Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317847.pdf: 108629463 bytes, checksum: 55e6d96e9fdf83641c9a74d98bb356b0 (MD5) Previous issue date: 2013 / A pesquisa racional de novos candidatos a antígenos vacinais ou imunodiagnóstico destinados ao controle da tuberculose bovina (bTB) requer o conhecimento básico da imunopatogênese da doença. No entanto, ainda há escassez de informações sobre os aspectos imunopatológicos da interação Mycobacterium bovis-hospedeiro durante a infecção natural de bovinos. Na análise de uma coorte de 349 bovinos positivos no teste tuberculínico (PPD), em 247 bovinos foi confirmada a infectação natural pelo M. bovis. Dos animais positivos para M. bovis, 92% (228/247) não apresentavam sinais sugestivos da doença, entretanto, apresentavam lesões de bTB graves e disseminadas. Além disso, a disseminação das lesões de bTB estava correlacionada positivamente com a gravidade da patologia da doença e carga bacteriana viável no tecido. Adicionalmente, o encapsulamento do granuloma foi correlacionado negativamente com o crescimento do M. bovis nos tecidos, bem como com a gravidade da patologia, sugerindo que o encapsulamento é um mecanismo dinâmico e pode ser eficaz para controlar a proliferação/disseminação micobacteriana intragranuloma durante a infecção natural. Além disso, a avaliação detalhada da resposta granulomatosa nos pulmões demonstrou que o número de células gigantes multinucleadas tipo Langhans correlaciona negativamente com a contagem micobacteriana. Em contraste, a população de neutrófilos na resposta granulomatosa tuberculosa foi associado com o aumento na proliferação do M. bovis intragranuloma. Os achados aqui apresentados sugerem que o encapsulamento e as células gigantes multinucleadas estão associados ao controle da infecção pelo M. bovis, enquanto que os neutrófilos podem servir como um biomarcador celular de proliferação bacteriana durante a infecção natural. Como prova de conceito de que a dinâmica celular incitada durante a infecção por M. bovis influencia o controle do crescimento micobacteriano, analisamos parâmetros imunopatológicos durante a co-infecção natural com o vírus da leucose enzoótica bovina (BLV), um patógeno que modula a resposta imune adaptativa. Bovinos coinfectados com M. bovis e BLV apresentaram maior carga micobacteriana intragranuloma e uma doença mais grave. Na análise histomorfológica das lesões granulomatosas, observamos uma diminuição significativa na população de linfócitos, seguido por um aumento no número de neutrófilos e menor deposição de tecido conjuntivo. Estes dados sugerem uma alteração no fluxo de células para o ambiente intragranuloma devido a defeitos linfocitários. Consistente com essa hipótese, observamos uma menor resposta de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em animais com linfocitose persistente (LP-BLV+). Estas evidências indicam que a infecção pelo BLV está associada à perda da homeostase da resposta imune celular do hospedeiro e possivelmente ao aumento da suscetibilidade do hospedeiro a bTB. Em conjunto, nossos dados integram a resposta granulomatosa do hospedeiro com a carga infecciosa micobacteriana e revelam novos elementos para o entendimento da imunopatogênese da bTB que poderiam ser empregados na implementação de estratégias racionais de controle da tuberculose bovina.<br. / Abstract : Rational discovery of novel immunodiagnostic and vaccine candidateantigens to control bovine tuberculosis (bTB) requires knowledge ofdisease immunopathogenesis. However, there remains a paucity ofinformation on the Mycobacterium bovis-host immune interactionsduring the natural infection. Analysis of 247 naturally tuberculinic testpositive (PPD) M. bovis-infected cattle revealed that 92% of theseanimals were found to display no clinical signs, but presenteddisseminated bTB-lesions positively correlated with both pathologyseverity score and viable tissue bacterial loads. Additionally, granulomaencapsulation negatively correlated with M. bovis growth as well aspathology severity, suggesting that encapsulation is an effectivemechanism to control bacterial proliferation during natural infection.Moreover, multinucleated giant cell numbers were found to negativelycorrelate with bacterial counts in lung granulomas. In contrast,neutrophil numbers in the granuloma were associated with increased M.bovis proliferation. To better understand the role of the granulomatousresponse for the control of mycobacterial growth during infection by M.bovis, immunopathological parameters during co-infection with naturalbovine leukemia virus (BLV), a pathogen that modulates the adaptiveimmune response, were analyzed. Cattle co-infected with M. bovis andBLV had higher mycobacterial intragranuloma load and more severedisease. In the histomorphological analysis of granulomatous lesions,we observed a significant decrease in the lymphocyte populationfollowed by an increase in neutrophils and a reduction in connectivetissue deposition. These data suggest an alteration in the cell flow for theintragranuloma environment due to defective lymphocytes. Consistentwith this hypothesis, we observed a lower delayed-type hypersensitivity(DTH) response in animals with persistent lymphocytosis (LP-BLV+).This evidence indicate that BLV infection is associated with a loss ofhomeostasis of the host cellular immune response and possiblyincreased susceptibility of the host to bTB. Together, our data integratethe host granulomatous response with the mycobacterial infectious loadand reveal new elements for understanding the immunopathogenesis ofbTB which can be used in the implementation of rational strategies tocontrol bovine tuberculosis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340733.pdf: 4900918 bytes, checksum: 4ded1757ae8581e2321959028f243ffc (MD5) Previous issue date: 2016 / Elie Metchnikoff descreveu pela primeira vez os macrófagos e suas funções, uma delas é a fagocitose e eliminação de patógenos. Porém, alguns microrganismos desenvolveram estratégias para sobreviver dentro destas células, um exemplo de sucesso é o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose. Este bacilo ganha acesso ao interior dos macrófagos utilizando receptores na superfície destas células. Devido à sua grande heterogeneidade, os macrófagos apresentam diversas moléculas em sua superfície, é possível que Mtb utilize diferencialmente essas moléculas para sua sobrevivência intracelular. A heterogeneidade dos macrófagos foi explorada neste trabalho através de duas subpopulações distintas de macrófagos derivados de medula óssea (MMOs). Estas subpopulações foram separadas, por citometria de fluxo, baseadas em características de tamanho, complexidade e por moléculas expressas em sua superfície. A subpopulação maior e mais complexa, foi denominada A e apresenta uma frequência média de 65%, já a subpopulação menor e menos complexa, denominada B, apresenta uma frequência média de 15%. Para estudar a interação destas subpopulações com Mtb, ensaios de adesão e fagocitose foram realizados. Foi possível observar que Mtb adere e é mais fagocitado pela subpopulação B, a qual foi caracterizada como SSCloFSCloF4/80intCD11bint quando comparada à subpopulação A. As análises de citometria de fluxo indicavam que CD195 (CCR5) era um receptor envolvido no aumento da interação entre a subpopulação B e Mtb, porém MMOs derivados de camundongos nocautes para este receptor apresentam o mesmo perfil de adesão que MMOs de camundongos selvagens. Além disso, também foi investigado se o estágio de maturação da subpopulação B poderia estar envolvido com o aumento da adesão destes macrófagos à Mtb, contudo o estágio de maturação não parece participar neste processo. Em conjunto, os dados deste trabalho mostram que macrófagos de medula óssea apresentam duas subpopulações distintas, chamadas A e B. A subpopulação B apresenta maior interação com Mtb e esta interação não é dependente de CD195. Além disso, a subpopulação B foi caracterizada como SSCloFSCloF4/80intCD11bint quando comparada à subpopulação A.<br> / Abstract : Elie Metchnikoff first described macrophages and its functions, one of them is the phagocytosis and killing of pathogens. However, some microorganisms developed strategies to survive inside macrophages, one successful example is Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causing agent of tuberculosis. This bacilli access the macrophage s intracellular environment through surface receptors. Because of its great heterogeneity macrophages express different surface molecules and it is possible that Mtb exploits these differentially expressed molecules to survive inside the cell. The heterogeneity of macrophages was explored here using two distinct subpopulations of bone marrow macrophages (BMMs). These subpopulations were separated by flow cytometry based on size and complexity and also by expression surface molecules. The subpopulation, which was bigger and more complex, was called A and displays a mean frequency of 65%, on the other side the smaller and less complex subpopulation, was called B and displays a mean frequency of 15%. To study the interaction between Mtb and these two subpopulations binding and phagocytosis assays were performed. It was observed that subpopulation B presents higher bacterial binding and phagocytosis and it was phenotypically characterized as SSCloFSCloF4/80intCD11bint when compared to subpopulation A. The flow cytometry analysis indicates that CD195 (CCR5) was involved in higher bacterial binding of subpopulation B, nevertheless BMMs from mice knockout for CD195 showed the same levels of bacterial binding then wild-type BMMs. Furthermore, it was also investigated if the maturation status of subpopulation B could be associated with the augmented mycobacterial binding, however it does not seems to participate in this process. Taken together, these data shows that BMMs presents two distinct subpopulations, which were named A and B. The subpopulation B, displays higher bacterial binding and phagocytosis and CD195 does not participate in these processes. Additionally, subpopulation B was phenotypically characterized as SSCloFSCloF4/80intCD11bint when compared to subpopulation A.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-04-18T04:11:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344470.pdf: 4039587 bytes, checksum: ca5e269c5e05ad34c4515affe7133117 (MD5) Previous issue date: 2016 / Introdução: A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa considerada um problema global de saúde pública. A terapia em longo prazo, somada aos efeitos adversos dos medicamentos, contribui para a não adesão do paciente, o que resulta em falência do tratamento e seleção de linhagens de Mycobacterium tuberculosis resistentes. Por isso, a pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, que permitam a redução do tempo de tratamento e sejam uma alternativa para o tratamento de cepas resistentes, são considerados urgentes. Produtos naturais representam importantes fontes para o desenvolvimento de novos fármacos. A atividade antimicobacteriana já foi relatada para diversos compostos pertencentes a diferentes classes químicas, isolados de plantas, fungos e organismos marinhos, o que estimula a pesquisa de novos fármacos para o tratamento da TB provenientes de fontes naturais. Objetivos: Avaliar atividade antimicobacteriana in vitro de extratos e compostos naturais isolados de Calea uniflora e Calea pinnatifida e investigar seu mecanismo de ação. Métodos: Inicialmente, foi realizada uma triagem de 10 extratos e 11 compostos isolados obtidos das plantas Calea uniflora e Calea pinnatifida quanto à atividade antimicobacteriana in vitro frente a cepas referência de M. tuberculosis, Mycobacterium avium e Mycobacterium fortuitum, em concentrações entre 1,56 µg/mL e 100 µg/mL. Sete lactonas sesquiterpênicas (LS) apresentaram os melhores resultados e foram escolhidas para seguimento dos estudos da atividade antimicobacteriana in vitro, além da realização de análises in silico e estudo do seu mecanismo de ação, por meio da avaliação do perfil transcricional de M. tuberculosis após o tratamento com os compostos. Resultados: As LS (LS01 a LS07) apresentaram atividade antimicobacteriana frente a M. tuberculosis em fase exponencial de crescimento, de modo tempo e dose dependentes, com concentração inibitória mínima (MIC) variando de 6,25 µg/mL a 25 µg/mL. LS06 e LS07 também apresentaram atividade frente a M. tuberculosis em estado não-replicativo, em concentrações correspondentes a 4xMIC e 8xMIC, respectivamente. Nenhum dos compostos apresentou atividade frente a M. avium e M. fortuitum. Quando testados frente a isolados clínicos resistentes aos fármacos, os compostos apresentaram MIC semelhante às obtidas com os isolados sensíveis. Quando em combinação com isoniazida (INH) e rifampicina (RMP), os compostos não apresentaram sinergismo nem antagonismo. Os índices de seletividade variaram entre 1,77 a 11,88 em células de linhagem pulmonar MRC5. LS01, L06 e LS07 também apresentaram atividade frente a bacilos intracelulares, em modelo de infecção de macrófagos e demonstraram capacidade de proteção às células infectadas em concentrações correspondentes à MIC. Já quando em concentrações superiores, apresentaram citotoxicidade. Quando testada em estrutura granuloma-like, LS01 foi capaz de reduzir a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) na concentração 100 µM. As predições in silico indicaram que as LS estudadas neste trabalho podem apresentam boa biodisponibilidade por via oral, entretanto, podem sofrer intenso metabolismo de primeira passagem e apresentar altas taxas de ligação a proteínas plasmáticas. A análise do perfil transcricional de M. tuberculosis após o tratamento com LS01, LS06 e LS07 sugere que sua resposta pode estar relacionada à geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que foi confirmado posteriormente, pela detecção de H2O2 em culturas de M. tuberculosis tratadas com os compostos. Este perfil também pode estar associado à habilidade das LS de se ligar aos resíduos de cisteína presentes em proteínas e no micotiol. Conclusão: Os compostos LS01-LS07 apresentaram boa atividade antimicobacteriana in vitro e parecem ter um novo mecanismo de ação quando comparadas aos fármacos utilizados atualmente no tratamento da TB e àqueles que se encontram em estudo clínico.<br> / Abstract : Background: Tuberculosis (TB) is a serious public health problem worldwide with one-third of the world´s population estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis. TB treatment requires the use of multiple drugs for at least 6 months. This lengthy drug therapy and adverse reactions to the drugs contribute to patient non-compliance, resulting in treatment failure and emergence of M. tuberculosis drug-resistant strains. There is an urgent need for new drugs to treat TB and natural products represent an important source for drug discovery. Several chemical classes of compounds isolated from plants, fungi and marine organisms have been described as potential antitubercular drugs, stimulating the search for new antimycobacterial agents isolated from natural sources. Aims: To evaluate the in vitro antimycobacterial activity of plant extracts and isolated plant-derived compounds from Calea uniflora and Calea pinnatifida and investigate their mode of action. Methods: A primary screening was conducted with 10 extracts from C. uniflora and C. pinnatifida and 12 purified compounds against M. tuberculosis, Mycobacterium avium and Mycobacterium fortuitum at concentrations ranging from 1.56 to 100 µg/mL. Seven sesquiterpene lactones (LS) showed the best results and were chosen for following studies on the in vitro antimycobacterial activity and also for in silico tests and transcriptional profiling analysis, in order to investigate their mode of action. Results: The LS (LS01-LS07) showed antimicrobial activity against log phase M. tuberculosis in a time- and concentration- dependent manner, with minimum inhibitory concentration (MIC) ranging from 6.25 to 25 µg/mL. LS06 and LS07 were also active against non-replicating M. tuberculosis at 4xMIC and 8xMIC, respectively. None of the compounds were active against M. avium and M. fortuitum. When tested against MDR M. tuberculosis clinical isolates, the compounds showed similar MIC compared to the sensitive isolates. They did not show synergism nor antagonism in combination with isoniazid or rifampicin. The selectivity index ranged from 1.77 to 11.88 in MRC5 lung cell line.LS01, LS06 and LS07 were also active against intracellular M. tuberculosis and were able to protect the infected cells at their MIC. Higher concentrations were found to be cytotoxic. When tested in a granuloma-like structure, LS01 reduced de colony forming units (CFU) counting at 100 µM. In silico studies indicate that these compounds may have good oral bioavailability, but intense first pass metabolism and high rates of plasma proteins binding. The transcriptional profiling analysis showed the response to LS01, LS06 and LS07 may be related to reactive oxygen species (ROS) generation, which was confirmed by the detection of H2O2 in M. tuberculosis cultures treated with the compounds. This response also may be related to the ability of the LS to bind to cysteine residues present in proteins and mycothiol. Conclusion: The LS 01-07 showed good in vitro antimycobacterial activity and seem to have a novel mode of action compared to the drugs currently used for the TB treatment and compared to the TB pipeline, which made them promising molecules for further studies.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:26:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-08. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:45:53Z : No. of bitstreams: 1 000844405_20151231.pdf: 590060 bytes, checksum: cc5b0a59d26777dd45d62d9077d94ade (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:36Z: 000844405_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:28Z : No. of bitstreams: 1 000844405.pdf: 5414366 bytes, checksum: b02494fdb2d981c078e2a3d145e297dd (MD5) / A tuberculose é considerada um problema prioritário de saúde pública. Há cada vez mais evidências de que, a variação das cepas de M. tuberculosis tem um papel importante no resultado da infecção por tuberculose. No presente estudo, além de descrever os aspectos sociodemográficos, clínico-epidemiológicos e bacteriológicos da tuberculose e relacionar com a distribuição de resistência aos fármacos antituberculose, também objetivou-se avaliar a diversidade dos genótipos de isolados de Mycobacterium tuberculosis utilizando as técnicas de Spoligotipyng (Spacer Oligonucleotide Typing) e MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-variable-number tandem repeats). Com relação à resistência aos fármacos, as culturas de MT e os testes de sensibilidade mostram que cepas de pessoas que fizeram tratamento de TB anterior ou infectados pelo HIV apresentaram mais resistência os fármacos quando comparados aos que não apresentavam essas características (p<0,05). Os casos resistentes, em sua maioria, são de origem pulmonar e apresentam baciloscopia positiva. A análise molecular mostrou que das 377 amostras com perfis completos para 14 loci MIRU-VNTR, os loci 10, 16, 23, 26, 27, 31, 39 e 40 tiveram um alto poder discriminatório (0.6), os loci 2, ETRB e Mtub21 foram moderadamente discriminatórios (0.3) e loci 4, 20 e 24, baixo poder discriminatório (0.3). Dos 250 isolados de M. tuberculosis analisados por spoligotyping, 92 diferentes padrões foram observados e diferentes famílias foram identificadas: Haarlem (H), Latin American and Mediterraneam (LAM), T Family, undesignated (U), S lineage e X Family. Significativa variabilidade genética foi observada nos isolados de M. tuberculosis circulantes na região Noroeste Paulista quando analisados por spoligotyping e MIRU-VNTR / Tuberculosis is considered a high priority public health problem. There is increasing evidence that the variation in Mycobacterium tuberculosis strains play an important role in the outcome of infections by tuberculosis. Apart from describing sociodemographic, clinical, epidemiological and bacteriological aspects of tuberculosis (TB) and correlating the distribution of resistance to antituberculosis drugs, one objective of this study was to evaluate the diversity of the genotypes of M. tuberculosis isolates using the Spoligotyping (spacer oligonucleotide typing) and MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units variable-number tandem repeats) techniques. With respect to drug resistance, cultures of M. tuberculosis and susceptibility tests showed that strains from people previously submitted to TB treatment or infected with HIV have more resistance to drugs compared to those without these characteristics (p <0.05 ). Resistant cases are mostly pulmonary M. tuberculosis, and have positive smear test results. Molecular analysis showed that of the 377 samples, 14 MIRU-VNTR loci had complete profiles; the 10, 16, 23, 26, 27, 31, 39 and 40 loci had high discriminatory power (0.6) the 2, ETRB and Mtub21 loci were moderately discriminatory (0.3) and 4, 20 and 24 loci had low discriminatory power (0.3). Ninety-two different patterns were observed in the 250 M. tuberculosis isolates analyzed by spoligotyping and different families were identified as Haarlem (H), Latin American and Mediterranean (LAM), T Family, undesignated (U), S lineage and X Family. Significant genetic variability was observed in M. tuberculosis isolates circulating in the northwestern region of Sao Paulo State when analyzed by spoligotyping and MIRU-VNTR

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-16Bitstream added on 2014-06-13T19:34:22Z : No. of bitstreams: 1 silva_jc_me_arafcf.pdf: 1130600 bytes, checksum: 7c00c4a3deedeb905819b7bbb4d0d62c (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Com o surgimento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) em 1981, observou-se tanto em países desenvolvidos como nos países em desenvolvimento um aumento do número de casos notificados de Tuberculose, principalmente em indivíduos infectados pelo HIV. Como agravante nos casos de co-infecção, existe a resistência aos anti-retrovirais, e uma das principais razões é a grande variabilidade genética do HIV. A genotipagem do HIV tornou-se uma ferramenta essencial para orientar e maximizar os benefícios do tratamento anti-retroviral dos pacientes HIV positivos. Neste estudo, pretendeu-se avaliar em um período de 6 meses os perfis imunológico e viral associados à freqüência de mutações no gene “pol” do HIV-1 em pacientes co-infectados HIV-Tuberculose. A casuística compreendeu 33 indivíduos de ambos os sexos e faixa etária entre 12 e 63 anos. Quatro grupos foram estudados: Grupo A (n=19) HIV tratando com anti-retroviral; e co-infectados: Grupo B (n=7) tratando com anti-retroviral; Grupo C (n=4) tratando com tuberculostático e Grupo D (n=3) tratando com anti-retroviral e tuberculostático. O perfil imunológico foi avaliado pela determinação quantitativa de fenótipos CD3/CD4 e CD3/CD8 de linfócitos do sangue periférico; perfil viral foi determinado pela quantificação da viremia RNA-HIV-plasmática; e os polimorfismos na região genômica “pol” avaliado pelo sequenciamento de cDNA. No entanto, na avaliação das contagens de Linfócitos T CD4/CD8 realizada para comparar os grupos foi notada uma tendência de redução das medianas no grupo D, pacientes que realizam tratamento duplo. Os demais grupos apresentaram um perfil imunológico satisfatório (CD4>400 células/μl) e a relação CD4/CD8 mantida inferior a 1.0. Dentre esses, o grupo que melhor apresentou perfil imunológico foi o constituído por indivíduos... / With the outbreak of the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) in 1981, it was observed both in developed countries and in developing countries an increase in the number of known cases of Tuberculosis, mainly in HIV infected individuals. As an aggravation in the co-infection cases there is the anti-retroviral resistance, and one of the main reasons is the HIV great genetic variability. The HIV genotyping became an essential tool to guide and maximize the benefits of the anti-retroviral treatment of positive HIV patients. In this study, it was intended to evaluate in a period of 6 months the immunology and viral profiles associated with the frequency of mutations in the HIV-1 “pol” gene in HIV-Tuberculosis co-infected patients. The study involved 33 individuals of both the sexes and ages between 12 and 63 years. Four groups were studied: Group A (n=19) HIV only under treatment with anti-retroviral drugs; and co-infected: Group B (n=7) under treatment with anti-retroviral drugs; Group C (n=4) under treatment with tuberculostatic drugs and Group D (n=3) under treatment with anti-retroviral and tuberculostatic drugs. The immunology profile was evaluated by quantitative determination of phenotype CD3/CD4 and CD3/CD8 of peripheral blood lymphocytes; viral profile was determined by quantification of the RNA-HIV-plasmatic viremia; and the polymorphisms in the “pol” genomic region were evaluated by sequencing of cDNA. The results were evaluated by non parametric “t” test and ANOVA and the demonstrated median showed that there was not significant difference (p>0,05) among the parameters of CD4/CD8 and viral load in the different studied groups. However, in the Lymphocyte counting evaluation the T CD4/CD8 carried out to compare the groups it was noticed a median reduction trend in group D, patients under double treatment. The other groups presented a satisfactory immunology profile (CD4>400 cells/μl) and the relation CD4/CD8 was kept below 1.

aumento do número de casos de tuberculose e o surgimento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistentes a múltiplas drogas, entre elas a isoniazida (INH) representa um sério problema de saúde pública. A enzima InhA, ou 2-trans-Enoil-ACP (CoA) redutase de MTB, catalisa a redução NADHdependente de ácidos graxos α,β-insaturados, precursores dos ácidos micólicos (importantes componentes do envelope celular do MTB). Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas à resistência in vivo à INH devido a uma menor afinidade pela molécula de NADH, sugerindo que o mecanismo de resistência deva estar relacionado com interações específicas entre a enzima e o cofator. Para verificar os eventos moleculares associados à afinidade da enzima pelo ligante e identificar os aspectos moleculares relacionados com a resistência, foram realizados estudos de simulação por dinâmica molecular (DM) dos sistemas InhA-NADH (espécie selvagem wt e mutantes) completamente solvatados.Todos os sistemas enzimáticos apresentaram grande flexibilidade durante as trajetórias por DM. Apesar da flexibilidade, no complexo wt InhA-NADH, a molécula de NADH permanece firmemente ligada ao sítio da enzima numa conformação estendida. Nos complexos mutantes I21V e I16T, onde as mutações ocorrem na alça rica em glicina, as interações entre enzima e cofator são menos efetivas, permitindo que a porção pirofosfato do NADH experimente importantes mudanças conformacionais e se afaste de sua região de ligação, indicando, provavelmente, um estágio inicial da dissociação do ligante. No mutante I47T, a substituição da Ile por Thr causa uma contração no sítio de ligação do NADH, que é refletida no rearranjo conformacional do NADH e na expulsão de moléculas de água importantes para a associação do cofator O mutante S94A apresentacomportamento muito semelhante à enzima selvagem, como esperado a partir dos experimentos cristalográficos. As afinidades das enzimas pelo NADH foram avaliadas por experimentos de docking molecular, onde as estruturas instantâneas geradas durante as trajetórias da DM foram utilizadas como forma de considerar explicitamente a flexibilidade da macromolécula. Os resultados do docking molecular mostraram que todos os mutantes apresentam menor afinidade pelo NADH, exceto o mutante S94A, cuja energia livre de ligação do NADH foi estatisticamente igual à observada para a enzima selvagem. Os resultados apresentados neste trabalho devem contribuir para o entendimento do mecanismo molecular específico de resistência à INH, que é crucial para o desenvolvimento de novos fármacos para o controle da tuberculose. / The increasing prevalence of tuberculosis in many areas of the world, coupled with the rise in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains presents a major threat to global health. InhA, the enoyl-ACP reductase from MTB, catalyzes the NADH-dependent reduction of long chain trans-2-enoyl-ACP fatty acids, an intermediate in mycolic acids biosynthesis. Mutations in the structural gene for InhA are associated with isoniazid resistance in vivo due to a reduced affinity for NADH, suggesting that the mechanism of drug resistance may be related to specific interactions between enzyme and cofactor within the NADH binding site. In order to compare the molecular events underlying this ligand affinity in the wild type and S94A, I21V, I16T and I47T clinical mutant enzymes, and to identify the molecular aspects related to resistance, molecular dynamics (MD) simulations of fully solvated NADH-InhA (wt and mutants) systems were performed.All InhA-NADH systems showed a large flexibility during the MD trajectories. Although very flexible, in the wt InhA-NADH complex, the NADH molecule keeps its extended conformation firmly bounded to the enzyme’s binding site. In the I21V and I16T mutant complexes, where mutated residues were located in the glycine rich loop, interactions between enzyme and cofactor became more labile, and the NADH pyrophosphate moiety undergoes to considerable conformational changes, becoming more hydrated and moving apart from its binding site, probably indicating the initial phase of ligand expulsion. In the I47T mutant, the substitution of an Ile residue for Thr causes a binding site contraction with conformational changes of the NADH molecule and expulsion of water molecules important for cofactor binding to the enzyme. The S94A mutant showed to be very similar to the wt enzyme, in agreement to crystallographic experiments observations. The enzyme-ligand affinities were evaluated by molecular docking experiments which were performed in the trajectory ensembles of MD snapshots asa way to explicit consider the macromolecular flexibility. All mutant enzymes had lower affinities for the NADH molecule, except the S94A mutant, whose free energy of NADH binding was statistically similar to that of the wild type enzyme. This results presented here should contribute to our understanding of specific molecular mechanisms of drug resistance, which is crucial for designing more potent antimycobacterial agents for controlling tuberculosis.

A enzima indol-3-glicerol fosfato sintase (IGPS) catalisa a formação irreversível do anel do composto 1-o-carboxifenilamino desoxiribulose-5-fosfato (CdRP), através de uma decarboxilação e de uma desidratação, liberando o composto indol-3-glicerol fosfato (IGP), o quinto passo na via de biossíntese do triptofano. Neste trabalho, é descrita a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética da IGPS, além da identificação de um intermediário reacional. Para a realização destes estudos, o substrato da enzima (CdRP) foi sintetizado quimicamente, purificado e caracterizado espectroscopicamente e espectrometricamente. A fluorescência do CdRP mostrou-se dependente de pH, possivelmente devido ao efeito de transferência intramolecular de prótons no estado excitado (ESIPT). Efeitos de temperatura foram analisados, indicando uma energia de ativação de 8.4 kcal mol-1 para a reação catalisada pela IGPS. Efeitos isotópicos de solvente mostraram que a transferência de próton é apenas modestamente limitante para a reação, e estudos de inventário de prótons demonstraram que apenas um próton é responsável pelo efeito isotópico de solvente observado. Perfis de pH foram realizados para avaliar a presença de catálise ácido-base, mostrando que um resíduo desprotonado de pKa aparente igual a 6.0 é necessário para a catálise e que um resíduo com pKa aparente igual a 6.8 é necessário para a ligação do CdRP. Sugerimos que ambos os pKa estejam reportando para um mesmo resíduo, que poderia ser um glutamato conservado em todas as IGPS caracterizadas até o presente. Um modelo é proposto para explicar o ESIPT, assim como uma seqüência cinética baseada nos perfis de pH. Para identificar possíveis intermediários reacionais, a técnica de ESI-MS foi empregada para estudar a reação catalisada pela IGPS, e um intermediário químico foi interceptado e caracterizado. / The enzyme indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) catalyzes the irreversible ring closure of 1-o-carboxyphenylamino deoxyribulose-5-phosphate (CdRP), through a decarboxylation and a dehydration, releasing indole-3-glycerol phosphate (IGP), the fifth step in the biosynthesis of tryptophan. In the present work, we describe cloning, expression, purification, and kinetic characterization of IGPS. In order to perform kinetic studies, CdRP was chemically synthesized, purified, and espectroscopically and spectrometrically characterized. CdRP fluorescence was pH-dependent, probably owing to excited-state intramolecular proton transfer (ESIPT) effect. Temperature effects were analyzed, indicating an activation energy of 8.4 kcal mol-1 for the IGPS catalyzed reaction. Solvent isotope effects showed that a proton transfer is only modestly limiting for the reaction, and proton inventory studies pointed to a single proton responsible for the observed solvent isotope effect. pH-rate profiles were carried out to probe for acid/base catalysis, showing that a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.0 is required for catalysis and a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.8 is necessary for CdRP binding. It was suggested that both apparent pKa report on the same residue, which might be a glutamate conserved amongst all IGPS characterized so far. A model is proposed to explain the ESIPT, and a kinetic sequence is suggested based on the pH-rate profiles. ESIMS was employed to identify possible chemical intermediates of the IGPS catalyzed reaction, and one chemical intermediate was intercepted and characterized.

As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose. / The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.

Para auxiliar no controle da tuberculose são necessários novos métodos de detecção de Mycobacterium tuberculosis que sejam rápidos, específicos e de aplicabilidade em laboratórios de saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento. Vários métodos moleculares de detecção e identificação de micobactérias em amostras clínicas têm sido desenvolvidos. Com o objetivo de padronizar e aplicar essas metodologias em laboratório foi desenvolvido um protocolo baseado na amplificação de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) e na detecção colorimétrica em microplacas. Uma região interna do elemento de inserção IS6110, específico do complexo M. tuberculosis, foi selecionada como alvo para amplificação por PCR com primers biotinilados. Uma sonda complementar a uma região interna do fragmento foi fixada em microplacas onde, posteriormente, foi hibridizado o produto amplificado. A detecção através de hibridização foi feita utilizando um conjugado estreptavidina peroxidase. A eficácia da técnica foi testada em amostras clínicas pulmonares de pacientes com suspeita de infecção e sem tratamento prévio para tuberculose. O padrão ouro no diagnóstico de infecção por M. tuberculosis foi a associação da baciloscopia com a cultura a partir da amostra clínica dos pacientes selecionados. Foram testadas 303 amostras de escarro induzido de 303 pacientes com suspeita de TB pulmonar, dos quais 69 apresentaram resultado positivo e 234 negativo para TB. A sensibilidade e especificidade obtidas foram 88% e 98% e os Valores Preditivos Positivo (VPP) e Negativo (VPN) foram 92% e 97%, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que a técnica desenvolvida no presente estudo pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico de tuberculose e poderia ser utilizada como um teste complementar no diagnóstico da doença. / New methods to detect Mycobacterium tuberculosis rapidly, accurately and that are feasible to apply in laboratories of developing countries are necessaries. Several methods for direct detection and identification of mycobacteria in clinical samples have been developed. With the aim to standardize the application of such methods in laboratory, we developed a molecular method for DNA extraction and PCR detection using a microwell plate hybridization assay. An internal region of the repetitive element, specific of M. tuberculosis complex, called IS6110 was selected as a target for amplification using specific biotinylated primers. The detection of amplified fragments was performed using microwell plates. An aminated DNA fragment complementary to an internal region of the amplified fragment was used as a probe. The biotinylated amplified products were added to the plate and identified with the use of streptavidin conjugated to horseradish peroxidase. The efficacy of the method was tested to detect pulmonary tuberculosis in patients suspected of TB infection with no previous treatment. As gold standard, the bacteriological criteria was used. Three hundred and three induced sputum samples from 303 pulmonary TB suspects were evaluated, of which 69 showed positive result and 224 negative for TB. The sensitivity and specificity obtained were 88% and 98% and Positive and Negative Predictive Values were 92% and 98%, respectively. The obtained results demonstrated that the PCR detection using a microwell plate hybridization assay may be an important tool for the diagnosis of tuberculosis and suggest that it could be used as a complementary diagnostic method.

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.