A utilização da radioterapia e da quimioterapia em maior escala no tratamento do câncer de cabeça e pescoço tem elevado a incidência de efeitos colaterais, em especial da mucosite bucal. O presente estudo estabeleceu como objetivo a avaliação do efeito da suplementação da vitamina E e do selênio na prevenção da mucosite causada pela radioterapia e/ou quimioterapia em pacientes com neoplasias malignas das vias aerodigestivas superiores. Como metodologia, decidiu-se por um ensaio clínico III, randomizado, duplo cego, realizado no Serviço de Oncologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Minas Gerais. A amostra foi constituída por 95 pacientes portadores de câncer nas vias aerodigestivas superiores, com indicação de radioterapia, sendo 78 (82,1%) do gênero masculino e 17 (17,9%) do gênero feminino, com média de idade de 54 ± 13,4 anos, variando entre 20 e 85 anos. O mineral selênio e a vitamina E foram classificados como grupo A e grupo B, respectivamente. Do primeiro dia da sessão de radioterapia até uma semana após o término da radioterapia, os pacientes tomaram uma cápsula por dia do suplemento. A mucosite foi avaliada semanalmente pelos cirurgiões dentistas do próprio serviço. Foram coletados dados de 115 pacientes. Como 20 deles foram excluídos, analisaram-se os resultados de apenas 95 indivíduos. Durante as dez semanas de acompanhamento desses pacientes, a avaliação da presença de mucosite foi realizada semanalmente. Do total de pacientes analisados, 88,2% desenvolveram mucosite (41 pacientes do grupo selênio e 41 pacientes do grupo vitamina E) decorrente do tratamento radioterápico realizado concomitantemente ou não com a quimioterapia. Na avaliação dos efeitos da suplementação nos diferentes graus de mucosite, observou-se que a maioria dos indivíduos se enquadrava na classificação grau II (alimentando-se normalmente, mas com dor). Independentemente do grau de mucosite, não foram encontradas diferenças entre os grupos suplementados (p=0,559). Em um período prévio a este trabalho, observou- se em pacientes avaliados semanalmente no mesmo ambulatório frequência de mucosite de 93% (noventa e três), dos quais 10,3% (dez) classificaram- se entre grau 0 e grau 1; 72,5% (setenta e dois) grau 2 e 17,2%.(dezessete) entre grau 3 e grau 4.Esses resultados sugerem que a suplementação com 100 µg de selênio ou de 400 mg de vitamina E não foi eficiente na prevenção da mucosite. Como conclusão, este estudo demonstra que a frequência de mucosite decorrente de tratamento radioterápico, com ou sem quimioterapia, é alta (88,2%) e que a suplementação do mineral selênio não é diferente da vitamina E na prevenção, intensidade ou retardo do aparecimento dessa enfermidade. / The increase of radiotherapy and chemotherapy intensity in the treatment of head and neck cancer has raised the incidence of side effects, specially of mouth mucositis. To evaluate the effect of the vitamin E and selenium supplementation in the prevention of the mucositis caused by the radiotherapy and/or chemotherapy in patients with upper aerodigestive ducts malign tumors. This study referred to at the Oncology Service of the UFMGs Oncology College. The sample has been constituted by patients with head and neck cancer and radiotherapy. 95 individuals were included, 78 (82,1%) male and 17 (17,9%) female, with a mean of age of 54+- 13,4, varying between 18 and 82 years old. The Selenium mineral and the Vitamin E were classified as Group A and B, respectively. The patients took one supplement capsule a day. The treatment started in the day of the radiotherapy session and ended one week after the radiotherapy . The mucositis was evaluated weekly by the services dentist surgeries. Data from 115 patients were collected. However, 20 patients were excluded from the study, therefore, 95 patients were analyzed. During the 10 weeks of patient follow-up, the mucositis presence evaluation was made weekly. We observed that 41 patients developed mucusitis during the radiotherapy treatment with or without chemotherapy, in both selenium and vitamin E groups. By evaluating the supplementation effects in the different levels of mucositis, it was observed that the great majority of individuals can be put in the level II classification (feed themselves normally, but with pain). Regardless the mucositis level, we have not found differences between the supplemented groups (p=0,559).In a period prior to this work, we observed in patients evaluated in the same clinic on a weekly frequency of mucositis 93% (ninety- three), of which 10.3% (ten) rated between grade 0 and grade 1, 72 , 5% (seventy two) grade 2 and 17.2%. (seventeen) of grade 3 and grade 4.We can suggest, therefore, that the supplementation with 10µg of selenium or 400mg of vitamin E have not been efficient in the mucositis prevention.In conclusion, this study has shown that the Selenium mineral and the Vitamin E supplementation did not prevent or retard the mucositis appearance.

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Objetivo: Avaliar o impacto da terapia periodontal na MO e investigar a ocorrência de patógenos periodontais em pacientes submetidos à quimioterapia para tumores sólidos e prévia ao transplante de medula óssea (TMO) Métodos: Avaliação dos dados sócio demográficos, dados da quimioterapia e comorbidades, além de avaliação sistemática orofacial. Estas ocorreram previamente e entre 7 a 14 dias após início da quimioterapia no grupo saúde periodontal (GSP). No grupo doença periodontal (GDP) somente após início da quimioterapia, 7 a 14 dias. A mucosa oral foi examinada para avaliar a presença e grau da MO induzida por quimioterapia. Ainda, testes clínicos para diagnóstico de disfagia, avaliação de xerostomia e qualidade de vida relacionada à saúde bucal (OHIP-14); e classe socioeconômica dos pacientes. Foram coletadas em ambos grupos, amostras subgengivais através da inserção de cones de papel estéreis, nos períodos descritos acima. Análise e quantificação da densidade bacteriana para cada espécie e número total de patógenos periodontais do “complexo vermelho” determinadas através do ensaio biomolecular de FISH (hibridação in situ fluorescente). Resultados: 51 pacientes com idade média de 51.1, sendo 38(74.5%) do sexo feminino e classe socioeconómico C 22(43.1%) predominante. Mama foi o local do tumor primário mais acometido 21(41.1%) e a doxorrubicina agente quimioterápico 22(43.1%) prevalente. A morbidade mais associada a hipertensão 20(39.2%). GSP incluiu 33 pacientes e GDP 18 pacientes. Análises estatísticas revelaram que as distribuições dos pacientes em relação à incidência de MO não diferiu entre estes grupos. Grau 1 de MO foi o mais incidente. Dezesseis(31%) pacientes desenvolveram MO, 9(56.2%) submetidos ao regime de condicionamento quimioterápico prévio ao transplante, 7(43.7%) em quimioterapia comum para tumores sólidos. Na qualidade de vida relacionada à saúde bucal, pacientes com complicações bucais mostraram média OHIP-14 de 1.36, enquanto aqueles sem complicações bucais média de 0.56, após quimioterapia para tumores sólidos. Conclusão: A saúde periodontal, pode afetar a incidência e grau da MO induzida por quimioterapia. Observando-se apenas pacientes com saúde periodontal submetidos ao regime de condicionamento quimioterápico e quimioterapia convencional, encontrou-se menor incidência de MO, comparado a evidências científicas. A necessidade de inclusão de pacientes com periodontite grave para avaliar essa relação dificultou tal julgamento. / Background: Periodontal disease (PD) and oral mucositis (OM) are immunoinflammatory conditions that can be characterized by the constant presence of systemic inflammation and bacteremia. Objective: Evaluate the impact of periodontal therapy in oral mucositis and investigate the occurrence of putative periodontal pathogens in patients undergoing chemotherapy for solid tumors and scheduled for hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods: This study included an evaluation of demographic data, data chemotherapy and comorbidities, and global systematic dental assessment. These were obtained prior and between 7- 14 days after initiated chemotherapy in periodontal health group (PH group). The Periodontal disease Group (PD Group) was evaluated during 7 to 14 days after of chemotherapy. The oral mucosa also was examined for scoring of chemotherapyinduced oral mucositis. Furthermore clinical tests for dysphagia diagnosis and evaluation of xerostomia and quality of life related to oral health; socio-economic class of patients was determined. Subgengival samples were collected by inserting sterile paper points for both groups, for same periods described above. Total number of bacterial cells and cells from each species determined by FISH (fluorescence in situ hybridization). Results: Fifty-one patients with solid tumors and scheduled for HSCT were assessed to evaluate the impact of periodontitis in OM. Mean age was 51.12, 38(74.5%) were female and socio-economic Class C 22(43.1%) was prevalent. The primary tumor site was most commonly breast cancer 21(41.1%) and prevalent chemotherapeutic agent was doxorubicin 22(43.1%). The prevalent morbidity associated was hypertension 20(39.2%). PH Group included 33 patients and PD Group enrolled 18 patients. Statistical analyses revealed that the distributions of patients with incidence of OM did not differ between both groups. The majority incidence of grade 1 chemotherapy-induced OM was observed. Sixteen(31%) patients developed oral mucositis, 9(56.2%) in patients undergoing conditioning regimen prior HSCT, and 7(43.7%) in patients undergoing common chemotherapy for solid tumors. Patients with oral complications showed a mean OHIP-14 index of 1.36, while those who did not develop oral complications had a mean OHIP-14 of 0.56, after chemotherapy for solid tumors. Conclusion: This study demonstrated that oral health, could affect experience and incidence of chemoinduced OM. When only patients periodontally healthy undergoing conditioning regimen of therapy and conventional chemotherapy were observed, was noted a lower incidence of oral mucositis, when compared with scientific evidences. The need of inclusion of patients with severe periodontitis to evaluate this relationship hampers such trial.

Einleitung: Die Mucositis enoralis stellt die bedeutendste und schwerwiegendste frühe Nebenwirkung bei der Strahlentherapie fortgeschrittener Kopf-Hals-Tumoren dar. Sie führt häufig zu einer Unterbrechung der Behandlung, mit der Folge einer reduzierten Tumorheilungschance. Des Weiteren wirkt sie sich nachteilig auf die Lebensqualität aus, erhöht das Risiko später Nebenwirkungen und Infektionen und stellt einen erheblichen Kostenfaktor dar. Trotz umfangreicher experimenteller und klinischer Untersuchungen wurde bisher keine allgemein anerkannte Strategie zur Prophylaxe oder Therapie der Mucositis enoralis klinisch etabliert. Die Blockade der Cyclooxygenase-2 (COX-2), welche in einer Reihe von Tumoren überexprimiert wird, wird in der Kombination mit einer Strahlentherapie diskutiert. Außerdem kommen COX-2-Inhibitoren als entzündungshemmende Medikamente therapiebegleitend zum Einsatz. C-Jun und NF-kB p50 sind Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise in der Pathogenese der radiogenen Mukositis eine wichtige Rolle spielen. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von Celecoxib, einem selektiven COX-2-Inhibitor, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa (Zellzahl, Epitheldicke) und die epitheliale Expression von c-Jun und NF-kB p50 im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. So soll festgestellt werden, ob eine Interaktion zwischen den begleitenden Entzündungsreaktionen und der eigentlichen epithelialen Strahlenreaktion besteht. Material und Methoden: In vorangegangenen Untersuchungen wurden die Schnauzen von Mäusen des Stammes C3H/Neu mit 5x3 Gy/Woche über 2 Wochen (Tag 0-4, 7-14) bestrahlt (200 kV Röntgenstrahlung). In einer weiteren Versuchsgruppe erhielten die Tiere täglich an den Tagen 0 bis 13 25 mg/kg/Tag Celecoxib oral per Schlundsonde. Im vierzehntägigen Untersuchungszeitraum wurden täglich jeweils 5 Mäuse je Versuchsgruppe getötet, deren Zungen entnommen und fixiert. In diesem Zustand wurde das Material von der Autorin dieser Arbeit übernommen. Mit Hilfe eines Zählrasters wurden in den vorliegenden Untersuchungen die Zellzahl, die Epitheldicke und die Expression von c-Jun und NF-kB p50 im Epithel der Zungenunterseite der unbehandelten Kontrolle (n = 5), während alleiniger Bestrahlung, sowie nach Bestrahlung und Gabe von Celecoxib manuell erfasst. Aufgrund der geringen Tierzahlen pro Untersuchungszeitpunkt (n = 5) und Versuchsgruppe wurde auf eingehende statistische Analysen verzichtet. Die vorliegende Arbeit beschränkt sich auf eine beschreibende Darstellung des Verlaufs der Einzelparameter über den Gesamtzeitraum. Ergebnisse: Das unbehandelte Epithel besteht aus 402 ± 11 Zellen, wobei 281 ± 8 Zellen der Germinativ- und 121 ± 4 Zellen der funktionellen Schicht angehören. Die Dicke des Gesamtepithels beträgt 68 ± 3 μm. Davon nehmen Germinativ- und Keratinschicht je 15 ± 1 μm und die funktionelle Schicht 38 ± 4 μm ein. Im Kontrollepithel wird c-Jun von 81 % der Zellen der funktionellen und von 80 % der Zellen der Germinativschicht exprimiert, wobei die funktionelle Schicht scheinbar eine größere Färbeintensität aufweist. NF-kB p50 wird von 79 % der Epithelzellen exprimiert, wobei eine stärkere Expression in der Germinativschicht zu beobachten ist. Bei alleiniger fraktionierter Bestrahlung verringert sich die Zellzahl innerhalb der ersten Woche auf 68 % des Kontrollwertes und bleibt anschließend trotz weiterer Bestrahlung weitestgehend konstant. Der größere Anteil an Zellen geht dabei in der funktionellen Schicht verloren. Die Epitheldicke nimmt in der ersten Bestrahlungswoche bis auf 113 % zu und liegt in der folgenden Woche im normalen bis subnormalen Bereich. Die epitheliale c-Jun-Expression nimmt unmittelbar nach Bestrahlungsbeginn zu und liegt anschließend während des gesamten Beobachtungszeitraums über dem Kontrollbereich. Während der gesamten Bestrahlung liegt die Färbeintensität der funktionellen Schicht weiterhin über derer der Germinativschicht. Auch bei NF-kB p50 nimmt die Färbeintensität in der ersten Bestrahlungswoche zu und bleibt anschließend erhöht. Der Anteil NF-kB p50 exprimierender Zellen ist in der Germinativschicht scheinbar größer als in der funktionellen Schicht. Unter zusätzlicher Celecoxibgabe liegen die Zellzahlen vom 6.-12. Tag des Beobachtungszeitraums vermutlich unterhalb derjenigen bei alleiniger Bestrahlung. Dieser Effekt ist besonders innerhalb der Germinativschicht sichtbar. Der Anstieg der Epitheldicke in der ersten Bestrahlungswoche fällt bei zusätzlicher Celecoxibtherapie stärker aus. Im weiteren Verlauf sind kaum Differenzen zu verzeichnen. Die epitheliale Färbeintensität von c-Jun unterscheidet sich kaum von den alleinig bestrahlten Tieren. Bei NF-kB p50 ist dies mit Ausnahme einer scheinbar geringeren Expressionsintensität am 8. und 13. Beobachtungstag ebenso. Schlussfolgerungen: Bei der frühen Strahlenreaktion der Mundschleimhaut werden c-Jun und NF-kB p50 verändert exprimiert. Celecoxib reduziert im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung die Zellzahl und verstärkt die Zunahme der Epitheldicke. Es hat keinen Einfluss auf die Expression von c-Jun und NF-kB p50. Somit ist die Regulation der Aktivität von c-Jun und NF-kB p50 unabhängig von der Aktivität von COX-2 erfolgt.

Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist die häufigste und Dosis limitierende frühe Nebenwirkung der Radio(chemo)therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Sie führt zu einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes sowie der Lebensqualität der Patienten. Nicht selten muss die Strahlentherapie unterbrochen werden, wodurch sich die Tumorheilungschance deutlich reduziert. Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Ansätze konnte bisher kein allgemein gültiges Konzept zur Prophylaxe und Therapie der radiogenen Mucositis enoralis in der Klinik etabliert werden. Die Pathogenese der oralen Mukositis ist komplex. Sie wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst, darunter verschiedene Signalkaskaden, wie die Rho- und Ras-vermittelte Signaltransduktion. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit untersuchte deshalb den Ein-fluss des 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase-Hemmers Lovastatin, welcher unter anderem die genannten Signalkaskaden modifiziert, auf die Reaktion der Mundschleimhaut auf fraktionierte Bestrahlung. Ergänzende histologische Untersuchungen sollen weitere Anhaltspunkte auf den Wirkmechanismus von Lovastatin geben. Alle Untersuchungen erfolgten am etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunter-seite der Maus (Inzucht-Stamm C3H/Neu). Die Bestrahlung wurde als fraktionierte, perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) mit wöchentlich 5x3 Gy über eine (Tag 0-4) bzw. zwei Wochen (Tag 0-4 und 7-11) durchgeführt. Das Bestrahlungsfeld war dabei so definiert, dass die gesamte Schnauze bis zu einer Ebene von den Augen bis zur Kehle, und damit die gesamte Zunge, eingeschlossen wurden. Daraus resultierte zunächst nur ein subklinischer Effekt an der Mundschleimhaut. Durch die lokale Testbestrahlung (25 kV Röntgen-strahlung) eines 3x3 mm² großen Feldes auf der Zungenunterseite wurde eine klinische Reaktion indiziert. Die lokale Bestrahlung erfolgte mit jeweils 5 gestaffelten Dosisgruppen (je-weils 10 Tiere zur Generierung vollständiger Dosis-Effekt-Kurven (Logit-Analyse). Als quantaler Endpunkt diente das Auftreten einer Ulzeration, entsprechend einer konfluenten Mukositis Grad 3 nach RTOG/EORTC-Klasifikation. Die Latenzzeit zwischen lokaler Bestrahlung und Diagnosestellung und die Dauer der Ulzeration bis zur Reepithelialisierung beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Der Beschreibung des Dosiseffektes dienten die ED50-Werte (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration innerhalb des Testfeldes zu erwarten ist) und deren Standardabweichung σ bzw. deren 95 %-Vertrauensbereiche. Für histologische Untersuchungen wurden an 16 aufeinander folgenden Tagen jeweils 3 Tiere einer Versuchsgruppe getötet. Als Kontrolle dienten 3 unbehandelte Tiere. Die Zungen wurden entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte angefertigt. Anschließend erfolgte die lichtmikroskopische Auswertung von mindestens 2 mm Epithellänge pro Präparat, wobei die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Funktions- und Germinativschicht sowie die Dicken der Germinativ-, Funktions- und Keratinschicht bestimmt wurden. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching) wurde in einer Dosierung von 16 mg/kg, entsprechend der empfohlenen Dosis beim Menschen, appliziert. Die Gabe des in destillierten Wasser suspendierten Medikamentes, erfolgte täglich per os über eine Schlundsonde. Bei fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche erhielten die Versuchstiere Lovastatin von Tag -3 (bezogen auf den Tag der ersten Fraktion) bis Tag +7 oder bis zur Ausheilung der Ulzerationen. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen wurden 4 Behandlungszeiträume von Lovastatin getestet: Tag -3 bis +4, Tag +7 bis +14, Tag 0 bis +14 oder Tag 0 bis zur Heilung der Ulzeration. Für die histologischen Untersuchungen erfolgte eine fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen. An den Tagen 0-14 bzw. 7-14 wurde Lovastatin verabreicht. Als Kontrolle dienten die Versuchsgruppen, welche eine alleinige Bestrahlung bzw. Lovastatingabe erhielten. Zur Testung der Verträglichkeit des Medikamentes erhielten zunächst 5 Versuchstiere einmal täglich 16 mg/kg Lovastatin über einen Zeitraum von 25 Tagen. Dabei konnten keine wesentlichen unerwünschten Arzneimittelwirkungen beobachtet werden. Die alleinige Einzeitbestrahlung ergab einen ED50-Wert von 11,5±1,0 Gy mit einer signifikan-ten Dosisabhängigkeit der Ulkusfrequenz (p=0,0007). Die Latenzzeit war 12,2±0,5 Tage, die Ulkusdauer 3,1±0,6 Tage. Der ED50-Wert für die alleinige fraktionierte Bestrahlung über 1 Woche war 8,6±1,4 Gy (p=0,0002). Es wurden für die Latenzzeit 9,7±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 5,4±1,1 Tage bestimmt. In beiden Versuchsprotokollen mit Lovastatingabe und fraktionierter Bestrahlung über eine Woche konnte eine signifikante Erhöhung der ED50-Werte gegenüber der alleinigen Fraktionierung festgestellt werden. Bei Medikamentengabe von Tag -3 bis +7 war die ED50 10,1±0,1 Gy, von Tag -3 bis zur Ausheilung 11,6±0,7 Gy. Die mittleren Latenzzeiten waren gegenüber der Kontrolle nicht signifikant verändert, es konnte jedoch in beiden Versuchsarmen eine Verkürzung der mittleren Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Für die Testbestrahlung nach alleiniger fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ergab sich ein ED50-Wert von 7,9±1,3 Gy (p=0,0002). Für die Latenzzeit wurden 11,8±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 4,5±1,0 Tage ermittelt. Die Gabe von Lovastatin führte in allen Behandlungs-protokollen zu einer signifikanten Erhöhung der ED50-Werte: Tag -3 bis +4: 12,7±0,9 Gy; Tag +7 bis +14: 11,6±0,9 Gy; Tag 0 bis 14: 14,3±1,2 Gy, Tag 0 bis Ausheilung der Ulzeration: 12,9±1,3 Gy. Ebenso wie bei fraktionierter Bestrahlung über eine Woche, konnte eine Verkürzung der Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Außerdem wurde eine Verkürzung der mittleren Latenzzeit von 2,4 Tagen (Medikamentengabe von Tag -3 bis +4) bis 4,1 Tagen (Tag 0 bis zur Ausheilung) gefunden. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen konnte für den gesamten Behandlungszeitraum eine gegenüber der unbehandelten Kontrolle reduzierte Gesamtzellzahl (Minimalwert Tag 4: 51%) festgestellt werden. Erst am Tag 16 wurde der Ausgangswert wieder erreicht. Demgegenüber ergab die alleinige Applikation von Lovastatin von Tag 0 bis 14 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant höhere Gesamtzellzahlen (Maximalwert Tag 9: 144% des Ausgangswertes). Bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe konnten gegenüber der Kontrolle reduzierte, jedoch höhere Gesamtzellzahlen als bei alleiniger Fraktionierung festgestellt werden. Die Gesamtschichtdicken aller 4 Behandlungsprotokolle ergaben ähnliche Verläufe ohne signifikante Unterschiede. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Applikation von Lovastatin während fraktionierter Bestrahlung einen mukoprotektiven Effekt aufweist. In allen Behandlungsprotokollen war eine signifikante Erhöhung der isoeffektiven Dosen festgestellt werden. Dabei scheint der mukoprotektive Effekt umso größer zu sein, je länger die Behandlung mit Lovastatin andauerte. Lovastatin führte zu einer eindeutigen Akumulation der epithelialen Zellproliferation. Die exakten Wirkmechanismen der Mukoprotektion durch Statine sind jedoch bisher nicht geklärt und bedürfen weitergehender Untersuchungen.:ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG 6 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich 9 2.2 Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren 11 2.2.1 Chirurgische Therapie 11 2.2.2 Strahlentherapie 11 2.2.3 Zytostatische Therapie 14 2.2.4 Kombinierte Radiochemotherapie 14 2.3 Nebenwirkungen der Strahlentherapie 14 2.3.1 Frühe Strahlenfolgen 15 2.3.2 Späte (chronische) Strahlenfolgen 16 2.3.3 Konsekutive Späteffekte 17 2.4 Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich 17 2.4.1 Frühreaktionen 17 2.4.2 Spätfolgen 19 2.5 Radiogene Mucositis enoralis 20 2.5.1 Pathogenese und zeitlicher Verlauf 20 2.5.2 Klassifizierungssysteme 22 2.5.3 Inzidenz und klinische Bedeutung 25 2.5.4 Prophylaxe und Therapie 26 2.6 Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut 30 2.6.1 Humane Mundschleimhaut 30 2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen 30 2.6.1.2 Proliferationskinetik 31 2.6.2 Murine Mundschleimhaut 31 2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus 31 2.6.2.2 Proliferationskinetik 32 2.7 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis 33 2.7.1 Maus 33 2.7.2 Hamster 34 2.7.3 Ratte 34 2.8 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 35 2.8.1 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept 35 2.8.2 Recovery (Erholung) 36 2.8.3 Repopulierung 37 2.8.4 Redistribution 38 2.8.5 Reoxygenierung 39 2.8.6 Volumeneffekt 39 2.9 Lovastatin 40 2.9.1 Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin 41 2.9.2 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik 42 2.9.3 Nebenwirkungen 42 2.9.4 Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) 44 2.10 Zielstellung der vorliegenden Arbeit 45 3 MATERIAL UND METHODEN 46 3.1 Versuchstiere 46 3.2 Bestrahlung 47 3.2.1 Bestrahlungsanlagen 47 3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung 47 3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung 48 3.2.2 Dosimetrie 48 3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung 48 3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung 49 3.3 Durchführung der Bestrahlung 49 3.3.1 Perkutane Schnauzenbestrahlung 49 3.3.2 Lokale Zungenbestrahlung 50 3.4 Beurteilung der Strahlenreaktion 51 3.5 Beschreibung der durchgeführten Experimente 52 3.5.1 Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) 53 3.5.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 53 3.5.3 Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) 54 3.6 Statistische Auswertung 54 3.6.1 Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen 54 3.6.2 Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis 55 3.6.3 Analyse der histologischen Parameter 55 3.7 Histologische Untersuchungen 55 4 ERGEBNISSE 57 4.1 Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L) 57 4.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 58 4.2.1 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus) 58 4.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion 58 4.3 Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) 60 4.3.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 60 4.3.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 61 4.4 Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0) 62 4.4.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 62 4.4.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 62 4.5 Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X) 63 4.5.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 64 4.5.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 65 4.6 Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) 66 4.6.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 66 4.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 67 4.7 Histologische Untersuchungen 68 4.7.1 Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der Zungenunterseite (H0 und H1) 69 4.7.1.1 Zellzahlen 69 4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.2 Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2) 71 4.7.2.1 Zellzahlen 71 4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.3 Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe 75 4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) 75 4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) 76 5 DISKUSSION 79 5.1 Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis 79 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 80 5.2.1 Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen 80 5.2.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 81 5.2.3 Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung 82 5.3 Applikation von Lovastatin 82 5.3.1 Dosierung 82 5.3.2 Verträglichkeit 83 5.4 Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch Lovastatin 83 5.4.1 Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung 83 5.4.2 Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung 84 5.5 Histologische Untersuchungen 85 5.5.1 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung 86 5.5.2 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe 87 5.5.3 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe 88 5.6 Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von Normalgeweben durch Statine 88 5.7 Mögliche Wirkmechanismen von Statinen 90 5.7.1 Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion 90 5.7.2 Beeinflussung der Entzündungsreaktion 92 5.7.3 Beeinflussung der Gefäßreaktion 93 5.8 Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe 94 6 AUSBLICK 95 7 ZUSAMMENFASSUNG 96 8 SUMMARY 99 9 THESEN 102 10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 104 11 TABELLENVERZEICHNIS 106 12 LITERATURVERZEICHNIS 107 13 ANHANG 127 DANKSAGUNG 131 ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 132 ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN 133 / The radiation response of oral mucosa is a frequent and dose-limiting side effect of radio(chemo)therapy of tumours in the head-and-neck region. Oral mucositis substantially im-pacts on the general condition and the quality of life of the patients. It necessitates treatment interruptions in a number of patients, with the consequence of a marked reduction of the tumour cure probability. Despite various experimental and clinical approaches, no general strategy for the prophylaxis or management of radiation-induced oral mucositis has so far been established in clinical routine. The pathogenesis of oral mucositis is complex and is influenced by a variety of factors, including miscellaneous signalling cascades, such as rho- and ras-dependent signal transduction. The present preclinical study in experimental animals was hence initiated to characterize the effect of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymeA-reductase inhibitor Lovastatin, which modulates the latter signalling chains, on the response of oral mucosa to fractionated irradiation. Accompanying histological studies were performed to illuminate the mechanism of action of Lovastatin. All investigations were performed in the mucosa of the lower surface of mouse tongue (C3H/Neu inbred strain) as an established animal model. Irradiation was administered as fractionated, percutaneous treatment of the entire snout of the animals (200 kV X-rays). The protocols comprised the application of 5x3 Gy/week over 1 week (days 0-4) or 2 weeks (days 0-4, 7-11). The treatment volume encompassed the snout of the animals to a plane from the eyes to the throat, thus including the entire tongue. With snout irradiation, only a subclinical mucosal effect was induced. Subsequent local test irradiation (25 kV X-rays) yielded a clinically manifest reaction within a 3x3 mm2 test area at the lower tongue surface. Local irradiation was performed in 5 graded dose groups with 10 animals each, in order to generate complete doseeffect curves (logit analyses). For this, mucosal ulceration, corresponding to confluent mucositis grade 3 according to the RTOG/EORTC classification, was analyzed as the quantal endpoint. The latent time between test irradiation and first ulcer diagnosis and the ulcer duration until reepithelialisation served as parameters of the time course of the radiation response. The dose effect was described by ED50 values (dose at which an ulceration within the test area is expected in 50 % of the animals) and their standard deviation  or their 95 % confidence intervals. For histological studies, 3 mice of each experimental group (see below) were sacrificed per day over a period of 16 days. Three untreated mice served as controls. The tongues were excised and the sections stained with haematoxylin and eosin. At least 2 mm epithelial length were examined by standard light microscopy, and the number of nucleated cells in the functional and germinal layers as well as the thickness of the individual epithelial layers was quantified. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching, Germany) was administered at a dose of 16 mg/kg, according to the recommended dose in patients. The drug was suspended in A. dest. and applied daily per os via gavage. With fractionated irradiation over 1 week, Lovastatin was administered from day -3 (before the first fraction) until day 7 or until clinical healing of all reactions. Fractionated irradiation over 2 weeks was combined with Lovastatin in 4 admini-stration intervals: day -3 to +4, day +7 to +11, day 0 to +14 or day 0 until clinical healing of all ulcerations. For the histological investigations, irradiation was applied with 10x3 Gy over 2 weeks. Lovastatin was administered on days 0-14 or 7-14, respectively. Groups that received either radiation alone or Lovastatin alone in similar protocols served as controls. To test for tolerability of the drug, 5 animals were treated daily with 16 mg/kg Lovastatin over 25 days. No adverse events were observed. Single dose irradiation alone resulted in an ED50 value of 11.5±1.0 Gy, with a significant dose dependence of ulcer frequency (p=0.0007). The latent time was 12.2±0.5 d, ulcer duration 3.1±0.6 d. The ED50 value for test irradiation after fractionated irradiation over 1 week was 8.6±1.4 Gy (p=0.0002). Latent time was 9.7±0.8 d, ulcer duration 5.4±1.1d. In both protocols with Lovas-tatin, a significant increase of the ED50 values was observed, with 10.1±0.1 Gy and 11.6±0.7 Gy for drug administration from day -3 to +7 and day -3 to ulcer healing, respectively. The mean latencies were not significantly different from the control. However, mean ulcer duration was shortened by ca. 2 d. For test irradiation after 2 weeks of fractionation alone, the ED50 was 7.9±1.3 Gy (p=0.0002). Mean latency was 11.8±0.8 d, mean ulcer duration 4.5±1.0 d. Lovastatin administration yielded a significant increase in ED50 values in all experimental protocols, with 12.7±0.9 Gy for day -3 to +4, 11.6±0.9 Gy for day +7 to +14, 14.3±1.2 Gy for day 0 to +14 and 12.9±1.3 Gy for day 0 until healing. Similar to one week of fractionation, a shortening of ulcer duration by ca. 2 d was found. Mean latencies were reduced by 2.4 days (drug administration day -3 to +4) to 4.1 days (day 0 to healing). Epithelial cell numbers were clearly reduced by fractionated irradiation (minimum day 4: 51 % of the control). Original values were not observed before day 16. In contrast, administration of Lovastatin alone significantly increased the total cell numbers in the epithelium (maximum day 9: 144 % of control). The combination of irradiation and Lovastatin resulted in total cell numbers that were reduced compared to the control, but markedly higher than with irradiation alone. No differences were found for epithelial thickness in comparison to irradiation alone. In conclusion, the administration of Lovastatin during fractionated irradiation showed a substantial mucoprotective effect. Isoeffective doses were significantly increased in all Lovastatin treatment arms. The longer the interval of drug administration was, the more pronounced was the effect. Lovastatin yielded a clear stimulation of epithelial cell proliferation. The detailed mechanisms of action of Lovastatin, however, remain unclear and require further investigation.:ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG 6 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich 9 2.2 Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren 11 2.2.1 Chirurgische Therapie 11 2.2.2 Strahlentherapie 11 2.2.3 Zytostatische Therapie 14 2.2.4 Kombinierte Radiochemotherapie 14 2.3 Nebenwirkungen der Strahlentherapie 14 2.3.1 Frühe Strahlenfolgen 15 2.3.2 Späte (chronische) Strahlenfolgen 16 2.3.3 Konsekutive Späteffekte 17 2.4 Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich 17 2.4.1 Frühreaktionen 17 2.4.2 Spätfolgen 19 2.5 Radiogene Mucositis enoralis 20 2.5.1 Pathogenese und zeitlicher Verlauf 20 2.5.2 Klassifizierungssysteme 22 2.5.3 Inzidenz und klinische Bedeutung 25 2.5.4 Prophylaxe und Therapie 26 2.6 Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut 30 2.6.1 Humane Mundschleimhaut 30 2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen 30 2.6.1.2 Proliferationskinetik 31 2.6.2 Murine Mundschleimhaut 31 2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus 31 2.6.2.2 Proliferationskinetik 32 2.7 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis 33 2.7.1 Maus 33 2.7.2 Hamster 34 2.7.3 Ratte 34 2.8 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 35 2.8.1 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept 35 2.8.2 Recovery (Erholung) 36 2.8.3 Repopulierung 37 2.8.4 Redistribution 38 2.8.5 Reoxygenierung 39 2.8.6 Volumeneffekt 39 2.9 Lovastatin 40 2.9.1 Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin 41 2.9.2 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik 42 2.9.3 Nebenwirkungen 42 2.9.4 Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) 44 2.10 Zielstellung der vorliegenden Arbeit 45 3 MATERIAL UND METHODEN 46 3.1 Versuchstiere 46 3.2 Bestrahlung 47 3.2.1 Bestrahlungsanlagen 47 3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung 47 3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung 48 3.2.2 Dosimetrie 48 3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung 48 3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung 49 3.3 Durchführung der Bestrahlung 49 3.3.1 Perkutane Schnauzenbestrahlung 49 3.3.2 Lokale Zungenbestrahlung 50 3.4 Beurteilung der Strahlenreaktion 51 3.5 Beschreibung der durchgeführten Experimente 52 3.5.1 Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) 53 3.5.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 53 3.5.3 Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) 54 3.6 Statistische Auswertung 54 3.6.1 Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen 54 3.6.2 Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis 55 3.6.3 Analyse der histologischen Parameter 55 3.7 Histologische Untersuchungen 55 4 ERGEBNISSE 57 4.1 Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L) 57 4.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 58 4.2.1 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus) 58 4.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion 58 4.3 Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) 60 4.3.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 60 4.3.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 61 4.4 Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0) 62 4.4.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 62 4.4.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 62 4.5 Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X) 63 4.5.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 64 4.5.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 65 4.6 Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) 66 4.6.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 66 4.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 67 4.7 Histologische Untersuchungen 68 4.7.1 Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der Zungenunterseite (H0 und H1) 69 4.7.1.1 Zellzahlen 69 4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.2 Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2) 71 4.7.2.1 Zellzahlen 71 4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.3 Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe 75 4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) 75 4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) 76 5 DISKUSSION 79 5.1 Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis 79 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 80 5.2.1 Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen 80 5.2.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 81 5.2.3 Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung 82 5.3 Applikation von Lovastatin 82 5.3.1 Dosierung 82 5.3.2 Verträglichkeit 83 5.4 Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch Lovastatin 83 5.4.1 Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung 83 5.4.2 Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung 84 5.5 Histologische Untersuchungen 85 5.5.1 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung 86 5.5.2 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe 87 5.5.3 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe 88 5.6 Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von Normalgeweben durch Statine 88 5.7 Mögliche Wirkmechanismen von Statinen 90 5.7.1 Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion 90 5.7.2 Beeinflussung der Entzündungsreaktion 92 5.7.3 Beeinflussung der Gefäßreaktion 93 5.8 Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe 94 6 AUSBLICK 95 7 ZUSAMMENFASSUNG 96 8 SUMMARY 99 9 THESEN 102 10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 104 11 TABELLENVERZEICHNIS 106 12 LITERATURVERZEICHNIS 107 13 ANHANG 127 DANKSAGUNG 131 ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 132 ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN 133

Die orale Mukositis ist eine der häufigsten und schwerwiegendsten frühen Nebenwirkungen nach einer Ganzkörperbestrahlung im Rahmen der Therapie hämatologischer Tumoren sowie nach einer Strahlenexposition im Kopf-Hals-Bereich. Es existieren zahlreiche experimentelle und klinische Ansätze zur Prophylaxe und Therapie dieser Strahlenfolge, aus denen jedoch bisher kein allgemein anwendbares Behandlungsschema ableitbar ist. Für Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) werden in präklinischen und klinischen Untersuchungen mukoprotektive Effekte nachgewiesen. Er ist als rekombinante humane Form (∆23-rHuKGF) mit der Wirkstoffbezeichnung Palifermin unter dem Markennamen Kepivance® für die Anwendung beim Menschen zur Prophylaxe der oralen Mukositis im Rahmen der Konditionierungsbehandlung bei Knochenmarktransplantationen zugelassen. Die Applikation von Palifermin erfolgt dabei intravenös in einer Dosierung von 60 g/kg an drei aufeinander folgenden Tagen vor und nach der Konditionierungstherapie. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu prüfen, ob eine Reduktion der Anzahl der Palifermin-Applikationen vor und/oder nach der Konditionierungstherapie möglich ist. Zusätzlich sollen histologische Untersuchungen Hinweise zum Mechanismus der Paliferminwirkung geben. Die Untersuchungen erfolgen am etablierten Modell des Epithels der Zungenunterseite von C3H/Neu-Mäusen. Eine Einzeitbestrahlung der Zunge simuliert die Konditionierungsbehandlung. Gestaffelte Strahlendosen werden zur Auslösung einer Ulzeration verwendet, um komplette Dosis-Effekt-Kurven zu generieren. Primärer Endpunkt ist die Induktion einer ulzerativen Mukositis in Abhängigkeit von der Strahlendosis. Latenzzeit und Ulkusdauer beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Die beim Menschen zugelassene Anwendung von Palifermin wird auf das Mausmodell übertragen (Standardanwendung), wobei Palifermin in einer Dosierung von 5 mg/kg an drei aufeinander folgenden Tagen vor und nach der Einzeitbestrahlung (Tag -3,-2,-1,+1,+2,+3) subkutan appliziert wird. Die Palifermin-Applikation wird vor der Bestrahlung auf zwei Gaben (Tag -3,-2,+1,+2+3, Tag -2,-1,+1,+2,+3) bzw. eine Gabe (Tag -3,+1,+2,+3, Tag -2,+1,+2,+3, Tag -1,+1,+2,+3) oder nach der Bestrahlung auf zwei (Tag – 3,-2,-1,+1,+2, Tag -3,-2,-1,+2,+3) bzw. eine Applikation (Tag -3,-2,-1,+1, Tag -3,-2,-1,+2, Tag -3,-2,-1,+3) reduziert. Die Palifermin-Dosierung beträgt bei mehr als einer Applikation 5 mg/kg s.c. täglich, bei einer einmaligen Anwendung 15 mg/kg s.c.. Histologische Untersuchungen der Mukosa erfolgen bei Standardanwendung von Palifermin sowie bei Applikation nur an drei Tagen vor oder nach der Einzeitbestrahlung. Nach alleiniger Einzeitbestrahlung treten ulzerative Läsionen mit einer ED50 von 11,0  1,3 Gy (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine ulzerative Läsion im Zungenepithel erwartet wird) nach durchschnittlich 10,0  0,7 Tagen (Latenzzeit) für 3,4  1,0 Tage (Ulkusdauer) auf. Erhalten die Mäuse Palifermin im Standardprotokoll, so ist die Strahlentoleranz des Zungenepithels im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung erhöht (ED50=21,9  2,2 Gy, DMF=2,0). Eine signifikant stärkere Wirkung wird erzielt, wenn Palifermin nach der Einzeitbestrahlung nur ein- oder zweimal appliziert (ED50=31,5  5,1 Gy und 28,9  3,8 Gy) oder wenn vor und nach der Einzeitbestrahlung der Wirkstoff nur einmal verabreicht wird (ED50=31,1  3,8 Gy). Die ulzerativen Reaktionen treten dabei später auf und sind von kürzerer Dauer, insbesondere wenn die Palifermin-Gabe unmittelbar nach der Einzeitbestrahlung erfolgt. Die Reduktion der Palifermin-Anwendung vor der Einzeitbestrahlung auf eine oder zwei Applikationen ist in ihrer Wirkung mit der Standardanwendung vergleichbar. Nach einer alleinigen Einzeitbestrahlung mit 13 Gy verringern sich Zellzahl (Minimalwert Tag 6 - 8, 73-74 %) und Dicke (Minimalwert Tag 4, 72 %) des Epithels, das Zellvolumen nimmt zu (Maximalwert Tag 8, 239 %). Palifermin erhöht nach dreitägiger Applikation vor der Bestrahlung die Zellzahl (184 %), die Epitheldicke (215 %) und vergrößert das Zellvolumen (152 %). Wird Palifermin zusätzlich an drei Tagen nach der Bestrahlung appliziert (Standardanwendung), erfolgt die Abnahme der epithelialen Zelldichte verzögert (Minimalwert Tag 7, 36 %). Die Epitheldicke nimmt bis Tag 3 weiter zu (286 %). Die vorliegenden Untersuchungen am Modell der Zungenseite der Maus zeigen, dass die mukoprotektive Wirkung von Palifermin im Vergleich zu klinisch üblichen Standardanwendung erhöht werden kann, wenn der Wirkstoff vor und nach der Bestrahlung nur einmal gegeben wird oder die Applikationen nach der Bestrahlung reduziert werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 5 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen 5 2.2 Strahlentherapie in der Humanmedizin 5 2.3 Einzeitbestrahlung/kurzfristige Bestrahlung in der Human- medizin 6 2.3.1 Ganzkörperbestrahlung 6 2.3.2 Stereotaktische Strahlentherapie (Radiochirurgie) 7 2.3.3 Intraoperative Strahlentherapie 8 2.3.4 Brachytherapie 8 2.4 Strahlentherapie bei Hunden und Katzen 8 2.5 Akutes Strahlensyndrom nach Strahlenunfällen (Akzidentielle Strahlenexposition) 15 2.6 Nebenwirkungen einer Strahlentherapie bzw. -exposition 17 2.6.1 Frühe Strahlenfolgen 18 2.6.2 Späte Strahlenfolgen 18 2.6.3 Konsekutive Strahlenfolgen 18 2.7 Aufbau und proliferative Organisation der Mundschleimhaut 19 2.7.1 Anatomischer Aufbau der Mäusezunge 19 2.7.2 Histologischer Aufbau des Epithels der Zungenunterseite der Maus 19 2.7.3 Proliferationskinetik des Epithels der Zungenunterseite der Maus 20 2.7.4 Besonderheiten der Mundschleimhaut des Menschen 21 .2.8 Strahlenreaktion des Epithels der Mundschleimhaut 22 2.8.1 Pathogenese der radiogenen oralen Mukositis 22 2.8.2 Bedeutung der radiogenen oralen Mukositis 22 2.8.3 Klassifizierung der radiogenen oralen Mukositis 23 2.8.4 Prophylaxe und Therapie der oralen Mukositis 25 2.8.4.1 Allgemeine Maßnahmen 26 2.8.4.2 Zahnsanierung 26 2.8.4.3 Mundspülungen 27 2.8.4.4 Kälteapplikation 27 2.8.4.5 Stimulation von Proliferationsvorgängen 28 2.8.4.6 Reduktion freier Sauerstoffradikale 28 2.9 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen oralen Mukositis 29 2.9.1 Maus 29 2.9.2 Ratte 30 2.9.3 Hamster 30 2.10 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 30 2.10.1 Intrinsische Radiosensibilität 31 2.10.2 Recovery (Erholung) 32 2.10.3 Repopulierung 33 2.10.4 Redistribution 33 2.10.5 Reoxygenierung 34 2.10.6 Volumeneffekt 34 2.11 Palifermin 35 2.11.1 Einfluss von Palifermin auf unbehandeltes Epithel 35 2.11.2 Einfluss von Palifermin auf das Zungenepithel bei Einzeitbestrahlung 36 2.11.2.1 In vitro Untersuchungen 36 2.11.2.2 In vivo Untersuchungen 37 2.11.3 Einfluss von Palifermin auf das Zungenepithel bei fraktionierter Bestrahlung 38 2.11.4 Einfluss von Palifermin auf das Zungenepithel bei Radiochemotherapie 38 2.11.5 Klinische Studien zur Wirkung von Palifermin 39 2.11.5.1 Gesunde Probanden 39 2.11.5.2 Palifermin in der Therapie hämatologischer Tumoren 39 2.11.5.3 Palifermin in der Therapie kolorektaler Karzinome 41 2.11.5.4 Palifermin in der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren 41 2.11.6 Nebenwirkungen einer Palifermin-Behandlung 42 3 Material und Methoden 43 3.1 Versuchstiere 43 3.2 Lokale Bestrahlung der Zungenunterseite 43 3.2.1 Bestrahlungsanlage 43 3.2.2 Dosimetrie 44 3.2.3 Versuchsdurchführung 44 3.3 Palifermin 45 3.4 Beschreibung der durchgeführten Versuche 46 3.4.1 Alleinige Einzeitbestrahlung (Versuch K) 47 3.4.2 Einzeitbestrahlung und Palifermin-Applikation (Versuchsreihe P) 47 3.4.2.1 Palifermin-Applikation an drei aufeinander folgenden Tagen vor und nach der Einzeitbestrahlung (Stanardan- wendung,Versuch P1) 47 3.4.2.2 Modifikation der Palifermin-Applikation vor der Einzeit- bestrahlung (Versuche P 2.x, P 3.x) 47 3.4.2.3 Modifikation der Palifermin-Applikation nach der Einzeit- bestrahlung (Versuche P 4.x, P 5.x) 47 3.4.2.4 Palifermin-Applikation an einem Tag vor und nach der Einzeitbestrahlung (Versuch P 6) 48 3.5 Klinische Beurteilung der Strahlenreaktion 48 3.6 Statistische Auswertung 48 3.6.1 Dosis-Effekt-Beziehungen 49 3.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 49 3.7 Histologische Untersuchungen 49 3.7.1 Versuchsprotokoll 49 3.7.2 Präparation der Zunge und Herstellung histologischer Schnitte 50 3.8 Histologische Auswertung 51 4 Ergebnisse 53 4.1 Strahlenreaktion des Epithels der Zungenunterseite 53 4.1.1 Klinische Veränderungen und zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 53 4.1.2 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion 55 4.1.3 Sonstige Effekte der Einzeitbestrahlung 55 4.2 Einfluss von Palifermin auf die Strahlenreaktion des Zungenepithels nach Einzeitbestrahlung 56 4.2.1 Palifermin-Applikation an drei Tagen unmittelbar vor und nach der Einzeitbestrahlung (Standardanwendung, Versuch P1) 57 4.2.1.1 Dosis-Effekt-Beziehung 57 4.2.1.2 Zeitlicher Verlauf 58 4.2.2 Reduktion der Palifermin-Gabe vor der Einzeitbestrahlung auf zwei Applikationen (Versuch 2.1, P 2.2) 58 4.2.2.1 Dosis-Effekt-Beziehung 58 4.2.2.2 Zeitlicher Verlauf 59 4.2.3 Reduktion der Palifermin-Gabe vor der Einzeitbestrahlung auf eine einmalige Applikation (P 3.1, P 3.2, P 3.3) 60 4.2.3.1 Dosis-Effekt-Beziehung 60 4.2.3.2 Zeitlicher Verlauf 61 4.2.4 Reduktion der Palifermin-Gabe nach der Einzeitbestrahlung auf zwei Applikationen (Versuch P 4.1, P 4.2) 61 4.2.4.1 Dosis-Effekt-Beziehung 61 4.2.4.2 Zeitlicher Verlauf 61 4.2.5 Reduktion der Palifermin-Gabe nach der Einzeitbestrahlung auf eine einmalige Applikation (Versuch P 5.1, P 5.2, P 5.3) 62 4.2.5.1 Dosis-Effekt-Beziehung 62 4.2.5.2 Zeitlicher Verlauf 63 4.2.6 Einmalige Palifermin-Applikation vor und nach der Einzeitbestrahlung (Versuch P 6) 64 4.2.6.1 Dosis-Effekt-Beziehung 64 4.2.6.2 Zeitlicher Verlauf 65 4.2.7 Zusammenfassung der Untersuchungen zur Ulkus- induktion 65 4.3 Histologische Untersuchungen 65 4.3.1 Histologie des unbehandelten Epithels 65 4.3.2 Qualitative histologische Veränderungen im Epithel durch die Behandlung 66 4.3.2.1 Alleinige Einzeitbestrahlung 66 4.3.2.2 Palifermin-Applikation 67 4.3.3 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach alleiniger Einzeitbestrahlung 68 4.3.3.1 Zellzahl 68 4.3.3.2 Epitheldicke 69 4.3.3.3 Zellvolumen 70 4.3.4 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach Palifermin-Applikation an drei Tagen vor und nach der Einzeitbestrahlung (Standard-anwendung) 71 4.3.4.1 Zellzahl 71 4.3.4.2. Epitheldicke 72 4.3.4.3 Zellvolumen 74 4.3.5 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach Palifermin-Applikation an drei Tagen vor der Einzeit- bestrahlung 75 4.3.5.1 Zellzahl 75 4.3.5.2. Epitheldicke 76 4.3.5.3 Zellvolumen 77 4.3.6 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach Palifermin-Applikation an drei Tagen nach der Einzeit- bestrahlung 78 4.3.6.1 Zellzahl 78 4.3.6.2. Epitheldicke 80 4.3.6.3 Zellvolumen 82 4.3.7 Zusammenfassung der Untersuchungen zu histologischen Veränderungen des Zungenepithels nach Einzeitbe- strahlung und Palifermin-Applikation 83 5 Diskussion 85 5.1 Radiogene orale Mukositis und Keratinozyten- Wachstumsfaktor 85 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 86 5.3 Strahlenreaktion des Epithels der Zungenunterseite nach Einzeitbestrahlung 87 5.4 Einfluss von Palifermin auf die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut 87 5.5 Histologische Untersuchungen 88 5.5.1 Zellzahl 89 5.5.2 Epitheldicke 91 5.6 Wirkmechanismen von Palifermin 91 5.7 Einfluss von Palifermin auf das Tumorwachstum 92 5.8 Ausblick 94 6 Zusammenfassung 95 7 Summary 97 8 Literaturverzeichnis 99 9 Anhang 125 9.1 SPF-Bedingungen im Tierstall des Experimentellen Zentrums 125 9.2 Reagenzien zur HE-Färbung 125 9.3 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen 126 Danksagung 132

Die frühe Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist eine regelmäßige und dosislimitierende Nebenwirkung der Strahlenbehandlung fortgeschrittener Kopf-Hals-Tumoren. Trotz einer Vielzahl von experimentellen und klinischen Ansätzen gibt es bis jetzt keine allgemein gültige Prophylaxe oder ein Behandlungskonzept. Die molekularen Mechanismen, die der Entstehung der radiogenen Mucositis enoralis zugrunde liegen, sind allerdings noch nicht geklärt. Die Beteiligung apoptotischer Prozesse an der Entstehung der radiogenen Mucositis enoralis wird derzeit kontrovers diskutiert. Das Signalmolekül Ceramid, welches bei Bestrahlung durch das Enzym neutrale Sphingomyelinase (nSMase) aus dem Membranbaustein Sphingomyelin freigesetzt wird, gilt als ein Initiator der Apoptose. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu prüfen, welchen Einfluss die Inhibition der Ceramidsynthese durch Glutathion auf die Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis hat. Ergänzt wurden die experimentellen Arbeiten durch die Auswertung histologischer Präparate, welche bei einer fraktionierten Bestrahlung ohne bzw. mit verschiedenen Inhibitoren der Ceramidsynthese (Glutathion, Fumonisin B1, Desipramin) behandelt wurden. Alle Untersuchungen wurden am etablierten Tiermodell der Zungenunterseite der Maus (Stamm C3H/Neu) durchgeführt. Die Bestrahlung erfolgte als lokale Einzeitapplikation (Tag 0) oder als perkutane fraktionierte Bestrahlung mit 5 x 3 Gy/ Woche über eine Woche (Tag 0-4) oder zwei Wochen (Tag 0-4, 7-11), gefolgt von einer lokalen Testbestrahlung an Tag 7 bzw. Tag 14. Als klinisch relevanter Endpunkt diente die Ausbildung ulzerativer Läsionen der Schleimhaut. Zur Inhibition der nSMase1 wurde Glutathion (1 µmol/Tag, subkutan) nach verschiedenen Protokollen verabreicht. In Verbindung mit einer Einzeitbestrahlung wurde Glutathion von Tag -3 bis zur ersten Diagnose der Ulzera (-3/D) bzw. deren kompletten Heilung (-3/H) appliziert. Bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung erfolgte die Applikation von Tag -3 bis zum Tag der Testbestrahlung (-3/7) oder bis zur Diagnose (-3/D) bzw. bis zur Heilung (-3/H) der ulzerativen Läsionen. Die Protokolle für die fraktionierte Bestrahlung über zwei Wochen umfassten die Applikation während der ersten Bestrahlungswoche (-3/7), der zweiten Bestrahlungswoche (7/14), des gesamten Bestrahlungszeitraumes (-3/14) sowie bis zur Diagnose (-3/D) und bis zur Heilung (-3/H). In begleitenden histologischen Untersuchungen wurden die Zellzahlen im Zungenepithel bestimmt, sowie verschiedene Marker der Proliferation (Ki-67), der Apoptose (cleaved Caspase-3, Bcl-2, Bax) und des Sphingolipidmetabolismus (nSMase1, Ceramid) immunhistochemisch erfasst. Es wurden dafür sowohl histologische Präparate der eigenen experimentellen Arbeit (Glutathion), als auch Präparate aus der Arbeitsgruppe (Kontrollen, Fumonisin B1, Desipramin) ausgewertet. Die Behandlung mit Glutathion führte bei Einzeitbestrahlung in keinem der Protokolle zu einer signifikanten Veränderung der ED50 im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung (Kontrolle: 13,0 ± 0,7 Gy; -3/D: 12,8 ± 0,7 Gy; -3/H: 12,3 ± 0,6 Gy). Bei der fraktionierten Bestrahlung über eine Woche mit Glutathiongabe von Tag -3 bis zur Erstdiagnose (-3/D) bzw. Heilung (-3/H) der ulzerativen Läsionen wurde eine signifikante Verringerung der Ulkushäufigkeiten beobachtet; die Applikation bis Tag 7 (-3/7) führte dagegen zu keiner signifikanten Veränderung der Ulkushäufigkeit (Kontrolle: 11,1 ± 0,1 Gy; -3/D: 14,6 ± 1,8 Gy; -3/H: 13,1 ± 0,6 Gy; -3/7: 12,0 ± 0,0 Gy). Auch die Protokolle der zweiwöchigen fraktionierten Bestrahlungen zeigten keine signifikanten Unterschiede der Strahlentoleranz bei Behandlung mit Glutathion (Kontrolle 12,1 ± 0,1 Gy; -3/14: 12,4 ± 0,7 Gy; -3/7: 13,2 ± 1,0 Gy; -3/D: 14,1 ± 0,7 Gy; -3/H: 13,5 ± 0,8 Gy; 7/14: 13,7 ± 0,6 Gy). Die histologischen Untersuchungen zeigten, dass die Applikation von Inhibitoren der Ceramidsynthese zu keiner systematischen Veränderung der epithelialen Zelldichte im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung führt. Das Minimum der Zellzahl der nur bestrahlten Proben betrug 68,6 % an Tag 5, vergleichbar mit dem Zellverlust der mit Glutathion, Desipramin und Fumonisin B1 behandelten Proben. Auf die Epitheldicke konnte ebenfalls kein systematischer Einfluss der getesteten Inhibitoren nachgewiesen werden. Die immunhistochemische Detektion des Proliferationsmarkers Ki-67 zeigte, dass sowohl Glutathion als auch die anderen verwendeten Inhibitoren im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung keinen Einfluss auf die Zellproliferation haben. Der Anteil apoptotischer Zellen (Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-3) blieb bei Inhibitor-Applikation in der ersten Woche der fraktionierten Bestrahlung relativ konstant auf dem Niveau der alleinigen Bestrahlung, in der zweiten Woche stieg er um den Faktor 10 an. In guter Übereinstimmung zu dem geringen Apoptoseindex der Mundschleimhaut nach Bestrahlung wurde das proapoptotischen Protein Bax nicht nachgewiesen. Das Enzym nSMase1 wurde in den Zellen im unteren Teil des Stratum spinosum des Schleimhautepithels nachgewiesen; eine Zunahme von Ceramid während der alleinigen Bestrahlung konnte immunhistochemisch nicht beobachtet werden. Die Behandlung mit den Inhibitoren hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf das Vorkommen von Ceramiden im Zungenepithel. Die Ergebnisse der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen erbrachten keine Hinweise auf die Beteiligung von Ceramiden bzw. apoptotischer Prozesse an der Strahlenreaktion der Mundschleimhaut. Wäre dies die Ursache, so müsste auch in allen Protokollen – insbesondere der Einzeitbestrahlung – eine Erhöhung der Strahlentoleranz durch die Applikation von Glutathion beobachtbar gewesen sein. Der mukoprotektive Effekt von Glutathion in den Versuchsarmen der fraktionierten Bestrahlung über eine Woche ist deshalb möglicherweise auf eine Stimulation der Repopulierung zurückzuführen. Für eine vollständige Klärung der zugrunde liegenden Mechanismen bedarf es weiterer präklinischer Studien.

Head and neck cancer is a heterogeneous group of tumours, of which certain subgroups such as cancer of the mobile tongue frequently are associated with a relatively poor prognosis due to the high risk of regional failure and mortality rates that haven’t improved in a significant way over the last 3 decades, despite advancements in both diagnostics and treatment. Today we lack means to assess the biological aggressiveness of each individual tumour, which varies largely. Treatment comprises of surgery with additional radiotherapy and medical therapies in more advanced tumours. The focus in this thesis is on molecular biomarker expression in head and neck cancer and especially in association with radiotherapy. Increased knowledge paves the way to a more individualized cancer treatment aiming for better outcome and less overtreatment and sequelae. The aims of this thesis was: To map the effects of radiotherapy in both tumour and adjacent tissue for the possible markers hyaluronan, EGFR and mast cells. To investigate whether the expression of hyaluronan in the epithelium and connective tissue stroma and EGFR in the tumour correlates with the risk for developing cervical metastasis in N0 patients, and to find out whether the 3-year tumour-specific survival rates correlates with the expression of HA in the epithelium and EGFR in the tumour. To establish an animal model for radiation-induced mucositis and to use that model to examine the pattern of invading inflammatory cells. To investigate whether the expression of podoplanin in tongue cancer correlates with the risk for cervical metastasis and to determine whether the total amount of lymph vessels in the diagnostic biopsy has any impact on the clinical outcome. To investigate the differences in the metabolome of tongue cancer cell lines with different radiosensitivity. The most important findings of this thesis were: The expression of EGFR and hyaluronan hade the same pattern of expression in both tumour and adjacent tissues before radiotherapy. The expression of EGFR was increased in the epithelium of the adjacent tissue close to the tumour after radiotherapy. The intensity of the staining of hyaluronan was correlated to the 3-year survival rates in patients with tongue cancer. An experimental model for radiation-induced oral mucositis in rat was established and in this model a temporal pattern of macrophage invasion with two different subtypes of macrophages was found. There were no correlation between the expression of podoplanin in the tumour tissue and the cervical metastasis rate in patients with tongue cancer, but the younger patients were more likely to have a higher expression of podoplanin in their tumour than elder patients. Tongue cancer cell lines with different radiosensitivity respond to irradiation with different patterns of metabolic expressions.

A mucosite oral (MO) constitui uma condição dolorosa que se desenvolve entre 47% e 100% dos pacientes submetidos a transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH), impactando enormemente em sua qualidade de vida. Investigar fatores preditivos para MO por meio de exames não invasivos faz-se necessário, visando melhorar a qualidade de vida dos pacientes. O objetivo do estudo foi investigar a relação dos regimes de condicionamento e dos níveis salivares de Interleucina 6 (IL- 6) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-?) com a MO, bem como investigar o impacto destes na qualidade de vida. Foram selecionados 82 pacientes submetidos a TCTH, que foram avaliados em 4 momentos diferentes: no início do condicionamento para o TCTH (M1), no dia da infusão das células (M2), após 12/20 dias do início do condicionamento para transplante autólogo e alogênico, respectivamente (M3), e após 30 dias ou na alta hospitalar para ambos (M4). Nestes momentos, foi avaliado clinicamente o grau de MO segundo critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS), coletada saliva total e aplicados 3 questionários de avaliação de qualidade de vida em relação à MO e à saúde bucal: PROMS, OHIP-14 e OMQoL. As informações clínicas e laboratoriais foram correlacionadas através do STATA 13.0 com 5% de nível de significância. Verificou-se que a maior incidência e intensidade de MO, os piores índices de qualidade de vida e os maiores níveis de IL- 6 e TNF-? foram registrados no M3, porém não houve correlação entre as citocinas e graus de MO. Houve associação entre altos níveis salivares de IL-6 e maiores pontuações no PROMS. O regime de condicionamento mieloablativo (ML) foi relacionado à MO intensa (graus 3 e 4) e à maiores pontuações nos 3 questionários de qualidade de vida, e os escores dos questionários foram maiores conforme maior foi intensidade da MO (p<0,05). / Oral mucositis (OM) is a painful condition that develops between 47% and 100% of patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), impacting greatly on their quality of life. Investigation of predictive factors for OM through noninvasive exams is necessary, in order to improve the quality of life of patients. The aim of the study was to investigate the relationship of conditioning regimens and salivary levels of Interleukin 6 (IL-6) and Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-?) with OM, and to investigate their impact on quality of life. We selected 82 patients undergoing HSCT, which were assessed at four different moments: at the start of conditioning for HSCT (M1), on the cell infusion day (M2), after 12/20 days of the start of conditioning for autologous and allogeneic transplantation, respectively (M3), and after 30 days or at hospital discharge for both (M4). In these moments, it was clinically evaluated the degree of OM according to criteria of the World Health Organization (WHO), collected whole saliva and applied 3 questionnaires of assessment of quality of life related to OM and oral health: PROMS, OHIP-14 and OMQoL. Clinical and laboratorial data were correlated using STATA 13.0 in a 5% significance level. It was found that the highest incidence and intensity of OM, the worst indices of quality of life and higher IL-6 and TNF-? levels were found in M3, but there was no correlation between cytokines and levels of OM. There was an association between high levels of salivary IL-6 and higher scores in PROMS. The myeloablative conditioning regimen (ML) was related to intense OM (grades 3 and 4) and to highest scores in the 3 questionnaires of quality of life, and the scores of questionnaires were higher as higher was the intensity of OM (p<0,05).

A mucosite é um efeito grave e dose-limitante do tratamento antineoplásico, cujas lesões ulceradas apresentam grande impacto na morbidade e mortalidade dos pacientes, por apresentar dor, restrição alimentar e servindo como porta de entrada para infecções originadas da mucosa bucal, com incidência variável de acordo com a doença de base, idade, condição de saúde bucal, dose e frequência da quimioterapia. A ocorrência de mucosite oral é frequente nos pacientes que receberam altas doses de quimioterapia seguidas de transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas. O objetivo deste estudo foi analisar os fatores que influenciam o desenvolvimento da mucosite oral. Foi realizada uma análise retrospectiva em 413 prontuários de pacientes consecutivos submetidos ao transplante autólogo de células tronco hematopoiéticas e os dados coletados incluíram dados demográficos (sexo, idade, doença de base), dados do TCTH (tipo de transplante, regime de condicionamento) e incidência de mucosite oral. Os resultados deste estudo mostraram que a incidência de mucosite foi maior em pacientes do sexo masculino e nos pacientes do sexo feminino com idade média de 29 anos, nos pacientes submetidos ao regime de condicionamento BU/MEL e naqueles pacientes portadores de LMA. Os resultados deste estudo permitiram concluir que a incidência de mucosite oral na casuística analisada foi maior nos pacientes do sexo masculino; nas mulheres jovens quando analisados sexo e idade separadamente, nos pacientes portadores de LMA e naqueles submetidos ao regime de condicionamento BU/MEL / Oral mucositis remains as a serious and dose-limiting side-effect of antineoplastic treatment and ulcerated lesions lead to a great impact on morbidity and mortality of patients due to pain, food restriction and serving as a gateway to originate infections of the oral mucosa patients. The incidence of oral mucositis remains uncertain and it is variable according to the underlying disease, age, oral health condition, dose and frequency of chemotherapy. The incidence of oral mucositis is high in patients receiving high-dose chemotherapy followed by autologous transplantation of hematopoietic stem cells. The aim of this study was to analyze the factors that influence the development of oral mucositis. a retrospective analysis of 413 medical records of consecutive patients undergoing autologous hematopoietic stem cell transplantation. Data collected included demographic data was performed (sex, age, underlying disease), HSCT data (type of transplant conditioning regimen) and incidence oral mucositis. The results of this study showed that the incidence of mucositis was higher in male patients and female patients with a mean age of 29 years, in patients undergoing conditioning regimen comprises BU / MEL and in those patients with AML. The results of this study showed that the incidence of oral mucositis in the analyzed sample was higher in males; in young women when analyzed separately sex and age, in patients with AML and those submitted to the BU / MEL conditioning regimen

O bussulfano (BU) é um quimioterápico amplamente utilizado para o tratamento de doenças hematológicas e para o condicionamento de transplante de células hematopoiéticas (TCH). As doses plasmáticas desse medicamento são altamente citotóxicas, causando mucosite oral (MO) com alta frequência e gravidade. O BU exibe concentrações na saliva que são similares às encontradas no plasma; porém, ainda não foi confirmado se essa concentração salivar também é citotóxica para queratinócitos, fato que poderia constituir um risco a mais para ocorrência de MO. A prevenção e o tratamento da MO têm sido realizados com laserterapia de baixa intensidade (LTBI), em que a fotobiomodução (FBM) favorece a redução da frequência e da duração das lesões. O objetivo deste trabalho foi verificar se o BU encontrado na saliva é citotóxico e genotóxico para queratinócitos em cultura, bem como se a FBM minimiza esses efeitos. Foram estabelecidos os seguintes grupos experimentais: Grupo Controle (C) - queratinócitos sem nenhum tratamento; Grupo Controle Saliva (CS)- queratinócitos expostos a saliva artificial; Grupo Controle Irradiado (CI) - queratinócitos expostos a LTBI; Grupo Controle Saliva Irradiado (CSI) - queratinócitos expostos a saliva e a LTBI; Grupo BU (BU) - queratinócitos expostos a BU veiculado em saliva; Grupo BU Irradiado (BUI) - queratinócitos expostos a BU salivar e concomitantemente a LTBI. Inicialmente testou-se se a saliva artificial formulada não causava modificações na viabilidade dos queratinócitos cultivados. Em seguida, essas células foram expostas ao BU veiculado em saliva ou inserido diretamente no meio, em concentrações que variaram de 4,0?g/mL a 5,5?g/mL. Nesse ensaio, avaliou-se a viabilidade celular tanto no BU veiculado em saliva quanto do BU inserido no meio de cultura. Foi padronizado também um protocolo de LTBI para ser realizado nas células cultivadas, que incluiu três sessões de laserterapia (660nm, 100mW, 0,028 cm² área do spot, 20 segundos de tempo de irradiação, 8J/cm², 3571mW/cm2) com intervalo de 4h entre elas. Após essas padronizações, a concentração salivar de 5,5?g/mL de BU, que provocou menor viabilidade celular, foi utilizada em outros ensaios, que incluíram avaliação da taxa de morte celular pelo teste de TUNEL, do estresse oxidativo (quantificação da porcentagem de sequestro do radical DPPH, quantificação da superóxido dismutase e da catalase e nível de peroxidação lipídica) e da presença de danos no DNA por intermédio do ensaio cometa. A saliva artificial formulada não alterou a viabilidade celular quando comparada ao grupo controle, porém induziu menor taxa de sequestro do DPPH e níveis discretos de dano no DNA. O BU veiculado na saliva provocou maior redução da viabilidade celular quando comparado ao BU inserido diretamente no meio de cultura (p<0.001), sugerindo que a saliva potencializou o efeito tóxico do BU. Comparando com o grupo controle saliva, o Grupo bussulfano exibiu maior frequência de células TUNEL positivas (p<0.05), menor taxa de sequestro do radical DPPH (p<0.05), maior atividade da catalase (p<0.01) e maior taxa de peroxidação lipídica (p<0.01); não houve, contudo, diferenças em relação à presença da superóxido dismutase. Em comparação ao Grupo BU, o Grupo BU Irradiado exibiu menor quantidade de células TUNEL positivas (p<0.05), maior potencial de sequestro do radical DPPH (p<0.05), menor atividade da catalase (p<0.01) e menor taxa de peroxidação lipídica (p<0.01). Na análise de cometa, o Grupo BU exibiu maior porcentagem de DNA fragmentado em relação ao Grupo BUI (p<0.05). Concluiu-se que a concentração salivar do BU é tóxica para queratinócitos, induzindo estresse oxidativo e danos no DNA, porém a LTBI foi eficaz para a redução da citotoxicidade e da genotoxicidade do BU. / Busulfan (BU) is a chemotherapeutic drug largely used into hematological diseases treatment and also on the conditioning hematopoietic cell transplantation (TCH). BU plasma concentrations are highly cytotoxic, causing oral mucositis (OM) with high frequency and severity. BU salivary concentrations are similar to those found in plasma; however, it has not been confirmed whether the salivary concentration is also cytotoxic for keratinocytes, increasing risk for the occurrence of OM. Low intensity laser therapy (LILT) has been used for prevention and treatment of OM. Photobiomoduction (FBM) contributes to the reduction of frequency and lesions duration. This study aimed to verify if the BU found in saliva is cytotoxic and genotoxic for cultured keratinocytes, as well as whether FBM minimizes these effects. The following experimental groups were established: Control Group (C) - keratinocytes without any treatment; Control Group Saliva (CS) - keratinocytes exposed to artificial saliva; Irradiated Control Group (CI)- keratinocytes exposed to LILT; Control Group Irradiated saliva (CSI) - keratinocytes exposed to saliva and LILT; BU Group (BU) - keratinocytes exposed to salivary BU; BU Group Irradiated (BUI) - keratinocytes exposed to salivary BU and concomitantly to LILT. Initially it was tested the artificial formulated saliva effects over the viability of the cultured keratinocytes. Thereafter, in order to verify the cells viability, these cells were exposed to BU diluted into artificial saliva or medium culture, the concentrations ranged from 4.0 ?g / mL to 5.5 ?g / mL. A LILT protocol was also standardized, which consist three laser therapy sessions (660nm, 100mW, 0.028cm² spot areas, 20 seconds irradiation time, 8J / cm², 3571mW / cm ²) with 4 hours interval between them. After these preliminary tests, the BU salivary concentration of 5.5 ?g / mL, which provoked less cell viability, was submitted in other tests, including the evaluation of cell death rate by the TUNEL test, oxidative stress (quantification of the DPPH radical, quantification of superoxide dismutase and catalase and level of lipid peroxidation) and the presence of DNA damage through the comet assay. The formulated artificial saliva did not modify the cell viability when compared to the Control group, but induced a lower DPPH sequestration rate and a discrete level of DNA damage. The salivary BU promoted a greater reduction in cell viability when compared to BU inserted directly into the culture medium (p <0.001), suggesting that saliva increased the toxic effect of BU. Comparing with the Saliva Control group, the BU group showed a higher frequency of TUNEL positive cells (p <0.05), a lower sequestration rate of the DPPH radical (p <0.05), higher catalase activity (p <0.01) and a higher lipid peroxidation rate (p <0.01); however, there were no differences related to the presence of superoxide dismutase. Compared to the BU group, the irradiated BU group had a lower TUNEL positive cells rate (p <0.05), a higher DPPH radical sequestration potential (p <0.05), lower catalase activity (p <0.01) and lower peroxidation rate lipid profile (p <0.01). In the comet analysis, the BU group exhibited a higher percentage of fragmented DNA in relation to the irradiated BU Group (p <0.05). It was concluded that the salivary concentration of BU is toxic to keratinocytes, inducing oxidative stress and DNA damage, but LTBI has been effective in reducing the cytotoxicity and genotoxicity of BU.