O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

abstract: Many Fic domain proteins, through catalyzing post translational modifications (PTM) of protein substrates, functionally contribute to bacterial pathogenesis and the regulation of bacterial growth. Furthermore, one form of Fic-mediated regulation is the Fic toxin-antitoxin system, whereby an antitoxin interacts with and inhibits the Fic toxin. This study sought to determine the functional importance of Mycobacterium tuberculosis Fic and its putative antitoxin protein, Rv3642c. Using M. tuberculosis H37Rv genetic deletion mutants, fic and Rv3642c were demonstrated to promote intracellular survival in human THP-1 macrophage-like cells. Unlike other Fic toxins, of Fic toxin-antitoxin systems, Fic did not inhibit bacterial growth in vitro in the absence of Rv3642c. Notably, Fic demonstrated in vitro AMPylation of a THP-1 cell extract protein as shown by immunodetection. Fic also exhibited auto-AMPylation activity. Interestingly, a mutation of the conserved histidine in the Fic domain motif, a residue previously shown to be critical for AMPylation, had no effect on Fic-mediated ATP hydrolysis or AMPylation activity. Rv3642c was demonstrated to form a complex with Fic when co-expressed in Escherichia coli, indicating a toxin-antitoxin interaction. Screening M. tuberculosis protein fractions and culture filtrate with α-Fic and α-Rv3642c rabbit antisera did not detect monomers of Fic or Rv3642c, thus the cellular localization of Fic and the Rv3642c-Fic complex remains unclear. The results of this study provide insight into the function of M. tuberculosis Fic, and suggest that Fic and Rv3642c are important for M. tuberculosis survival in the intracellular macrophage environment. Furthermore, these findings challenge the current dogma that Fic domain catalysis is dependent on the conserved histidine of the Fic motif. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Molecular and Cellular Biology 2017

L'ulcère de Buruli est une maladie infectieuse tropicale présente dans des foyers endémiques. Cette infection essentiellement cutanée est causée par Mycobacterium ulcerans. M. ulcerans est un pathogène opportuniste dont le réservoir est environnemental. Notre revue de la littérature a répertorié les sources environnementales potentielles de cette mycobactérie. Seulement cinq souches de M. ulcerans ont été isolées à partir de prélèvements de l’environnement. Il existe une corrélation inverse entre réchauffement climatique et incidence de l’ulcère de Buruli, peut-être liée à la sensibilité intrinsèque de M. ulcerans aux variations de température, ou bien à des modifications de son écosystème. Dans la perspective d’améliorer les protocoles d’isolement de M. ulcerans à partir de l’environnement, nous avons entrepris une analyse phénotypique à haut débit des substrats carbonés métabolisés par M. ulcerans et le profil obtenu nous a orientés après une recherche bibliographique des principales sources environnementales de ces substrats, vers des interactions plus spécifiques de M. ulcerans avec les bactéries, algues, mollusques et champignons. Les résultats de ce premier travail ont servi de base pour la mise au point de milieux de culture innovants qui nous ont permis d’isoler pour la première fois, une microcolonie de M. ulcerans à partir de fèces d’agouti. Nous avons mis au point une méthode de lecture automatisée des échantillons colorés par la méthode de Ziehl-Neelsen. Notre travail de thèse a produit des protocoles qui ont pour objectif d’être mis en œuvre dans les pays d’endémie, pour préciser les sources et modes de transmission de M. ulcerans aux populations. / Buruli ulcer is a tropical infectious disease present in endemic foci/This mainly cutaneous infection is caused by Mycobacterium ulcerans. M. ulcerans is an opportunistic pathogen from the environment. Our literature review has listed the potential environmental sources of this mycobacterium.. However, only five strains of M. ulcerans have been isolated from environmental samples. There is an inverse correlation between global warming and incidence of Buruli ulcer, possibly related to the intrinsic sensitivity of M. ulcerans to temperature, or to changes in its ecosystem. In order to improve the isolation protocols of M. ulcerans from the environment, we conducted a high-throughput phenotypic analysis of the carbon substrates metabolized by M. ulcerans and the profile obtained oriented us afterwards a bibliographic search of the main environmental sources of these substrates, towards more specific interactions of M. ulcerans with other bacteria, algae, molluscs and fungi. The results of this first work served as a basis for the development of innovative culture media which, allowed us to isolate for the first time a microcolony of M. ulcerans from feces of agouti. We also developed a method for automated reading of samples stained by Ziehl-Neelsen staining. Our thesis work has produced protocols that are intended to be implemented in African endemic countries, in order to clarify the sources and modes of transmission of M. ulcerans to populations.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-09Bitstream added on 2014-06-13T18:31:20Z : No. of bitstreams: 1 pavan_fr_me_arafcf.pdf: 465333 bytes, checksum: a257ef7f9c510b42345a93dc770ca838 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Mycobacterium tuberculosis, principal agente da tuberculose (TB), é responsável pela morte anual de dois a três milhões de pessoas no mundo e por prejuízos econômicos globais de aproximadamente 12 bilhões de dólares ao ano. Estima-se que 1/3 da população mundial esteja infectada com o bacilo na forma latente. Apesar disso, nenhuma nova droga específica contra o M. tuberculosis foi desenvolvida desde 1960. O presente trabalho objetivou a investigação do potencial anti-M. tuberculosis intra e extracelular juntamente com a citotoxicidade de 66 compostos envolvendo diferentes classes de ligantes como tiossemicarbazonas, semicarbazonas, hidrazonas, diiminas, fosfinas e bases de Schiff, juntamente com dois diferentes metais (vanádio e rutênio) formando diferentes e inéditos complexos. Para as diferentes análises biológicas in vitro, 3 técnicas já padronizadas foram utilizadas para a detecção da Concentração Inibitória Mínima (CIM), da Citotoxicidade (IC50) e da Atividade Intracelular. Dos 66 compostos analisados neste trabalho, 7 complexos contendo o rutênio, cis-[RuCl2(NO)(BPA)] (G1), cis- [Ru(pic)(dppe)2]PF6 (G6), [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (G7), [Ru(pic)(dppb)(Mebipy)] PF6 (G8), [Ru(pic)(dppb)(Cl-bipy)]PF6 (G9), [Ru(pic)(dppb)(fen)] (G12), cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] (G14), foram qualificados como potenciais agentes anti- TB, porque apresentaram atividade inibitória melhor do que algumas drogas comumente utilizadas no tratamento da tuberculose, baixa citotoxicidade e alta atividade inibitória intracelular. / The Mycobacterium tuberculosis, the major agent of tuberculosis (TB), is responsible for approximately 2-3 million deaths annually, with a global economic injury of approximately $12 billion per year. It is estimated that 1/3 of the worldwide population are infected with the latent form bacilli. Although, no new specific drug against M. tuberculosis was developed since 1960. The objective of this study was the investigation of intra and extracellular anti-M. tuberculosis activity and cytotoxicity of 66 compounds involving different class of ligants as thiosemicarbazones, semicarbazones, hydrazones, diimines, phosphines and Schiff bases with two different metals (vanadium and ruthenium) resulting different and unknown complexes. For the different biologicals in vitro analyses, three standardized techniques had been used for the detection of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC), Cytotoxicity (IC50) and Intracellular Activity. Of 66 compounds analyzed in this study, 7 complexes containing the ruthenium, cis-[RuCl2(NO)(BPA)] (G1), cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (G6), [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (G7), [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (G8), [Ru(pic)(dppb)(Cl-bipy)]PF6 (G9), [Ru(pic)(dppb)(fen)] (G12), cis- [RuCl2(dppb)(bipy)] (G14), were qualified as potential anti-TB agents, because they presented inhibitory activity better than some drugs commonly used in the TB treatment, low cytotoxicity and high intracellular inhibitory activity.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-14Bitstream added on 2014-06-13T18:55:59Z : No. of bitstreams: 1 prince_ka_me_arafcf.pdf: 475821 bytes, checksum: 2cb63318a8694f13dc0ed4139cca5f2b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O problema da tuberculose no Brasil, reflete o desenvolvimento social do país, onde novas causas concorrem para o agravamento, como a epidemia de AIDS e também a multiresistência às drogas. Portanto, torna-se necessária a busca de novas alternativas terapêuticas, como a utilização de novos princípios ativos sintéticos e/ou extraídos de plantas. Em muitas partes do Brasil, existe uma rica tradição no uso de plantas medicinais para a cura de várias doenças infecciosas. Este trabalho teve como objetivo a pesquisa de metabólitos secundários bioativos de fungos endofíticos de plantas do cerrado, com atividade contra o Mycobacterium tuberculosis. Este trabalho faz parte do projeto temático “Conservação, Sustentabilidade e Uso de Plantas do Cerrado e da Mata Atlântica: Diversidade Química e Prospecção de Drogas em Potencial” dentro da linha de pesquisa “Bioprospecção em Fungos Endofíticos de Espécies Vegetais do Cerrado e da Mata Atlântica’. Neste estudo, a partir de 3 plantas do Cerrado, foram isolados 11 fungos endofíticos e destes obtidos 16 extratos brutos e 1 substância pura. A atividade anti- M. tuberculosis, foi determinada empregando o MABA, determinando a concentração inibitória mínima (CIM) de composto necessária para inibir a multiplicação de 90% das células micobacterinas. Dos 17 extratos brutos testados 3 apresentaram CIM > 250 µg/mL (17,6%), em 7 o valor de CIM foi de 250 µg/mL (41,2%), em 3 de 125 µg/mL (17,6%), em 2 de 62,5 µg/mL (11,8 %) e em outros 2 de 31,25 µg/mL (11,8%). A substância purificada, identificada como ácido pirenochaético, apresentou excelente atividade antimicobacteriana, com valor de CIM de 3,9 µg/mL. O estudo revelou atividade anti- M. tuberculosis promissora em 7 extratos brutos testados (41,2%), e na substância pura. / The tuberculosis in Brazil shows the social development problem in the country, as there are several new causes increasing the numbers, like HIV epidemic and the drugs multi-resistance. Therefore it’s necessary the research of alternative therapies as the use of new synthetic compounds and plant extracts. In most parts of Brazil, there is the tradition in the use of medical plants to the cure of various infectious diseases. The objective of this work was to research of bioactive secondary metabolites from endophytic fungi of “Cerrado” plants active against Mycobacterium tuberculosis. This work is part of the thematic project “Conservation, Sustentability and the Use of “Cerrado” Plants and from Atlantic Forest: Chemistry Diversity and Drugs Potential Prospecting” inside the research line “Bioprospection in Endophytic Fungi from Vegetable Species of “Cerrado” and Atlantic Forest”. From 3 plants of “Cerrado”, was isolated 11 endophytic fungi and from this, was obtained 16 crude extracts and 1 pure substance. The activity against M. tuberculosis was determined using the MABA, finding the minimal inhibitory concentration (MIC) of the drug necessary to inhibit the multiplication of 90% of bacillary growth. From 17 crude extracts tested, 3 showed MIC >250 μg/mL (17.6%), in 7, the MIC value was of 250 μg/mL (41.2%), in 3 of 125 μg/mL (17.6%), in 2 of 62.5μg/mL (11.8%) and in the last 2 was of 31.25 μg/mL (11.8%). The purified fraction, identified as pirenochaetic acid presented excellent activity against M. tuberculosis with MIC value of 3.9μg/mL. The study showed promising activity against M. tuberculosis in 7 crude extracts tested (41.2%) and at the pure substance.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-31. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:17:02Z : No. of bitstreams: 1 000858669.pdf: 1471775 bytes, checksum: ca6c2e33abaf19566d54a77422e3397e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa transmitida pelo ar, curável e afeta principalmente os pulmões. Nos últimos anos, a taxa de mortalidade vem reduzindo, entretanto, cepas resistentes e a co-infecção TB/HIV têm dificultado as tentativas de controle da doença, levando ao aumento da mortalidade. Outro fator preocupante é que um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis (MTB) em estado de latência, o qual serve como reservatório para TB ativa. No esforço de sanar esta falha, é crescente a importância da Química Bioinorgânica como um aliado na pesquisa de novos fármacos anti-TB. O Rutênio (Ru) é um elemento químico que apresenta capacidade de mimetizar o Ferro (Fe) em nosso organismo, apresentando baixa toxicidade e capaz de formar complexos estáveis, este elemento vem sendo estudado desde a década de 80 como possível substituto da Platina (Pt), metal central da estrutura da cisplatina utilizada em tratamentos antineoplásicos. Em estudos anteriores envolvendo os complexos heterolepticos de rutênio: [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (SCAR1); [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (SCAR2); [Ru(pic)(dppb)(phen)]PF6 (SCAR4); cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (SCAR5); cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] (SCAR6) e [Ru(pic)(dppe)(phen)] PF6 (SCAR7), foi observada excelente atividade anti-TB, uma moderada toxicidade celular e a falta de biodisponibilidade oral em modelo in vivo desses complexos, desse modo, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a toxicidade e biodisponibilidade oral desses complexos nanoencapsulados. Estes sistemas nanoestruturados foram desenvolvidos utilizando diferentes proporções de tensoativo (fosfatidilcolina de soja, Emulgin® e oleato de sódio), fase aquosa (tampão fosfato pH 7,4) e oleosa (colesterol), afim de se obter um sistema para incorporação dos compostos de rutênio. O sistema foi caracterizado através das análises de reologia, tamanho de partículas e potencial zeta. A atividade... / Tuberculosis (TB) is an infectious airborne disease, curable and mainly affects the lungs. In recent years, the death rate has been decreasing, however, resistant strains and co-infection TB / HIV have hampered the disease control efforts, leading to increased mortality. Another troubling factor is that one third of the world's population is infected with Mycobacterium tuberculosis (MTB) in a state of latency, which serves as a reservoir for active TB. In an effort to remedy this failure, it is increasing the importance of bioinorganic chemistry as an ally in the new anti-TB drug research. The Ruthenium (Ru) is a chemical element that has the capacity to mimic the iron (Fe) in our body, with low toxicity and able to form stable complexes, this element has been studied since the 80's as a possible substitute for platinum (Pt ), the central metal structure of cisplatin used in anticancer treatments. In previous studies involving heteroleptic ruthenium complexes: [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (SCAR1); [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (SCAR2); [Ru(pic)(dppb)(phen)]PF6 (SCAR4); cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (SCAR5); cis[RuCl2(dppb)(bipy)] (SCAR6) and [Ru(pic)(dppe)(phen)]PF6 (SCAR7), we observed an excellent anti-TB activity, moderate cell toxicity and lack of oral bioavailability in vivo model of these complexes thus the main objective of this study was to evaluate the toxicity and oral bioavailability of those nano-coated complexes. These nanostructured systems have been developed using different ratios of surfactant (soybean phosphatidylcholine, Emulgin® and sodium oleate), aqueous phase (phosphate buffer pH 7.4) and oil (cholesterol) in order to obtain a system for incorporating the compounds of ruthenium. The system was characterized by analyzes rheology, particle size and zeta potential. The anti-TB activity of the compounds was determined by the microdilution assay with Resazurin (REMA) compared to strains of M. tuberculosis H37Rv and clinical isolates... / FAPESP: 13/14957-5

Submitted by GUILHERME FELIPE DOS SANTOS FERNANDES null (guilhermefelipe@outlook.com) on 2016-06-29T18:50:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Final - Guilherme - Volume 1 e 2.pdf: 19109367 bytes, checksum: 006d994bad51f023d9c3cb161ae8cf89 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-04T12:29:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandes_gfs_me_arafcf.pdf: 19109367 bytes, checksum: 006d994bad51f023d9c3cb161ae8cf89 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-04T12:29:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandes_gfs_me_arafcf.pdf: 19109367 bytes, checksum: 006d994bad51f023d9c3cb161ae8cf89 (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Mycobacterium tuberculosis (MTB), principal agente da tuberculose (TB), é responsável pela morte anual de 1,5 milhões de pessoas no mundo. Atualmente, uma das grandes preocupações mundiais é o aumento do número de casos de TB multirresistente a fármacos (MDR-TB) e TB extensivamente resistente a fármacos (XDR-TB) devido à elevada taxa de mortalidade, dificuldade de tratamento e os altos custos envolvidos nessas condições. A bedaquilina foi o último fármaco aprovado pela agência norte americana - Food and Drug Administration (FDA) - para tratamento da MDR-TB e XDR-TB, após um intervalo de mais de 50 anos sem novos fármacos. Todos estes fatos justificam a descoberta de fármacos mais seguros e efetivos contra formas sensíveis e resistentes do MTB. Entre os fármacos utilizados no tratamento da tuberculose, a isoniazida (INH) é um dos principais representantes da primeira linha de tratamento. Além disso, compostos contendo a função N-óxido como os furoxanos e as quinoxalinas têm sido descritos como protótipos para descoberta de novos fármacos anti-TB. O objetivo deste trabalho foi o planejamento, síntese e avaliação antituberculose de novas moléculas híbridas entre furoxanos e INH (série 1) e quinoxalinas e INH (série 2). Nesse contexto, sintetizamos e caracterizamos onze moléculas híbridas finais da série 1 e sete derivados quinoxalínicos da série 2 e avaliamos a atividade anti-TB contra cepas de MTB H37Rv e isolados clínicos multirresistentes. As moléculas apresentaram valores de concentração inibitória mínima (CIM) entre 1,03 – 101 µM. Quatro moléculas da série 1 se mostraram promissoras e foram avaliadas quanto a sua citotoxicidade (IC50) em células MRC-5 e J774A.1. As moléculas da série 2 não foram consideradas promissoras devido aos baixos valores de índice de seletividade (IS). O índice de seletividade das moléculas da série 1 variaram de 3,78 - 52,74 em células MRC-5 e 1,25 – 34,78 em células J774A.1. Além disso, as moléculas da série 1 apresentaram atividade em diversas cepas multirresistentes, com valores de CIM variando de 1,44 a 23,53 µM. Os derivados furoxânicos da série 1 foram capazes de liberar óxido nítrico em uma faixa de 0,16 – 44,23%. Verificou-se que a atividade antituberculose das moléculas desta série está relacionada em parte com esta liberação de óxido nítrico. A molécula mais promissora da série 1 foi estável em diferentes pHs (5.0 e 7.4) em estudos de estabilidade química. Além disso, foi caracterizado que os valores de logPo/w das moléculas de ambas variaram entre 0.7 a 2.9. Em conclusão, os novos derivados furoxânicos identificados neste trabalho apresentam-se como compostos promissores úteis para o tratamento da tuberculose, incluindo MDR-TB. / Mycobacterium tuberculosis, the main agent of tuberculosis, is responsible for the annual death of 1.5 million people worldwide. Currently, one of the major global concerns is the increasing number of cases of multi drug-resistant tuberculosis (MDR-TB) and extensively drug resistant tuberculosis (XDR-TB) due to the high mortality rate, difficulty of treatment and the high costs involved. Bedaquiline was the last drug approved by the north american agency - Food and Drug Administration - to treat MDR-TB and XDR-TB after a gap of more 50 years without new drugs. All these facts justify the need for discovery of new drugs for treatment. Isoniazid is one of the main first line drugs used to treat tuberculosis. Compounds containing the N-oxide functions, such as furoxans and quinoxalines, have been described as prototypes for discovery novel anti-TB drugs. The aim of this work was the planning, synthesis and biological evaluation of novel hybrid molecules between furoxan and INH (Series 1) and quinoxaline and INH (Series 2). In this context, we have synthesized and characterized eleven hybrid molecules of series 1 and seven molecules of series 2. Moreover, we have evaluated the anti-TB activity of these molecules against MTB H37Rv strains and multidrug-resistant clinical isolates. The compounds exhibited minimum inhibitory concentration ranging from 1,03 to 101 µM. Four molecules from series 1 have shown promising antitubercular activity and were evaluated regarding their cytotoxicity against J774A.1 and MRC-5 cells. The molecules of series 2 were not considered promising due to their low selectivity index values. The selectivity index of these four molecules ranged from 3.78 to 52.74 in MRC-5 cells and 1,25 - 34,78 in J774A.1 cells. Furthermore, the molecules have shown activity against several multidrug-resistant strains, with MIC values ranging between 1.44 – 23.53 µM. The furoxan derivatives were capable to release nitric oxide at levels ranging from 0,16 - 44,23%. It was observed that the antitubercular activity of these molecules seems to be related in part to the nitric oxide release. The most promising compound of series 1 was stable at different pHs (5.0 and 7.4) evaluated through chemical stability studies. Furthermore, it was characterized that logPo/w values from both series ranged from 0.7 to 2.9. In conclusion, the new furoxan derivatives have shown promising antitubercular activity useful for the treatment of tuberculosis, including MDR-TB. / FAPESP: 2014/02240-1 / FAPESP: 2014/24811-0

Submitted by ELOISE BRASIL DE MORAES null (eloise.moraes@hotmail.com) on 2016-09-27T17:52:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Eloise Brasil de Moraes 27092016.pdf: 3256270 bytes, checksum: 552f07ca0be78ccc829982a34ef04bcf (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-29T14:30:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moraes_eb_me_bot.pdf: 3256270 bytes, checksum: 552f07ca0be78ccc829982a34ef04bcf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T14:30:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moraes_eb_me_bot.pdf: 3256270 bytes, checksum: 552f07ca0be78ccc829982a34ef04bcf (MD5) Previous issue date: 2016-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tuberculosis (TB) is a major cause of mortality, and Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), the causative agent. The study of molecular epidemiology associated with classical epidemiology, provides an understanding of the spread of M. tuberculosis and ads in epidemiological investigation, determining outbreaks and risk factors for transmission in the population. This study aimed to provide a more accurate view of the molecular epidemiology and genetic diversity of M. tuberculosis by MIRU-VNTR technique and get a better understanding of the relevance of the epidemiological and clinical potential of RDRio genotype in municipalities in the state of São Paulo, investigating possible associations with clinical and epidemiological data. Besides this study investigate possible transmission between contacts of patients with TB. Heterogeneity was observed in both regions that were grouped independently in phylogenetic analysis. Nevertheless some specific isolated from both regions showed high genetic similarity. When investigated epidemiological data of these patients 30% were from prisons. This suggests a recent transmission process within the penitentiaries to the general community between these two regions. Although the clustering rate found to be low, we noted in cluster formation the presence again of patients sharing the same genetic profile in different penitentiaries suggesting once more a transmission between distinct prision units. Regarding RDRio deletion was found high statistical significance for the factors and alcohol use by age group, with conflicting data already published in the literature. The results generated interesting questions that should be addressed in the future. / A tuberculose (TB) é uma importante causa de mortalidade, sendo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) o agente etiológico. O estudo da epidemiologia molecular associada à epidemiologia clássica propicia a compreensão da disseminação de M. tuberculosis e auxilia na investigação epidemiológica, determinando surtos e fatores de risco para a transmissão na população. Este estudo teve como objetivo fornecer uma visão mais apurada sobre a epidemiologia molecular e a diversidade genética de M. tuberculosis pela técnica de MIRU-VNTR e também obter um melhor entendimento da relevância do potencial epidemiológico e clínico do genótipo RDRio em cepas de municípios do Estado de São Paulo investigando as possíveis associações com dados clínicos e epidemiológicos. Além de investigar uma possível transmissão entre contatos de pacientes com TB. Foi observada uma heterogeneidade nas duas regiões que se agruparam independentemente na análise filogenética. Apesar disso alguns isolados específicos das duas regiões apresentaram alta similaridade genética. Quando investigado dados epidemiológicos desses pacientes 30% deles eram provenientes de unidades prisionais. O que sugere um processo de transmissão recente de dentro das penitenciárias para a comunidade geral entre essas duas regiões. Apesar de a taxa de agrupamento encontrada ser baixa, observamos na formação de cluster a presença novamente de pacientes compartilhando mesmo perfil genético dentro de penitenciárias distintas, sugerindo ainda transmissão entre unidades prisionais diferentes. Com relação à deleção RDRio foi encontrado alta significância estatística para os fatores etilismo e por faixa etária, dados divergentes com os já publicados na literatura. Os resultados geraram perguntas interessantes que devem ser abordados em estudo futuros. / FAPESP: 2013/09538-3

Orientador : Fernando Rogério Pavan / Coorientador: Patricia Bento da Silva / Banca:Marlus Chorilli / Banca: Amauri Antonio Menegário / Resumo: A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa transmitida pelo ar, curável e afeta principalmente os pulmões. Nos últimos anos, a taxa de mortalidade vem reduzindo, entretanto, cepas resistentes e a co-infecção TB/HIV têm dificultado as tentativas de controle da doença, levando ao aumento da mortalidade. Outro fator preocupante é que um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis (MTB) em estado de latência, o qual serve como reservatório para TB ativa. No esforço de sanar esta falha, é crescente a importância da Química Bioinorgânica como um aliado na pesquisa de novos fármacos anti-TB. O Rutênio (Ru) é um elemento químico que apresenta capacidade de mimetizar o Ferro (Fe) em nosso organismo, apresentando baixa toxicidade e capaz de formar complexos estáveis, este elemento vem sendo estudado desde a década de 80 como possível substituto da Platina (Pt), metal central da estrutura da cisplatina utilizada em tratamentos antineoplásicos. Em estudos anteriores envolvendo os complexos heterolepticos de rutênio: [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (SCAR1); [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (SCAR2); [Ru(pic)(dppb)(phen)]PF6 (SCAR4); cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (SCAR5); cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] (SCAR6) e [Ru(pic)(dppe)(phen)] PF6 (SCAR7), foi observada excelente atividade anti-TB, uma moderada toxicidade celular e a falta de biodisponibilidade oral em modelo in vivo desses complexos, desse modo, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a toxicidade e biodisponibilidade oral desses complexos nanoencapsulados. Estes sistemas nanoestruturados foram desenvolvidos utilizando diferentes proporções de tensoativo (fosfatidilcolina de soja, Emulgin® e oleato de sódio), fase aquosa (tampão fosfato pH 7,4) e oleosa (colesterol), afim de se obter um sistema para incorporação dos compostos de rutênio. O sistema foi caracterizado através das análises de reologia, tamanho de partículas e potencial zeta. A atividade... / Abstract: Tuberculosis (TB) is an infectious airborne disease, curable and mainly affects the lungs. In recent years, the death rate has been decreasing, however, resistant strains and co-infection TB / HIV have hampered the disease control efforts, leading to increased mortality. Another troubling factor is that one third of the world's population is infected with Mycobacterium tuberculosis (MTB) in a state of latency, which serves as a reservoir for active TB. In an effort to remedy this failure, it is increasing the importance of bioinorganic chemistry as an ally in the new anti-TB drug research. The Ruthenium (Ru) is a chemical element that has the capacity to mimic the iron (Fe) in our body, with low toxicity and able to form stable complexes, this element has been studied since the 80's as a possible substitute for platinum (Pt ), the central metal structure of cisplatin used in anticancer treatments. In previous studies involving heteroleptic ruthenium complexes: [Ru(pic)(dppb)(bipy)]PF6 (SCAR1); [Ru(pic)(dppb)(Me-bipy)]PF6 (SCAR2); [Ru(pic)(dppb)(phen)]PF6 (SCAR4); cis-[Ru(pic)(dppe)2]PF6 (SCAR5); cis[RuCl2(dppb)(bipy)] (SCAR6) and [Ru(pic)(dppe)(phen)]PF6 (SCAR7), we observed an excellent anti-TB activity, moderate cell toxicity and lack of oral bioavailability in vivo model of these complexes thus the main objective of this study was to evaluate the toxicity and oral bioavailability of those nano-coated complexes. These nanostructured systems have been developed using different ratios of surfactant (soybean phosphatidylcholine, Emulgin® and sodium oleate), aqueous phase (phosphate buffer pH 7.4) and oil (cholesterol) in order to obtain a system for incorporating the compounds of ruthenium. The system was characterized by analyzes rheology, particle size and zeta potential. The anti-TB activity of the compounds was determined by the microdilution assay with Resazurin (REMA) compared to strains of M. tuberculosis H37Rv and clinical isolates... / Mestre

Em todo o mundo, menos de 5% dos doentes com tuberculose (TB), sejam casos novos ou previamente tratados, tem a avaliação dos isolados quanto ao perfil de sensibilidade aos antibioticos. No Rio Grande do Sul, estado localizado no sul do Brasil, cerca de 4700 casos novos de TB são registrados a cada ano, com uma taxa de cura de 68,9%, e uma taxa de abandono de 7,5%. A identificação rápida da resistência às drogas, em isolados clínicos de M. tuberculosis é importante para o estabelecimento de uma quimioterapia eficaz bem como para evitar a propagação de cepas resistentes. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os pacientes de TB com maior risco de possuir TB-­‐MDR, analisando o perfil de resistência às drogas dos isolados e o perfil epidemiológico desses pacientes. Além disso utilizou-­‐se as amostras clínicas para avaliar o teste comercial (GenoType® MTBDRplus) e para desenvolver e padronizar um novo teste (Detect-­‐TBMR) para detectar as mutações mais frequentes associadas a resistência à INH e RIF. Uma proporção significativamente maior (75% versus 20%, p = 0,009) de pacientes do gênero masculino foi encontrada entre os casos resistentes às drogas do que entre os casos suscetíveis. 43,8% dos pacientes demoraram mais de 30 dias para procurar assistência médica e no grupo TB MDR, 25% dos casos não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio anti-­‐TB. Em nossas amostras, encontramos uma proporção de 48,3% de TB-­‐ MDR. A família T foi a família de spoligotipo mais frequente. Comparado com o método da proporções, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foram 82% e 94% para a resistência à RIF, 60% e 94% para resistência à INH. Comparado com sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foi 92% e 97% para a resistência à RIF e 100% e 100% para a resistência à INH, respectivamente. Para detectar resistência à RIF e INH, o ensaio Detect-­‐TBMDR mostrou sensibilidade e especificidade de 79,3% e 77,0% e 100% e 65%, respectivamente, em comparação com o método da proporções. Comparado com o sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio Detect-­‐TBMDR foi de 81,2% e 94,7% e 100% e 96,2%, para detectar e resistência à RIF e INH, respectivamente. Ainda existem discordâncias entre o método das proporções e a abordagem molecular, particularmente em relação a resistência à INH. Contudo, estes métodos são muito importantes para o manejo mais rápido e correto dos pacientes, auxiliando na escolha do melhor esquema terapêutico. / In most parts of the world, less than 5% of new and previously treated tuberculosis (TB) patients are tested for multidrug resistance (MDR) TB. In Rio Grande do Sul state, the southern most Brazilian state; approximately 4700 new cases of TB are recorded each year, with a cure rate of 68.9%, and a noncompliance rate of 7.5%. Rapid identification of drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis is important to facilitate rapid and adequate chemotherapy of TB, and to prevent the spread of resistant strains. The aim of this study was to characterize TB patients at higher risk of having MDR-TB, to analyze the drug resistance and epidemiological profile of these patients. Use the clinical samples to assess the commercial test (GenoType® MTBDRplus) and develop and standardize a new test (Detect-MDRTB) for detecting the most frequent mutations associated with resistance to INH and RIF. A significantly higher proportion (75% versus 20%, p = 0.009) of males were found among drug-resistant cases than drug susceptible cases. 43.8% of patients took longer than 30 days to seek medical care and in the MDR group 25% of the cases did not undergo any previous anti-TB treatment. In our samples we found a proportion of 48.3% of MDR-TB. The T family was the most frequent spoligotype family. Compared with the proportion method, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 82% and 94% for RIF-resistance, 60% and 94% for INH resistance. Compared with sequencing, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 92% and 97% for RIF-resistance, 100% and 100% for INHresistance. To detect RIF and INH-resistance, the Detect-TBMDR assay showed a sensitivity and specificity of 79.3% and 77.0%, and 100% and 65%, respectively, compared to proportion method. When compared with sequencing, Detect-TBMDR assay, to detect RIF and INH-resistance, showed a sensitivity and specificity of 81.2% and 94.7% and to 100% and 96.2%, respectively. Discordances still exist between the proportion method and molecular approach, particularly regarding INH-resistance. However, these methods are very important for the management faster and correct patient, helping to choose the best treatment regimen.