Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules endothéliales (CE) vasculaires cérébrales jouent un rôle important en tant que composantes structurales et fonctionnelles de la barrière hémato-encéphalique. L'angiogenèse tumorale, un processus important pour la croissance tumorale et pour le processus métastasique, régule le recrutement des CE qui, lorsqu'activées, prolifèrent et se différencient pour générer des structures capillaires afin de livrer les nutriments et l'oxygène au sein du compartiment tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis de cibler, d'un point de vue pharmacologique, l'angiogenèse tumorale cérébrale. Dans le premier volet de cette étude, nous avons évalué l'impact anti-angiogénique in vitro de l'AD4-015, un inhibiteur du transporteur du glucose-6-phosphate (G6PT), sur les CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une inhibition de la migration cellulaire, de la tubulogenèse in vitro et de l'inhibition de la sécrétion et de l'expression génique de la métalloprotéinase matricielle-9 induite par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un carcinogène promoteur de tumeur. L'expression de la cyclooxygénase-2 (cox-2) était aussi inhibée. L'inhibition pharmacologique de G6PT pourrait être une importante avenue thérapeutique ciblant la néo-vascularisation tumorale. Dans le deuxième volet de notre étude, nous avons investigué les effets du 2-déoxy-D-glucose (2DG), un analogue du glucose ayant comme rôle d'inhiber la glycolyse par la déplétion d'ATP, sur les propriétés angiogéniques des CE vasculaires cérébrales. Nous avons observé une diminution de la tubulogenèse conséquente à une diminution du niveau d'ATP. L'induction de l'expression de cox-2 et de GRP78 a été potentialisée par la combinaison du 2DG avec le PMA. Le niveau de la sécrétion de protéine et de l'expression génique de MMP-9 a été diminué en présence du 2DG, un phénomène impliquant la signalisation par le facteur nucléaire kappa-B. Nous fournissons donc des preuves que l'ATP est nécessaire au processus de la tubulogenèse et nous établissons un lien entre le stress du réticulum endoplasmique et l'inflammation. Dans le troisième volet de notre étude, nous avons investigué les propriétés inhibitrices de plusieurs flavonoïdes et la voie de signalisation du facteur nucléaire kappa-B, qui est une voie commune pour la régulation de l'expression de cox-2 et de MMP-9. Nous avons observé une diminution de l'expression génique et des niveaux de protéines de cox-2 et de MMP-9 par la fisetine, l'apigénine et la lutéoline. Il a également été démontré qu'il y a inhibition des niveaux de phosphorylation d'IkB prouvant leur impact sur l'activité de phosphorylation des IkB kinases. Nos résultats démontrent donc que la perturbation de la barrière hémato-encéphalique pourrait être minimisée par certains flavonoïdes qui agissent comme des inhibiteurs de la voie de signalisation de NF-kB. Collectivement, nos résultats démontrent les effets de différents inhibiteurs sur la tubulogenèse médiée par les CE vasculaires cérébrales. Dans le futur, ceci permettra le ciblage pharmacologique de l'angiogenèse tumorale cérébrale avec l'utilisation de molécules inhibitrices comme l'analogue de la mumbaistatine, le 2DG et certains flavonoïdes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules endothéliales vasculaires cérébrales, angiogenèse, cox-2, MMP-9.

Les lymphomes sont constitués de sous-groupes tumoraux définis par différents critères cliniques, morphologiques, immunophénotypiques et moléculaires. Néanmoins, même au sein d’un sous-groupe, il existe une grande hétérogénéité dans l’évolution clinique des patients, ce qui rend leur prise en charge difficile. Ceci souligne l’importance de découvrir de nouveaux biomarqueurs pronostiques qui amélioreraient l’approche thérapeutique personnalisée. <p>La revue de la littérature fait apparaitre les galectines-1 et -3 comme des protéines impliquées dans le développement des cancers ainsi que dans la biologie des lymphocytes. Pourtant, au moment où nous avons débuté ce travail, peu de chercheurs s’étaient intéressés à l’implication de ces galectines dans les lymphomes.<p>Nous avons donc décidé d’évaluer le rôle diagnostique ou pronostique de la galectine-1 et de la galectine-3 dans les lymphomes.<p><p>La première étude a consisté en la caractérisation de l’expression immunohistochimique de ces deux galectines au sein d’une série clinique de lymphomes systémiques humains en comparaison au tissu lymphoïde normal. <p>En ce qui concerne la galectine-1, les cellules lymphomateuses l’expriment peu, de façon similaire à ce qui est observé pour les cellules lymphoïdes normales. Au contraire, les cellules endothéliales associées aux lymphomes sont caractérisées par une augmentation de l’expression de galectine-1 en comparaison aux cellules endothéliales normales. Cette expression endothéliale ne montre pas de relation avec les variables cliniques de notre étude mais est corrélée à la densité microvasculaire des lymphomes. <p>En ce qui concerne la galectine-3, les cellules lymphomateuses des lymphomes B diffus à grandes cellules se caractérisent par une expression plus élevée comparativement aux autres sous-groupes de lymphomes et aux cellules lymphoïdes normales. Cette expression de galectine-3 n’est pas associée aux variables cliniques dans notre étude. Contrairement à la galectine-1, la galectine-3 est exprimée de façon similaire par les cellules endothéliales des vaisseaux des tissus lymphoïdes normaux et des lymphomes.<p>Ces données suggèrent un rôle angiogénique de la galectine-1 dans les lymphomes systémiques.<p><p>Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’expression des galectines-1 et -3 au sein d’une série clinique de lymphomes primitifs du système nerveux central (LPSNC). <p>Nous avons observé que les profils d’expression des cellules lymphomateuses sont similaires pour les lymphomes systémiques et les LPSNC, caractérisés par une absence d’expression de galectine-1 et une expression variable de galectine-3. <p>A l’opposé, nous avons observé une expression endothéliale de ces galectines différente entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. La galectine-1 n’est pas exprimée par les cellules endothéliales des vaisseaux des LPSNC. Par contre, la galectine-3 est exprimée par les cellules endothéliales de certains LPSNC. Cette expression est associée à un mauvais pronostic. <p>Nous avons également démontré que l’hyperplasie endothéliocapillaire est associée à une survie diminuée. <p>Cette hyperplasie endothéliocapillaire et/ou l’expression endothéliale de galectine-3 sont des facteurs pronostiques indépendants au sein de notre série de patients immunocompétents atteints de LPSNC et traités par chimiothérapie.<p><p>Au vu des résultats des deux premières études, nous pensons que les galectines-1 et -3 jouent un rôle dans l’angiogenèse des lymphomes. Ce rôle est très certainement complexe comme l’illustre la différence d’expression endothéliale de ces galectines entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. Ces variations d’expressions selon l’organe hôte sont à intégrer avec la notion générale d’hétérogénéité des cellules endothéliales. Cette hétérogénéité s’observe également entre les cellules endothéliales des vaisseaux normaux et les cellules endothéliales des vaisseaux dans un contexte tumoral (TAECs - tumor-associated endothelial cells). <p>Suite à ces observations, nous avons décidé d’étudier l’implication des galectines-1 et -3 extracellulaires sur deux modèles in vitro de cellules endothéliales (cellules HUVEC et EA.hy926). La revue de la littérature nous a permis de poser l’hypothèse que la lignée EA.hy926 pourrait s’apparenter aux TAECs. La première partie de cette troisième étude a pour but de valider cette hypothèse. La comparaison morphologique des lignées EA.hy926 et HUVEC cultivées sur un substrat de matrigel a permis de montrer que les tubes formés par les cellules EA.hy926 sont plus hétérogènes comme ce que l’on peut observer dans les vaisseaux tumoraux. La comparaison des profils d’expression des gènes de ces deux lignées a mis en évidence que différents gènes surexprimés dans les TAECs le sont également dans les cellules EA.hy926. Les cellules EA.hy926 présentent un profil d’expression des récepteurs au VEGF (VEGFR- vascular endothelial growth factor receptor) caractérisé par un taux élevé de VEGFR1 et un faible taux de VEGFR2 en comparaison aux cellules HUVEC. L’analyse in vivo des VEGFRs au sein des cellules endothéliales de tissus humains normaux et tumoraux nous a permis de confirmer la surexpression de VEGFR1 par les TAECs. L’ensemble de ces résultats supportent donc notre hypothèse que la lignée EA.hy926 présente des caractéristiques plus proches des TAECs en comparaison à la lignée HUVEC.<p>Nous avons ensuite, dans la deuxième partie de cette troisième étude, analysé les effets respectifs de la galectine-1, de la galectine-3 et de leur combinaison sur ces deux lignées. Nous avons observé que la galectine-1 extracellulaire dans notre modèle de cellules endothéliales normales (HUVEC) augmente la croissance cellulaire ainsi que la formation de tubes sans mise en évidence de phosphorylation significative de VEGFR1 ni de VEGFR2. Dans notre modèle de TAECs (EA.hy926), la galectine-1 extracellulaire ne favorise pas la croissance cellulaire et est faiblement angiogénique via la phosphorylation du VEGFR2, sans phosphorylation du VEGFR1. <p>En ce qui concerne la galectine-3, nous avons observé dans nos deux modèles des résultats similaires, à savoir une absence d’effet sur la croissance cellulaire et un effet positif sur la formation de tubes s’accompagnant d’une phosphorylation de VEGFR2 sans phosphorylation de VEGFR1. <p>Le résultat le plus original consiste en la mise en évidence d’un effet synergique des deux galectines sur la croissance et la formation de tubes des cellules EA.hy926. Cet effet synergique s’accompagne d’une phosphorylation de VEGFR1 et de VEGFR2. Il est important de noter que l’activation de VEGFR1 n’a été observée que pour la lignée EA.hy926 et uniquement en présence des deux galectines. <p>Dans ces conditions, nous avons démontré que les voies de signalisation activées suite à l’ajout de ces galectines impliquent la voie de l’extracellular signal regulated kinase1/2 et de l’heat shock protein 27. <p><p>En conclusion, ce travail nous a donc permis, à partir de la caractérisation de l’expression de galectine-1 et -3 dans une série de lymphomes systémiques et cérébraux, de proposer un rôle angiogénique pour ces galectines. Les études in vitro ont souligné les rôles différents que joueraient ces galectines extracellulaires dans l’angiogenèse non tumorale et tumorale et l’implication du VEGFR1 dans l’angiogenèse tumorale. <p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La rétine est constituée de l’association d’un tissu neurosensoriel et de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Malgré la présence d’une barrière hémato-rétinienne, la rétine est contrainte aux changements de son milieu environnant, incluant les modifications du régime alimentaire et les stress environnementaux. Au cours du vieillissement, les échanges de nutriments et l’élimination des déchets métaboliques et cellulaires au travers de l’EPR diminuent. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) sont les pathologies rétiniennes les plus prévalentes dans les populations occidentales avant et après l’âge de 50 ans, respectivement. L’atrophie géographique et la DMLA néovasculaire constituent les stades avancés des maculopathies liées à l’âge. La RD affecte 60% des patients atteints de diabète de type 2 (T2D) dans les 15 années suivant l’apparition de la pathologie. Par ailleurs, les facteurs alimentaires interfèrent avec le développement de la DMLA et du T2D. Considérant l’épidémie mondiale de T2D d’une part, et l’allongement de l’espérance de vie d’autre part, les dépenses médico-sociales relatives à la prise en charge des patients atteints de T2D ou de DMLA sont à même de devenir un enjeu socioéconomique majeur. Le syndrome métabolique (SMet) est un des principaux facteurs de risque du T2D. Il peut ainsi être suggéré que limiter le développement du SMet pourrait potentiellement limiter l’incidence du T2D et de ses complications. Dans ce contexte, la consommation d’acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC) de type oméga 3 fait partie des recommandations nutritionnelles pour la population afin de prévenir l’apparition du SMet et du T2D. Par ailleurs, une alimentation riche en AGPI-LC omega-3 est également associée à la réduction du risque de DMLA. En revanche, l’association entre T2D, RD et DMLA reste controversée, bien que quelques études basées sur des grandes cohortes rapportent une prévalence de DMLA augmentée chez les patients atteints de diabète ou de RD. Nos objectifs ont été d’évaluer premièrement si un SMet constituait un environnement favorable au développement des complications de type néovasculaires dans la rétine, et de tester secondairement l’efficacité d’AGPI-LC omega-3 dans la réduction des conséquences de ce SMet sur la rétine. Pour atteindre cet objectif, des rats ont été nourris avec un régime diabétogène enrichi en fructose afin de provoquer un SMet. Une néovascularisation choroïdienne a ensuite été induite en utilisant un modèle d’impacts laser au fond d’œil. Nous nous sommes intéressés tout d’abord à l’effet de ce régime à court terme et avons mis en évidence une diminution de la sensibilité des photorécepteurs de type cônes après 8 jours de régime, ainsi qu’une modification de l’expression des gènes et en particulier des sous-familles de cristallines. Ensuite, nos études se sont portées sur les effets de régime enrichi en fructose à long terme jusqu’à 6 mois. Le développement d’un SMet a été illustré par une augmentation de la masse grasse, une hyperinsulinémie, une hyperleptinémie et l’installation d’une stéatose hépatique. Ces rats ont développé une néovascularisation choroïdienne exacerbée après 1 et 3 mois de régime associée à une surexpression de facteurs pro-angiogéniques tels que VEGF et leptine .Une infiltration de macrophages dans la rétine et/ou l’activation des cellules microgliales résidentes a également été détectée. Les données électrorétinographiques ont suggéré une diminution de la sensibilité des photorécepteurs de type bâtonnets ainsi qu’une altération des fonctionnalités des cellules de la rétine interne à 6 mois. Dans un second temps, l’efficacité des AGPI-LC omega-3 (EPA+DHA) dans le but de réduire les conséquences du SMet dans la rétine a été testée. Nos données mettent en évidence qu’une forte dose d’EPA+DHA n’a cependant pas amélioré le SMet chez le rat. / The retina is the association of the neurosensory tissue and the retinal pigment epithelium (RPE). Despite the presence of the blood retinal barrier, the retina is submitted to changes of the external milieu, including dietary modulation and environmental stresses. With advanced age, the exchanges of nutrients and elimination of cellular and metabolic wastes via the RPE become limited. Age-related Macular Degeneration (AMD) and Diabetic Retinopathy (DR) are the most prevalent retinal pathologies in Western adult populations before and after the age of 50 years, respectively. Geographic atrophy and neovascular AMD are advanced stages of age-related maculopathies. DR afflicts 60% of type 2 diabetic (T2D) patients in the first 15 years of the disease. Dietary factors interfere in the development of both AMD and T2D. Accounting the worldwide epidemics of T2D in the one hand, and the improvement of life expectancy in the other hand, medical care to the patients is expected to worsen the socioeconomic burden of both T2D and AMD. Metabolic syndrome (MetS) is one of the major risk factor for T2D. Lowering the development of MetS would potentially lessen the incidence of T2D, and its complications. The daily intake of omega 3 long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) is now recommended by health agencies for the prevention of MetS. Meanwhile dietary omega 3 LC-PUFA are associated with reduced risk of AMD. The association between T2D, DR, and AMD remains controversial, although large-scale population-based studies have reported increased prevalence of AMD in patients with diabetes or DR. Our objectives were first to evaluate whether MetS would represent a favorable environment for the development of neovascular complications in the retina, and second to test the efficacy of omega 3 LC-PUFA to reduce the consequences of MetS in the retina. For that purpose, a pro-diabetogenic high fructose diet was fed to rats to induce MetS and choroidal neovascularization was triggered by laser impacts in the eye fundus. We focused first on short term diet periods, and showed impairment on cone photoreceptor sensitivity after 8 days, as well as changes in gene expression in relation to crystallin sub-families. A long term - up to 6 months - fructose diet period triggered MetS as illustrated by body fat increase, hyperinsulinemia, hyperleptinemia and liver steatosis. Rats exhibited exacerbated laser-induced choroidal neovascularization after 1 and 3 months of feeding, that was associated with up-regulation of genes coding pro-angiogenic factors such as VEGF and leptin, as well as infiltration of macrophages and/or activation of retinal microglia. Electroretinographic data showed decreased sensitivity of rod photoreceptors and inner retinal cell functionality at 6 months of feeding. In a second time, the efficacy of dietary omega 3 LC-PUFA (EPA plus DHA) to reduce the consequences of MetS in the retina was tested. Our data showed that a high dose of EPA+DHA in rats did not improve MetS. Furthermore, side effects were generated as illustrated by localized atrophy in the retina submitted to the combination of laser-impacts, and normal light exposure. These works allowed us to suggest that MetS generated a favorable environment in the retina for the development of neovascular complications. Meanwhile, the sensitivity of cones and rods was impaired by MetS. Accounting the deleterious long term effects of omega 3 LC-PUFA in the retina, caution may be taken while recommending massive supplementation with omega 3 LC-PUFA in the context of MetS.

Problématique : De nombreuses recherches sont actuellement menées afin de découvrir des biomarqueurs pour aider les pathologistes à poser des diagnostics et pour éclairer les cliniciens dans le choix du meilleur traitement pour le cancer du sein. Ces biomarqueurs sont de diverses natures et plusieurs sont issus des caractéristiques de la tumeur. Mon projet de recherche visait à déterminer la valeur pronostique de marqueurs de méthylation de gènes candidats (PLAU (plasminogen activator, urokinase), RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) et TIMP3 (TIMP metallopeptidase inhibitor 3)) principalement impliqués dans le processus d’angiogenèse. Approches méthodologiques et résultats: Nous avons étudié une population de 254 patientes diagnostiquées d’un cancer du sein entre 1983 et 1993, pour lesquelles les spécimens tumoraux ont été fixés au Bouin et congelés. Les informations clinicopathologiques sont disponibles pour ces patientes (âge, indice de masse corporelle, ER, PgR, taille de la tumeur, grade histologique, statut des métastases ganglionnaires, type histologique et densité des microvaisseaux). Préalablement à l’analyse des spécimens de la population à l’étude, nous avons développé une approche quantitative afin d’évaluer le statut de méthylation des gènes candidats. Une fois l’ADN isolé par microdissection à partir des spécimens tumoraux congelés, celui-ci a été traité avec une enzyme de restriction spécifique aux sites méthylés et soumis à des réactions spécifiques de polymérisation en chaîne (PCR). La spécificité, la linéarité et la reproductibilité de cette approche ont été clairement démontrées par comparaison avec des échantillons standardisés ainsi que sur des lignées cellulaires. En parallèle, une approche immunohistochimique automatisée a été développée pour évaluer l’expression de marqueurs tumoraux du sein. Nous avons démontré qu’il est possible d’obtenir des résultats semblables soit en faisant des marquages immunohistochimiques sur des coupes histologiques de tissus fixés au Bouin et enrobés dans la paraffine en utilisant une technique validée soit en faisant des immunohistochimies sur des coupes histologiques de spécimens fixés dans le formol tamponné neutre. Cette étape était nécessaire afin d’évaluer l’expression de gènes (ER, PgR, HER2, CK5/6, EGFR, P63, ECAD) reconnus pour la classification et la caractérisation des carcinomes mammaires. Enfin, l’étude du statut de méthylation de 3 gènes candidats a été effectuée sur les spécimens de la population à l’étude en utilisant les approches citées ci-haut. Une première observation révèle une association significative entre le statut de méthylation, du gène RECK et la survie spécifique au cancer du sein en analyse univariée (régression de Cox : rapport de risque (Hasard Ratio (HR) = 0.72; 95 % intervalle de confiance (IC), 0,53 to 0,98; P = 0,037) mais non significative en analyse multivariée (RR = 0,75; 95 % IC, 0,54 to 1,03; P = 0,075). Alors que l’atteinte ganglionnaire est un facteur de mauvais pronostic (RR = 6,07; 95 % IC, 4,30 to 8,55; P < 0,001), nous avons observé une interaction significative entre le statut des ganglions lymphatiques et celui du gène RECK (Pinteraction = 0,0011). En analyses multivariées, chez les patientes sans envahissement ganglionnaire, une association significative est observée entre la présence de méthylation du gène RECK et une augmentation de la survie (HR = 0,30; 95 % IC, 0,14 to 0,64; P = 0,002). Cependant, chez les patientes avec métastases ganglionnaires, la présence de méthylation du gène RECK est associée à une diminution de la survie (HR = 1,51; 95 % IC, 1,00 to 2,3; P = 0,05). Une association entre la présence de méthylation du gène TIMP3 et une meilleure survie a été observée mais celle-ci est non significative. Le marqueur de méthylation uPA testé dans notre étude n’est pas associé à la survie. Conclusion: Nous avons démontré que la méthylation du gène RECK dans le cancer du sein est associée à la survie. Nous avons également observé que cette association varie selon le statut de l’envahissement ganglionnaire. Cette étude mériterait d’être répliquée dans une population indépendante présentant les mêmes caractéristiques. / Purpose: Studies are now conducted to find new biomarkers to help clinicians diagnose and treat breast cancers. The purpose of my research project was to determine the prognostic value of DNA methylation markers of selected genes (PLAU (plasminogen activator, urokinase), RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) and TIMP3 (TIMP metallopeptidase inhibitor 3)) which are mainly involved in the process of angiogenesis. Methods and results: We studied a population of 254 patients diagnosed with breast cancer between 1983 and 1993, for which a part of the tumor specimens was fixed in Bouin and embedded in paraffin and the other part was frozen. The clinicopathological characteristics were available for these patients (age, body mass index, ER, PgR tumor size, histological grade, lymph node metastasis status, histological type and microvessel density). Prior to the analysis of specimens from the study population, we developed a quantitative approach to assess the methylation status of candidate genes. Once the DNA is isolated by laser-capture microdissection from frozen tumor specimens, it was treated with a methylation sensitive restriction enzyme and subjected to specific polymerase chain reaction (PCR). Specificity, linearity and reproducibility of this approach have been clearly demonstrated by comparison with standard samples and cell lines. In addition, an automated immunohistochemical approach has been successfully evaluated showing that the expression of tumor markers on histological sections of tissues fixed in Bouin and embedded in paraffin, is similar to that of specimens fixed in neutral buffered formalin. This step was necessary to evaluate the expression of genes (ER, PgR, HER2, CK5/6, EGFR, P63, ECAD) recognized for the classification and characterization of breast carcinomas. Finally, the study of methylation status of three candidate genes was performed on specimens in the study population evaluated using the approaches above. A first observation showed a significant association between the methylation status of RECK gene and breast cancer-specific survival in univariate analysis (hazard ratio (HR) = 0.72, 95% confidence interval (CI), 0.53 to 0.98, P = 0.037) but not significant in multivariate analysis (HR = 1.01, 95% CI, 0.72 to 1.41, P = 0.96). While the lymph node is a bad prognostic factor (HR = 6.07, 95% CI, 4.30 to 8.55, P < 0.001), we observed a significant interaction between lymph node status and the RECK gene (Pinteraction = 0.0011). In multivariate analysis, among patients without nodal involvement, a significant association between the presence of methylation of RECK gene and an increase in survival was observed (HR = 0.30, 95% CI, 0.14 to 0.64, P = 0.002). For patients with lymph nodes metastasis, an association between the presence of methylation of RECK gene and a decrease in survival was observed (HR = 1.51, 95% CI, 1.00 to 2.3, P = 0.05). An association between the presence of methylation of TIMP3 gene and a better survival was observed but was not significant. The uPA methylation markers tested in our study are not associated with survival. Conclusion: We observed that the methylation status of RECK gene is associated with survival of patients with breast cancer. We also observed that this association varies with lymph node metastasis status. This study needs to be replicated in an independent population with similar characteristics.

La migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF est une étape cruciale du processus angiogénique. La liaison du VEGF sur son récepteur, le VEGFR2, conduit à l’autophosphorylation sur la tyrosine 1214 de ce dernier ce qui induit l’activation de la voie p38 MAP-kinase, le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration cellulaire. Les microARNs sont de courts ARN non-codant qui régulent de façon post-transcriptionnelle l’expression des gènes. Nous avons identifié deux microARNs, miR-20a et miR-196a, dont les niveaux d’expression sont respectivement augmentés et diminués en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces deux microARNs modulent le remodelage du cytosquelette d’actine, la migration et l’angiogenèse. Aussi, nous avons décrit leurs implications dans la régulation de la voie p38. Tout d’abord, miR-20a agit en amont de p38, et réprime l’expression de MKK3 en se liant de façon spécifique à sa région 3’UTR. MKK3 étant un activateur direct de p38 en réponse au VEGF, la surexpression de miR-20a empêche l’activation de p38, de son substrat la MAPKAP kinase-2 et la phosphorylation subséquente de HSP27. En conséquence, miR-20a inhibe la formation des fibres de tension, la migration endothéliale et l’angiogenèse. Ces résultats nous ont permis de conclure que miR-20a agit dans une boucle de régulation négative afin de moduler la migration dépendante de la voie p38 activée par VEGF. Ensuite, le niveau d’expression de miR-196a est diminué en réponse au VEGF et nous avons démontré sa liaison spécifique à la région 3’UTR de l’ANXA1. En accord avec nos précédents travaux démontrant que l’ANXA1 est importante pour la migration endothéliale dépendante de l’activation de p38 par le VEGF, la surexpression de miR-196a empêche la formation des lamellipodes, réduit les capacités migratoires des cellules endothéliales et inhibe ainsi l’angiogenèse in vitro et in vivo. En conclusion, une réduction de l’expression de miR-196a agit en synergie avec le VEGF, pour faciliter la migration endothéliale, en maintenant un niveau d’expression élevé de l’ANXA1 pro-migratoire. Nos résultats, en impliquant miR-20a et miR-196a dans la modulation de l’angiogenèse, apportent des concepts nouveaux sur la régulation de la voie p38 pro-migratoire en réponse au VEGF. Ces travaux ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à régulariser l’angiogenèse pathologique. / Endothelial cell migration in response to VEGF is a crucial step of angiogenesis. VEGF binding to its receptor VEGFR2 results in the autophosphorylation of the receptor at tyrosine 1214, which induces the downstream activation of the p38 MAP-kinase pathway leading to actin cytoskeleton remodeling and cell migration. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate post-transcriptionally gene expression. We identified two microRNAs, miR-20a and miR-196a, whose levels of expression were increased and decreased respectively in response to VEGF in endothelial cells. Both microRNAs modulate VEGF dependent-endothelial cell cytoskeleton remodeling, migration and angiogenesis. Also, we described that they are involved in regulating the p38 pathway. First, miR-20a acts upstream of p38, and negatively regulates MKK3 by specifically binding on MKK3 3’UTR. As MKK3 is a direct activator of p38 in response to VEGF, overexpression of miR-20a impairs p38 activation, the downstream activation of MAPKAPK2 and the phosphorylation of HSP27. Consequently, miR-20a reduces stress fibers formation, and subsequent endothelial cell migration and angiogenesis. We conclude that miR-20a may act in a feedback loop to regulate the p38 pathway-mediated VEGF-induced endothelial cell migration. Then, miR-196a is decreased in response to VEGF and we demonstrate its specific binding on ANXA1 3’UTR. In accordance with our previous work demonstrating that ANXA1 is important for VEGF-induced endothelial migration downstream of p38 pathway, overexpression of miR-196a impairs lamellipodia and endothelial cell migratory capacities upon VEGF treatment, leading to angiogenic defects. We conclude that miR-196a acts in a synergetic mechanism with VEGF to facilitate endothelial cell migration, by maintaining high level of the pro-migratory protein ANXA1. Finally, our results implicate miR-20a and miR-196a in the angiogenic process and give new insights in p38 pathway-dependent endothelial cell migration regulation in response to VEGF. The present work opens new avenues for strategies and future development of therapeutics in line with the treatment of angiogenic pathologies.

La migration des cellules endothéliales est une des étapes nécessaires à l'angiogenèse physiologique et tumorale. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la kinase de stress SAPK2/p38 via le récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR-2. Nous avons étudié les événements moléculaires suivant l'activation du récepteur du VEGF et menant à l'activation de la voie SAPK2/p38 dans les cellules endothéliales. La tyrosine 1214 en C-terminal du VEGFR-2 est un site majeur d'autophosphorylation nécessaire à l'activation de SAPK2/p38 par le VEGF dans les cellules endothéliales. Le résidu phospho-tyrosine 1214 permet le recrutement de la protéine adaptatrice Nck via son domaine SH2. De plus, l'activation de Fyn, une kinase de la famille Src, mais non c-Src même, dépend de la phosphorylation de la tyrosine 1214. L'utilisation d'un dominant négatif de Fyn empêche l'activation de SAPK2/p38, inhibe la formation de fibres de tension et abolit la migration endothéliale. Nck et Fyn s'associent en réponse au VEGF et l'activité de Fyn est nécessaire à la phosphorylation sur tyrosine de Nck et de la kinase PAK-2. La formation de fibres de tension nécessite aussi l'activation de la petite GTPase Cdc42, ce qui permet d'acheminer le signal du VEGF vers SAPK2/p38, sa cible physiologique MAPKAP K2, puis vers l'actine. Ces résultats suggèrent une séquence d'étapes moléculaires précoces suivant l'activation du VEGFR-2 et régulant la dynamique d'actine nécessaire à la migration endothéliale. 11 s'agit de la première description d'une séquence d'événements couplant l'activation d'un récepteur à activité tyrosine kinase à celle d'une kinase de stress. Par ailleurs, l'identification du rôle du site tyrosine 1214 du VEGFR-2 en fait une cible précise pour le développement d'une drogue anti-angiogénique. / Endothelial cell migration is one major step of physiological and pathological angiogenesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent regulator of angiogenesis and induces actin reorganization into stess fibers and cell migration via activation of SAPK2/p38 downstream of the tyrosine kinase receptor VEGFR-2. We studied the molecular events following the activation of the VEGF-receptor that lead to the activation of the SAPK2/p38 pathway in endothelial cells. The tyrosine 1214 residue in C-terminal of the VEGFR-2 is a major autophosphorylation site that is required for the activation of SAPK2/p38 by VEGF in endothelial cells. The adaptor protein Nck is recruited to the phospho-tyrosine 1214 residue via its SH2 domain. Moreover, the activation of the Src-family kinase Fyn, but not c-Src itself, depends on phospho-tyrosine 1214. A dominant negative form of Fyn inhibits SAPK2/p38 activation, stress fibers formation and endothelial cell migration. Nck and Fyn associate in response to VEGF and Fyn activity is required for the tyrosine-phosphorylation of Nck and PAK-2. The activation of the small Rho GTPase Cdc42 downstream of tyrosine 1214 is also required for the activation of SAPK2/p38, its physiological target MAPKAP K2, and stress fiber formation. Altogether, these results suggest a sequence of early molecular steps following VEGFR-2 activation by VEGF that regulate the actin dynamics required for endothelial cell migration. This is the first description of a sequence of events that couple the activation of a tyrosine kinase receptor to that of a stress-activated kinase. The identification of the role of the tyrosine 1214 residue on VEGFR-2 makes it an appealing target for the development of an anti-angiogenic therapy.

Les médicaments botaniques, y compris ceux utilisés en médecine traditionnelle chinoise (MTC), traitent depuis longtemps les maladies cardiovasculaires où la dysfonction endothéliale est un facteur de risque bien établi. Dans la littérature, il existe de nombreux rapports sur les avantages dans la clinique et la santé des médicaments ou des préparations botaniques pour le système cardiovasculaire. Il a été indiqué que des médicaments botaniques, en particulier ceux ayant une capacité antioxydante puissante, protègent les cellules endothéliales (CE) en culture contre les radicaux libres et les oxydants. Cependant, il y a peu de recherches sur les médicaments botaniques dans le contexte de la cicatrisation et de la régénération tissulaire. Cette thèse a étudié quatre médicaments botaniques enregistrés dans la MTC pour explorer leurs effets sur la croissance des CE vasculaires et l'angiogenèse, deux événements activement impliqués dans la cicatrisation et la régénération tissulaire. Dans la première partie de la thèse, des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC) ont été cultivées en présence de différentes doses d'extrait d'astragale en forme de poudre, d'injection d'astragale, d'injection de puerarin et de proanthocyanidine. Parmi les quatre médicaments, la proanthocyanidine a montré un effet puissant sur la viabilité cellulaire et stimulé la croissance cellulaire d'une manière dépendante de la dose. En dehors de la gamme de doses efficaces, la proanthocyanidine était inefficace ou cytotoxique. Fait important, la proanthocyanidine testée était capable de maintenir une viabilité cellulaire comparable aux cellules supplémentées avec le milieu spécifique pour les CE avec un niveau bas ou normal de sérum, ce qui suggère le potentiel de la proanthocyanidine en tant que stimulateur de croissance et réactif angiogénique. Dans la seconde partie de la thèse, des études mécanistiques ont été réalisées en bloquant à la fois les récepteurs du facteur de croissance des cellules endothéliales (VEGFR) et les récepteurs du facteur de croissance des cellules épithéliales (EGFR). Cependant, les bloqueurs ont été inefficaces pour réduire l'effet stimulant de la proanthocyanidine sur les CE. En conséquence, il est conclu que la proanthocyanidine stimule probablement la croissance des CE à travers des récepteurs membranaires autres que VEGFR et EGFR. Dans la troisième partie de la thèse, il a été montré que la proanthocyanidine pouvait être chargée dans un cryogel d'alcool polyvinylique, puis libérée du gel à une concentration dans la gamme de la dose efficace. Ceci a démontré la faisabilité d'une libération lente de proanthocyanidine à partir d'un support polymérique. Enfin, la propriété angiogénique de la proanthocyanidine a été testée sur un modèle de membrane chorioallantoïque d'embryon de poulet (CAM), montrant que ce médicament botanique était capable de stimuler le développement du système vasculaire. Cette thèse a donc démontré pour la première fois que la proanthocyanidine est capable de moduler l'activité des CE humaines, particulièrement de réguler positivement l'activité et la croissance des CE en l'absence de facteurs de croissance, et que la proanthocyanidine peut être utilisée comme réactif angiogénique et libérée d'un support de médicament synthétique. En somme, cette thèse a démontré que les médicaments botaniques en médecine traditionnelle chinoise peuvent être utilisés comme substituts pour produits protéiques pour maintenir les cellules en culture et induire l'angiogenèse pour la cicatrisation et la régénération tissulaire. / Botanic drugs including those used in traditional Chinese medicine (TCM) have a long history of treating cardiovascular diseases, of which endothelial dysfunction is well established as a risk factor. In literature there exist extensive reports about the clinic and healthy benefits of botanic drugs or preparations to the cardiovascular system. Botanic drugs particularly those with potent antioxidative capacity have also been reported to protect endothelial cells (EC) in culture against free radicals and oxidants. However, there is little research about botanic drugs in the context of wound healing and tissue regeneration. This thesis studied four botanic drugs recorded in TCM to explore their effects on vascular EC growth and angiogenesis, two events actively involved in wound healing and tissue regeneration. In the first part of the thesis, human umbilical endothelial cells (HUVEC) were cultured in the presence of different doses of astragalus powder extract, astragalus injection, puerarin injection, and proanthocyanidin. Among the four drugs, proanthocyanidin showed a potent effect on cell viability and stimulated cell growth in a dose dependent manner. Outside the effective dose range proanthocyanidin was either ineffective or cytotoxic. Importantly, the proanthocyanidin under test was able to maintain a cell viability comparable with the cells supplemented with the commercially available EC growth medium at both low and normal serum conditions, which suggests the potential of proanthocyanidin as an EC growth stimulator and an angiogenic reagent. In the second part of the thesis, mechanistic studies were performed by blocking both endothelial cell growth factor receptors (VEGFR) and epithelial cell growth factor receptors (EGFR). However, the blockers were ineffective in reducing the stimulatory effect of proanthocyanidin on EC. Therefore it is concluded that proanthocyanidin stimulates EC growth through membrane receptors other than VEGFR and EGFR. In the third part of the thesis, it was shown that proanthocyanidin could be loaded into polyvinyl alcohol cryogel and then released from the gel at a concentration within the effective dose window. This demonstrated the feasibility of drug releasing of proanthocyanidin. Finally, the angiogenic property of proanthocyanidin was tested in chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model, showing that this botanic drug was capable of stimulating vasculature development. Preliminary data in rat subcutaneous model also support the angiogenic potential of proanthocyanidin. This thesis therefore demonstrated for the first time that proanthocyanidin was capable of modulating the activity of human EC and in particular upregulating EC activity and growth in the absence of growth factors, and that proanthocyanidin may be used as an angiogenic reagent and released from a synthetic drug carrier. Consequently, this thesis has demonstrated that botanic drugs in traditional medicine may be used as substitutes of protein products to maintain cells in culture and to induce angiogenesis for wound healing and tissue regeneration.

Favorisant plusieurs altérations physiologiques et autres conditions telle l'instabilité génomique, l'inflammation chronique joue un rôle central de l'initiation jusqu'au développement du cancer. Cette condition requiert la contribution de plusieurs types cellulaires et de médiateurs inflammatoires telle que la protéine transductrice du signal et activatrice de la transcription 3 (STAT3). Cette dernière est un médiateur majeur dans l'induction et le maintien d'un microenvironnement tumoral inflammatoire. En effet, la phosphorylation de STAT3 est essentielle à la régulation et à la transcription de plusieurs facteurs de croissance et cytokines incluant la cyclooxygénase-2 (COX)-2 et l'interleukine-6 (IL6), mais par son rôle de transducteur, elle répond aussi à plusieurs stimuli tant endogènes qu'environnementaux. Une des voies les plus importantes à cet effet est celle de JAK/STAT3. Une boucle rétroactive d'activation de STAT3 alimente d'ailleurs les processus impliqués dans le développement tumoral comme la prolifération, l'anti-apoptose, l'angiogenèse et la métastase. Les objectifs de notre étude sont, dans un premier temps, d'évaluer les effets de 5 polyphénols connus pour leur propriété anti-angiogénique; la lutéoline (Lut), l'apigénine (Api), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la delphinidine (Dp) et l'acide éllagique (EA), sur différentes étapes de l'angiogenèse déclenchée par l'IL-6 et d'en déterminer le mécanisme d'action au niveau moléculaire. Dans un deuxième temps, nous avons évalué chez les cellules souches mésenchymateuses (MSC) ayant un phénotype pro-inflammatoire induit par la concanavaline A (ConA), l'implication de la métalloprotéinase membranaire matricielle de type-1 (MT1-MMP) dans l'activation de STAT3 et l'expression de COX-2. Les résultats ont montré principalement que la Lut et l'Api inhibent très significativement la prolifération, la migration et la tubulogenèse des cellules endothéliales (EC) induite par l'IL-6 via la voie JAK/STAT3. En deuxième lieu, chez les MSC, la MT1-MMP semble être un contributeur important dans le phénotype pro-inflammatoire et implique également la voie JAK/STAT3. De façon inattendue l'inactivation de STAT3 potentialise l'expression de COX-2. Étant donné que les MSC sont recrutées aux sites inflammatoires de plusieurs cancers, ces résultats confirment l'importance de la MT1-MMP dans la régulation de la signalisation intracellulaire pro-inflammatoire des MSC. L'action double de STAT3 régulé par la MT1-MMP, montre son rôle majeur comme contributeur dans l'équilibre de l'expression de COX-2. Ce mécanisme permettrait ainsi aux MSC de s'adapter au microenvironnement inflammatoire pro-tumoral. Connaissant la diversité des polyphénols d'origine alimentaire et leur potentiel anti-inflammatoire, anti-angiogénique et anticancéreux on a aussi montré dans le cadre de cette étude que le potentiel de l'activité anti -inflammatoire de la Lut et d'Api permet, en partie d'expliquer leur activité anti-angiogénique et anti-cancer. Ainsi, ces flavones pourraient non seulement servir de base de recherche d'agents thérapeutiques anti-angiogéniques minimisant la résistance aux agents chimiothérapeutiques, mais aussi mettre en lumière le rôle majeur de l'alimentation dans la prévention du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : STAT3, MT1-MMP, angiogenèse, inflammation, IL6, COX-2

L'angiogénèse est un phénomène vital dans de nombreux processus physiologiques tels que le développement embryonnaire ou la cicatrisation. Mais c'est aussi un processus pathologique impliqué dans la croissance des tumeurs malignes, dans le développement des métastases et dans des maladies telles que l'endométriose, la dégénérescence Maculaire liée à l'âge (DMLA) et l'arthrose. La néovascularisation pathologique est dense et désordonnée contrairement à la néovascularisation physiologique, ce qui en fait une cible thérapeutique attrayante. Les agents perturbateurs vasculaires (VDA) sont une nouvelle classe de molécules bioactives qui détruisent sélectivement la néovascularisation tumorale et arrêtent l'apport sanguin aux tumeurs solides, provoquant une nécrose tumorale étendue. Parmi les VDA, les agents se liant à la tubuline sont principalement représentés. Le processus d'angiogénèse au sein de l'arthrose ainsi que le mode d'action des VDA nous amène a envisager l'utilisation de ses derniers en tant que nouveau traitement anti-arthrosique. Dans la recherche de nouveaux scaffolds VDA, nous avons d'abord comparé les activités biologiques de plusieurs VDA. Une classe en particulier a attiré notre attention sur laquelle seules quelques études avaient été menées. Cela nous a permis de sélectionner des pistes avec un espace chimique exploitable pour concevoir des scaffolds originaux. Cette thèse présentera les analogues qui ont été synthétisés, leur viabilité cellulaire sur les HUVEC (cellules endothéliales de la veine ombilical humaine) et leur activité sur l'inhibition de la polymérisation de la tubuline (ITP). / Angiogenesis is a vital phenomenon in many physiological processes such as embryonic development or wound healing. But it is also a pathological process involved in the growth of malignant tumors, in the development of metastases and in diseases such as endometriosis or age-related macular degeneration (AMD) and osteoarthritis. Pathological neovasculature is dense and disordered in contrast to physiological neovasculature, which makes it an attractive therapeutic target. Vascular Disrupting Agents (VDA) are a new class of bioactive molecules that selectively destroy tumour neovasculature and shut down blood supply to solid tumours, causing extensive tumour cell necrosis.1 Among small molecule VDAs, tubulin-binding agents are mostly represented. The process of angiogenesis within osteoarthritis as well as the mode of action of VDA leads us to consider the use of its last as a new anti-osteoarthritis treatment. In the search for novel VDA scaffolds, we first compared the biological activities of several VDA. One class in particular attracted our attention on which only a few studies had been conducted. This allowed us to select leads with exploitable chemical space to design original scaffolds. These thesis will present analogs which were synthesized, their cell viability on HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) and their activity on tubulin polymerization inhibition (ITP).