A la suite d’un criblage pangénomique, nous avons montré que l’inhibition d’un miARN de la famille let-7, miR-98, entraîne une forte accélération de la différenciation musculaire avec hypertrophie des myotubes. Lors de ma thèse, j’ai cherché à comprendre comment miR-98 retarde la différenciation du muscle strié squelettique. Des analyses transcriptomiques dans des myoblastes où ce miARN a été inhibé ont montré la perturbation de l’expression d’environ 240 gènes. Parmi eux, j’ai montré que le répresseur transcriptionnel E2F5 est important pour la régulation de la différenciation musculaire via miR-98, et est directement ciblé par ce miARN. L’inhibition de E2F5 permet de rétablir un niveau de différenciation normal malgré l’inhibition de miR-98. E2F5 est un régulateur important du cycle cellulaire. Sa fonction dans le muscle n’avait pas encore été explorée. Mes résultats montrent que E2F5 accélère le processus de différenciation musculaire. J’ai ensuite montré que E2F5 peut réguler directement des gènes répresseurs de la différenciation musculaire, comme ID1 et HMOX1, et indirectement des répresseurs de la voie TGF-β, expliquant son action sur la différenciation. Au final, miR-98 régule la différenciation du muscle strié squelettique en agissant directement sur l’expression de E2F5, et indirectement sur ses multiples cibles. Mes résultats ont ainsi mis en évidence une nouvelle voie de régulation de la différenciation musculaire : la voie let-7 – E2F5. / A genome-wide screen had previously shown that knocking-down miR-98, a miRNA of let-7 family, leads to a dramatic increase of terminal myogenic differentiation, with myotube hypertrophy. My PhD project aimed to understand how miR-98 delays skeletal muscle differentiation. Transcriptomic analysis of human myoblasts with knocked-down miR-98 revealed that approximately 240 genes were sensitive to miR-98 depletion. Among these potential targets, I have identified the transcriptional repressor E2F5, which turned out to be important for miR-98 regulation of muscle differentiation. Knocking down E2F5 and miR-98 simultaneously had almost fully restored normal differentiation. I have subsequently shown that E2F5, an important cell cycle regulator, is a direct target of miR-98 in muscle, where its function had never been investigated before. My results show that E2F5 is a positive regulator of the muscle differentiation process. E2F5 can directly repress inhibitors of muscle differentiation, such as ID1 and HMOX1, and indirectly regulate TGF-β pathway family members. In conclusion, miR-98 regulates skeletal muscle differentiation by directly regulating E2F5 expression, and thus controlling the expression of multiple E2F5 targets. My results have highlighted a new regulatory pathway of muscle differentiation: the let-7 – E2F5 pathway.

Sirt1 (Sirtuine 1) est une protéine histone déacétylase dépendante de NAD+ qui stimule la néoglucogénèse et inhibe la glycolyse dans le foie, et qui augmente l'oxydation des acides gras dans le muscle strié squelettique. Le but de ce travail de thèse a été de définir les fonctions métaboliques de Sirt1 dans le muscle strié squelettique. Nous avons tout d'abord montré, à l'aide d'un modèle de souris déficientes pour le gène Sirt1, que Sirt1 régulait l'expression de l'hexokinase II et de SREBP-1c, protéine régulatrice de l'expression de l'hexokinase. De plus, un modèle d'électrotransfert de gènes permettait de mettre en évidence que Sirt1 régulait l'expression de SREBP-1c de façon LXR dépendante. Enfin, l'inhibition de Sirt1 par l'EX527 aboutissait à une diminution de la consommation de glucose chez des myotubes C2C12. Prises ensemble, ces données suggèrent un rôle important de Sirt1 dans la régulation du métabolisme du glucose dans le muscle strié squelettique. Dans un second temps, nous avons déterminé le rôle potentiel de Sirt1 lors d'un jeûne chez des myotubes C2C12. Un jeûne entraînait une augmentation de l'activité cathepsine B + L et une déphosphorylation des protéines AktS473, GSK3S21/S9, p70S6KT412 et S6 S235/S236 qui précédait une amyotrophie des myotubes. La renutrition aboutissait à une rephosphorylation de ces protéines et à un retour à la normale de la taille des myotubes. L'activité cathepsine B + L restait cependant élevée. Enfin, le niveau en ARNm de Sirt1 était augmenté de façon transitoire lors de la renutrition. D'autres mesures de marqueurs des voies protéolytiques et de l'activité de Sirt1 sont à envisager. Nos données ainsi que celles de la littérature suggèrent que Sirt1 pourrait avoir un rôle dans la régulation de l'autophagie lors du jeûne. Pour conclure, ce travail de thèse met en évidence un rôle pour Sirt1 dans la régulation du métabolisme du glucose dans le muscle strié squelettique et apporte de nouvelles perspectives dans l'étude de la régulation de ce métabolisme en conditions pathologiques

Le muscle strié squelettique subit de graves lésions d'ischémie-reperfusion (IR) au cours de la progression de l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs et lors d'interventions chirurgicales qui nécessitent l'interruption transitoire du flux sanguin dans les artères des membres. Dans ce contexte, nos objectifs étaient de mettre à profit deux modèles expérimentaux d'IR des membres inférieurs par clampage aortique et garrotage unilatéral pour : ° tester l'efficacité d'une alternative médicamenteuse au postconditionnement ischémique par l'utilisation de la cyclosporine A (CsA). En se liant à la cyclophiline D, la CsA empêche l'ouverture du pore de transition mitochondrial (mPTP) à un niveau très distal de la cascade d'évènements qui conduit à la nécrose après IR. ° déterminer de quelle façon deux comorbidités fréquemment retrouvées chez des patients souffrant d'atteinte artérielle (le diabète et l'âge) influencent l'effet de la cyclosporine. Avec les protocoles de conditionnement et aux doses que nous avons utilisées, la cyclosporine a des effets différents sur les conséquences musculaires de l'ischémie-reperfusion des membres inférieurs, dépendant de la pathologie sous-jacente des animaux étudiés. Il semble intéressant d'étudier l'effet dose-réponse de la cyclosporine A pour déterminer l'intervalle thérapeutique optimal, celui-ci pouvant être différent chez l'animal sain et pathologique. D'autre part, étant donné l'importance considérable du stress oxydant chez les animaux diabétiques et sénescents, la co-administration de cyclosporine et d'un antioxydant au moment de la reperfusion pourrait rétablir une protection.

Les cellules souches musculaires, ou cellules satellites, adoptent différents états en transitant de quiescence à prolifération et différentiation. Ces transitions s'accompagnent de variations des demandes énergétiques. Il demeure cependant incertain comment la modulation du métabolisme énergétique peut dicter la spécification d'un état cellulaire donné. Mon projet de thèse a eu pour objectif principal la caractérisation des voies du métabolisme énergétique à l’œuvre dans les différents états cellulaires, et comment leur modulation peut influencer ces états. Nous montrons ainsi que les cellules satellites quiescentes ont de faibles besoins énergétiques et que la phosphorylation oxydative est altérée au cours du vieillissement ainsi que dans les cellules survivant après la mort de l'animal. Au cours de la formation du tissu en croissance ou en régénération chez l'adulte, nos résultats indiquent de larges différences dans leurs demandes énergétiques. Les cellules fœtales ont une faible demande respiratoire et reposent essentiellement sur la glycolyse par rapport aux cellules adultes en cours de régénération. L'altération de la b-oxidation peroxisomale et non mitochondriale induit une différentiation précoce des cellules satellites. L'inhibition pharmacologique des b-oxidations peroxisomale et mitochondriale après blessure aiguë montre différentes contributions de ces organelles à la régénération musculaire. Les transitions entre différents états des cellules satellites s'accompagnent de modifications drastiques de leurs besoins énergétiques et l'altération de vois métaboliques spécifiques peut altérer le destin des cellules myogéniques et la régénération musculaire. / Muscle stem (satellite, MuSC) cells acquire different cell states as they need to pass from quiescence to proliferation and differentiation to support muscle homeostasis. Some of these changes are accompanied by changes in energy demands. However, it is currently unclear whether modulation in the energy metabolism pathways can in turn influence the commitment to a specific cell state. A central focus of my thesis project is to characterise the energy metabolism pathways that act in the different phases of lineage progression and how their modulation can influence the state of the cell. We show that quiescent cells have low energetic demands and OxPhos is perturbed during aging, as well as in cells that survive after death. We also compared different proliferative states, both during muscle growth and regeneration, and our results indicate a surprising difference in their metabolic requirements. Gene expression profiling and bioenergetics analysis showed that foetal cells have a low respiration demand and rely mostly on glycolysis when compared to regenerating MuSCs. Furthermore, we show distinct requirements for peroxisomal and mitochondrial mediated fatty acid oxidation (FAO) in myogenic cells. Altering peroxisomal but not mitochondrial FAO promotes early differentiation of satellite cells. Experiments using acute muscle injury and pharmacological block show differential requirements for these organelles during regeneration. These observations indicate that changes in the cell state of muscle stem cells lead to significant changes in metabolic requirements and altering specific metabolic pathways can have an impact on myogenic cell fate and the regeneration process.

L'obésité, en opposition avec la pratique régulière d'activité physique et une bonne condition physique, prédispose au syndrome métabolique ainsi qu'à des perturbations de la fonction et du métabolisme musculaire. Puisque peu d'études ont analysé la condition physique (VO₂max) et ses liens avec la santé chez des gens sédentaires, ce mémoire décrira les déterminants d'une meilleure VO₂max ainsi que les conséquences métaboliques associées. Nos résultats démontrent que le potentiel oxydatif du muscle squelettique ainsi que le faible niveau d'obésité abdominale sont de bons prédicteurs d'une meilleure capacité à l'effort. Également, une VO₂max plus élevée est reliée à un meilleur profil métabolique. Par contre, cette relation est largement déterminée par le niveau d'obésité des sujets. Bien qu'une bonne condition physique soit un élément important à considérer dans l'évaluation de la santé des individus, il faut se méfier des impacts de l'obésité. Ainsi, la pratique régulière d'activité physique est à considérer puisqu'elle entraîne des effets bénéfiques sur la santé.

La résistance à l' insuline du muscle squelettique se situe au niveau des étapes subséquentes à la liaison de l'hormone à son récepteur. L' origine de la résis'tance à l'insuline n est pas identifiée avec précision, bien que l'on sache qu'une association de plusieurs facteurs en soit responsable. Parmi ces facteurs de risque, nous avons identifié la synthase inductible du monoxyde d'azote (NO). Cette enzyme (iN OS) a la particularité de produire de fortes concentrations de NO e'n réponse à divers stimuli inflammatoires. Les études présentées dans cette thèse perniettent de mieux comprendre l' implication de cette enzyme dans la résistance à l' insuline ainsi que les mécanismes d'action via lesquels le NO inhibe 1 action de l' insuline. Dans la première étude, nous avons confirmé dans un modèle cellulaire de muscles la capacité de iNOS à causer un défaut du transport du glucose en réponse à l'insuline. Nous avons toutefois également observé que les adipocytes ne développaient pas ce défaut suite à l' induction de l'enzyme. Dans une seconde étude, nous avons cherché à comprendre le mécanisme par lequel la production de NO pouvait être reliée à la résistance à l' insuline. Nous avons montré que la génération d'un oxydant découlant de la synthèse de NO, le peroxynitrite (ONOO-), causait la nitration de tyrosine de la molécule IRS-l et ainsi interfère dans la cascade des étapes de signalisation de l' insuline. Dans une troisième étude, nous avons démontré que l'incubation de muscles in vitro causait des altérations dans la captation de glucose via l' induction de iNOS causée par le procédé d' incubation. Finalement, dans une quatrième étude, nous proposons un mécanisme d'inhibition de iNOS pouvant être mis à profit dans la recherche de cibles thérapeutiques contre la résistance à l' insuline. Nous avons démontré que l'activati.on de la kinase sensible à l'AMP (AMPK) réduisait l' induction de iNOS, tant au niveau cellulaire (myocytes, adipocytes et macrophages) que dans les muscles et le tissu adipeux de rats traités à la lipopolysaccharide (LPS). L' ensemble de nos études précise l'implication de iNOS dans la résistance à l' insuline associée à l'inflammation et oriente la recherche vers de nouvelles pistes et un certain nombre d'applications thérapeutiques.

La membrane plasmique est un assemblage supramoléculaire qui délimite la cellule. C’est une structure fine, complexe et dynamique assurant des fonctions multiples et vitales pour la cellule. Sa rupture est un évènement physiologique pour les cellules soumises à des stress mécaniques fréquents et/ou importants, comme les cellules épithéliales, les cellules endothéliales ou les cellules musculaires. Dans des conditions physiopathologiques, la membrane plasmique peut également être endommagée par l’insertion de toxines bactériennes formant des pores (PFTs, pour « pore forming toxins »). Le processus de réparation membranaire et la machinerie protéique associée sont encore mal connus. Connaître les partenaires protéiques et comprendre les mécanismes mis en jeu durant le processus de réparation de la membrane plasmique sont deux enjeux fondamentaux majeurs. En effet, il a été établi qu’une défaillance du processus de réparation membranaire pour les fibres musculaires est la cause principale de certaines dystrophies musculaires. La machinerie protéique de réparation comprend des protéines comme la dysferline, la cavéoline-3 et certaines Annexines (Anx). Les Anx appartiennent à une superfamille de protéines répandue chez la plupart des eucaryotes, qui ont la propriété commune de se lier aux membranes biologiques en présence de calcium (Ca2+). Certaines Anx, comme l’AnxA5, une fois liées aux membranes biologiques s’auto-assemblent spontanément en réseau-2D. Lors de ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de l’AnxA5 dans la réparation membranaire des trophoblastes placentaires et des cellules du muscle squelettique humain. Pour les deux types cellulaires, nous avons montré que l’AnxA5 est un acteur indispensable du processus de réparation membranaire dans le cas de ruptures mécaniques. En associant des approches de microscopie de fluorescence et de microscopie électronique à transmission (MET), nous avons mis en évidence que dans ces cellules, le mécanisme de réparation est principalement basé sur la formation d’un « patch » lipidique. Dans les cellules musculaires, les expériences de MET ont mis en évidence qu’un pool d’AnxA5 endogène se lie aux bords du site de rupture quelques secondes après la lésion du sarcolemme. Ceci suggère qu’après rupture de la membrane plasmique, l’augmentation locale de la concentration calcique intracellulaire provoque la liaison de l’AnxA5 spécifiquement aux bords de la région membranaire lésée où elle forme un réseau-2D. Le réseau-2D stabiliserait localement la membrane et préviendrait sa déchirure, induite par les forces de tensions exercées par le cytosquelette cortical. Nous avons également montré que l’AnxA5 ne semble pas impliquée dans la réparation de la membrane plasmique après insertion de PFTs. Ceci suggère que différents mécanismes de réparation existent et que leur mise en place dépend probablement du type ou de l’importance des dommages. Finalement nous avons étendu notre étude à des lignées cellulaires établies à partir de patients diagnostiqués comme souffrant de dystrophies des ceintures de type 2B (déficience en dysferline) et 1C (déficience en cavéoline-3), respectivement. Nous avons montré, pour ces lignées, que la déficience en dysferline ou cavéoline-3 provoque un défaut de réparation dans le cas des ruptures mécaniques de la membrane plasmique. Dans ces cellules musculaires pathologiques intactes ou endommagées, l’AnxA5 a le même comportement, ce qui suggère que l’action de l’AnxA5 est indépendante de ces protéines. A la différence des cellules déficientes en dysferline, nous avons observé que les cellules déficientes en cavéoline-3 sont capables de réparer efficacement des lésions créées par l’insertion de PFTs dans le sarcolemme. Ce résultat supporte l’hypothèse de l’existence de plusieurs mécanismes de réparation. En conclusion, ce travail montre que l’AnxA5 est un composant clé de la machinerie de réparation dans le cas des ruptures mécaniques. / Plasma membrane is the supramolecular assembly that delimits the cell. It is a thin, dynamic and complex structure, ensuring multiple and vital cell functions. Its disruption is a physiological event occurring in cells submitted to frequent mechanical stresses, such as endothelial cells, epithelial cells and muscle cells. It is also a physiological event for cells exposed to pore forming bacterial toxins (PFTs). Membrane repair mechanisms and associated protein machinery are still poorly understood. This knowledge is, however, essential for obvious physiopathological issues. Indeed, a defect of membrane repair in muscle cells leads to some muscular dystrophies. Membrane repair machinery includes proteins such as dysferlin, MG-53, caveolin-3 and some Annexins (Anx). Anx belong to a superfamily of proteins widely spread in most of eukaryotes, which share the property of binding to biological membranes in the presence of calcium (Ca2+). Here, we investigated the role of AnxA5 in cell membrane repair of human trophoblastic and skeletal muscle cells. We showed that AnxA5 is required for membrane repair of mechanical damages in the two cell types. By combining fluorescence and transmission electron microscopy approaches, we evidenced that membrane repair mechanism in these cells is based on the formation of a lipid “patch”. In human muscle cells, TEM experiments revealed that a pool of endogenous AnxA5 binds to the edges of the torn sarcolemma as soon as a few seconds after membrane disruption. Our results suggest the following mechanism: triggered by the local increase in Ca2+ concentration, AnxA5 molecules bind to PS exposed at the edges of the torn membrane, where they self-assemble into 2D arrays. The formation of 2D arrays strengthens the damaged sarcolemma, counteracts the tensions exerted by the cortical cytoskeleton and thus prevents the expansion of the tear. We showed also that a pool of endogenous AnxA5 binds to intracellular vesicles that obstruct the wounding site. It is likely these vesicles, once associated one to each other, ensure membrane resealing. Our results suggest that sarcolemma repair of damages caused by PFTs is independent of AnxA5. Therefore, different membrane repair mechanisms may exist, their occurrence probably depending on the type and/or the size of damages. Finally, we performed studies on muscle cells established from patients diagnosed with limb girdle muscular dystrophies type 2B (dysferlin-deficient) and 1C (caveolin-3-deficient), respectively. We found that dysferlin or caveolin-3 deficiency leads to a defect of membrane repair, in the case of mechanical damages. AnxA5 behaved similarly in these damaged cells and wild-type cells, suggesting that its function is independent of dysferlin or caveolin-3. Unlike dysferlin-deficient cells, damages created by PFTs are efficiently repaired in caveolin- 3-deficient cells. This result supports the hypothesis that different mechanisms occur in muscle cells, depending on the type of damage. In conclusion, this work indicates that AnxA5 is a key component of the membrane repair machinery, in the case of mechanical disruptions. Our results enable to propose a detailed mode of action for AnxA5.

Nous avons généré des souris déficientes pour les gènes codant pour les échangeurs Na/Ca de type I (NCX1) et de type III (NCX3) afin d'étudier, in vivo, le rôle de ces deux protéines.<p>L‘analyse phénotypique des souris adultes totalement déficientes pour le gène Ncx1 (Ncx1-/-) n'a pu être menée étant donné que ces souris décèdent au cours du développement embryonnaire.<p>Les souris déficientes pour le gène Ncx3 (Ncx3-/-) sont viables et fertiles. Nous avons analysé l'effet de l'inactivation du gène Ncx3 dans le muscle squelettique et plus particulièrement au niveau de la jonction neuromusculaire.<p>L'analyse histologique des muscles squelettiques de souris Ncx3-/- a révélé des altérations des fibres musculaires caractérisées par la présence de foyers de fibres nécrotiques et d'infiltrats de cellules mononuclées.<p>L'analyse électromyographique classique a montré un électromyogramme anormal du muscle gastrocnémien de souris Ncx3-/-, révélant une affection neuromusculaire pré- et post-synaptique caractérisée par (i) la petitesse de l'amplitude de la réponse M au repos, (ii) le décrément après stimulation répétitive à basse fréquence, (iii) l'incrément après stimulation répétitive à haute fréquence et (iv) la facilitation post-exercice. L'électromyographie à fibre unique a révélé une MCD élevée et des blocages anormaux de la transmission neuromusculaire, reflétant une atteinte post-synaptique de la jonction neuromusculaire chez les souris Ncx3-/-. L'ensemble de ces anomalies électromyographiques sont les caractéristiques du syndrome myasthénique de Lambert-Eaton.<p>Finalement, pour déterminer les conséquences de l'inactivation du gène Ncx3 sur l'activité physique des souris Ncx3-/-, nous avons réalisé des tests comportementaux sur ces souris. Ces tests ont permis de détecter un épuisement et une faiblesse musculaire accrus à l'effort chez ces souris.<p>En conclusion, nos observations montrent que les souris Ncx3-/- présentent des anomalies électromyographiques similaires à celles du syndrome myasthénique de Lambert-Eaton. Ces résultats suggèrent que l'échangeur NCX3 est peut-être impliqué dans la pathogenèse de certaines formes de cette maladie.<p>Des études supplémentaires afin de confirmer notre hypothèse devront donc être réalisées.<p>/<p>We produced and analyzed mice deficient for Na/Ca exchanger 3 (NCX3), a protein which mediates cellular Ca2+ efflux (forward mode) or Ca2+ influx (reverse mode) and thus controls intracellular Ca2+ concentration. NCX3-deficient mice (Ncx3-/-) present a skeletal muscle fiber necrosis and a defective neuromuscular transmission, reflecting the absence of NCX3 in the sarcolemma of the muscle fibers and at the neuromuscular junction. The defective neuromuscular transmission is characterized by the presence of electromyographic abnormalities including low compound muscle action potential amplitude, a decremental response at low frequency nerve stimulation, an incremental response and a prominent post-exercise facilitation at high frequency nerve stimulation as well as neuromuscular blocks. The analysis of quantal transmitter release in Ncx3-/- neuromuscular junctions revealed an important facilitation superimposed on the depression of synaptic responses and an elevated delayed release during high frequency nerve stimulation. It is suggested that Ca2+ entering nerve terminals is cleared relatively slowly in the absence of NCX3, thereby enhancing residual Ca2+ and evoked and delayed quantal transmitter release during repetitive nerve stimulation. Our findings indicate that NCX3 plays an important role in vivo in the control of Ca2+ concentrations in the skeletal muscle fibers and at the neuromuscular junction.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La mitochondrie est de plus en plus reconnue pour sa contribution à la dégénerescence musculaire. Les dysfonctions mitochondriales, en plus de causer une défaillance énergétique, contribuent à la signalisation apoptotique, stimule la production de ROS et peuvent induire une surcharge calcique. Ces caractéristiques sont tous reliées à certains types de myopathies. Cette thèse met en lumières comment certaines dysfonctions mitochondriales peuvent intervenir dans la pathogenèse de diverses myopathies. Nous démontrons que les dysfonctions mitochondriales sont impliqués dans l’atrophie dû à la perte d’innervation. Par contre, la désensabilisation de l’ouverture du pore mitochondrial de transition de perméabilité, via ablation génétique de cyclophiline-D, ne prévient ni la signalisation apoptotique mitochondrial ni l’atrophie. Nous avons aussi observé des dysfonctions mitochondriales dans le muscle atteint de dystrophie musculaire de Duchenne qui furent améliorés suite à une transfection de PGC1-α, laquelle résulta aussi en une amélioration de la pathologie. Finalement, nous démontrons que le recyclage de mitochondrie par les voies de mitophagies et de contrôles de la qualité impliquant Parkin et possiblement d’autres voies de signalisation inconnues sont cruciales au recouvrement cardiaqe lors d’un choc septique. / Mitochondria are increasingly being recognized for their role in contributing in cellular damage. Mitochondrial dysfunctions, in addition to causing energy failure, contribute to apoptotic signaling, stimulate ROS production and calcium overload. These are all features of various types of myopathies. This thesis sheds light on how mitochondrial dyfunctions may contribute to the pathogenesis in certain myopathies that have been found to show mitochondrial abnormalities. Specifically, we found that although mitochondrial dysfunctions are involved in denervation-associated atrophy, desensitizing mitochondrial permeability transition pore opening through genetic ablation of CyclophilinD does not prevent mitochondrial apoptotic signaling nor atrophy in this model of chronic inactivity. We also observed mitochondrial dysfunctions in the Duchenne dystrophic muscle that were improved after PGC1-α transfection, which also resulted in an amelioration of the disease presentation. Finally, we found that mitochondrial recycling, led by Parkin and alternate mitophagy pathways a crucial component of cardiac recovery in sepsis.

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