos receptores TLR2, TLR4 e CD14 na superfície de monócitos e a resposta in vitro aos estímulos LipL32 (extraído de Leptospira sp.), MALP-2 (antígeno sintético de Mycoplasma fermentans) e LPS (antígeno extraído de Salmonella abortus equi) ligantes dos TLRs, medida pela produção de citocinas, em pacientes com leptospirose. Métodos: Foram incluídos 07 pacientes com quadro clínico e laboratorial de leptospirose e 07 voluntários sadios, utilizados como controle. As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram separadas utilizando ficoll-paque, congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido. Após descongelamento, verificação da viabilidade e acerto da concentração de células para 1x106 células/mL foi mensurada a expressão de TLR2, TLR4 e CD14 na superfície de monócitos. O restante da suspensão de células foi incubada por 6 horas com os estímulos de 1000ng/mL de LipL32, 0,4U/mL de MALP-2 ou 100ng/mL de LPS. Após a primeira hora de incubação foi adicionado monensina para bloqueio da secreção de citocina. Em seguida, as CMSP foram marcadas com CD14, fixadas, permeabilizadas e expostas aos anticorpos anti-IL-6 e anti-TNF-α para detecção intracelular da produção destas citocinas inflamatórias nos monócitos. Foram adquiridos 10.000 eventos combinado-se morfologia e positividade para CD14 em citometria de fluxo. Resultados: Não foi observada diferença significativa na resposta inflamatória entre pacientes com leptospirose e voluntários sadios quando CMSP foram estimuladas in vitro com MALP-2 e LipL32 para indução da produção de citocinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α) em monócitos. Todavia, a produção de TNF-α foi menor após estímulo com LPS (p=0,035), o que não ocorreu com a produção de IL-6. Em relação à expressão de receptores de superfície, foi observado aumento da expressão de TLR2 (p=0,025) na superfície de monócitos dos pacientes, porém não houve diferença na expressão de TLR4 e CD14. Conclusões: Neste estudo demonstramos que a capacidade de reconhecimento de antígenos pelos monócitos do sangue periférico de pacientes com leptospirose está preservada ou aumentada. Além disso, observamos que a produção de citocinas inflamatórias frente a antígeno da própria Leptospira (LipL32) e outro antígeno agonista de TLR2 (MALP-2) está mantida. Entretanto, a produção de citocina inflamatória frente ao LPS (agonista de TLR4) mostrou-se complexa podendo estar influenciada pela tolerância cruzada. / The Leptospirosis is one of the world's most important zoonoses, found in regions of tropical climate, occurring mainly in rainy seasons. The control of infection depends on the proper recognition of the microorganism by receptors for recognition of patterns of pathogens, the TLRs present in the cells of the innate immune system of the host. The activation of TLRs is crucial for triggering the inflammatory response, mediator of the response of protection in case of injury and infection. Objectives: To evaluate the expression of receptors TLR2, TLR4 and CD14 on the monocytes surface in vitro and response to stimuli LipL32 (extracted from Lestospira sp.), MALP-2 (synthetic antigen of Mycoplasma fermentans) and LPS (antigen extracted from bacteria-gram negative) binders of TLRs, as measured by production of cytokines in patients with leptospirosis. Methods: 07 patients with clinical and laboratory of leptospirosis were included and 07 healthy volunteers, used as controls. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated using ficoll-paque, frozen and stored in liquid nitrogen. After thawing, checking the feasibility and wisdom of the concentration of cells to 1x106 células/mL was measured the expression of TLR2, TLR4 and CD14 on the monocytes surface. The rest of the cell suspension was incubated for 6 hours with the stimuli of 1000ng/mL of LipL32, 0.4 U / mL of MALP-2 or 100ng/mL of LPS. After the first hour of incubation was added monensin for blocking the secretion of cytokine. Then the PBMC were stained with CD14, set, permeabilizaded and exposed to anti-IL-6 and anti-TNF-α for detection of intracellular production of inflammatory cytokines in monocytes. They were acquired 10,000 events combined to morphology and positive for CD14 in flow cytometry. Results: There was no significant difference in the inflammatory response among patients with leptospirosis and healthy volunteers when PBMC were stimulated in vitro with MALP-2 and LipL32 to induce the production of inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) in monocytes. However, the production of intracellular of TNF-α was lower after stimulation with LPS (p = 0035), which did not occur to the production of IL-6. Regarding the expression of surface receptors, it was observed increased expression of TLR2 (p = 0025) on the monocytes surface of patients, but there was no difference in the expression of TLR4 and CD14. Conclusions: This study demonstrated that the ability of recognition of antigens by peripheral blood monocytes of patients with leptospirosis is preserved or increased. Also, we observed that the production of inflammatory cytokines in front of the Leptospira antigen (LipL32) and another antigen agonist of TLR2 (MALP-2) is maintained. Meanwhile, the production of inflammatory cytokine front of LPS (agonist of TLR4) proved to be complex may be influenced by cross tolerance. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:19Z : No. of bitstreams: 1 Publico-141.pdf: 1535996 bytes, checksum: af74b773a6305b7327f17191a30e524c (MD5) / Pré-exposição a pequenas doses de LPS induz resistência a uma dose letal de LPS, um fenômeno conhecido como tolerância à endotoxina. A pré-exposição ao LPS modula o padrão de resposta celular, conforme ilustrado pela expressão gênica e síntese protéica alteradas de citocinas inflamatórias. No entanto, os mecanismos envolvidos neste processo ainda são parcialmente descritos. Interessante, as células tolerantes ao LPS assemelham-se àquelas obtidas de pacientes sépticos. Métodos: Tolerância ao LPS foi induzida em células mononucleares do sangue periférico humanas pela incubação destas com 1 ng/mL de LPS durante 48 horas. Após este período, as células foram desafiadas com 100 ng/mL de LPS por 2, 6 e 24 horas. Em cada um destes momentos, foi avaliada a expressão de 84 genes relacionados à via dos receptores do tipo Toll, por PCR array. Resultados: O pré-tratamento com LPS não modulou a expressão de CD14 e TLR4 na superfície de monócitos, demonstrando que a tolerância não ocorreu devido à modulações dos receptores do LPS. Um gene foi considerado tolerizável quando o pré-tratamento com LPS reverteu o efeito causado na expressão gênica pelo desafio com LPS; enquanto um gene foi considerado não tolerizável quando o pré-tratamento com LPS não reverteu o efeito do desafio com LPS. As cascatas no NF-κB, JNK, ERK e TRIF estavam bloqueadas ou atenuadas em células tolerantes, enquanto a expressão dos genes relacionados à cascata da p38 estava aumentada. Conclusão: Esses resultados demonstram uma regulação distinta entre as cascatas da via de sinalização dos TLRs durante a tolerância. Além disso, este achado pode explicar a regulação diferenciada entre alguns mediadores inflamatórios, como por exemplo a regulação positiva de IL-10 e COX2 e regulação negativa de TNF-α e IL-12, fato este também explicado pela influência de regulações epigenéticas. A tolerância pode resultar em repressão ou indução de expressão gênica, sendo tal efeito dependente de regulação positiva ou negativa induzida pelo desafio com LPS. / Pre-exposure to low doses of LPS induces resistance to a lethal challenge, a phenomenon known as endotoxin tolerance. In this study, tolerance was induced in human PBMC by culturing cells with 1 ng/mL LPS for 48 h. Cells were subsequently challenged with 100 ng/mL LPS for 2, 6 and 24 h, and the expression of 84 genes encoding proteins involved in the TLR signaling pathway was evaluated at each time point by PCR array. LPS pretreatment did not modulate the expression of TLR4 and CD14 on the surface of monocytes. A gene was defined as tolerized when LPS pretreatment reversed the effect of LPS challenge on the expression of the gene or as non-tolerized when LPS pretreatment did not reverse the effects of LPS challenge. We observed impaired or attenuated signal transduction through the NF-κB, JNK, ERK and TRIF pathways, whereas expression of p38 pathway-related genes was preserved in LPStolerant cells. These results show a distinct regulation of the TLR pathway cascades during tolerance; this may account for the differential gene expression of some inflammatory mediators, such as up-regulation of IL-10 and COX2 as well as down-regulation of TNF-α and IL-12. Depending on the effect of LPSinduced gene up-regulation or down-regulation, tolerance, as a reversion of such LPS effects, may result in repression or induction of gene expression. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A atividade física moderada regular apresenta uma série de efeitos benéficos para a fisiologia do organismo, particularmente no tocante à atividade do sistema imunológico. O exercício físico promove aumento da resistência a infecções por agentes virais e bacterianos, reduz a incidência de certos tipos de câncer, reduz enormemente os riscos de doenças cardiovasculares agudas e crônicas e melhora a qualidade de vida de uma maneira geral. Contudo, os mecanismos pelos quais o exercício físico regular melhora a performance do sistema imunológico não estão completamente elucidados. Particularmente em relação às alterações imunológicas observadas em sessões agudas de exercício moderado, pouco se sabe. Neste trabalho foi estudado o efeito de sessões agudas de exercício de natação em ratos (1 h, em água aquecida a 30ºC, com sobrepeso de 5% ligado à cauda) sobre a funcionalidade imunológica e inflamatória de macrófagos obtidos a partir de monócitos circulantes destes animais. Os resultados mostraram que o exercício induz uma intensa ativação na capacidade fagocitária (2,4 vezes maior que nos controles P = 0,0041), na produção basal de NO avaliada pelo acúmulo de NO3-, NO2- e NOx- total em macrófagos incubados por 1 h (até 95,5% de aumento P = 0,0220) e na produção de H2O2 estimulada pelo éster de forbol PMA (9,6 vezes maior que nos controles, P = 0,0022). O aumento na capacidade basal de produção parece estar associado à expressão da isoforma induzível da NO sintase (iNOS = NOS-2), já que o exercício provocou uma expressiva indução na expressão da enzima (P = 0,0319). Embora a indução da expressão da iNOS esteja relacionada à ativação da via do fator nuclear κB (NF-κB) o que, por sua vez, está normalmente associado ao estresse oxidativo, vários parâmetros sugerem que a ativação dos monócitos/macrófagos deva ter ocorrido localmente a despeito de qualquer alteração redox sistêmica, já que o exercício não levou a qualquer alteração na quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) plasmáticas ou no índice de estado redox eritrocitário, avaliado pela relação entre as concentrações intracelulares de dissulfeto de glutationa e glutationa. Também não houve alteração na expressão das proteínas de choque térmico da família das HSP70, o que sugere que o exercício não tenha provocado nenhuma sorte de estresse pronunciado sobre os macrófagos. Somados, os dados sugerem que o exercício agudo moderado possa desempenhar importante papel na ativação de certos mecanismos imunológicos e inflamatórios em monócitos/macrófagos e que algum fator neural ou humoral, que não o estresse oxidativo, possa mediar esta resposta.

A atividade física moderada regular apresenta uma série de efeitos benéficos para a fisiologia do organismo, particularmente no tocante à atividade do sistema imunológico. O exercício físico promove aumento da resistência a infecções por agentes virais e bacterianos, reduz a incidência de certos tipos de câncer, reduz enormemente os riscos de doenças cardiovasculares agudas e crônicas e melhora a qualidade de vida de uma maneira geral. Contudo, os mecanismos pelos quais o exercício físico regular melhora a performance do sistema imunológico não estão completamente elucidados. Particularmente em relação às alterações imunológicas observadas em sessões agudas de exercício moderado, pouco se sabe. Neste trabalho foi estudado o efeito de sessões agudas de exercício de natação em ratos (1 h, em água aquecida a 30ºC, com sobrepeso de 5% ligado à cauda) sobre a funcionalidade imunológica e inflamatória de macrófagos obtidos a partir de monócitos circulantes destes animais. Os resultados mostraram que o exercício induz uma intensa ativação na capacidade fagocitária (2,4 vezes maior que nos controles P = 0,0041), na produção basal de NO avaliada pelo acúmulo de NO3-, NO2- e NOx- total em macrófagos incubados por 1 h (até 95,5% de aumento P = 0,0220) e na produção de H2O2 estimulada pelo éster de forbol PMA (9,6 vezes maior que nos controles, P = 0,0022). O aumento na capacidade basal de produção parece estar associado à expressão da isoforma induzível da NO sintase (iNOS = NOS-2), já que o exercício provocou uma expressiva indução na expressão da enzima (P = 0,0319). Embora a indução da expressão da iNOS esteja relacionada à ativação da via do fator nuclear κB (NF-κB) o que, por sua vez, está normalmente associado ao estresse oxidativo, vários parâmetros sugerem que a ativação dos monócitos/macrófagos deva ter ocorrido localmente a despeito de qualquer alteração redox sistêmica, já que o exercício não levou a qualquer alteração na quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) plasmáticas ou no índice de estado redox eritrocitário, avaliado pela relação entre as concentrações intracelulares de dissulfeto de glutationa e glutationa. Também não houve alteração na expressão das proteínas de choque térmico da família das HSP70, o que sugere que o exercício não tenha provocado nenhuma sorte de estresse pronunciado sobre os macrófagos. Somados, os dados sugerem que o exercício agudo moderado possa desempenhar importante papel na ativação de certos mecanismos imunológicos e inflamatórios em monócitos/macrófagos e que algum fator neural ou humoral, que não o estresse oxidativo, possa mediar esta resposta.