L’émergence de formes multirésistantes de tuberculose et la résistance intrinsèque de Mycobacterium abscessus à de nombreux anti-infectieux imposent l’identification de nouveaux antibiotiques et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les mycobactéries sont naturellement peu sensibles aux β-lactamines par production d’une β-lactamase et de cibles atypiques de faible affinité, les L,D-transpeptidases, qui sont efficacement inactivées par une seule classe de β-lactamines, les carbapénèmes. L’objectif de la thèse est d’étudier le mode d’action des β-lactamines afin de proposer des stratégies permettant d’optimiser ces antibiotiques. Pour comprendre la spécificité des L,D-transpeptidases vis-à-vis des carbapénèmes, nous avons étudié la cinétique et le mécanisme de la réaction d’inactivation de ces enzymes par différentes méthodes de spectroscopie en flux arrêté. Nos résultats indiquent que l’efficacité des carbapénèmes est due à leur capacité à former rapidement un intermédiaire tétrahédrique et à la stabilité de l’acylenzyme. La spécificité des L,D-transpeptidases pour les carbapénèmes ne dépend pas de leurs chaînes latérales, qui pourraient être modifiées pour améliorer les propriétés pharmacologiques de ces antibiotiques. Chez M. abscessus, nous avons identifié un inhibiteur de la β-lactamase, l’avibactam, qui augmente l’activité de certaines β-lactamines in vitro, en intracellulaire et dans un modèle d’infection du poisson zèbre. Nos résultats montrent que les β-lactamines peuvent être optimisées pour le traitement des infections dues aux mycobactéries multirésistantes par l’amélioration de l’inactivation des cibles ou l’inhibition des β-lactamases. / The emergence of multidrug-resistant tuberculosis and the intrinsic resistance of Mycobacterium abscessus to most antibiotics require the identification of new drugs and new therapeutic strategies. Mycobacteria are naturally poorly susceptible to β-lactam antibiotics due to production of a β-lactamase and of atypical low-affinity targets, the L,D-transpeptidases, which are effectively inactivated by a single class of β-lactams, the carbapenems. The aim of the thesis is to study the mode of action of β-lactams to propose strategies for the optimization of these antibiotics. To understand the specificity of L,D-transpeptidase for carbapenems, we have studied the kinetics and mechanism of inactivation of these enzymes using various stopped-flow spectroscopic methods. Our results indicate that the efficacy of carbapenems is due to their ability to rapidly form a tetrahedral intermediate and to the stability of the acylenzyme. The specificity of the L,D-transpeptidases for carbapenems does not depend upon the side chains of the drugs, which may be modified to improve their pharmacological properties. In M. abscessus, we have shown that the β-lactamase inhibitor avibactam increases the activity of various β-lactams in vitro, intracellularly, and in zebrafish model. Our results show that β-lactams can be optimized for the treatment of infections due to multidrug-resistant mycobacteria by improving inactivation of the targets and by inhibiting the β-lactamases.

Apesar das recomendações da Organização Mundial da Saúde, na reunião ministerial realizada em Amsterdam, Holanda em 2000, a tuberculose continua em ritmo crescente, atingindo principalmente os países em desenvolvimento e pessoas com o sistema imunológico comprometido, principalmente as infectadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida. Os métodos utilizados no diagnóstico continuam os mesmos utilizados por muitos anos, cujas limitações impedem a ação rápida dos programas de saúde que buscam interromper a cadeia de transmissão da doença. Continuando uma linha de pesquisa do Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do IMTSP, utilizando o método do Western Blotting, procuramos neste trabalho ampliar os conhecimentos da resposta imunológica de anticorpos em pacientes com tuberculose pulmonar, clinica e laboratorialmente definida, avaliando a participação das imunoglobulinas IgG, IgA e IgM, subclasses de IgG (IgG1 e IgG3) e a avidez da imunoglobulina IgG em amostras de soros colhidas no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que o melhor marcador imunológico foi a imunoglobulina IgG por apresentar melhor desempenho diagnóstico quando comparada com os resultados dos métodos microbiológicos e de dosagem de interferon gama, Quantiferon TB Gold. As frações protéicas que apresentaram melhor desempenho diagnóstico foram as de 38 e 30 KDa / Despite the recommendations of the World Health Organization, during the Ministerial meeting held in Amsterdam, Holland in 2000, tuberculosis continues at an important increasing rate, affecting mostly developing countries and people with severe compromised immune systems, especially those infected with human acquired immunodeficiency virus. The methods used for diagnosis are the same used for many years, whose limitations prevent the rapid action of countries health programs that seek to stop the chain of disease transmission. Continuing a line of research of the Laboratory of Seroepidemiology and Immunobiology of IMTSP using the method of Western blotting, in this study we tried to broaden the knowledge of the immune response of antibodies in patients with pulmonary tuberculosis, clinical and laboratory defined by evaluating the participation of IgG, IgA and IgM, IgG subclasses (IgG1 and IgG3) and immunoglobulin IgG avidity in serum samples collected in the beginning and end of treatment. Our results showed that the immunoglobulin IgG was best immunological marker when compared with the results of microbiological methods and determination of interferon gamma, QuantiFERON TB Gold. The proteins fractions that showed better diagnosis performance were 38 and 30 KDa

A manutenção da infecção latente pelo M. tuberculosis (TBIL) pode ser atribuída à sua capacidade de sobreviver durante anos no organismo humano em um estado não replicativo (dormente). A proteína HspX do M. tuberculosis, induzida sob condições de hipóxia, está fortemente associada com a manutenção da viabilidade do bacilo na TBIL. O presente estudo tem como objetivo, verificar se a superexpressão da proteína HspX altera a expressão de genes envolvidos com a síntese de componentes da parede celular, replicação do DNA e divisão celular de bacilos, assim como, na expressão de genes envolvidos com a resposta imune inata em macrófagos infectados com esses bacilos. O gene hspX foi amplificado pela PCR a partir do DNA do M. tuberculosis H37Rv, clonado no vetor de expressão pFPCA1GFP, e a proteína HspX expressa em M. smegmatis mc2155. As bactérias, nas quais, a presença da proteína recombinante foi confirmada por Western Blot, foram utilizadas, para a análise de expressão gênica tanto em bactérias quanto em macrófagos infectados. O estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a RT-qPCR. Quando comparado aos controles, as bactérias que expressavam a proteína HspX apresentaram uma redução na expressão de genes de replicação do DNA e divisão celular, que foi acompanhado por uma tendência a filamentação das células e uma redução no tamanho das colônias. Além disso, nos macrófagos infectados com a bactéria expressando a proteína HspX, houve um aumento tanto da expressão do mRNA quanto da secreção de IL-1b, citocina importante para estabilização do granuloma, e uma redução na expressão de IRGM, gene relacionado com o processo autofágico, importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra bactérias intracelulares. Portanto, em conjunto, essas alterações de expressão gênica, em consequência da presença da proteína HspX sugerem uma contribuição, direta ou indireta, dessa proteína para a adaptação morfológica e metabólica da bactéria dormente durante a TBIL, e consequentemente, para a resposta imune inata dos macrófagos infectados favorecendo a viabilidade intracelular dessas bactérias. / The maintenance of Mycobacterium tuberculosis infection latent (TBIL) may be attributed to its ability to persist for years in the host in a non-replicative state (dormant). The HspX protein from M. tuberculosis, induced under hypoxic, is strongly associated with maintaining the bacillus viability in TBIL. This study aims to determine if HspX overexpression chances the expression of genes involved in the synthesis of cell wall components, DNA replication and cell division of bacilli, as well as, the expression of genes involved in innate immune response of macrophages infected. The gene hspX was amplified by PCR from DNA of M. tuberculosis H37Rv, and cloned into the expression vector pFPCA1GFP. The HspX was expressed in M. smegmatis mc2155 and the recombinant protein was confirmed by Western blot. The bacterias expressing HspX were used for gene expression analysis both in bacteria and in infected macrophages by RT-PCRq. In bacterias expressing HspX, it was observed a reduction in expression of genes involved in DNA replication and cell division, and with cells more filamentous and smaller colonies, compared with controls. In addition, in macrophages infected with bacillus expressing HspX, there was an increase in both mRNA expression and secretion of IL-1b, an important cytokine for granuloma stability, and a reduction in expression of IRGM, an autophagic gene, important for host defense mechanism against intracellular bacteria. Together, these results suggest a direct or indirect contribution of HspX protein for metabolic and morphological adaptation of dormant bacteria in TBIL, and for the innate immune response in infected macrophages, improving the bacteria intracellular viability.

O presente trabalho objetivou avaliar o efeito da gordura do leite caprino na resistência térmica do Mycobacterium fortuitum. A realização desta pesquisa é motivada pelos seguintes fatos: 1. a pasteurização lenta é amplamente utilizada para o beneficiamento do leite caprino destinado ao consumo e industrialização; 2. o binômio tempo x temperatura foi estabelecido com base na resistência térmica do Mycobacterium ssp; 3. o valor D expressa o tempo que se leva, a uma dada temperatura, para se reduzir um ciclo logarítmico de um microrganismo; 4. a gordura exerce efeito protetor sobre os microrganismos; 5. M. fortuitum é a espécie recomendada para testes iniciais, por ser menos patogênica e de crescimento rápido. Foram realizados dois experimentos (um com leite integral e outro com leite desnatado, com três repetições cada), utilizando-se amostras de cabras sadias. As amostras foram contaminadas com inóculo previamente padronizado e distribuídas em oito tubos com tampa, que foram submetidos a tratamento térmico em banho-maria à 65oC. Realizou-se a contagem das UFC/mL do leite contaminado antes do tratamento térmico (controle da contaminação) e dos tubos retirados nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos. Realizou-se a diluição seriada até 10-7, com posterior semeadura em duplicata em placas de petri com meio Lowenstein-Jensen, incubadas por cinco dias à oC. Os resultados, em logarítmo, foram plotados em diagrama de dispersão, com posterior regressão linear para construção da curva de sobreviventes (ou curva de morte térmica), o valor D65oC foi calculado a partir da equação da reta obtida em cada repetição, e também a melhor curva obtida a partir das três repetições. Através dos resultados obtidos no presente trabalho obteve-se o valor D65oC do Mycobacterium fortuitum em leite caprino integral de 10,2 minutos e 8,61 minutos para o leite desnatado. Isso mostra que, na condição estudada a pasteurização lenta é capaz de reduzir 3,48 log de M. fortuitum em leite desnatado, e apenas 2,94 log em leite integral e, portanto, resultará em diferentes níveis de segurança ao consumidor. A variação nos valores D65oC observadas neste trabalho sugerem que a gordura não é a única responsável por essa diferença, pois houve variação entre as repetições realizadas no mesmo substrato. A variação entre os resultados em leite integral pode ser atribuída, pelo menos em parte, à composição da gordura que têm influência na resistência térmica dos microrganismos. A gordura do leite interfere negativamente na eficiência da pasteurização lenta sobre destruição de M. fortuitum. A importância dessa informação para a saúde pública é dependente, em primeiro lugar, da comprovação de que esse fenômeno é comum às espécies patogênicas de micobactérias, e determinar sua intensidade. A gordura não interfere no padrão de morte térmica no leite de cabra. / This work describes the results obtained to evaluate the effect of fat goat milk on thermal resistance of Mycobacterium fortuitum. This research is motivated for the following motives: 1. The holder pasteurization is extensive method using for the processing goat milk destined for consumption and industrialization; 2. The couple time x temperature was established for the thermal resistance of Mycobacterium ssp; 3. The value D express the necessary time, in a given temperature, to reduce a logarithmic cycle of microorganism; 4. The fat causes a protecting effect on the microorganisms; 5. Mycobacterium fortuitum is the specie recommended for beginnings tests, because it is less pathogenic and have fast growth. Two experiments were done (one using raw goat milk and another using skim goat milk, with three repetition each). The samples were contaminated with previous standard inoculum and distributed in eight tubes, that had been submitted a thermal treatment in water-bath in 65°C. The cfu/mL were counted in the contamined milk before the thermal treatment (contamination control) and the tubes pulled off in the times: 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutes. Following was realized a series diluted until 10-7, with later spreaded in duplicate petri plates with medium Lowestein Jensen, incubated for five days in 37°C. The results obtained were represented in a logarithmic graph of dispersion diagram, with posterior linear regression for the construction survivor?s curve (or death thermal curve), the value D65oC was calculated from the equation of the straight line obtained in each repetition, and the best straight line obtained from the three repetitions too. Through the results obtained in the present work get a value D65oC of Mycobacterium fortuitum in raw goat milk the 10,2 minutes, and 8,61 minutes for skim goat milk, this mean that in these study conditions, the holder pasteurization is able to reduce 3,48 log of Mycobacterium fortuitum in skim milk and only 2,94 log in raw milk, and thus results in different security levels for the consumers. The variation observed in the values D65oC obtained in this work suggest that the fat doesn?t a unique responsible for this difference, because have a variation among the repetitions done in the same substrate. The variation between the results in raw milk can be attribute, in part, for the composition of fat that have a influence on the thermal resistance in the microorganisms. The fat milk interferes negatively in the holder pasteurization effective about the Mycobacterium fortuitum destruction. The importance on this information for the public health is dependent, in first moment, the proved that this phenomenon is common for the micobacteria pathogenic species, and determined its intensity. The fat doesn't interfere in the standard thermal death in the goat milk.

Avaliou-se a aplicação rotineira de um método automatizado TSMA em comparação ao convencional TSMP na determinação da sensibilidade a drogas anti-micobacterianas de 126 isolados clínicos de bactérias do complexo M. tuberculosis. Os isolados clínicos foram divididos em: sem tratamento (NT), tratado anteriormente (RT) e multirresistentes (MDR). A concordância entre TSMP e TSMA, para Rifampicina no NT, foi de 98.3%, p=1.000 e Kappa=0.659. No RT, foi de 94.3%,p=0.625 e Kappa=0.639, no MR, foi de 96.6%, p=0.625 e Kappa=0.651. Para Hidrazida, no NT, foi de 88.5%, p=0.125 e Kappa=0.408 no RT foram de 88.6%, p=0.625 e Kappa=0.645 no de pacientes MR, foi de 86,7%, p=0.625 e Kappa=0.053. Para Estreptomicina no NT, foi de 93.5%, p=0.125 e Kappa=0.635. No RT, foi de 79.4%, p=0.016 e KAPPA=0.296 no MR, foi de 76,6%, p=0.453 e Kappa=0.533. Para Etambutol, no NT, foi de 93.4%, p=0.125 e Kappa=0.315, no RT foi de 94.3%, p=0.500 e Kappa=0.478. No MR, foi de 72.4%, p=0.70ª e Kappa=0.455. A metodologia automatizada mostrou-se mais rápida. / We evaluated the routinely application of an automated system(STAM) and the conventional method (STPM), used to determine the profile of sensitivity to antimycobacterial drugs of 126 clinical isolates of the complex M. tuberculosis. Clinical isolates was group divided into: without treatment (WT), previously treated (PT) and multidrug resistant (MDR).Concordant result between STPM and STAM, for Rifampin, in WT, was 98.3%, p=1.000 and Kappa=0.659. PT, was 94.3%, p=0.625 and Kappa=0.639; in MDR, was 96.6%, p=0.625 and Kappa=0.651. For Hidrazin, WT, was 88.5%, p=0.125 and Kappa=0.408; in PT, 88.6%, p=0.625 and Kappa=0.645; for MDR, 86.7%, p=0.625 and Kappa=0.053. For Streptomycin, PT was 93.5%, p=0.125 and Kappa=0.635. In PT, was 79,5%, p=0.016 and Kappa=0.296; in MDR, 76.6%, p=0.453 and Kappa=0.533. For Ethambutol, WT was 93.4%, p=0.125; in PT 94.3%, p=0.500 and Kappa=0.478. MDR was 72.4%, p=0.70 and kappa=0.455. Evaluation of mycobacterial sensitivity was faster in the automated method when compared with the conventional method.

Dada a existência de quatro famílias molecularmente distintas de estirpes de Mycobacterium avium isoladas de suínos da região Sul do Brasil e a verificação de diferentes virulências em hamsters de um representante por família, o presente trabalho objetiva relacionar a virulência de isolados de M. avium aos seus perfis genéticos obtidos em experimentos de RFLP. Foram selecionados três representantes por família que foram inoculados pela via intraperitoneal em hamsters distribuídos em doze grupos (cada grupo recebeu uma estirpe diferente). Foi mantido um grupo controle que recebeu solução salina estéril pela mesma via. Após 16 dias da inoculação, os animais foram eutanasiados; os baços foram colhidos, pesados, macerados, suspendidos em solução salina estéril e diluídos. Cada uma das diluições foi semeada em duplicata em placas com meio de Petragnani, que foram incubadas a 37°C. Após 30 dias de incubação, foram realizadas as contagens de UFC e os resultados foram expressos em UFC de M. avium por grama de baço. As famílias genéticas apresentaram capacidade de virulência semelhante (p=0,49). As estirpes dentro das famílias PIG B e PIG D não apresentaram diferença na virulência (p=0,15 e p=0,87, respectivamente). Dentro da família PIG A, o isolado A52 foi mais virulento do que A1 e A162; a estirpe C122 se apresentou menos virulenta do que as estirpes C44 e C68 dentro da família PIG C. Independente das famílias, todos os isolados apresentaram diferenças na virulência. A estirpe A52 mostrou maior capacidade de virulência em relação às estirpes A1, A162, B72, C122, D242 e 243. Diferentes contagens de UFC significam diferentes capacidades de produzir infecção, ou seja, diferentes virulências. Concluiu-se que isolados de M. avium com diferentes perfis de RFLP podem apresentar diferentes virulências, independentemente de pertencerem a uma mesma família genética definida com base na similaridade dos padrões de RFLP; não houve diferença de virulência entre as quatro famílias genéticas de M. avium estruturadas com base na similaridade dos padrões de RFLP. / Knowing the existence of four molecularly distinct families of Mycobacterium avium strains isolated from swine populations of Brazil Southern and the corroboration of diverse virulence in experimentally infected hamsters by one representative of each family, this work intend to establish relation between virulence of M. avium isolates and their genetic patterns obtained in prior RFLP analyses. We selected three representatives of each family, totalizing twelve strains, which were introduced by intraperitoneal route into hamsters distributed in twelve groups (each group received a different strain). A control group was maintained and received buffer solution by the same route. Sixteen days after the inoculation, animals were euthanized and their spleens were collected, weighted, triturated, suspended in buffer solution and then diluted. Two plates containing Petragnani medium were seeded with each dilution and were incubated at 37ºC. At the 30th day, the CFU counting was performed and the results were expressed in M. avium CFU/g of spleen. All genetic families presented similar capacity of virulence (p=0,49). Strains of PIG B and PIG D families presented similar virulence within their families (respectively, p=0,15 and p=0,87). Inside the PIG A family, strain A52 was more virulent than strains A1 and A162; the strain C122 presented the lowest virulence compared with the strains C44 and C68 within the PIG C family. All strains, independent of their family, presented diverse virulence. Strain A52 was more virulent than strains A1, A162, B72, C122, D242 and D243. Distinct counting of CFU means different capacity of producing infection, i.e. diverse virulence. We concluded that, independent fo the genetic family established by similarity of RFLP patterns, M. avium isolates with diverse RFLP profiles may present different virulence; there was not difference in virulence; among all of four M. avium genetic families structured according to the similarity of RFLP patterns.

Os casos de tuberculose vêm crescendo, coincidindo com o aumento dos casos de AIDS, sendo uma das doenças que causa maior número de mortes no mundo. Entretanto, a busca por novos fármacos cresce de forma lenta, principalmente pelo baixo interesse da indústria farmacêutica, uma vez que a tuberculose ocorre predominantemente em países em desenvolvimento. Tiossemicabazonas têm atraído a atenção de muitos pesquisadores por suas propriedades biológicas e farmacológicas. Esta classe de ligantes é biologicamente ativa contra Mycobacterium tuberculosis, agente causador da tuberculose. Este trabalho apresenta a síntese e caracterização de uma série de complexos de metais da primeira série de transição com ligantes tridentados do tipo 2-acetilpiridina-N(4)-R-tiossemicarbazona (Hatc-R). A caracterização dos compostos envolveu diversas técnicas, como análise elementar, espectroscopia na região do infravermelho e do UV-Vis, condutimetria, ressonância magnética nuclear (1H RMN), voltametria cíclica, voltametria de pulso diferencial, medidas de susceptibilidade magnética e difração de raios X em monocristais. Baseando-se nos resultados de caracterização, verificou-se a formação de complexos de geometria octaédrica do tipo [M(atc-R)2], onde M = Mn(II) (R = hidrogênio, metil, etil, fenil, ciclohexil e morfolinil), Ni(II) (R = etil) e Zn(II) (R = etil e fenil); [M(atc-R)2]X, onde M = Fe(III) (R = etil e fenil, X = HSO4-) e Co(III) (R = etil e fenil, X = Cl-), e complexos de cobre (II) com geometrias quadrática-plana [CuCl(atc-Me)] e pirâmide de base quadrada [Cu2(µ-atc-Me)2µ-SO4]. Com isto, foi possível avaliar a influência dos metais, da geometria formada e dos grupos periféricos (R) dos ligantes na atividade anti-Mycobacterium tuberculosis, bem como na citotoxicidade dos complexos obtidos, de modo a potencializar a atividade desta classe de ligantes e obter um complexo com alto índice de seletividade, com potencial para ser futuramente utilizado na terapia da tuberculose. Dentre os 15 complexos obtidos neste trabalho, destacaram-se os compostos [Mn(atc-Ph)2], [Co(atc-Et)2]Cl e [Co(atc-Ph)2]Cl com valores de IS igual à 50. Estes resultados são comparáveis ou melhores que alguns fármacos de primeira e segunda linha usados atualmente no tratamento de tuberculose, tornando estes complexos fortes candidatos à futuros fármacos. / Tuberculosis cases have been rising, coinciding with the increase of AIDS cases, becoming one of the diseases with highest mortality worldwide. However, the research for new drugs grows slowly, mainly due to the low interest of the pharmaceutical industry, once tuberculosis usually occurs in developing countries. Thiosemicarbazones have attracted the attention of many researchers due to their biological and pharmacological properties. This class of ligands is biologically active against Mycobacterium tuberculosis, the pathogenic agent of tuberculosis. This work presents the synthesis and characterization of a set of complexes of the first transition metals series with tridentate ligands of the type 2-acetylpyridine-N(4)-R-thiosemicarbazone (Hatc-R). The characterization involved many techniques such as elemental analyses, infrared and UV-Vis spectroscopies, conductometry, nuclear magnetic resonance (1H NMR), cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, magnetic susceptibility measurement and X-ray diffraction on single crystals. Based on the results of the characterization it was observed the formation of complexes in octahedral geometry of the type [M(atc-R)2], where M = Mn(II) (R = hydrogen, methyl, ethyl, phenyl, ciclohexyl and morpholinyl), Ni(II) (R = ethyl) and Zn(II) (R = ethyl and phenyl); [M(atc-R)2]X, where M = Fe(III) (R = ethyl and phenyl, X = HSO4-) and Co(III) (R = ethyl and phenyl, X = Cl-), and copper (II) complexes with square-planar [CuCl(atc-Me)] and square pyramidal [Cu2(µ-atc-Me)2µ-SO4] geometries. So, it was possible to evaluate the influence of the metals, of the generated geometry and of the peripheral groups (R) of the ligands on the anti-Mycobacterium tuberculosis activity, as well as the citotoxicity of the obtained complexes, in order to enhance the activity of the class of ligands and to obtain a complex with high selectivity index, with potential to be futurely used in tuberculosis therapy. Among the 15 complexes obtained in these work, the most selective compounds were [Mn(atc-Ph)2], [Co(atc-Et)2]Cl and [Co(atc-Ph)2]Cl with values of SI equal to 50. These results are comparable or better than some drugs of first and second line for the currently treatment of tuberculosis, making these complexes strong candidates for future drugs.

A tuberculose ainda é pontuada como uma doença de impacto mundial, sendo considerada desde 1993 um problema de saúde pública global. Uma das grandes preocupações é a contínua prevalência de cepas da Mycobacterium tuberculosis multidroga resistentes, especialmente o genótipo hipervirulento W-Beijing. Acredita-se que este genótipo apresenta alguma vantagem seletiva em relação a outros genótipos da M. tuberculosis, além de estar associado à falha terapêutica, tuberculose extrapulmonar, resistência à vacinação pela BCG e acentuada capacidade de disseminação. Estas cepas apresentam variável capacidade de sobrevivência dentro de macrófagos e do granuloma, modulando vias metabólicas específicas que culminam no escape do sistema imunológico e sucesso na infecção. Buscando entender esta vantagem seletiva e capacidade de persistência na infecção, este estudo teve como objetivo analisar e comparar o perfil transcriptômico de macrófagos infectados com as cepas da M. tuberculosis, W-Beijing 1471 e H37Rv. Os RNAs mensageiros dos macrófagos infectados foram sequenciados em plataforma HiScan Genome Analyzer Illumina. Foram gerados aproximadamente 30 milhões de sequências por amostra, em leituras single reads, com mais de 70% de sequências com valores de score Q de qualidade superior ou igual a 30. Foram mapeados e analisados 35.581 transcritos. Em média, 63% dos genes não apresentaram diferenças nos valores de expressões, 19% tiveram suas expressões reduzidas e 18% dos genes foram classificados como mais expressos, para todas as amostras de macrófagos sequenciadas. Após as análises terciárias e validação por PCR em tempo real, as amostras infectadas com a cepa W-Beijing 1471 apresentaram um aumento nas expressões de IFNs da classe I (p<0,001) e aumento exacerbado de TNF-alfa (p<0,001), comparativamente ao controle e as amostras infectadas com a cepa padrão H37Rv. Aditivamente foi observado um aumento nas expressões de duas quinases, RIPK1 e RIPK3 e de moléculas envolvidas na indução e controle de espécies reativas de oxigênio (ROS), que em infecções por bactérias intracelulares, estão correlacionadas com a morte de macrófagos por necroptose. A cepa hipervirulenta da M. tuberculosis, W-Beijing 1471, apresentou reduzida persistência intramacrofágica e induziu morte precoce dos macrófagos ao quinto dia de infecção. A morte observada nos macrófagos foi associada a ativação de IFNs da classe I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 e ROS, indicando necroptose. Ainda, foi observado um aumento na expressão do receptor TLR3 nas amostras infectadas com a cepa W-Beijing, comparativamente as amostras controles e infectadas com a cepa H37Rv. É provável que a ativação inicial dos IFNs da classe I tenha ocorrido via TLR3 através do reconhecimento de dsRNAs da M. tuberculosis. / Since 1993 the tuberculosis is considered as a disease of worldwide impact and a problem of public health. A major concern is the continuing prevalence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains, especially the hypervirulent W - Beijing genotype. It is believed that this genotype has a selective advantage over other genotypes of M. tuberculosis and has being associated with treatment failure, extrapulmonary tuberculosis, resistance to BCG vaccination and marked ability to spread. These strains have varying ability to survive within macrophages and granuloma, modulating specific metabolic pathways that culminate in the escape of the immune system response. To understand this selective advantage and ability to persist in infection, this study aimed to analyze and compare the transcriptomic profile of macrophages infected with strains of M. tuberculosis W - Beijing 1471 and H37Rv. The mRNAs of infected macrophages were sequenced in HiScan Illumina Genome Analyzer platform. Were generated approximately 30 million sequences per sample, in single-reads readings. More than 70 % of sequences had values of Q score superior or equal to 30. Were mapped and analyzed 35,581 transcripts. On average, 63% of the genes showed no differences in the expressions, 19% were downregulated and 18% were upregulated, for all samples sequenced macrophages. After tertiary analysis and validation by real-time PCR, samples infected with the strain W -Beijing in 1471 showed an increase in expression of IFN class I (p <0.001) and exacerbated increase of TNF- alpha (p < 0.001) when compared to the control samples and those infected with standard strain H37Rv. Additively was observed an increase in expressions of the two kinases RIPK1 and RIPK3 and molecules involved in the induction and control of reactive oxygen species (ROS). In infections by intracellular bacteria, activation of RIPK1, RIPK3, ROS and TNF-&#945;, are correlated with death of macrophages by necroptosis. The hypervirulent M. tuberculosis W - Beijing 1471 strain showed reduced persistence inside macrophage and induced early death of macrophages in the fifth day of infection. The death observed in macrophages was associated with activation of IFNs class I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 and ROS, indicating necroptosis. Also was observed an increase in the expression of TLR3 receptor in infected samples with W-Beijing 1471 strain compared to controls and those infected with H37Rv strain. Probably the initial activation of IFNs class I occurred by TLR3 through the recognition of M. tuberculosis dsRNAs.

Foi estabelecida uma parceria entre o Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal (VPS) da FMVZ-USP, a Coordenadoria de Defesa Agropecuária do Estado de São Paulo e o Serviço de Inspeção Federal (SIF) para organizar um sistema capaz de detectar focos de tuberculose bovina no Estado, com base nas rotinas de inspeção de carcaças em abatedouros, cujos objetivos foram: 1) conhecer a diversidade genética de isolados de Mycobacterium bovis em bovinos no Estado de São Paulo; 2) estudar a distribuição espacial desses focos; 3) estudar a tipologia das unidades de criação de bovinos caracterizadas como focos de tuberculose; 4) verificar se é possível, com a atual infra-estrutura existente em São Paulo, operar um sistema de vigilância para detecção de focos de tuberculose bovina. Assim, foi estruturado um sistema de coleta, envolvendo as redes SISP (Sistema de Inspeção do Estado de São Paulo) e SIF, que realizou as coletas de materiais e informações de maio de 2002 a janeiro de 2004. Todo o material seguiu para o VPS, onde foram processados. As propriedades caracterizadas como focos foram rastreadas e delas foi coletada outro conjunto de informações. Seguem os resultados alcançados: 1) foram identificados 33 diferentes espoligotipos dentre os 248 isolados de M. bovis de bovinos no Estado de São Paulo. Os isolados do espoligotipo SB0295 foram re-discriminados em 13 novos perfis genéticos de M. bovis pela técnica MIRU-VNTR; 2) dentre os dois espoligotipos mais prevalentes estudados (SB0295 e SB0121), apenas o SB0295 apresentou-se de forma agrupada nas análises espaciais; 3) foram geradas várias informações sobre a tipologia e o manejo das unidades de criação de bovinos caracterizadas como focos de tuberculose; 4) a atual infra-estrutura existente no Estado de São Paulo foi capaz de operar um sistema de detecção de focos de tuberculose bovina / A partnership between the Department of Preventive Veterinary Medicine and Animal Health (VPS) of the FMVZ-USP, the Coordination of Agriculture and Animal Defense of the State of São Paulo, and the Federal Inspection Service (SIF) was established to organize a work system for detection of bovine tuberculosis focus in the state, based on routine methods of carcass inspection in the abattoir, with the following objectives: 1) to determine the genetic diversity of the isolates of Mycobacterium bovis from bovines in the state of São Paulo; 2) to study the spatial distribution of the focuses; 3) to study the typology of the bovine breading units (farms), which were characterized as tuberculosis focus; 4) to verify the possibility of operating a surveillance system for detection of bovine tuberculosis focus based on the current network in the state of São Paulo. Thus, it was performed a system for data collection involving the current systems SISP (System of Inspection of the State of São Paulo) and SIF, who performed the collection of biological samples and information from May 2002 to January 2004. All samples were addressed to the VPS, where they were processed. Farms characterized as focus were traced to obtain new information. The results obtained in this study follow: 1) A total of 33 different spoligotypes were determined out of 248 bovine isolates of M. bovis in the state of São Paulo. The spoligotype SB0295 isolates were re-discriminated into 13 new M. bovis genetic profiles by the MIRU-VNTR technique; 2) From the two most prevalent spoligotypes analyzed in this study (SB0295 e SB0121), only SB0295 showed a cluster presentation by the spatial analyses; 3) Several information about typology and bovine breeding unit management were generated regarding the status of tuberculosis focus; 4) the current network in the state of São Paulo was capable of operating a system for detection of bovine tuberculosis focus

Dada a importância do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), a necessidade de uma eficiente caracterização bacteriológica dos focos como ponto fundamental do sistema de vigilância e as dificuldades encontradas pelos laboratórios quanto aos métodos de isolamento de Mycobacterium bovis fizeram crescer o interesse do meio científico por estudos, sobretudo moleculares, de isolados M. bovis. Para a realização dessas técnicas moleculares, é necessária abundância de massa bacilar, obtida através da manutenção dos isolados em laboratório e repiques em meios de cultura. Entretanto o crescimento fastidioso do M. bovis em meios de cultura traz grandes dificuldades para essas operações. Assim sendo, o presente estudo teve por objetivos: 1º) Comparar três métodos de descontaminação para homogeneizados de órgãos, etapa que precede a semeadura em meios de cultura, onde 60 amostras de tecidos com lesões granulomatosas, provenientes de abatedouros bovinos do Estado de São Paulo, foram colhidas e imersas em solução saturada de Borato de Sódio e transportadas para o Laboratório de Zoonoses Bacterianas do VPS-FMVZ-USP, onde foram processadas até 60 dias após a colheita. Essas amostras foram submetidas a três métodos de descontaminação: Básico (NaOH 4%), Ácido (H2SO4 12%) e 1- Hexadecylpyridinium chloride a 1,5% (HPC) e o quarto método foi representado pela simples diluição com solução salina (controle). Os resultados foram submetidos à comparação de proporções, pelo teste de &#967;², na qual verificou-se que o método HPC foi o que apresentou menor proporção de contaminação (3%) e maior proporção de sucesso para isolamento de BAAR (40%). 2º) Comparar três diferentes meios criopreservates para M. bovis, foram utilizados 16 isolados identificados pela técnica de spoligotyping. Cada um desses isolados foi solubilizado em três meios (solução salina, 7H9 original e 7H9 modificado), e armazenado em três diferentes temperaturas (-20ºC, -80ºC e -196ºC), sendo descongelado em três diferentes tempos (45, 90 e 120 dias de congelamento). Antes do congelamento e após o descongelamento foram feitos cultivos quantitativos em meios de Stonebrink Leslie. Os porcentuais de redução de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) nas diferentes condições foram calculados e comparados entre si através de métodos paramétricos e não-paramétricos. Os resultados obtidos foram: na análise da variável tempo, em 90 dias de congelamento foi observada uma maior proporção de perda de M. bovis, quando comparado ao tempo 120 dias (p=0,0002); na análise da variável temperatura, foi observada uma diferença estatística significativa entre as proporções de perda média nas temperaturas de -20ºC e -80ºC (p<0,05); na análise da variável meio, foi observada uma diferença significativa (p=0,044) entre os meios A e C, para 45 dias de congelamento e -20ºC de temperatura de criopreservação. Embora as medianas dos porcentuais de perdas de UFC terem sido sempre inferiores a 4,2%, permitiram sugerir que o melhor protocolo de criopreservação de isolados de M. bovis é solubilizá-los em 7H9 modificado e mantê-los à temperatura de -20ºC / In the context of the National Program of Control and Eradication of Brucellosis and Tuberculosis (PNCEBT), the necessity of an efficient bacteriologic characterization of the infected herds as a cornerstone of the monitoring system and the difficulties faced by the laboratories regarding the methods for Mycobacterium bovis isolation led to a growing interest for scientific studies, especially molecular, of M. bovis isolates. To use these molecular techniques it is necessary to have an abundant bacillary mass, obtained through the maintenance of isolates in laboratory and replication in culture media. However the fastidious growth of M. bovis in culture media brings out great difficulties for these activities. Thus, the present study has the following objectives: First, to compare three decontamination methods for organ homogenates, phase that precedes the sowing in culture media, 60 samples of tissues with granulomatosis injuries, proceeding from bovine slaughterhouses in the State of São Paulo, were obtained, immersed in sodium borato saturated solution and transported to the Laboratório de Zoonoses Bacterianas of the VPS-FMVZ-USP, where they were processed up to 60 days after the sampling. These samples were submitted to three methods of decontamination: Basic NaOH 4%, Acid (H2SO4 12%) and 1- Hexadecylpyridinium chloride (HPC) 1.5% and a simple dilution with saline solution (control method). The results were analysed by means of the &chi test to compare proportions, and it was verified that HPC method presented the smallest proportion of contamination (3%) and the greatest proportion of success for M. bovis isolation (40%). Second, to compare three different cryopreservation media for M. bovis, 16 isolates identified by the technique of spoligotyping were used. Each one of these isolates was solubilized in three media (original saline solution, 7H9 and 7H9 modified), and stored in three different temperatures (-20ºC, -80ºC and -196ordm;C), and defrosted in three different time periods (45, 90 and 120 days of freezing). Before the freezing and after the unfreezing, quantitative cultivations in Stonebrink Leslie media were carried out. The proportions of Colony-Forming Units (CFU) loss in the different conditions were calculated and compared with one another through parametric and non-parametric methods. The results obtained were: in the analysis of the variable time, at 90 days of freezing a bigger proportion of CFU loss was observed when compared to 120 days (p=0,0002); in the analysis of the variable temperature, a statistically significant difference was observed between the average proportions of CFU loss for the temperatures of -20ºC and -80ºC (p<0,05); in the analysis of the variable media, a significant difference was observed (p=0,044) between the media A and C, for 45 days of freezing and -20ºC of cryopreservation temperature. Althougth the medium ones of the proportion of losses of CFU to always have been inferior 4,2%, had allowed to suggest that the best protocol for cryopreservation of M. bovis isolates is to solubilize them in 7H9 modified medium and to keep them at a temperature of -20ºC