Um grande número de medicamentos utilizados no tratamento contra o HIV agem procurando inibir a ação das proteínas transcriptase reversa e protease. Mutações existentes nas sequências dessas proteínas podem estar relacionadas à resistência aos medicamentos e podem prejudicar o desempenho de um tratamento. O estudo do genótipo dos vírus pode ajudar na tomada de escolhas específicas em tratamentos para cada indivíduo, tornando maiores a chance de sucesso. Com a maior acessibilidade a exames de genotipagem, uma grande quantidade de sequências do vírus está disponível, contendo um grande volume de informação. Padrões de ocorrência de mutações são exemplos de informações contidas nessas sequências e são importantes por estarem relacionados à resistência aos medicamentos. Um dos caminhos que pode ser capaz de nos levar ao entendimento desses padrões de mutações é a aplicação de técnicas de agrupamento e biclustering. Essas técnicas visam a geração de grupos ou biclusters que possuam dados com propriedades em comum. São empregadas em casos em que não há grande quantidade de informação prévia e existem poucas hipóteses sobre os dados. Assim, pode-se encontrar os padrões de mutações que ocorrem nessas sequências e tentar relacioná-los com a resistência aos medicamentos, utilizando métodos de agrupamento e bicluster em sequências de protease e transcriptase reversa. Existem alguns sistemas que tentam predizer a resistência ou susceptibilidade das sequências, porém, devido à grande complexidade dessa relação, ainda é necessário esclarecer o vínculo entre combinações de mutações e níveis de resistência fenotípica. Desta forma, a principal contribuição deste trabalho é o desenvolvimento de um framework baseado na aplicação dos algoritmos KMédias e Bimax às sequências de transcriptase reversa e protease de pacientes infectados com HIV, em uma codificação binária. O presente trabalho também introduz uma representação visual dos grupos e biclusters baseada em dados de microarranjos para casos em que se tem grandes volumes de dados, de forma a facilitar a visualização da informação extraída e a caracterização dos grupos e biclusters no domínio da doença. / Drugs used in HIV treatment intend to inhibit protease and reverse transcriptase. Mutations in the sequences of these proteins can be related to drug resistance and can reduce treatment efficacy. Studying virus genotype may help choosing specific treatments for each patient, increasing success probability. As genotyping tests become available, a great amount of virus sequences, which comprehend lots of information, are more accessible. Patterns of mutation are examples of information comprised in the sequences and are important since are related to drug resistance. One way that can lead to the understanding of these mutation patterns is the use of clustering and biclustering techniques. These techniques search for clusters or biclusters comprising data with similar attributes. They are used when there is not a lot of previous information and there are few hypothesis about the data. Therefore, it may be possible to find patterns of mutations in the sequences and to relate them to drug resistance using clustering and biclustering techniques with protease and reverse transcriptase sequences. There are a few systems that predict drug resistance according to the sequence of the virus, however, due to the complexity of the relationship, it is still necessary to elucidate the connection between mutation combinations and the level of phenotypic resistance. Accordingly, this work main contribution is the development of a framework based on Kmeans and Bimax algorithms with protease and reverse transcriptase sequences from HIV patients in a binary form. This work also presents a visual representation of the clusters and biclusters based on microarray data suitable for large data volumes, helping the visualization of information extracted from data and cluster and bicluster characterization in the disease domain.

Les mycoplasmes sont des bactéries atypiques, dépourvues de paroi et souvent considérées comme des cellules minimales du fait de la taille réduite de leur génome. De nombreuses espèces sont pathogènes et ont un impact économique important dans les filières d'élevage, notamment pour les ruminants. Les mycoplasmes n'échappent pas au phénomène mondial de la résistance aux antibiotiques. Contrairement à la plupart des autres bactéries, les mycoplasmes ne contiennent pas de plasmides conjugatifs souvent incriminés dans la dissémination horizontale de gènes de résistance, la base moléculaire principalement décrite étant la mutation chromosomique des gènes cibles. De façon générale, le transfert horizontal de gènes (HGT) chez les mycoplasmes a longtemps été sous-estimé. Récemment, deux mécanismes de HGT ont été décrits chez Mycoplasma agalactiae : le transfert d'élément conjugatif et intégratif (ICE), et le transfert non-conventionnel de régions chromosomiques par conjugaison appelé MCT (Mycoplasma Chromosomal Transfer). Nos travaux se sont attachés à explorer ce dernier mécanisme et à évaluer son impact sur l'acquisition de la résistance aux antibiotiques. Une analyse de génomique comparative a été conduite à partir du séquençage de nombreux mutants spontanément résistants et de transconjugants générés par des expériences de mating et sélectionnés pour leur résistance. Nos résultats montrent que le MCT conduit de façon distributive au transfert simultané de nombreux fragments. En une seule étape de conjugaison impliquant deux souches, ce phénomène génère une population variée de génomes hautement mosaïques. Il accélère la dissémination de l'antibiorésistance, permettant l'acquisition de plusieurs mutations distantes associées à la résistance en un seul événement. De par les multiples possibilités de réassemblage génomique qu'il produit, le MCT pourrait avoir des conséquences importantes sur d'autres processus adaptatifs comme la virulence ou la spécificité d'hôte. Enfin, les modalités distributives et l’ampleur du MCT expliquent l'origine des transferts de gènes précédemment détectés in silico entre de nombreux mycoplasmes. Ce phénomène pourrait donc avoir eu des répercussions importantes sur l'évolution de ces bactéries minimales et être un facteur clé de leur persistance et virulence actuelles.

O câncer colorretal é um dos tipos de tumores mais frequentes no mundo. A atual dificuldade na avaliação correta da resposta ao tratamento torna necessário o desenvolvimento de novas abordagens de detecção tumoral. Atualmente, o sequenciamento genômico em larga escala permite um estudo mais compreensivo das alterações estruturais e de sequência presentes no tumor. A aplicação destas abordagens de maneira personalizada permite o desenvolvimento de biomarcadores tumor específicos que podem facilitar a avaliação de resposta ao tratamento e a presença de doença residual, bem como revelar alterações de sequência em genes capazes de servir de novos alvos terapêuticos. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia eficiente para a identificação de biomarcadores baseados na existência de variações estruturais em genomas de tumores de reto, eliminando a necessidade de sequenciamento do genoma normal do mesmo paciente e diminuindo portanto o custo da abordagem. Os biomarcadores encontrados para cada um dos seis pacientes foram utilizados para avaliar a presença de doença residual após o tratamento através da detecção de DNA tumoral circulante nas amostras de plasma coletadas em momentos diferentes do tratamento. O sequenciamento em baixa cobertura personalizado é portanto uma alternativa viável e promissora para avaliar a resposta ao tratamento em pacientes com tumores de reto. Na segunda parte do estudo, a análise de linhagens celulares de tumores colorretais revelou uma grande quantidade de mutações pontuais somáticas (SNVs e InDels) em genes codificadores para proteínas de superfície celular (surfaceoma). Estas alterações no surfaceoma indicam potenciais novos alvos para drogas e vias regulatórias alteradas neste tipo de tumor. Além disso, estas mutações pontuais também são responsáveis pela geração de epítopos com potencial imunogênico e estes novos epítopos podem ser aplicados como vacinas antitumorais personalizadas e já haviam sido propostos como uma alternativa terapêutica. A presença de novos epítopos, principalmente nas linhagens com elevadas taxas de mutação (resultante da instabilidade de microssatélites e mutações em genes de reparo de DNA tipo mismatch ou POLE), sugerem também um potencial uso de drogas moduladoras do sistema imune em pacientes com tumores que apresentam estas mesmas características. Portanto, o estudo de alterações genômicas em tumores primários e linhagens de câncer colorretal permitiu a detecção de variações estruturais que foram utilizadas como biomarcadores personalizados em pacientes com tumores de reto assim como a identificação de genes contendo mutações pontuais em linhagens celulares de câncer colorretal, que revelam potenciais novos alvos terapêuticos a serem explorados na clínica / Colorectal cancer is one of the more frequent tumor types in the world. To select the appropriate treatment course, it is necessary to develop more precise diagnostic approaches. The current availability of high throughput genome sequencing methods allows for a comprehensive characterization of the structural and sequence alterations present in each tumor. The use of tumor genome sequencing in a personalized setting can result in tumor specific biomarkers that help evaluate response to treatment and the presence of residual disease, improving the clinical management of these patients, and also reveal sequence alterations in genes capable of serving as new therapeutic targets. In this study we developed an efficient bioinformatics pipeline to identify biomarkers based on the existing structural alterations in rectal tumor genomes, eliminating the need to sequence the matched normal genome and therefore reducing the cost for this approach. The biomarkers found for each of the six patients were used to evaluate the presence of residual disease after treatment through the detection of circulating tumor DNA in plasma samples collected at different points during the treatment. Sequencing tumor genomes with low coverage is therefore a viable and promising alternative to follow up rectal cancer patient\'s response to treatment. In the second part of this study, the analysis of colorectal cancer cell lines revealed a large quantity of point mutations (SNVs and InDels) in genes coding for proteins located in the cell surface (surfaceome). These alterations in the surfaceome indicate potential new drug targets and altered pathways in this type of tumor. Furthermore, these point mutations are also responsible for the generation of new epitopes with immunogenic potential and these new epitopes can be applied as personalized tumor vaccines and had previously been proposed as a therapeutic alternative. The presence of new epitopes, especially in the cell lines with elevated mutation rates (resulting from MSI and mutations in DNA mismatch-repair genes or POLE), suggests a potential use of immune checkpoint target drugs in patients with tumors that share these genetic characteristics. With a large-scale bioinformatics approach, we detected new tumor epitopes resulting from point mutations, present in most of the cell lines used. The analysis of gene expression data puts into perspective both the somatic mutations found and which targets are promising as well as the development of therapies based on vaccines derived from tumor epitopes. In conclusion, the study of genomic alterations in primary tumors and colorectal cancer cell lines allowed the detection of structural variations that were used as personalized biomarkers in patients with rectal tumors as well as the identification of genes containing point mutations in colorectal cancer cell lines, that reveal potential new therapeutic targets to be explored in the clinical setting.

Por muitos anos o fluconazol tem sido uma opção usual para tratamento de infecções por Candida. Entretanto, o uso indiscriminado desta terapia antimicótica tem favorecido o surgimento de microrganismos resistentes. A redução da afinidade da enzima alvo dos antifúngicos, 14--demetilase (ERG11p), tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência, caracterizado por mutações em seu gene codificante ERG11. Neste estudo, foi investigada a suscetibilidade ao fluconazol de 87 isolados de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei e C. glabrata, com valores de MIC determinados através do método de microdiluição em caldo M27-A3 (CLSI, 2008); verificou-se que dezessete isolados apresentavam decréscimo da suscetibilidade ao fluconazol. A triagem de mutações foi realizada através da amplificação de quatro regiões do gene ERG11 com primers específicos delineados neste estudo, para cada espécie de Candida, seguida de análise pela técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado. Foram identificadas 217 mutações, incluindo 185 silenciosas e 32 por troca de sentido (que altera o aminoácido resultante). Estas últimas foram observadas em 19 isolados e 17 resíduos distintos, sendo 7 deles ainda não descritos anteriormente: L321F em C. albicans; K53M em C. krusei; Y221F, K344T, V362M e R371S em C. tropicalis; e R398I em C. parapsilosis. Confrontando os resultados entre a técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado, não houve associação direta entre as mudanças na migração eletroforética e alterações na seqüência nucleotídica do gene ERG11. Sugerimos que a freqüência elevada de alterações no gene ERG11 de Candida deve ser considerada no design de novos fármacos que visem a enzima ERG11p / For many years, fluconazole has been a usual option for treatment of Candida infections. However, the indiscriminate use of antimycotic therapy has favored the emergence of resistant organisms. The decrease in the affinity of the enzyme target of antifungal agents, 14--demethylase (ERG11p), has been described as an important mechanism of resistance, characterized by mutations in its encoding gene ERG11. In this study, we investigated the susceptibility to fluconazole of 87 strains of C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei and C. glabrata with MIC values determined by broth microdilution M27-A3 (CLSI, 2008), found that seventeen isolates showed decreased susceptibility to fluconazole. Mutation screening was performed by the amplification of four regions of the ERG11 gene with specific primers designed in this study for each Candida species, followed by electrophoresis SSCP analysis and sequencing. We identified 217 mutations, including 185 silent mutations and 32 missense mutations. Missense mutations were observed in 19 isolates and 17 distinct residues, 7 of them still not described earlier: L321F in C. albicans, K53M in C. krusei; Y221F, K344T, V362M and R371S in C. tropicalis, and R398I in C. parapsilosis. Comparing the results between SSCP electrophoresis technique and sequencing, there was no direct association between changes in electrophoretic migration and changes in the nucleotide sequence of the ERG11 gene. We suggest that the high frequency of changes in ERG11 gene of Candida should be considered in the design of new drugs targeting the enzyme ERG11p

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francisco Weliton Rodrigues.pdf: 26774271 bytes, checksum: c81af1f8ff9812886fda32632000dc44 (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / Pterygium is a disease of unknown origin and pathogenesis that can be vision threatening. Several researchers believe that pterygium is UV-related and that abnormal expression of p53 protein and infection with human papillomavirus (HPV) are risk factors for pterygium, but their experiments have been inconclusive. We investigated its relation with p53 protein expression, p53 gene codon 72 polymorphism and infection with HPV DNA. Pterygial samples were obtained from 36 patients; 21 normal conjunctival samples were used as controls. Expression of p53 protein was studied by Immunohistochemistry, using the antibody DO-7. Analysis for the p53 genotype was made with PCR, using specific primers for the arginine and proline alleles, and an analysis for HPV was made of the pterygium patients and control group. Fourteen of the 36 pterygia specimens were positive for abnormal p53 expression. Thirty one of the patients were heterozygotic and three were homozygotic for the proline allele; two were homozygotic for the arginine allele; in the control group 12 of 21 were heterozygotic and seven of these 21 were homozygotic for the proline allele; two were homozygotic for the arginine allele. Twenty-one of the pterygia patients were positive for HPV; HPV type 1 was found in nine of these, type 2 in seven and both types in five. Only two of the 21 controls had HPV; both had type 16. We suggest that abnormal expression of p53, p53 codon 72 polymorphisms and HPV DNA are required cofactors for the development of pterygium. / O pterígio é uma doença de origem e patogênese desconhecida que pode comprometer a visão. Vários pesquisadores acreditam que o pterígio está relacionado à luz UV e a expressão anormal da proteína p53, além da presença do papilomavírus humano (HPV), como fatores de risco para o seu desenvolvimento, mas os resultados são inconclusivos. Investigamos a expressão da proteína p53, o polimorfismo do codon 72 do gene TP53 e a presença do HPV. Amostras de pterígio foram obtidas de 36 pacientes e 21 escleras normais formaram o grupo controle. A expressão de p53 foi analisada por imunohistoquímica usando anticorpo DO-7. Análise do genótipo de p53 foi realizada por PCR com primers específicos para os alelos arginina e prolina e a presença do HPV foi analisada nos dois grupos. Quatorze amostras de pterígio (39%) foram positivas para expressão anormal de p53. O polimorfismo foi observado em 31 (86%) amostras heterozigotas, 03 (8%) homozigotas para prolina e 02 (6%) homozigotas para arginina, enquanto que no grupo controle foi observado 12 (57%) amostras heterozigotas, 07 (33%) homozigotas para prolina e 02 (10%) homozigotas para arginina. 21 pterígios (59%) foram positivos para HPV e o tipo 01 foi encontrado em 43% (9/21), tipo 02 em 34% (7/21) e os dois tipos simultaneamente em 23% (5/21) amostras do gruppo pterígio. O grupo controle mostrou 9.5% (2/21) amostras positivas para HPV e o tipo 16 nas duas amostras. Nossos dados sugerem que a expressão anormal de p53, o polimorfismo do codon 72 e a presença do HPV podem estar relacionados com o desenvolvimento do pterígio.

Introdução: O hipotireoidismo congênito possui prevalência de 1/4000 crianças nascidas vivas e pode ser causado por disgenesia tireoideana (80% dos casos) ou por defeitos de síntese hormonal (20% restantes). A disormonogênese tem sido associada a mutações nos genes: tireoglobulina, simportador sódio/iodo, tireoperoxidase, dual oxidase 2, e pendrina. A tireoglobulina é uma glicoproteína de 660KDa e funciona como matriz para a síntese dos hormônios tireoideanos. Até o momento 38 mutações inativantes, associadas a bócio e hipotireoidismo, foram identificadas no gene da tireoglobulina. Objetivos: Este estudo visou caracterizar mutações no gene da tireoglobulina em 13 pacientes brasileiros com bócio e hipotireoidismo congênito e verificar o efeito funcional da mutação A2215D identificada neste estudo. Casuística e Métodos: Foram estudados 13 pacientes com hipotireoidismo congênito por possível defeito de síntese de tireoglobulina. Foi utilizado DNA de sangue periférico de todos os pacientes e amostra de tecido da paciente portadora da mutação A2215D. Os métodos utilizados foram: amplificação e sequenciamento dos 48 exons e das junções exon/intron, transfecção de células de mamífero com plasmídeos contendo o cDNA da tireoglobulina mutada e não mutada, eletroforese de proteínas e hibridização com anticorpo específico, dosagem de tireoglobulina por fluoroimunoensaio indireto, quantificação de RNAm por PCR quantitativo em tempo real, imunohistoquímica, microscopia por coloração de hematoxilina/eosina e microscopia eletrônica e imunoeletrónica. Resultados: O defeito de síntese de tireoglobulina nos pacientes foi confirmado pela ausência de elevação do valor da tireoglobulina sérica 24 e 48hs após a aplicação de 0,45mg de TSH humano recombinante. No gene da tireoglobulina foram identificadas cinco mutações, sendo duas novas (Q2142X e IVS46-1G>A) e três já descritas na literatura (R277X, IVS30+1G>T e A2215D); 19 polimorfismos e 13 alterações em introns. Doze dos treze pacientes apresentaram mutações bialélicas (homozigose ou em heterozigose composta). O estudo funcional em células de mamíferos revelou diminuição da secreção da proteína mutada e no tecido do paciente portador da mutação A2215D mostrou: localização intracelular da tireoglobulina com ausência quase total no colóide; retículo endoplasmático rugoso de volume extremamente aumentado, presença de tireoglobulina dentro do retículo endoplasmático rugoso e baixo conteúdo de RNAm de tireoglobulina e da própria proteína. Também foram verificados baixo conteúdo de RNAm de genes tireoideanos (TPO, TTF1, PAX-8, NIS, receptor de TSH). Conclusão: Todas as mutações identificadas neste estudo explicaram o hipotireoidismo congênito diagnosticado nos pacientes. A mutação A2215D promoveu a retenção da proteína mutada dentro do retículo endoplasmático rugoso e diminuiu sua secreção para o colóide, ocasionando grave defeito de síntese hormonal e hipotireoidismo. A tireoglobulina endógena portadora da mutação A2215D poderia atuar como regulador da função tireoideana via supressão da expressão dos fatores de transcrição importantes na fisiologia da tireóide. / Introduction: Congenital hypothyroidism is one of the most common hereditary endocrine disorders, which affects 1:4000 newborns. Congenital hypothyroidism is caused by thyroid gland dysgenesis (80%) or inborn errors of thyroid hormone synthesis (20%). Genetic defects in thyroglobulin, pendrin, thyroperoxidase, dual oxidase 2, simporter sodium/iodine have been associated to dyshormonogenesis. Thyroglobulin is a large glycoprotein that functions as the matrix for thyroid hormone synthesis. At least 38 mutations in the TG gene have been identified in patients with thyroid dyshormonogenesis. Objectives: The aims of this study were to identify thyroglobulin gene mutations associated with congenital hypothyroidism in 13 Brazilian patients, and to determine the functional effect of the mutation A2215D identified in this study. Patients and methods: Thirteen patients with congenital hypothyroidism due to defective thyroglobulin synthesis were included. Peripheral blood DNA from all the patients and one thyroid tissue sample from a patient with the A2215D mutation were collected. Thyroglobulin exons and exons/introns borders were amplified by PCR and sequenced. Mammalian cells were transfected with expression vectors encoding mutated and non-mutated thyroglobulin cDNA. Immunoblots, determination of thyroglobulin concentrations, real time PCR to quantify mRNA expression, immunohistochemical analysis, hematoxilyn-eosin staining and electronic and immunogold microscopy were performed. Results Abnormal thyroglobulin synthesis and secretion was confirmed by the absence of a serum thyroglobulin elevation 24 and 48 hours after the stimulation with recombinant human TSH (0.45 mg). Molecular analysis revealed five mutations in the thyroglobulin gene, 2 novel (Q2142X and IVS46-1G>A) and three previously described mutations (R277X, IVS30+1G>T and A2215D); 19 polymorphisms and 13 intronic alterations. Biallelic mutations (homozygous or compound heterozygous) in the thyroglobulin gene were identified in twelve of thirteen patients. Functional studies in mammallian cells showed low secretion of the mutated thyroglobulin (A2215D). The complete analysis of the thyroid tissue from a patient with the A2215D mutation revealed: mutant thyroglobulin in the follicular cell but not in the lumen, marked dilatation of the endoplasmic reticulum, thyroglobulin immunopositivity in the endoplasmic reticulum and low concentration of thyroglobulin protein and mRNA. Furthermore, low mRNA levels of thyroid genes (TPO, TTF1, PAX-8, NIS, receptor de TSH) were detected. Conclusions: All the identified thyroglobulin gene mutations explained the congenital goiter hypothyroidism of the patients. The mutation A2215D promoted the retention of the mutant thyroglobulin in the endoplasmic reticulum, decreased the thyroglobulin secretion to the colloid resulting in an impairment of thyroid hormone synthesis and congenital hypothyroidism. The endogenous A2215D mutant thyroglobulin could be considered a regulator of follicular function mediated by the transcriptional suppression of thyroid genes.

A ?-talassemia, uma hemoglobinopatia, é caracterizada como um distúrbio hereditário monogênico onde a síntese das cadeias globínicas ? está alterada. Devido desiquilíbrio na relação entre as cadeias ? e ? produzidas, observa-se um excesso de cadeias ? livres, determinante da fisiopatologia da doença. As manifestações observadas são eritropoese ineficaz, hemólise extramedular, anemia, expansão medular, esplenomegalia, deformidades ósseas e acúmulo de ferro. Clinicamente classifica-se como ?-talassemia major (BTM) a forma mais grave da doença, devido à ausência de cadeias ? (?0) ou redução acentuada (?+) acarretando em dependência de transfusões sanguíneas periódicas, para sobrevivência. O traço ?-talassêmico (BTT) antes vistos como assintomáticos, também apresentam alterações, inclusive acúmulo de ferro e eritropoese ineficaz, mas não são dependentes de transfusão e tampouco passam por acompanhamento médico. Extremamente heterogênea, apresenta diversos fenótipos e mais de 300 alterações moleculares causadoras de ?-talassemia já foram descritas em todo mundo. O objetivo deste estudo foi identificar as mutações de ?-talassemia em Ribeirão Preto-SP e procurar associar tais alterações à avaliação hematológica e do status férrico, na tentativa de estabelecer uma relação genótipo-fenótipo. Para tanto, 27 BTM, 23 BTT e 28 controles foram recrutados no Ambulatório de Hemoglobinopatias, do HC/FMRP-USP de Ribeirão Preto. Por meio de PCR-Alelo Específico, pesquisamos as quatro mutações mais comuns no Brasil: CD39 (CAG->TAG), IVS1-110 (G->A), IVS1-6 (T->C) e IVS1-1 (G ->A). A distribuição foi 64% CD39, 26% IVS1-110 e 4% IVS1-6. A análise de covariância e comparação múltiplas, entre os grupos formados e o controle, revelou alterações hematológicas e no status férrico. Os pacientes BTM com a mutação CD39, em sua forma heterozigota ou homozigota, e heterozigotos para a IVS1-110, revelaram anemia grave e intensa sobrecarga de ferro. Os BTT heterozigotos para CD39 demonstraram comprometimento do metabolismo ferro e/ou eritropoese. A adoção de medidas paliativas e de monitoramento aos BTT faz-se necessária, uma vez que, alterações apresentadas associam-se a desordens graves, mas quando não negligenciadas podem ser facilmente prevenidas. A metodologia adotada demonstrou-se eficaz para a pesquisa das mutações estudadas. Embora tenhamos conseguido observar uma relação genótipo-fenótipo, um estudo multicêntrico da população brasileira proporcionará a identificação de mais relações, principalmente nos fenótipos menos prevalentes em nossa região, contribuindo para a compreensão da heterogeneidade da ?-talassemia. / The ?-thalassemia, one haemoglobinopathies, is characterized as a monogenic hereditary disorder where the synthesis of ? globin chains is modified. Due to imbalance in the relationship between production of ? and ? chains, there is an excess of free ? chain that determines the pathophysiology of the disease. Manifestations observed are ineffective erythropoiesis, extra medullary hemolysis, anemia, bone marrow expansion, splenomegaly, bone deformities and iron accumulation. Clinically is classified as ?-thalassemia major (BTM), the most severe form of the disease, as a result of the absence of ? chains (?0) or very large reduction of these (?+) resulting in dependence on regular blood transfusions to survive. The ?-thalassemia trait (BTT) before seen as asymptomatic, also show changes, including iron accumulation and ineffective erythropoiesis, despite of that they aren\'t dependent on transfusion nor undergo medical care. It is extremely heterogeneous, presents several phenotypes and more than 300 molecular changes that causing ?-thalassemia have been described worldwide. The purpose of this study was to identify ?-thalassemia mutations in Ribeirao Preto-Brazil and to explore changes in hematological evaluation and iron status in an attempt to establish a genotype-phenotype relationship. Therefore, a group of 27 BTM, 23 BTT and 28 controls were recruited from the outpatient clinic of hemoglobinopathies, from The Clinical Hospital of Medical School of Ribeirao Preto (HC / FMRP-USP), Brazil. Adopting the technique ARMS (Amplification Refractory Mutation System), we searched for the four most common mutations in Brazil: CD39 (CAG -> TAG), IVS1-110 (G -> A), IVS1-6 (T -> C) and IVS1-1 (G -> A). The distribution was 64% presents CD39 mutation, followed by IVS1-110 e IVS1-6, with 26% and 4% respectively. Covariance Analysis and multiple comparison between the studies groups and control, showed differences in hematological parameters and in iron status either. The BTM heterozygous or homozygous for CD39 mutation and heterozygous for IVS1-110 revealed severe anemia and iron overload. The BTT heterozygous for CD39 showed impairment of iron metabolism and / or erythropoiesis. It is necessary the monitorization of the BTT patients is necessary, since changes presented by them are associated with serious disorders, the adoption of mitigation measures which when are not neglected can be easily prevented. The methodology proved to be effective for the investigation of mutations studied. While we were able to observe a genotype-phenotype relationship, a multicenter study of the Brazilian population will provide the identification of more relations, especially in less prevalent phenotypes in our region, contributing to the understanding of the heterogeneity of ?-thalassemia.

Marine bivalves are a group of species composed of clams, mussels and oysters. Bivalves are keystone species in coastal ecosystems and represent an increasingly important segment of the global aquaculture industry. Domestication of shellfish species is in the early stages, with few organized breeding programmes and a heavy reliance on wild seed. Consequently, the development and use of genomic markers may significantly assist shellfish aquaculture breeding and production. However, molecular genetic markers typically exhibit unusual patterns of segregation in bivalve species, which result in deviations from Mendelian expectations, and could potentially limit their use in parental assignment, mapping of quantitative trait loci and genomic prediction. Previous studies have suggested that segregation distortions originate at the larval stage, as a result of the linkage of markers to deleterious mutations. This high genetic load has been associated with the high fecundity of bivalve species. However, no direct evidence of a high incidence of de novo mutations has been provided. The aim of this thesis is to gain further insight into segregation distortions in bivalve species by studying the phenomenon at a genome-wide scale, using modern high-throughput sequencing technology. The studies presented in this thesis derive from experiments involving genotyping of parents and offspring from pair-crosses of three different bivalve species (the Pacific oyster Crassostrea gigas, the Blue mussel Mytilus edulis, and the GreenshellTM mussel Perna canaliculus) using high throughput sequencing and SNP arrays. The parent and offspring genotype data were used to characterize patterns of segregation distortion at a genome-wide level, followed by exploratory analyses to test hypotheses related to possible causes of this distortion. Three main findings resulted from the genome-wide analysis of segregation patterns. First, by using Restriction site Associated DNA sequencing (RAD-Seq) we observe that technical artefacts are more widespread than previously considered, contributing to apparent distortions via unreliable genotype calls. By analysing read depth data from RAD-Seq, we suggest that apparent homozygous genotype calls may actually be hemizygous, suggesting a very high frequency of null alleles which contribute to distorted segregation patterns. Bioinformatic pipelines to improve RAD-Seq locus assembly and marker genotyping for bivalve species are presented. Second, by using a high-density SNP array and RAD-Seq in pair crosses of Pacific oyster and aligning to the reference genome assembly, we find that segregation distortions cover extensive regions of the genome, and that certain genomic regions are consistently distorted in different families. Finally, following previous suggestions that the reproductive strategies of bivalve species may favour a high mutation rate, we provide preliminary evidence of a high incidence of de novo mutations that appear spontaneously (i) during male and female gamete formation and (ii) post-zygotically, during larval development. This putative high de novo mutation rate is likely to also contribute to deviations from Mendelian inheritance patterns in these species. New genomic technologies have allowed us to gain substantial insight into the intriguing yet poorly understood phenomena related to inheritance in bivalve species. The results have both fundamental and practical implications for genetic analysis interpretation and selective breeding for aquaculture in this large and highly diverse group of species.

Por muitos anos o fluconazol tem sido uma opção usual para tratamento de infecções por Candida. Entretanto, o uso indiscriminado desta terapia antimicótica tem favorecido o surgimento de microrganismos resistentes. A redução da afinidade da enzima alvo dos antifúngicos, 14--demetilase (ERG11p), tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência, caracterizado por mutações em seu gene codificante ERG11. Neste estudo, foi investigada a suscetibilidade ao fluconazol de 87 isolados de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei e C. glabrata, com valores de MIC determinados através do método de microdiluição em caldo M27-A3 (CLSI, 2008); verificou-se que dezessete isolados apresentavam decréscimo da suscetibilidade ao fluconazol. A triagem de mutações foi realizada através da amplificação de quatro regiões do gene ERG11 com primers específicos delineados neste estudo, para cada espécie de Candida, seguida de análise pela técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado. Foram identificadas 217 mutações, incluindo 185 silenciosas e 32 por troca de sentido (que altera o aminoácido resultante). Estas últimas foram observadas em 19 isolados e 17 resíduos distintos, sendo 7 deles ainda não descritos anteriormente: L321F em C. albicans; K53M em C. krusei; Y221F, K344T, V362M e R371S em C. tropicalis; e R398I em C. parapsilosis. Confrontando os resultados entre a técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado, não houve associação direta entre as mudanças na migração eletroforética e alterações na seqüência nucleotídica do gene ERG11. Sugerimos que a freqüência elevada de alterações no gene ERG11 de Candida deve ser considerada no design de novos fármacos que visem a enzima ERG11p / For many years, fluconazole has been a usual option for treatment of Candida infections. However, the indiscriminate use of antimycotic therapy has favored the emergence of resistant organisms. The decrease in the affinity of the enzyme target of antifungal agents, 14--demethylase (ERG11p), has been described as an important mechanism of resistance, characterized by mutations in its encoding gene ERG11. In this study, we investigated the susceptibility to fluconazole of 87 strains of C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei and C. glabrata with MIC values determined by broth microdilution M27-A3 (CLSI, 2008), found that seventeen isolates showed decreased susceptibility to fluconazole. Mutation screening was performed by the amplification of four regions of the ERG11 gene with specific primers designed in this study for each Candida species, followed by electrophoresis SSCP analysis and sequencing. We identified 217 mutations, including 185 silent mutations and 32 missense mutations. Missense mutations were observed in 19 isolates and 17 distinct residues, 7 of them still not described earlier: L321F in C. albicans, K53M in C. krusei; Y221F, K344T, V362M and R371S in C. tropicalis, and R398I in C. parapsilosis. Comparing the results between SSCP electrophoresis technique and sequencing, there was no direct association between changes in electrophoretic migration and changes in the nucleotide sequence of the ERG11 gene. We suggest that the high frequency of changes in ERG11 gene of Candida should be considered in the design of new drugs targeting the enzyme ERG11p

All cellular forms of life contain Deoxyribonucleic acid (DNA). DNA is a molecule that carries all the information necessary to perform both, basic and complex cellular functions. DNA is replicated to form new tissue/organs, and to pass genetic information to future generations. DNA replication ideally yield an exact copy of the original DNA. While replication generally occurs without error, it may leave DNA vulnerable to accidental changes via mistakes made during the replication process. Those changes are called mutations. Mutations range in magnitude. Yet, mutations of any magnitude range in consequences, from no effect on the organism, to disease initiation (e.g. cancer), or even death. In this thesis, we limit our focus to mutations in human DNA, and in particular, MMBIR mutations. Recent literature in human genomics has found Microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) to be a common mechanism producing complex mutations in DNA. MMBIRFinder is a tool to detect MMBIR regions in Yeast DNA. Although MMBIRFinder is successful on Yeast DNA, MMBIRFinder is not capable of detecting MMBIR mutations in human DNA. Among several reasons, one major reason for its deficiency with human DNA is the amount of computations required to process human large data. Our contribution in this regard is two fold: 1) We utilize parallel computations to significantly reduce the processing time consumed by the original MMBIFinder, and address several performance degrading issues inherent in the original design; 2) We introduce a new heuristic to detect MMBIR mutations that were not detected by the original MMBIRFinder, even in the case of small sized DNA, like Yeast DNA.