Orientador: James Venturini / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides. As principais formas clínicas da doença são aguda/subaguda e crônica (FC), sendo que nessa última, a maioria dos pacientes desenvolvem fibrose pulmonar e enfisema. Estudos prévios demonstraram que pacientes FC, na forma ativa da doença, apresentam elevada produção de mediadores inflamatórios, incluindo a IL-1β. Essa citocina, diferente das demais, é produzidas por uma plataforma protéica intracelular denominada inflamassoma que pode ser ativadas por patógenos e sinais de dano do hospedeiro. Considerando-se que os mecanismos de ativação do inflamassoma em pacientes com PCM não são conhecidos, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão de genes envolvidos na ativação do inflamassoma e a produção de citocinas por monócitos e macrófagos alveolares de pacientes com PCM em diferentes momentos do tratamento antifúngico.Nossos resultados demonstram a ativação do NLRP3-inflamassoma, caracterizada pela elevada expressão de NLRP3, CASP1 e IL1B por monócitos. Esses achados corroboram a contribuição do NLRP3-inflamassoma na patogênese da PCM também em pacientes. / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by species of the genus Paracoccidioides . The main clinical forms of the disease are acute/subacute (AF) and chronic (CF), and in the latter, most patients develop pulmonary fibrosis and emphysema. Previous studies showed that CF patients in active disease, exhibit elevated production of inflammatory mediators, including IL-1β. This cytokine, different from the others, are produced by an intracellular multiprotein platform called inflammasome that can be activated by pathogens and host signs of damage. Considering that the activation mechanisms of the inflammasome in patients with PCM are not know, this study aimed to determine the expression of genes involved in inflammasome activation and cytokine production by monocytes and alveolar macrophages from PCM patients at different times of antifungal treatment. Our results demonstrate the activation of the NLRP3 inflammasome-characterized by high expression of NLRP3, CASP1 and IL1B by monocytes. These findings corroborate the contribution of NRLP3-inflamassome in pathogenesis of PCM also in patients. / Mestre

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: Introdução: A pré-eclampsia (PE) destaca-se como uma das principais causas de morbidade e mortalidade tanto materna como fetal, se caracteriza por ativação anormal do sistema imune inato e adaptativo. No plasma de gestantes portadoras de PE encontram-se níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular, denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) como, proteína de choque térmico (Hsp70), HMGB1 (high mobility group box 1), Hialurona (HA) e Ácido Úrico, que parecem contribuir diretamente com a patogênese dessa doença. Essas DAMPs ligam-se a receptores presentes em células da imunidade inata, podendo ativar um complexo intracelular denominado inflamassoma, responsável pelo processamento e liberação de IL-1β e IL-18. Essas citocinas são potentes mediadores inflamatórios e importantes na ativação da resposta imune adaptativa, auxiliando a diferenciação de células T em Th17 e Th1, respectivamente. Na PE, a ocorrência de resposta inflamatória sistêmica parece decorrer da deficiência no controle de células T efetoras por células T reguladoras (Treg). Portanto, o balanço entre células Treg e Th17 pode ser crítico para a tolerância ao feto e para a prevenção da doença. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivos: Avaliar o estado de ativação, endógena e induzida pelas DAMPs (urato monossódico (MSU), HA e Hsp70), em monócitos, pela identificação da presença do inflamassoma e associação com a produção de citocinas; Avaliar o envolvime... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LEDICE TESE.pdf: 4130760 bytes, checksum: 417837b74b4f56201f6555cdb552d8b2 (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is caused by Leishmania protozoan that infects mononuclear phagocytic cells leading to cutaneous or mucosal lesions. The mechanisms responsible for parasite control or persistence are not completely known. Human monocytes are blood cells subdivided into three subsets (classical, nonclassical and intermediate) according to the CD14 and CD16 expression that is associated with different phenotypical and functional characteristics. The aim of this study was to evaluate the profile of monocytes in ATL. First, it was analyzed the nonclassical monocytes (CD14loCD16+) and CD56+CD16+ NK cell frequencies in peripheral blood (by using flow cytometry) of a patient with diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL) before, during and after immunochemotherapy (chemotherapy treatment together with L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis monovalent vaccines plus BCG). Then, in localized cutaneous leishmaniasis (LCL) patients (n = 32) and healthy donors, the three monocyte subsets (CD14hiCD16-, CD14hiCD16+, CD14loCD16+) were evaluated by flow cytometry; in the whole blood cultures we evaluated the expression of cytokines in CD14+ monocytes activated with lipopolysaccharide (LPS, by flow cytometry), and the secretion of proinflammatory (tumor necrosis factor, TNF) and antiinflammatory (interleukin 10, IL-10) after activation with Toll-like receptor agonists (TLR2 (Pam3Cys), TLR4 (LPS)) or L. (V.) braziliensis antigen (Ag; ELISA was used). In DCL patient it was detected an increase in non classical monocytes and NK cell frequencies probably associated to BCG stimulation, contributing to the clinical cure of several lesions caused by L. (L.) amazonensis. In LCL patients, the CD16+ monocyte subsets were increased before treatment. A similar TNF and IL-10 expression in CD14+ monocytes activated with LPS was found in patients and controls. It was not possible to identify which monocyte subpopulation was the responsible for the TNF or IL-10 production due to alterations of the percentages of each subset after LPS stimulation. Activation through TLR2, TLR4 or with Ag leads to a higher production of TNF but not IL-10 in whole blood cultures of patients than of controls. Whereas in healthy controls there was a positive correlation between TNF and IL-10 production after different stimulations (LPS, Pam3Cys and Ag), this was not observed in LCL patients, except for TLR2 stimulation. A positive correlation was detected between amount of TNF in serum or in activated-whole blood cultures and the number of cutaneous lesions. These results suggested that nonclassical monocytes can contribute to the control of infection in DCL patient, a clinical form in which patients do not present acquired cellular immune response. In this case, activation of innate cells as monocytes can cause lesion regression decreasing costs with medicines and improving the life quality of the patients. On the other hand, in LCL patients monocyte subsets and cytokine imbalance, especially with increase of nonclassical and intermediate monocytes (CD14loCD16+, CD14hiCD16+) and TNF, can contribute to leishmaniasis immunopathogenesis. To understand the role of monocyte subsets in ATL can open new avenues to the identification of biological markers of disease severity as well as new therapeutic targets to ATL treatment. / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é causada por protozoários do gênero Leishmania que infectam células do sistema fagocíticomononuclear, causando lesões na pele ou nas mucosas oral e nasofaríngea. Apesar dos vários estudos sobre a imunologia da LTA, o conhecimento ainda é insuficiente para a compreensão dos mecanismos que levam ao controle ou à persistência dos parasitos. Os monócitos são células do sangue que se subdividem em clássicos, não clássicos e intermediários, de acordo com a expressão de moléculas CD14 e CD16, apresentando diferenças fenotípicas e funcionais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a participação dos monócitos na LTA. Para tanto, foram avaliadas as alterações nas frequências dos monócitos CD14loCD16+ (não clássicos) e de células NK CD56+CD16+ (por citometria de fluxo) do sangue periférico de um paciente com leishmaniose cutâneo difusa (LCD), antes e após imunoquimioterapia (tratamento quimioterápico mais vacinas monovalentes de L. (L.) amazonensis e de L. (V.) braziliensis com BCG). Em seguida, em pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL), foram avaliadas as subpopulações de monócitos (CD14hiCD16-, CD14hiCD16+, CD14loCD16+, usando citometria de fluxo); a expressão de citocinas em monócitos CD14+ em hemoculturas ativadas com lipopolissacarídeo (LPS; usando citometria de fluxo); a produção de citocinas pro- (fator de necrose tumoral, TNF) e antiinflamatória (interleucina 10, IL-10) secretadas em hemoculturas ativadas com agonistas de receptores similares a Toll [TLR2 (Pam3Cys) e TLR4 (LPS)] ou antígenos de L. (V.) braziliensis (Ag; dosados por ELISA) e associação com dados clínicos. No paciente com LCD, houve um aumento da frequência de monócitos CD14loCD16+ e de células NK, provavelmente associado ao uso do BCG, que contribuiu para a cura clínica das lesões causadas por L. (L.) amazonensis. Nos pacientes com LCL, as subpopulações de monócitos CD16+ estavam aumentadas no sangue periférico, antes do tratamento. Foi detectada uma expressão similar das citocinas TNF e IL-10 intracelularmente nos monócitos CD14+, após cultura com LPS, de pacientes com LCL e indivíduos controles. Não foi possível avaliar quais subpopulações de monócitos estavam produzindo as citocinas, porque após ativação dos monócitos com LPS houve alterações nas porcentagens das subpopulações de monócitos. Após a ativação de hemoculturas com agonistas de TLR2 e TLR4 ou Ag, hemoculturas de pacientes com LCL produziram mais TNF e similares concentrações de IL-10 em relação às hemoculturas de indivíduos sadios. Enquanto em indivíduos sadios foi detectada uma correlação positiva entre as concentrações de TNF e IL-10 produzidas após diferentes estímulos (LPS, Pam3Cys e Ag), esta correlação não foi detectada nas hemoculturas de pacientes com LCL, exceto quando usado Pam3Cys. Houve uma correlação positiva entre as concentrações de TNF, presentes no soro e produzidos antes e após diferentes estímulos nas hemoculturas, e o número de lesões dos pacientes com LCL. Os dados sugerem que ativar os monócitos pode levar ao controle da infecção em paciente com LCD, uma forma clínica em que não há uma eficiente resposta imune celular adquirida, sendo, portanto, importante ativar células da imunidade natural que possam causar regressão das lesões, diminuindo os custos com medicamentos e melhorando a qualidade de vida do paciente. Por outro lado, na LCL, alterações nas subpopulações de monócitos e um desequilíbrio na produção de citocinas pro- e antiinflamatórias podem contribuir para a imunopatogenia da doença. Nos casos estudados houve aumento de monócitos não clássicos e intermediários (CD14loCD16+, CD14hiCD16+) e associação entre o número de lesões e a produção de TNF pelos monócitos. Uma compreensão sobre o papel das subpopulações de monócitos na LTA pode abrir novas perspectivas para a identificação de marcadores de gravidade da doença, bem como de futuros alvos terapêuticos na LTA.

A análise da expressão da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), envolvida na regulação da resposta imune, em vacinas de células dendríticas (DCs) como imunoterapia para tratamento de indivíduos HIV+, pode fornecer informações sobre o perfil dessas células e auxiliar o aperfeiçoamento das técnicas atualmente utilizadas. A avaliação da expressão de IDO, por citometria de fluxo, foi realizada em monócitos e DCs de indivíduos sadios e HIV+. A expressão do RNAm de IDO foi analisada por PCR e a capacidade das DCs em estimular linfoproliferação e apresentar antígenos de HIV a linfócitos autólogos foi avaliada por ensaio de cocultivo. DCs ativadas de indivíduos HIV+ demonstraram expressão mais elevada de IDO tanto em relação às DCs imaturas quanto em relação às DCs dos indivíduos sadios. DCs foram capazes de induzir resposta proliferativa e polifuncional de linfócitos autólogos. Nossos resultados sugerem uma expressão diferencial de IDO entre indivíduos sadios e HIV+, indicando um importante papel da enzima no controle da resposta imune e na patogênese da AIDS. / The evaluation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) levels, a regulatory enzyme, in the context of DCs vaccines as a therapeutic alternative for the HIV+ patients, can bring information about DCs profiles that can improve current techniques of vaccine production. IDO expression was evaluated by flow cytometry in monocytes and DCs from healthy subjects and HIV+ patients. Expression of IDO mRNA was performed by real-time PCR and the ability in stimulate lymphoproliferation and presenting HIV antigens to autologous lymphocytes was evaluated in coculture assays. Comparison between immature and activated DCs showed an increased IDO expression in activated DCs in patients group. DCs derived from HIV+ patients showed an increased IDO expression when compared to healthy donors. DCs were able to induce lymphofoproliferation and polyfunctional response in autologous lymphocytes. Our results suggest a differential expression of IDO between health subjects and HIV+ patients, indicating an important role of IDO in the control of the immune response and in the HIV pathogenesis.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:03:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra infecções. A erradicação de microorganismos invasores pelos neutrófilos, monócitos e macrófagos depende em grande parte da capacidade fagocítica e posterior geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), assim como produção de óxido nítrico (NO). Neste trabalho avaliouse a produção de EROs e NO em monócitos e neutrófilos do sangue periférico, em um mesmo indivíduo durante o tratamento da sepse. Casuística e métodos: Foi coletado sangue em heparina sódica de 50 pacientes sépticos nos dias zero (D0), até 48h após o evento sepse. Foi realizada uma segunda coleta em 30 destes pacientes sete dias (D7) após a primeira. A produção de EROs e de NO foi mensurada por citometria de fluxo, utilizando-se como substrato DCFH-DA e DAF-FM-DA, respectivamente. Os dados foram adquiridos e analisados no programa CellQuest. Nos ensaios foi observada a produção espontânea e após os estímulos com S. aureus e P. aeruginosa. Resultados: A produção de EROs no dia 0 em monócitos e neutrófilos foi maior nos pacientes sépticos comparado aos controles sadios nas três situações avaliadas: sem estímulo, estimulado com P.aeruginosa e S. aureus. A produção EROs em monócitos e neutrófilos no DO não apresentou correlação com idade, gênero e os escores APACHE II e SOFA. Não houve diferença na produção de EROs e NO entre pacientes com sepse grave e choque séptico. Também não houve diferença na produção de EROs entre pacientes que sobreviveram e que evoluíram para óbito no D0. Os monócitos dos pacientes apresentaram diminuição da produção de EROs no dia 7 em relação ao dia 0 em todas as situações analisadas, enquanto essa diminuição nos neutrófilos ocorreu somente na situação estimulada com S. aureus. Nas coletas de seguimento em relação ao desfecho clínico dos pacientes na alta hospitalar (mortalidade ou sobrevida), os monócitos dos pacientes que sobreviveram apresentaram diminuição da produção de EROs no dia 7 em relação ao dia 0 em todas as situações avaliadas. Nos neutrófilos essa diminuição ocorreu nas situações estimuladas com P. aeruginosa e S. aureus. A produção de NO em monócitos no dia 0 foi maior nos pacientes sépticos comparado aos controles sadios nas três situações avaliadas: sem estímulo, estimulado com P. aeruginosa e S.aureus enquanto que nos neutrófilos isso ocorreu somente na situação sem estímulo. A produção de No em monócitos e neutrófilos no DO não apresentou correlação com idade, gênero e os scores APACHE II e SOFA. Não houve diferença na produção de NO entre pacientes com sepse grave e choque séptico. Também não houve diferença na produção de NO entre pacientes que sobreviveram e que evoluíram para óbito no D0. A produção de NO nos monócitos mostrou-se aumentada no D0 comparado ao D7 na situação sem estímulo. Nos neutrófilos isso ocorreu nas condições sem estímulo e estimulado com S. aureus. Nas coletas de seguimento em relação ao desfecho clínico dos pacientes na alta hospitalar (mortalidade ou sobrevida), os monócitos e neutrófilos dos pacientes que sobreviveram apresentaram uma diminuição de NO no dia 7 em relação ao dia 0 nas situações sem estímulo e estimulado com S. aureus. Conclusão: O aumento da produção de EROs e NO no início da sepse contribui para uma resposta eficaz do hospedeiro para erradicação do patógeno do organismo, mas a persistência exacerbada desses mediadores pode ter impacto negativo na sobrevida do paciente com sepse. / The innate immune system is the first line of defense against infections. The eradication of invading microorganisms by neutrophils, monocytes and macrophages depends largely on the phagocytic ability and subsequent generation of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). This study evaluates the production of ROS and NO by monocytes and peripheral blood mononuclear cells, during the treatment of sepsis. Blood samples from 50 septic patients, in which the event of sepsis was diagnosed until 48 hours, was collected as day zero (D0) and a second sample from 30 of these patients was collected seven days (D7) after the defining event of sepsis. The production of ROS and NO was measured by flow cytometry, using DCFH-DA and DAF-FMDA as substrates, respectively. Data were acquired and analyzed using CellQuest software. Spontaneous production of ROS as well ROS generation after stimulation with S. aureus and P. aeruginosa was observed. The production of ROS by monocytes and neutrophils on D0 was higher in septic patients when compared to the healthy controls in three situations: without stimulation, stimulated with P. aeruginosa and stimulated with S. aureus. This production was not correlated with age, gender, APACHE II and SOFA scores. There were no differences in ROS and NO production among patients with severe sepsis and septic shock. Also, there were no differences in ROS production between survivors and patients who died. Comparative production of ROS on D7 in relation to D0 demonstrated a decrease in the ROS production by monocytes of septic patients, in the three conditions evaluated. When the same analysis was run to neutrophils, a decrease in ROS production was observed in D7 when cells were stimulated with S. aureus. Monocytes of patients who survived showed a decrease in ROS production on D7 compared to D0 in all situations evaluated. This decrease occurred in neutrophils stimulated with P. aeruginosa and S. aureus. NO production in monocytes on D0 was higher in septic patients compared to the healthy controls in three situations evaluated: without stimulation, stimulated with P. aeruginosa and S. aureus. A decrease in NO production in neutrophils occurred only when cells were not stimulated. NO production in monocytes and neutrophils in the DO did not correlate with age, gender, APACHE II and SOFA. There was no difference in NO production among patients with severe sepsis and septic shock. There was also no difference in NO production among patients who survived and who died on D0. The production of NO on D7 increased significantly when compared to D0 in monocytes without stimulation. In neutrophils this increase in the production occurred in the conditions without stimulation and when cells were stimulated with S. aureus. A decrease of NO production in D7 in relation to D0 by monocytes and neutrophils without stimulation and stimulated with S. aureus was observed in those patients who survived when compared to those who died. The increased production of ROS and NO in early sepsis may be contributing to an effective response of the host in an attempt to eradicate the pathogen, however the persistence of these mediators may contribute to exacerbate the negative impact on survival of patients with sepsis. / FAPESP: 2006/ 58744-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / A sepse apresenta crescente incidência e elevada morbidade e mortalidade, sendo a principal causa de óbito nas unidades de terapia intensiva. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento dos microrganismos pelas células do hospedeiro e de resposta efetora competente. Paradoxalmente, na sepse, os mecanismos de proteção estão também envolvidos no processo de doença, sendo o limite entre resposta protetora e de lesão ainda impreciso. Objetivos: Avaliar a expressão de receptores de reconhecimento de patógenos na superfície de monócitos e a resposta a estímulos exógenos - LPS, IL-1 P e TNF-α - in vitro, medida pela produção de citocinas, em pacientes em diferentes estádios da sepse. Métodos: Foram incluídos 41 pacientes, classificados de acordo com as definições do consenso de 1992 sendo, 14 com sepse, 12 com sepse grave e 15 com choque séptico. Dezessete voluntários sadios foram incluídos como controle. Através da citometria de fluxo, a expressão de TLR2, TLR4, CD14, CD11b e CD11c foi analisada na superfície dos monócitos em sangue total. A forma solúvel do receptor CD14 (sCD14) também foi mensurada em soro através de ELlSA. A produção de citocinas inflamatórias (TNF-α e IL-6) e antiinflamatória (IL-10) foi mensurada em sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico após os estímulos de LPS, IL-1 P e TNF-α in vitro. Resultados: Foi detectado aumento do sCD14 sérico e uma queda expressão de mCD14 em monócitos periféricos nos pacientes em relação aos voluntários sadios (p<0,01). Entretanto não houve diferença entre os grupos estudados quanto à expressão dos receptores TLR2, TLR4, CD11b e CD11c. O grupo com sepse apresentou, comparado com os outros grupos, aumento da produção de IL-6 e TNF-α após o estímulo de LPS. Esta regulação positiva foi menos intensa com IL-1 p e ausente com TNF-α Uma regulação negativa da produção de citocinas inflamatórias foi observada na sepse grave e choque séptico. Não foi observada diferença significante na produção de IL-10 entre os grupos, todavia uma menor produção frente ao estímulo de LPS foi detectada nos pacientes em choque séptico em relação aos pacientes em sepse (p<0,05). A correlação entre receptores de superfície de monócitos e produção das citocinas frente ao LPS pode ser demonstrada quando os resultados obtidos dos pacientes sépticos foram agrupados. Surpreendentemente, detectou-se correlação da expressão dos mesmos receptores com os outros estímulos utilizados, IL-1 p e TNF-α., também foi observada. Conclusões: Neste estudo demonstramos que a resposta inflamatória está associada com o continuum de manifestações clinicas, com uma forte resposta na fase inicial (sepse) e quadro refratário nas fases tardias (sepse grave e choque séptico). A correlação observada entre os receptores de superfície e a produção de citocinas frente aos estímulos de TNF-α e IL-1p e o mesmo padrão de resposta observado com os diferentes estímulos sugere um padrão de resposta imunológica que não depende apenas da expressão dos receptores avaliados e provavelmente, tem uma regulação na via de sinalização intracelular. / Sepsis presents increasing incidence and high morbidity and mortality and is the main cause of death in the intensive care units. The infection control depends on the adequate microorganism recognition by the host cells and competent effector’s response. Paradoxically, in sepsis, the protective mechanisms are also involved in the illness process, with the limit between protective and harmful response still inexact. Purpose: To evaluate the expression of pathogen recognition receptors on monocytes surface and the response to exogenous stimulus - LPS, IL-1β e TNF-α - in vitro, measured by the cytokine production, in patients in different sepsis stages. Methods: Forty one patients, classified in accordance with the definitions of the Consensus of the 1992, had been enrolled: 14 with sepsis, 12 with severe sepsis and 15 with septic shock. Seventeen healthy volunteers were included as control. Through flow cytometry, the expression of TLR2, TLR4, CD14, CD11b and CD11c were analyzed on monocytes surface in whole blood. The soluble form of CD14 receptor (sCD14) also was measured in serum by ELISA. Inflammatory (TNF-α and IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) cytokine levels was measured in peripheral blood mononuclear cells supernatants following LPS, IL-1β e TNF -α - stimulus in vitro. Results: An increase in sCD14 in sera and a decreased mCD14 expression on peripheral monocytes were found in patients comparing to healthy volunteers (p<0,01). However, no differences in the expression of TLR2, TLR4, CD11b and CD11c were found among the groups. The sepsis group showed, compared with the others groups, higher IL-6 and TNF-α production after LPS stimulus. This positive regulation was less intense with IL-1β and absent with TNF- α. A negative regulation of the inflammatory cytokine production was observed in severe sepsis and shock septic patients comparing to the sepsis and healthy group, independent of the stimulus. No significant difference in the IL-10 production was found among the groups, yet a lower production after LPS challenge was detected in septic shock compared with the sepsis patients (p<0,05). A correlation between monocytes surface receptors and cytokine production after LPS challenge could be demonstrated when the results of the septic groups had been grouped. Surprising, correlation of the expression of the same receptors with the other stimulus used, IL-1β e TNF-α, were also observed. Conclusions: In this study we show that the inflammatory response is associated with the continuum of clinical manifestations of sepsis, with a strong inflammatory response in the early-phase (sepsis) and refractory picture in the late-phases (severe sepsis and septic shock). The correlation between the cell surface receptors and the cytokine production after IL-1β e TNF-α stimuli and the observation of one same standard response with the different stimulus suggest a pattern of immunology response that does not depend only of the expression of the evaluated receptors and, probably, has a regulation in the intracellular signaling pathways. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Emanoel Martins Filho (emanoelfilho@ufba.br) on 2016-09-13T01:18:45Z No. of bitstreams: 1 Carlos_Humberto_Vieira.pdf: 3115604 bytes, checksum: 185acb42af9a3986d42a53be2fc6f05a (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2016-09-13T20:37:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Carlos_Humberto_Vieira.pdf: 3115604 bytes, checksum: 185acb42af9a3986d42a53be2fc6f05a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T20:37:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos_Humberto_Vieira.pdf: 3115604 bytes, checksum: 185acb42af9a3986d42a53be2fc6f05a (MD5) / O infiltrado inflamatório no microambiente tumoral, em especial nos tumores mamários, tem despertado grande interesse na oncologia, por desempenhar diferentes funções na progressão ou regressão tumoral a depender dos tipos e subtipos celulares envolvidos. O presente estudo objetivou avaliar (1) a presença e intensidade de infiltrado macrofágico no microambiente tumoral; (2) a expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 nos macrófagos; e (3) a possível relação destes parâmetros com a evolução tumoral e a sobrevida, como um possível fator prognóstico em cadelas portadoras de carcinomas mamários. Foram estudadas 22 cadelas com diagnóstico histopatológico de carcinoma em tumor misto benigno de mama (CaTMB), divididas em dois grupos, sendo G1 constituído por cadelas sem metástase (11) e G2 com metástase (11); em G1 e G2 os animais foram subclassificados de acordo com a utilização ou não do tratamento quimioterápico. As cadelas foram submetidas a análise clínico-patológica (tamanho do tumor; presença de metástase em linfonodo; estadiamento clínico; graduação histológica; distribuição e intensidade do infiltrado inflamatório; quantificação e verificação do estado de ativação de macrófagos no infiltrado por análise imunoistoquímica da expressão de SOCS1 e SOCS3), imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo com marcadores celulares CD14, MHCI e MHCII, e avaliação da taxa de sobrevida. A morfometria do infiltrado inflamatório associado ao tumor revelou, em todos os grupos, predominância da distribuição multifocal e intensidade moderada. A maior proporção de macrófagos no infiltrado inflamatório (≥400) foi associada a uma maior taxa de sobrevida. A imunomarcação revelou maiores proporções de macrófagos SOCS3 positivos nas cadelas que não apresentavam metástases para linfonodo, enquanto que os macrófagos SOCS1 positivos predominaram nas cadelas com metástase (p<0,05). Adicionalmente, a análise multivariada revelou associações entre estadiamento clínico, graduação histológica, sobrevida, tratamento quimioterápico e expressão de moléculas MHCI em monócitos circulantes. Os resultados das análises quantitativa e qualitativa dos macrófagos no infiltrado inflamatório indicam que o estado de ativação, sugerido pela maior expressão das proteínas SOCS3 e 1, define a relação do infiltrado macrofágico com a resposta imune antitumoral ou com a progressão tumoral associada ao desenvolvimento de metástases, respectivamente. / The inflammatory infiltrate in the tumor microenvironment, particularly in breast tumors, has aroused great interest in oncology due to their different roles in tumor progression or regression depending on the types and cell subsets involved. The objective of this study was to evaluate the presence and intensity of macrophage infiltrate in the tumor microenvironment; the expression of SOCS1 and SOCS3 proteins in these macrophages; and the relation of the former parameters to tumor development and survival, as possible prognostic factors of breast carcinomas evolution in female dogs. Were studied 22 female dogs with histopathological diagnosis of carcinoma in benign mixed tumor (CaTMB), divided into two groups consisting of animals without metastasis (G1=11) and animals with metastasis (G2=11); in G1 and G2, the dogs were graded according with the use or not of chemotherapy. All animals underwent clinicopathological analysis (tumor size, lymph node metastasis, clinical stage, histological grade, distribution and intensity of the inflammatory infiltrate, especially macrophages, as well as their possible activation state by immunohistochemical analysis anti-SOCS1 and anti-SOCS3) immunophenotyping by flow cytometry of PBMC for cell markers CD14, MHCI and MHCII, and assessment of survival rate. The morphology of the inflammatory infiltrate associated with tumor showed, in all groups, prevalence of multifocal distribution and moderate intensity. The higher intensity of the macrophage infiltrate (≥400) was associated with a higher survival rate. The immunostaining revealed a higher proportion of positive macrophages for SOCS3 in dogs who had no metastasis to lymph node, while the positive SOCS1 macrophages predominated in animals with metastases (p <0.05). In addition, the multivariate analysis revealed associations between clinical staging, graduation, survival, chemotherapy and expression of MHCI molecules in circulating monocytes. The results obtained in the present study indicated that the activation state, suggested by expression of SOCS3 and 1 proteins, defines the relationship of the macrophage infiltration with antitumor or immune response to tumor progression associated with the development of metastasis, respectively.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-13T18:18:32Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Angela Giudice Diniz.pdf: 1118441 bytes, checksum: a3651deda168fee418b2f5acb8f9b6a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-13T18:18:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Angela Giudice Diniz.pdf: 1118441 bytes, checksum: a3651deda168fee418b2f5acb8f9b6a9 (MD5) / NIH Grant AI30639;Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);Universal 472198/2009-2. / Introdução: Na leishmaniose cutânea (LC) e mucosa (LM) causadas por Leishmania braziliensis, a patologia está associada com a produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias. Cerca de 10% dos indivíduos residentes em Corte de Pedra- BA, uma área de transmissão de L. Braziliensis apresentam reação de hipersensibilidade tardia ao antígeno de Leishmania, não apresentam evidências de doença clínica e são considerados como tendo uma forma subclínica (SC) da doença. linfócitos desses indivíduos não produzem ou apresentam uma produção menor de IFN- e TNF- quando comparados a pacientes com LC. Até o momento não está claro porque esses indivíduos têm a capacidade de controlar a doença. Como a erradicação do parasito ou a ocorrência de formas assintomáticas da infecção não podem ser explicadas pela ação efetiva da resposta imune adaptativa, é necessário um maior aprofundamento do conhecimento do papel da resposta imune inata no controle da infecção. Os macrófagos são as principais células que abrigam a Leishmania e consequentemente a sobrevivência ou morte desse parasito depende da ativação dessas células, da produção de oxidantes e de moléculas inflamatórias. Todavia na LC e na LM os parasitos não são totalmente destruídos e uma constante ativação macrofágica pode vir a contribuir para a reação inflamatória e patogênese da doença. Objetivo: Avaliar o papel dos monócitos /macrófagos na imunopatogênese da leishmaniose tegumentar. Metodologia: Macrófagos de pacientes com LC, LM e indivíduos SC foram infectados in vitro com L. braziliensis e avaliados quanto à suscetibilidade a infecção por Leishmania e a capacidade de matar o parasito. No sobrenadante dos macrófagos infectados foram avaliadas as produções de óxido nítrico (NO), superóxido (O2-) pelo reagente de Griess, quimiocinas e TNF-α por teste imunoenzimático. Foram também avaliadas a frequência de monócitos inflamatórios (CD14+CD16+), assim como a caracterização fenotípica dessas células por citometria de fluxo nos diferentes grupos estudados. Resultados: Após a exposição a L. braziliensis, macrófagos de indivíduos SC apresentaram uma diminuição significante na percentagem de células infectadas e no número de amastigotas por 100 macrófagos em comparação com as células de pacientes com LC e LM. A produção de NO e O2- foi detectada, mas não houve variação significante entre os diferentes grupos. A produção de quimiocinas e de TNF-α foi maior em pacientes com LC e LM quando comparado com a do grupo SC. A frequência de monócitos CD14+CD16+ foi maior em doentes com LC em comparação com indivíduos SC. Conclusão: Nossos dados sugerem que monócitos/macrófagos desempenham um papel importante no controle da infecção por L. braziliensis e na patologia da leishmaniose tegumentar. / Salvador

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10767a.pdf: 1296672 bytes, checksum: 6f8ba558bac665a25fad4ca2e64a288c (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10767a.pdf: 1296672 bytes, checksum: 6f8ba558bac665a25fad4ca2e64a288c (MD5) Publico-10767b.pdf: 1513875 bytes, checksum: b0bbfd84ceaf858aad2bc6c9a3aaa160 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: O LPS induz a ativacao celular apos ligacao com CD14 e TLR4. A forma R de LPS (sem o polissacarideo O) pode ativar de forma independente de CD14. Neutrofilos e monocitos diferem de forma expressiva em sua expressao de CD14 na superficie. Objetivos: Comparar a acao biologica de formas R e S de LPS em neutrofilos e monocitos do sangue periferico de humanos. Metodos: A modulacao de receptores de superficie celular foi observada em monocitos e neutrofilos, e producao de especies reativas de oxigenios (EROs) e de oxido nitrico (NO), alem de ativacao de p38 e NFƒÈB foram avaliadas em neutrofilos por citometria de fluxo, apos incubacao com r e sLPS. Resultados: Houve uma pequena alteracao de TLR4 em monocitos com 6 h de incubacao, enquanto nenhuma modulacao foi vista para TLR2 em ambas as celulas. A modulacao de CD14 na superficie de monocitos mostrou-se bifasica, havendo incremento inicial na primeira hora seguida de queda com 6 h. Nao foi observada modulacao de CD14 na superficie de neutrofilos. Ambas as formas de LPS levaram a inducao de CD66b na superficie de neutrofilos, efeito que permanece pelo menos ate 24 h de incubacao. CD11b foi aumentado em neutrofilos e monocitos por r e sLPS, chegando ate 4 vezes a expressao depois de 3h, enquanto que a expressao CXCR2 cai em poucos minutos e permanece reduzida em neutrofilos. A expressao de HLADR foi aumentada nos monocitos no tempo de 3h. O efeito do sLPS na expressao de CD11b, CD66b e CXCR2 em neutrofilos mostrou-se um pouco mais precoce. Ambas as formas de LPS induziram pequena producao de NO e de EROs, quando comparadas com outros estimulos, assim como a translocacao de NFƒÈB p65 e p50 e ativacao de p38. Conclusoes: as formas R e S de LPS ativam similarmente os neutrofilos, apesar de sua baixa expressao de CD14 na superficie. Enquanto proteinas do soro podem otimizar a acao do LPS e sCD14 pode suprir a falta de CD14 em neutrofilos, e interacoes com monocitos podem ter seu papel na resposta dessas celulas ao LPS, e provavel que outros receptores estejam envolvidos na sinalizacao ao LPS em neutrofilos. Uma modulacao complexa de receptores de superficie foi vista em ambas as celulas com aumento ou decrescimo dependendo do receptor avaliado. / Objective: To compare the biological action of R form and S form LPS in human peripheral blood neutrophils and monocytes. Methods: Cell surface receptors modulation, ROS and NO production were evaluated on monocytes and neutrophils in whole blood, and NF-êB activation was evaluated in isolated neutrophils by flow cytometry after incubation with R and S-LPS. Results: A small enhancement of TLR4 expression was observed on monocytes with 6 h stimulation whereas no modulation of TLR2 was seen on either cell. Modulation of CD14 on monocytes was biphasic, with initial increment in the first hour followed by decreased expression at 6 h. Both LPS increased CD66b expression on neutrophils. Expression of CD11b was rapidly up-regulated on monocytes and neutrophils by both LPS, while down regulation of CXCR2 expression on neutrophils was observed after a few minutes, lasting for 6 h. S-LPS effect on neutrophils expression of CD11b, CD66b and CXCR2 receptors was a little earlier than the R-LPS effect. Both LPS induced low production of ROS and NO compared to other stimuli, as well as NF-êB translocation. Conclusions: A complex LPS-induced cell surface receptors modulation was seen on monocytes and neutrophils in human blood, with up and down regulation depending on the receptors evaluated. R for and S form LPS have similarly activated human neutrophils, despite the low expression of CD14 in those cells. While the presence of LBP and of sCD14 could provide the requirements for S-form LPS induction of neutrophils activity in whole blood, other receptors are also likely to be involved in LPS cell signaling in neutrophils. / FAPESP: 04/15584-2 / FAPESP: 05/58015-7 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 cintia_marinho_ioc_dout_2015.pdf: 2296721 bytes, checksum: 160c0c4d020b49fe043c76c8f20136ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O Sistema Complemento (SC) desempenha papel importante no controle de infecções atuando na eliminação do patógeno e na regulação da resposta imune. Contudo, uma ativação desregulada do SC gera efeitos deletérios ao hospedeiro, contribuindo para a patogênese de diversas doenças, como na Dengue. Entretanto, o envolvimento do SC na infecção pelo vírus Dengue (DENV) ainda tem vários aspectos a serem investigados. Assim, avaliamos a contribuição do SC na infecção in vitro de monócitos pelo DENV; o perfil de expressão dos Receptores de Complemento (CR) CR1, CR2, CR3, CR4, CD46, CD55 e CD59, e de moléculas de ativação nos monócitos e linfócitos T circulantes de pacientes infectados pelos DENV-1,-2 ou -4 por citometria de fluxo. Dosamos os níveis de SC5b-9 e citocinas em pacientes por ELISA. Avaliamos ainda, a contribuição da ativação do SC na permeabilidade e viabilidade endotelial, utilizando modelo in vitro de células endoteliais (CEs) pela medida da resistência elétrica transendotelial (TEER) e liberação de LDH sobrenadante de culturas. Por fim investigamos a interação DENV-2 com componentes purificados do SC por eletroforese das proteínas. Como achados principais, observamos diminuição na frequência de monócitos CD14+ expressando CR3, CR4 e CD59 em pacientes comparado aos controles saudáveis. De forma interessante, o bloqueio do CR3 levou à diminuição em cerca de 30% da infecção in vitro pelo DENV-2 em monócitos, sem alterar o fenótipo de ativação ou a ativação da caspase-1 destas células. No entanto, com o bloqueio de CR3, detectamos diminuição na produção de TNF-alfa e IFN-alfa. Não observamos diferença significativa na frequência de linfócitos T expressando CR3, CD46, CD55 e CD59 de em pacientes-Dengue-4 Apesar disso, os linfócitos T CR+ apresentaram um perfil ativado coexpressando CD29, CCR5 e CD107a. Na infecção pelo DENV, independente do sorotipo viral, detectamos elevados níveis circulantes de SC5b-9. Na infecção pelo DENV-1/-2 os níveis mais elevados de SC5b-9 foram observados em pacientes que apresentaram sangramentos e extravasamento plasmático, enquanto nos pacientes-DENV-4, os níveis de SC5b-9 foram correlacionados diretamente com a manutenção da integridade vascular. Entretanto, o SC5b-9 parece estar associado com a liberação de LDH intracelular. Finalmente, vimos que DENV-2 promove a clivagem de C3 na ausência de fator D. Nossos dados sugerem que uma frequência diminuída de monócitos expressando CR3 em pacientes poderia ser uma tentativa de controle da infecção, uma vez que detectamos diminuição da infecção, com o bloqueio de CR3 in vitro e ainda, vimos que o DENV-2 modula a clivagem de C3. O aumento da frequência de linfócitos T CR+ coexpressando moléculas de ativação sugere que células de perfil ativado, capazes de controlar a infecção, estariam protegidas da lise via SC. Confirmamos que o SC está ativado na Dengue, pelos altos níveis de SC5b-9. Entretanto, os níveis de SC5b-9 foram associados com a gravidade nos pacientes-DENV-1/-2 enquanto, nos pacientes-DENV-4 foram correlacionados com a manutenção da integridade vascular. Esses dados sugerem que a ativação do SC estaria relacionada diferencialmente com a patogênese de acordo com o sorotipo da infecção / The complement system (CS) develops an important role in the infection control, by direct elimination of pathogens and regulation o f the immune response. However, a deregulated CS activation is responsible to induce deleterious effects to the host, contributing to the pathogenesis of several diseases, including Dengue. Besides this, the involvement of the CS on Dengue virus (DENV) inf ection still has many aspects to be investigated. So, we evaluated the CS contribution during in vitro infection of monocytes by DENV; the profile of complement receptors (CR) CR1, CR2, CR3, CR4, CD46,CD55 and CD59 expression on circulating monocytes and T cells from DENV - 1, - 2 or - 4 infected patients by flow cytometry. We assessed the levels of SC5b - 9 and cytokines in patients by ELISA. We evaluated the contribution of the CS activation on endothelial permeability and viability by using an in vitro model wi th endothelial cells by accessing the transendothelial electric resistence (TEER) and LDH release on culture supernatants. Finally, the interaction of DENV - 2 and purified components was evaluated by electrophoresis of proteins. As principal findings, we ob served decreased frequencies of CD14 monocytes expressing CR3, CR4 and CD59 in patients compared to healthy controls. Interestingly, the blockage of CR3 resulted in around 30% reduction of the DENV - 2 infection in monocytes in vitro , without alteration on activation phenotype neither on caspase - 1 activation, of these cells. However, with CR3 - blocking we detected decreased production of TNF - alpha and IFN - alpha. Unaltered frequencies of T cells expressing CR3, CD46, CD55 and CD59 were found in DENV - 4. Beside s, T cells CR+ presented an activated profile, by the coexpression of CD29, CCR5 e CD107a. In DENV infection, regardless the viral serotype, we detected increased levels of circulating SC5b - 9. However among the two groups of patients we saw controversial r esults. In the DENV - 1/ - 2 infection higher levels of SC5b - 9 were detected in patients with bleeding and vascular leakage, while in DENV - 4 patients, the levels of SC5b - 9 were directly correlated with the maintenance of the vascular integrity. Although, the SC5b - 9 levels is associated to release of intracellular LDH. Finally, we saw that DENV - 2 promotes C3 cleavage in the absence of factor D. Our data suggest that a decreased frequency of CR3 - expressing monocytes in DENV - patients would aim to control the infe ction, since in vitro , we detected decreased infection when CR3 was blocked e also, DENV - 2 seems to modulate the cleavage of C3. The increased frequency of T cells CR+ coexpressing activation molecules suggest that cells with activated profile, able to con trol the infection, would be protected of CS mediated lysis. We confirmed that CS is activated during Dengue, by the high levels of SC5b - 9. However, the levels of SC5b - 9 were associated with to severity in DENV - 1/ - 2 patients, while in DENV - 4 it was directl y correlated with the maintenance of the vascular integrity. These data suggest that CS activation would be differentially related to the disease pathogenesis in accordance to the serotype of the infection