O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2014. / Submitted by Josina da Silva Vieira (josinasv1990@gmail.com) on 2014-07-17T14:56:19Z No. of bitstreams: 3 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8299224 bytes, checksum: e7fc821d4f808367de0b3df8039d1138 (MD5) 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8299224 bytes, checksum: e7fc821d4f808367de0b3df8039d1138 (MD5) 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8299224 bytes, checksum: e7fc821d4f808367de0b3df8039d1138 (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: Josina, Por favor, excluir os arquivos duplicados. Obrigada! Jacqueline on 2014-07-18T14:39:10Z (GMT) / Submitted by Josina da Silva Vieira (josinasv1990@gmail.com) on 2014-07-18T14:44:07Z No. of bitstreams: 1 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8403115 bytes, checksum: 8a074a463a04e8f0e656e5023f02c793 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-18T15:43:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8403115 bytes, checksum: 8a074a463a04e8f0e656e5023f02c793 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-18T15:43:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8403115 bytes, checksum: 8a074a463a04e8f0e656e5023f02c793 (MD5) / As microbactérias de crescimento rápido (RGM) têm implicações importantes em patologias humanas, sendo relacionadas à infecções oportunistas. Desde sua descrição em 2004, os casos clínicos associados a Mycobacterium massiliense, uma espécie representativa do grupo das RGM, tem sido crescentemente reportados. Com o aumento dos surtos causados por essas bactérias, o desenvolvimento de novas técnicas de detecção de espécie e de predição de padrões de susceptibilidade e essencial para o controle e ciente de suas infecções. O objetivo deste trabalho e utilizar a genômica comparativa para traçar umperfil do funcionamento biológico e dos mecanismos de virulência de M. massiliense, facilitandoa descoberta de moléculas de interesse. A estirpe GO 06 de M. massiliensefoi isolada durante o surto ocorrido no período entre 2005 e 2007 em Goiás, na região central do Brasil, e teve seu genoma seqüenciado pela plataforma de seqüenciamento de alto desempenho 454 GS-FLX Titanium (Roche). Foi possível montar o genoma completo da estirpe GO 06, constituído por seu cromossomo e dois plasmídos, bem como anotar a maioria das suas ORFs preditas (3.491 ORFs, representando 84,5% do total identificado), com a identificação de 826 genes relacionados a virulência. Também foi possível identificar 46 tRNAs e um único operon de rRNA. As vias metabólicas relacionadas aos sistemas de secreção bacterianos e a bioissíntese de sideróforos de M. massiliense GO 06, geralmente envolvidas na patogenicidade microbacteriana, foram descritas in silico. 15 genes relacionados ao T7SS também foram identificados no genoma do isolado GO 06, sugerindo a existência dos sistemas ESX-3 e ESX-4. Os dados gerados neste projeto fornecem informações importantes para o desenvolvimento de estratégias de controle de surtos relacionados as RGM, sendo disponibilizados em uma página hospedada no domínio público da Universidade de Brasília. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Rapid growing mycobacteria (RGM) have important implications in human diseases, being often related to opportunistic infections. Since its description in 2004, clinical cases related to Mycobacterium massiliense, a representative species of the RGM group, have been increasingly reported. With the increase of outbreaks related to these bacteria, the development of new species detection and susceptibility pattern prediction techniquesis essential for the efficient control of their infections. The goal of this project is touse comparative genomics to trace the biological functioning and virulence mechanisms pro_les of M. massiliense, facilitating the discovery of molecules of interest. The strain GO 06 of M. massiliense was isolated during the outbreak that occurred between 2005 and 2007 in Goias, in the midwest region of Brazil, and had its entire genome sequence dusing the 454 GS-FLX Titanium (Roche) high-throughput sequencer. It was possibleto construct strain GO 06's entire genome, which was comprised of its chromosome and two plasmids, and annotate the majority of its predicted ORFs (3.491 ORFs, 84,5% of all identified ORFs), with the identication of 826 genes related to virulence. It was also possible to identify 46 tRNAs and a single rRNA operon. M. massiliense GO 06'smetabolic pathways regarding bacterial secretion systems and siderophore biosynthesis,usually involved in mycobacterial pathogenicity, were described in silico. 15 genes related to T7SS were also identied in isolate GO 06's genome, suggesting the existence of ESX-3and ESX-4 systems. The data generated in this project represents useful information inthe development of control strategies of outbreaks related to RGM, being made availablein a webpage hosted in the public domain of University of Brasília.

O gênero Mycobacterium spp. compreende microrganismos saprófitas e patogênicos de interesse em saúde animal e humana. A espécie M. bovis, que causa tuberculose nos animais, é excretada através do leite de bovinos infectados e tem no consumo de leite cru e seus derivados uma importante via de transmissão para o homem, causando uma doença tão grave quanto à causada pelo M. tuberculosis. Como a doença nos animais é endêmica no Brasil e o queijo minas meia cura é normalmente fabricado com leite cru e muito apreciado pelo consumidor paulistano, amostras desse produto, obtidas em feiras-livres, foram analisadas quanto à ocorrência de micobactérias. As amostras foram descontaminadas pelo método HPC 1,5%, semeadas em meio Stonebrink-Leslie (incubadas a 37ºC/90 dias) e as colônias suspeitas, submetidas à reação de PCR TB multiplex e sequenciamento nucleotídico. Em 12% das amostras (16/133) foram isoladas 26 colônias de Mycobacterium spp., tendo sido identificadas 6 espécies, todas ambientais: Mycobacterium fortuitum, M. confluentis, M. elephantis, M. novocastrense, M. sphagni e M. arupense; 7 isolados, no entanto, permaneceram sem caracterização quanto à espécie. O M. fortuitum é um patógeno oportunista importante em saúde pública, sem que haja, entretanto, evidências de transmissão alimentar; o M. novocastrense, M. arupense e M. elephantis também têm sido consideradas espécies com potencial patogênico ao ser humano. Os resultados sugerem, tal como era esperado, que a frequência e a carga inicial de M. bovis em queijo Minas meia cura sejam baixas, mas se deve considerar que a metodologia empregada, por falta de outra específica, não privilegia a detecção em cenário de baixa carga inicial do agente acompanhada por alta carga contaminante. Sugerem também a necessidade de se avaliar a importância da transmissão alimentar de micobactérias não tuberculosas, especialmente para indivíduos imunossuprimidos. / Mycobacterium genus consists of saprophytic and pathogenic microorganisms of interest in animal and human health. M. bovis specie, which causes tuberculosis in animals, is excreted through the milk of infected cattle and the consumption of raw milk and its derivatives is an important route of transmission to humans, causing a disease as serious as the one caused by M. tuberculosis. Considering that the disease in animals is endemic in Brazil and that minas meia cura cheese cure is usually made from raw milk and much appreciated by paulistano consumer, samples of the product acquired in open markets, were analyzed for the occurrence of mycobacteria. The samples were decontaminated by the method HPC 1.5%, sown in Stonebrink-Leslie medium (incubated at 37 ° C/90 da ys) and the suspected colonies, submitted to PCR TB multiplex and nucleotide sequencing reaction. In 12% of samples (16/133) were isolated 26 colonies of Mycobacterium spp. and 6 species have been identified, all of them are environmental Mycobacterium fortuitum, M. confluentis, M. elephantis, M. novocastrense, M. sphagni and M. arupense; 7 isolates, however, remained without characterization for the specie. M. fortuitum is an important opportunistic pathogen in public health, without, however, evidence of being transmitted by food; M. novocastrense, M. arupense and M. elephantis species have also been considered potentially pathogenic to humans. The results suggest that the frequency and/or contamination load of M. bovis in meia cura Minas cheese is (are) low (s). We have to consider, however, that this result may have been influenced by the absence of an analytical method capable of identifying the agent in the food matrix in which a low load of microorganism is expected, accompanied by high load of contaminants. Also suggest the need to evaluate the possible importance of foodborne non-tuberculous mycobacteria, especially for immunocompromised individuals.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae and presents a wide range of clinical manifestations, depending on the host immune response. At the tuberculoid pole, patients have an effective Th1 cellular immune response against bacillus, with well-demarcated granulomas, which limits the disease, while the lepromatous pole is characterized by the absence of specific cellular immunity against Mycobacterium leprae, with a Th2 immune response, uncontrolled proliferation of leprosy bacilli and a spread disease. In addition to Th1 and Th2 lymphocytes, recently other subset of T cells has been described. T regulatory lymphocytes play an immunosuppressive role in the activity of other cells and seem to participate in modulating the immune response in human chronic infections and self-tolerance. We performed immunohistochemical study on skin biopsies of 35 patients with different forms of leprosy using anti-CD4, anti-CD8 and anti-FoxP3 antibodies. There was an increased CD4 expression in tuberculoid patients and an increased CD8 expression in lepromatous patients. The FoxP3 expression was higher in lepromatous and reversal leprosy reaction patients. As previously demonstrated in other granulomatous infections, T regulatory cells may play a role in the immunopathology of leprosy. However, studies with larger series of patients are required to further elucidate the relationship between the presence of these cells and the clinical form of the disease. / A hansenÃase à uma doenÃa infecciosa crÃnica causada pelo Mycobacterium leprae e apresenta uma grande variedade de manifestaÃÃes clÃnicas que dependem da resposta imunolÃgica do hospedeiro. Em um polo està a forma tuberculoide, na qual os pacientes apresentam uma resposta imunolÃgica Th1 celular contra o bacilo, com formaÃÃo de granulomas bem delimitados com doenÃa localizada. No outro polo temos a forma virchowiana caracterizada pela ausÃncia de imunidade celular especÃfica ao Mycobacterium leprae, com padrÃo de resposta imunolÃgica Th2, com macrÃfagos repletos de bacilos, mas com poucos linfÃcitos, sem formaÃÃo de granulomas e com disseminaÃÃo da doenÃa. AlÃm dos linfÃcitos Th1 e Th2, outra populaÃÃo de linfÃcitos T foi descrita recentemente. Os linfÃcitos T regulatÃrios desempenham um papel imunossupressor na atividade de outros linfÃcitos e de outras cÃlulas inflamatÃrias e parecem participar da modulaÃÃo da resposta imunolÃgica em infecÃÃes crÃnicas em seres humanos e da autotolerÃncia. Neste trabalho, foram analisadas 35 biÃpsias cutÃneas de lesÃo de pacientes portadores de diferentes formas de hansenÃase quanto à expressÃo dos marcadores celulares CD4, CD8 e FoxP3 por imunohistoquÃmica. Enquanto a expressÃo do CD4 foi maior nos pacientes portadores da forma tuberculoide da hansenÃase, a expressÃo do CD8 mostrou-se maior nos portadores de hansenÃase virchowiana. Quanto à expressÃo do FoxP3, esta foi maior nos portadores da forma virchowiana da hansenÃase e da reaÃÃo hansÃnica tipo 1 em relaÃÃo aos indivÃduos sadios. Parece que, assim como jà demonstrado em outras doenÃas infecciosas granulomatosas, os linfÃcitos Treg participam da imunopatologia da hansenÃase. Entretanto, estudos com maior nÃmero de pacientes sÃo necessÃrios, para um melhor entendimento da relaÃÃo entre a presenÃa desses linfÃcitos e a forma clÃnica da doenÃa.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A doenÃa tuberculose à altamente infecciosa e estima-se que um terÃo da populaÃÃo mundial esteja infectada. Em 2012, foi estimado que 8,6 milhÃes de pessoas no mundo tiveram a doenÃa, representando umas das doenÃas infecciosas que mais matam no mundo. O agente causador da infecÃÃo à o Mycobacterium tuberculosis, uma micobactÃria com alta capacidade de adquirir resistÃncia aos fÃrmacos usados no tratamento. O desenvolvimento de novas drogas ou opÃÃes terapÃuticas com atividade antimicobacteriana se faz necessÃrio para a reduÃÃo da prevalÃncia da doenÃa. As plantas atravÃs de vias metabÃlicas secundÃrias produzem diversos compostos, sendo jà verificada atividade biolÃgica contra micobactÃrias em algumas classes de terpenÃides. Este estudo avaliou a atividade antimicobacteriana de Ãleos essenciais de Lippia alba, Lippia sidoides, Cymbopogon citratus, Plectranthus amboinicus e Cinnamomun zeylanicum contra a cepa padrÃo (H37Rv) de M. tuberculosis. A tÃcnica utilizada foi de microdiluiÃÃo em placa de 96 poÃos (Resazurin Microtiter Assay - REMA), onde se utiliza a rezasurina, indicador de oxirreduÃÃo, para a avaliaÃÃo do crescimento bacteriano. O rendimento da extraÃÃo dos Ãleos de L. alba, L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum foi de 0,49%, 0,68%, 0,30%, 0,009% e 0,13%, respectivamente. O citral foi encontrado como o principal constituinte dos Ãleos de L. alba (70,6%) e C. citratus (80,7%). O Ãleo de L. sidoides teve como principal constituinte o cariofileno (30,2%). O timol (64,3%) foi encontrado em maior percentual de concentraÃÃo no Ãleo do P. amboinicus. No Ãleo de C. zeylanicum foi encontrado o trans-cinamaldeÃdo (86,0%) como principal constituinte. O Ãleo essencial de L. alba nÃo apresentou atividade antimicobacteriana. Os Ãleos de L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum apresentaram CIM de 299,5Â117,2Âg/ml, 1.250Âg/ml, 351,6Â55,2Âg/ml e 286,5Â130,2Âg/ml, respectivamente. O Ãleo que apresentou maior atividade antimicobacteriana foi o de L. sidoides, com potÃncia de 5,4 x 10-4. Os resultados mostram que os Ãleos essenciais de L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum, contÃm substÃncias com propriedades de inibiÃÃo do crescimento da cepa padrÃo H37Rv de M. tuberculosis. Os Ãleos essenciais sÃo alternativas promissoras na descoberta de novos agentes terapÃuticos. / The infectious agent is the Mycobacterium tuberculosis, one mycobacteria with high capacity to acquire resistance to agents used in the treatment. The development of new drugs or treatments with antimicrobial activity is necessary for reducing the prevalence of the disease. Plants through secondary metabolic pathways produce various compounds, being already observed biological activity against mycobacteria in some classes of terpenoids. This study evaluated the antimicrobial activity of essential oils from Lippia alba, Lippia sidoides, Cymbopogon citratus, Plectranthus amboinicus and Cinnamomun zeylanicum against standard strain (H37Rv) of M. tuberculosis. The technique used was in 96-well microdilution (Resazurin Microtiter Assay - REMA) card, which uses the rezasurina, redox indicator for the evaluation of the bacterial growth. The yield of extraction of oils from L. alba, L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum was 0.49%, 0.68%, 0.30%, 0.009% and 0.13%, respectively. Citral was found as the major constituent of oil of L. alba (70.6%) and C. citratus (80.7%). The oil of L. sidoides has as the main constituent the caryophyllene (30.2%). The thymol (64.3%) was found in a higher percentage of oil concentration in P. amboinicus. In the oil of C. zeylanicum the trans-cinnamaldehyde (86.0%) was found as the main constituent. The essential oil of L. alba do not showed antimicrobial activity. The oil of L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum showed MIC of 299.5Â117.2mg/ml, 1.250μg/ml, 351.6Â55.2mg/ml and 286.5Â130.2g/ml, respectively. The oil that showed higher antimicrobial activity was the of L. sidoides, with power of 5.4 x 10-4. The results show that essential oils of L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum contains substances with properties of inhibiting the growth of the standard strain H37Rv of M. tuberculosis. Essential oils are promising alternatives in the discovery of new therapeutic agents.

Realizou-se estudo comparando o uso da reação em cadeia da polimerase à evolução clínica e painel de exames tradicionais para diagnóstico em pacientes com suspeita clínica de tuberculose cutânea e micobacteriose atípica. Observou-se sensibilidade da reação em cadeia da polimerase de 88%, especificidade de 83%, valor preditivo positivo de 82%, valor preditivo negativo de 88% e acurácia de 85% com concordância pelo teste de McNemar (p= 0,655). Os exames do painel de maior acurácia, após a reação em cadeia da polimerase, foram o teste tuberculínico com acurácia de 79% e a presença de dermatite crônica granulomatosa com reação em cadeia da polimerase positiva com acurácia também de 79%, ambos com concordância pelo teste de McNemar (p= 0,179 e p= 0,655, respectivamente) / A study was performed comparing the polymerase chain reaction and the traditional panel of exams for the diagnosis in patients with a clinical suspicion of cutaneous tuberculosis and atypical mycobacteria infection to the clinical evaluation. It was observed that the sensitivity of the PCR was 88%, the specificity was 83%, the positive predictive value was 82%, the negative predictive value was 88% and the accuracy was 85% in agreement with the McNemar test (p=0.655). The panel exams of second highest accuracy, were the tuberculin test with an accuracy of 79% and the chronic granulomatous dermatitis with positive PCR, also with an accuracy of 79%, both in agreement with the McNemar test (p=0.179 and p=0.655, respectively)

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

aumento do número de casos de tuberculose e o surgimento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistentes a múltiplas drogas, entre elas a isoniazida (INH) representa um sério problema de saúde pública. A enzima InhA, ou 2-trans-Enoil-ACP (CoA) redutase de MTB, catalisa a redução NADHdependente de ácidos graxos α,β-insaturados, precursores dos ácidos micólicos (importantes componentes do envelope celular do MTB). Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas à resistência in vivo à INH devido a uma menor afinidade pela molécula de NADH, sugerindo que o mecanismo de resistência deva estar relacionado com interações específicas entre a enzima e o cofator. Para verificar os eventos moleculares associados à afinidade da enzima pelo ligante e identificar os aspectos moleculares relacionados com a resistência, foram realizados estudos de simulação por dinâmica molecular (DM) dos sistemas InhA-NADH (espécie selvagem wt e mutantes) completamente solvatados.Todos os sistemas enzimáticos apresentaram grande flexibilidade durante as trajetórias por DM. Apesar da flexibilidade, no complexo wt InhA-NADH, a molécula de NADH permanece firmemente ligada ao sítio da enzima numa conformação estendida. Nos complexos mutantes I21V e I16T, onde as mutações ocorrem na alça rica em glicina, as interações entre enzima e cofator são menos efetivas, permitindo que a porção pirofosfato do NADH experimente importantes mudanças conformacionais e se afaste de sua região de ligação, indicando, provavelmente, um estágio inicial da dissociação do ligante. No mutante I47T, a substituição da Ile por Thr causa uma contração no sítio de ligação do NADH, que é refletida no rearranjo conformacional do NADH e na expulsão de moléculas de água importantes para a associação do cofator O mutante S94A apresentacomportamento muito semelhante à enzima selvagem, como esperado a partir dos experimentos cristalográficos. As afinidades das enzimas pelo NADH foram avaliadas por experimentos de docking molecular, onde as estruturas instantâneas geradas durante as trajetórias da DM foram utilizadas como forma de considerar explicitamente a flexibilidade da macromolécula. Os resultados do docking molecular mostraram que todos os mutantes apresentam menor afinidade pelo NADH, exceto o mutante S94A, cuja energia livre de ligação do NADH foi estatisticamente igual à observada para a enzima selvagem. Os resultados apresentados neste trabalho devem contribuir para o entendimento do mecanismo molecular específico de resistência à INH, que é crucial para o desenvolvimento de novos fármacos para o controle da tuberculose. / The increasing prevalence of tuberculosis in many areas of the world, coupled with the rise in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains presents a major threat to global health. InhA, the enoyl-ACP reductase from MTB, catalyzes the NADH-dependent reduction of long chain trans-2-enoyl-ACP fatty acids, an intermediate in mycolic acids biosynthesis. Mutations in the structural gene for InhA are associated with isoniazid resistance in vivo due to a reduced affinity for NADH, suggesting that the mechanism of drug resistance may be related to specific interactions between enzyme and cofactor within the NADH binding site. In order to compare the molecular events underlying this ligand affinity in the wild type and S94A, I21V, I16T and I47T clinical mutant enzymes, and to identify the molecular aspects related to resistance, molecular dynamics (MD) simulations of fully solvated NADH-InhA (wt and mutants) systems were performed.All InhA-NADH systems showed a large flexibility during the MD trajectories. Although very flexible, in the wt InhA-NADH complex, the NADH molecule keeps its extended conformation firmly bounded to the enzyme’s binding site. In the I21V and I16T mutant complexes, where mutated residues were located in the glycine rich loop, interactions between enzyme and cofactor became more labile, and the NADH pyrophosphate moiety undergoes to considerable conformational changes, becoming more hydrated and moving apart from its binding site, probably indicating the initial phase of ligand expulsion. In the I47T mutant, the substitution of an Ile residue for Thr causes a binding site contraction with conformational changes of the NADH molecule and expulsion of water molecules important for cofactor binding to the enzyme. The S94A mutant showed to be very similar to the wt enzyme, in agreement to crystallographic experiments observations. The enzyme-ligand affinities were evaluated by molecular docking experiments which were performed in the trajectory ensembles of MD snapshots asa way to explicit consider the macromolecular flexibility. All mutant enzymes had lower affinities for the NADH molecule, except the S94A mutant, whose free energy of NADH binding was statistically similar to that of the wild type enzyme. This results presented here should contribute to our understanding of specific molecular mechanisms of drug resistance, which is crucial for designing more potent antimycobacterial agents for controlling tuberculosis.