Poor prognosis for high-risk neuroblastoma patients makes it necessary to find novel treatmentstrategies. This work aims to understand the cell cycle behavior of various high-riskneuroblastoma cell lines following chemotherapy treatment. Here, we mapped the expressionof cell cycle dependent proteins, p21 and p27, in seven high-risk neuroblastoma celllines. All cell lines showed an overall impaired growth following doxorubicin treatment.However, regrowth was observed in all cell lines between day 6 to 15 by forming colonies.The expression of p21 and p27 was measured in all cell lines showing an upregulationof p21 in 3 out of 5 p53 mutated cell lines while it was downregulated in the 2 cell lineswith a p53 wild type. Furthermore, inhibition assays using inhibitors of CHK1/2, p21 ,andSKP2 were performed. The results were promising as the CHK1/2 inhibitor reduced cellviability in all tested cell lines, while the p21 inhibitor had an effect in 3 out of 6 testedcell lines and the SKP2 inhibitor in 4 out of 6 tested cell lines. Confluency measurementover 15 days showed impaired growth following treatment with the CHK1/2 inhibitor for3 out of 6 tested cell lines and p21 inhibitor in 1 out of 6 tested cell lines. The obtainedresults were encouraging and might aid in finding a novel treatment strategy preventingresistance and relapse in neuroblastoma. However, further studies are needed in order tovalidate the efficacy and safety of these promising drugs in neuroblastoma patients. / Dålig prognos för högrisk neuroblastompatienter gör det nödvändigt att hitta nya behandlingsstrategier.Detta arbete syftar till att förstå cellcykelbeteendet hos olika högrisk neuroblastomcellinjerefter kemoterapibehandling. I denna studie kartlades uttrycket av cellcykelberoendeproteinerna, p21 och p27, i sju högrisk neuroblastomcellinjer. Alla cellinjervisade en total nedsatt tillväxt efter doxorubicinbehandling. Återväxt observerades emellertidmellan dag 6 och 15 genom bildandet av kolonier. Uttrycket av p21 och p27 mättesi alla cellinjer. Resultaten visade en uppreglering av p21 i 3 av 5 p53-muterade cellinjermedans det nedreglerades i de två cellinjerna med en p53-vildtyp. Vidare utfördes inhiberingsanalysermed användning av hämmare mot CHK1/2, p21 eller, SKP2. Resultatenär lovande då CHK1/2-hämmaren reducerade cellviabiliteten i alla testade cellinjer, medanp21-hämmaren hade en effekt i 3 av 6 testade cellinjer och SKP2 i 4 av 6 testadecellinjer. Konfluensmätning under 15 dagar visade nedsatt tillväxt efter behandling medCHK1/2-hämmaren för 3 av 6 testade cellinjer och p21-hämmare i 1 av 6 testade cellinjer.De erhållna resultaten är lovande och kan hjälpa till att hitta en ny behandlingsstrategi somförhindrar resistens och återfall i neuroblastom. Ytterligare studier behövs emellertid föratt validera effektiviteten och säkerheten för dessa lovande läkemedel hos neuroblastompatienter.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente et mortelle chez les jeunes enfants. Il se caractérise par une résistance à la chimiothérapie possiblement en partie dû à la présence de cellules initiatrices de tumeurs (TICs). Des études ont mis en évidence le rôle de CD133 comme un marqueur des TICs dans divers types de cancers. Les buts de notre travail étaient d’abord de démontrer les vertus de TICs des cellules exprimant CD133 et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), d’effectuer une analyse différentielle entre les TICs et les autres cellules du NB afin d’en identifier les anomalies génétiques spécifiques. Des lignées cellulaires de NB ont été triées par cytométrie de flux afin d’obtenir deux populations: une enrichie en CD133 (CD133high), l’autre faible en CD133 (CD133low). Afin de déterminer si ces populations cellulaires présentent des propriétés de TICs, des essais sur les neurosphères, les colonies en agar mou et les injections orthotopiques de 500 cellules sélectionnées dans 11 souris ont été réalisées. Après une isolation de l’ADN des populations sélectionnées, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ». Pour vérifier l’expression des gènes identifiés, des Western Blots ont été réalisés. Nos résultats ont démontré que la population CD133 avait des propriétés de TICs in vitro et in vivo. L’analyse génotypique différentielle a permis d’identifier deux régions communes (16p13.3 and 19p13.3) dans la population CD133high ayant des gains et deux autres régions (16q12.1 and 21q21.3) dans la population CD133low possédant des pertes d’hétérozygoties (LOH). Aucune perte n’a été observée. Parmi les gènes étudiés, l’expression protéique d’éphrine-A2 était corrélée à celle de CD133 dans 6 tumeurs et 2 lignées cellulaires de NB. De plus, l’augmentation de la concentration d’anticorps anti-éphrine-A2 dans le milieu diminue la taille des neurosphères. Ainsi, la population CD133high, qui a des vertus de TICs, possède des caractéristiques génotypiques différentes par rapport à celle CD133low. La présence d’éphrine-A2 dans les cellules exprimant CD133 souligne son importance dans le développement des TICs. Ces résultats suggèrent la présence de potentielle cible pour de nouvelles thérapeutiques ciblant les TICs mise en évidence par l’étude génomique. / Neuroblastoma (NB) is the most common and deadly extracranial solid tumor of childhood characterized by a resistance to chemotherapy possibly due to the presence of tumor initiating cells (TICs). Studies showed the role of CD133 as a marker of TICs in various types of cancers. Our goals were first to demonstrate the stemness of TICs expressing CD133 and then, using a global genomic analysis with single nucleotide polymorphism (SNPs), to perform a differential analysis between TICs and other cells of NB to identify the specific genetic abnormalities. NB cell lines were sorted by flow cytometry to obtain two populations: one enriched in CD133 (CD133high), the other low in CD133 (CD133low). To determine whether these cell populations have TICs properties, we test the ability of cells to form either neurosphères or, colonies in soft agar and we also test their carcinogenic properties by orthotopic injections of 500 selected cells in 11 mice. After a DNA extraction on selected populations, a differential genotyping analysis has been made with Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. To verify the expression of the genes identified, Western blots had been made. Our results have demonstrated that CD133high population presented TICs properties in vitro and in vivo. The differential genotyping analysis allowed identifying two gains common regions (16p13.3 and 19p13.3) in CD133high population and two others loss of heterozygosity (LOH) (16q12.1 and 21q21.3) in CD133low population . No losses were observed. Among the genes studied, ephrin-A2 protein expression was correlated to CD133 expression in 6 NB tumors and 2 NB cell lines. Also, ephrin-A2’s increased concentration influenced the neurospheres by decreasing their size. Thereby, CD133high population, which had TICs properties, possess different genotyping characteristics compared to CD133low population. The presence of ephrine-A2 in cells expressing CD133 emphasizes its importance in the development of TICs. These results suggest the presence of potential target for new therapies targeting the TICs demonstrated by the genomic study.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumour of childhood. In spite of many therapeutic improvements, only 60% survive long term. Presence of cancer stem cell (CSCs) is thought to mediate such resistance. PARP-1 plays an important role in the chemoresistance of certain tumours and its inhibition is shown to potentiate cells to routinely used anticancer agents. Moreover, Bcl-2 is over-expressed in NB and that its increased expression would contribute to chemotherapy resistance. Our goal was to determine the efficacy in vitro of a PARP inhibitor, AG-014699 (AG), and a Bcl-2 inhibitor, Obatoclax (Obx), in vitro and in vivo, in monotherapy or in combination to Doxorubicine (Doxo) and Cisplatine (Cis), classical chemotherapeutic agents used in NB treatment. In order to determine PARP-1 expression in NB tumours, 132 tumours were analyzed. We used an MTT test to evaluate 6 NB cell line and CSC sensitivity to AG alone or in combination to Doxo and Cis. We investigated the extent of cell death by Annexin-V and determined the degree of DNA damage by γH2aX staining. Also, signalling pathway modulations were analyzed by Western Blots. Obx sensitivity was determined by MTT test on 6 NB cell lines and its combination to Cis was also examined in 2 NB cell lines. Annexin-V and combinations to ZVAD-FMK also evaluated its effect on apoptosis. In vivo experiments were also done. Our results show that PARP-1 is associated to less aggressive tumors. AG has little to no effect on tumour growth when used alone and does not potentiate the effects of Doxo and Cis although more experiments will be needed. AG combined to Doxo seems to sensitize CSC in one cell line. Annexin-V and γH2aX staining reveal no effects of AG combination and Doxo mostly confers all cell damage and death. However, we do observe an increase in DNA damage and apoptosis in one cell line (SK-N-FI) when AG is used in monotherapy. pAKT and pERK are upregulated by Doxo and AG combination. NB cells are sensitized to Obx at nanomolar concentrations. Also, Obx activates apoptotic cell death. Moreover, Obx synergizes with Cis in vitro. In vivo, Obx significantly decreases tumor size. We conclude that Obx seems like a promising therapeutic approach in NB treatment whilst AG does not look so encouraging.

Le neuroblastome (NB) est une tumeur fréquente et agressive du jeune enfant. Les tumeurs de haut grade de forme métastatique, généralement développées chez l'enfant de plus de 1 an, sont associées à une importante mortalité malgré un traitement lourd incluant une chimiothérapie à haute dose. La chimiorésistance est donc un problème majeur qui caractérise ces NB de haut grade. Une des hypothèses pour expliquer cette chimiorésistance est celle de l’activation de l’autophagie, un mécanisme auquel recourent les cellules afin de faire face aux situations de stress. D’ailleurs, plusieurs études ont démontré que l'autophagie était activée à la suite des thérapies anticancéreuses. Son inhibition pourrait donc représenter une stratégie thérapeutique très intéressante pour le traitement de cancers. Le but de ce projet de recherche a été de mettre en évidence l'importance de l'autophagie dans les cellules du NB ainsi que l'effet de son inhibition sur la sensibilité des cellules du NB à la chimiothérapie conventionnelle. La présence d'autophagie dans les cellules de NB et sa valeur pronostic ont été évaluées par une étude immunohistochimique et par western blot sur 184 tumeurs patient. Ensuite, dans le but de déterminer l'effet de la chimiothérapie conventionnelle sur le niveau d'autophagie, des études in vitro sur 6 lignées cellulaires ont été effectuées utilisant des tests de mesure d'autophagie (MDC, monodanylcadaverine), de viabilité cellulaire (MTT) et de western blot. Celles ci ont été suivies par des tests d'inhibition de l'autophagie par deux méthodes: l’inactivation du gène ATG5 par un lentivirus contenant un shRNA ciblant ATG5 ou de l'hydroxychloroquine (HCQ), un inhibiteur pharmacologique de l’autophagie. Cette inhibition a été testée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie conventionnelle dans le but de déterminer le rôle de l'autophagie dans la sensibilisation des cellules de NB à la chimiothérapie. Ensuite, l’intérêt de l’inhibition de l’autophagie a été évalué sur des modèles murins. Enfin, le niveau d'autophagie a été testé dans des cellules souches de NB. Notre étude a démonté que l'autophagie est présente à un niveau basal dans une majorité des NB mais qu'elle ne représentait pas un facteur pronostic dans ce type de tumeur. Les différentes chimiothérapies testées induisent une augmentation de l'autophagie dans les cellules du NB. Les deux tests d'inhibition ont démontré in vitro que l'autophagie participe à la résistance des cellules aux traitements chimiothérapeutiques classiques du NB. Le blocage de l’autophagie in vivo augmente l’efficacité de la chimiothérapie, cependant certaines données associées au traitement par HCQ devront être complétées. Cette étude démontre que l'inhibition de l'autophagie en combinaison avec la chimiothérapie classique représente une approche thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB. / Neuroblastoma (NB) is a common tumor in childhood. Despite major advances in treatments, NB still have a poor prognosis with 40% of mortality. Chemoresistance is a major issue that characterizes aggressive NB. This is a consequence of an autophagic mechanism that tumor cells use to overcome stressful situations encountered during treatments. Autophagy has been the subject of several studies showing its activation in response to anticancer therapies. Its inhibition may therefore represent a very interesting therapeutic strategy for cancer treatment. The purpose of this research was to determine the presence of autophagy in NB cells and the effect of autophagy inhibition in sensitizing NB cells to conventional chemotherapy. The presence of autophagy was verified in 184 NB tumors. To determine the effect of conventional chemotherapy on autophagy, the MTT cell viability test and the autophagy measurement test (MDC, monodansylcadaverine) have been used to study 6 NB cell lines in vitro. An immunohistochemical study also allowed the verification of autophagy activation in tumors grown in mouse models. A lentivirus containing a shRNA against ATG5 was used to generate autophagy deficient cells. Using the MTT and MDC tests, we assessed their sensitivity to chemotherapy. In order to determine the effect of HCQ in sensitizing NB cells to chemotherapy, we used HCQ alone or in combination with conventional chemotherapy. This study demonstrated that autophagy is present at a basal level in NB cells. Unlike for LC3, the results showed that Beclin 1 is a factor of poor prognosis. The MTT and MDC tests have shown that vincristine, doxorubicin, cisplatin, temozolomide, rapamycin, and LY294002 induce autophagy in NB cells. Also, immunohistochemical studies showed that cisplatin treatment increased autophagy in vivo in xenograft model of human NB in mice. ATG5 deficient cells showed greater sensitivity to chemotherapy. Furthermore, the use of these cells in mouse models showed an important role of autophagy in tumor progression as well as an increased sensitivity to vincristine. Finally, combination of HCQ with conventional chemotherapy showed an increased sensitivity of NB cells to chemotherapy compared to cells receiving chemotherapy only. This study demonstrates that inhibition of autophagy in combination with conventional chemotherapy is an attractive therapeutic approach for the treatment of NB.

Das Neuroblastom (NB) zählt zu den therapieresistentesten Tumoren des Kleinkindalters. Besonders NB-Patienten mit MYCN-Amplifikation sind mit einer schlechten Prognose konfrontiert. Neuere Studien legen nahe, dass eine spezifische aktive Immuntherapie gegen MYCN ein vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung dieser malignen Erkrankung darstellen könnte. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde ein sogenanntes Minigen-Vakzin, welches für drei ausgewählte Epitope aus der MYCN-AS-Sequenz kodiert, generiert. Die Auswahl der Minigen-Epitope erfolgte mit dem MHC-Liganden-Vorhersageprogramm syfpeithi, welches drei starke H2-Kk-Liganden lieferte. Außerdem wurden zwei weitere Vakzine hergestellt: als Negativkontrolle MYCNLow, dessen MYCN-Peptide laut syfpeithi schlechte MHC-Klasse-I-Liganden darstellen und ein cDNA-Vakzin auf Basis der gesamten MYCN-cDNA-Sequenz. Zur Applikation der Vakzine wurden attenuierte Salmonella typhimurium SL7207 verwendet, die eine zusätzliche Stimulierung des mukosalen Immunsystems hervorrufen. Für die Untersuchung der Impfstoffe in vivo wurden zwei neuartige immunkompetente NB-Mausmodelle etabliert. Dazu wurden die syngenen NXS2/C1300 A/J-Mausmodelle soweit modifiziert, dass sie über eine induzierbare MYCN-Expression verfügten. Nach Auswahl und Charakterisierung geeigneter Transfektanten in vitro und in vivo wurde in diesen Modellen die Wirksamkeit der Vakzine untersucht. In diesen Versuchen konnte mit Hilfe der Vakzine das Primärtumorwachstum von NXS2-MYCN in geimpften Tieren signifikant im Vergleich zu Kontrollen reduziert und die Metastasierung durch C1300-MYCN Zellen signifikant verzögert werden. Mit den in-vivo-Versuchen anschließenden Analysen wurde schließlich bewiesen, dass die Immunantwort durch tumorinfiltrierende MYCN-spezifische zytotoxische CD8+ T-Zellen vermittelt wird. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine MYCN-DNA-Vakzinierung erfolgreich zur Behandlungen MYCN-exprimierender NB im Mausmodell eingesetzt werden kann. / High-level expression of MYCN protein caused by amplification of the gene characterizes a malignant phenotype of neuroblastoma (NB). Recent studies suggest that MYCN might be a promising target for immunotherapy. Therefore, we investigated the efficacy of three MYCN-specific DNA vaccines. Two minigene vaccines were generated; each encoded for three selected epitopes of the MYCN protein sequence with the highest, or as a control lowest, predicted affinity to MHC-Class-I Molecules. The third vaccine based on the cDNA of MYCN. Salmonella typhimurium SL7207 were used as oral application vehicle for the vaccines in in vivo experiments to induce an additional stimulation of the immune system. To investigate the immunotherapeutic approach NXS2- and C1300-cells syngeneic to immunocompetent A/J-mice were stably transfected with a tetracycline inducible vector system coding for MYCN. The transfectants were characterized and established in vitro and in vivo. In the MYCN-overexpressing models vaccination with the MYCN-DNA-vaccines resulted in significant reduced primary tumor growth or decelerated metastasis spread. The immune responses in the in vivo experiments followed by orally applied MYCN-DNA vaccines was mediated by tumor infiltrating cytotoxic CD8+ and CD4+ T cells. MYCN specificity of infiltrating lymphocytes was verified by MYCN-specific cytolytic activity and IFN-gamma secretion ex vivo. Finally, we showed that blocking of MHC-class I molecule H2-Kk approbated cytotoxicity mediated by CD8+ T cells, indicating MYCN specificity of the induced immune response. In summary, we showed that a MYCN based DNA vaccination strategy is effective against MYCN-expressing NB in vivo. In light of the description of MYCN-specific T cells in NB patients, the lytic action of autologous T cells on MYCN-expressing cells and the results of this study underline the possible potential of an active immunotherapy against MYCN as an alternative therapeutic approach to treat NB.

Das Neuroblastom ist ein vom sympathischen Nervensystem ausgehender neuroektodermaler maligner Tumor des Kleinkindesalters. Bei über 50% der Neuroblastom-Ersterkrankungen liegt bereits das disseminierte Stadium 4 vor, das eine infauste Prognose hat. Eine wirksame Behandlung des Stadium 4 Neuroblastoms stellt deshalb nach wie vor eine der größten Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie dar: Die Gesamtüberlebensrate von 20-25% der Kinder, die an dieser bösartigen Krankheit leiden, konnte während der letzten zwei Jahrzehnte trotz neuer Chemotherapie-Protokolle nicht wesentlich verbessert werden. Aus diesem Grund gibt es zunehmend Bestrebungen sich um Therapiealternativen zu bemühen. In dieser Arbeit werden die derzeit möglichen immunologischen Strategien zur Behandlung des Neuroblastoms abgehandelt. / Neuroblastoma is a neuroectodermal malignancy of early childhood derived from sympathetic nervous tissue. At initial diagnosis over 50% of patients present with disseminated stage 4 disease which has a dismal prognosis. Effective treatment of patients with stage 4 neuroblastoma remains a major challenge in pediatric oncology. Despite novel therapeutic approaches including chemotherapy and autologous stem cell transplantation the overall survival rate of only 20-25% did not improve over the last two decades. Therefore, a lot of effort has been made to develop novel alternative therapies. This thesis summarizes possible immunotherapeutic strategies for the treatment of neuroblastoma.

A investigação do potencial terapêutico de compostos naturais não tóxicos capazes de prevenir ou reduzir o impacto do estresse oxidativo em doenças inflamatórias diretamente relacionadas a dor tem exercido um papel fundamental no desenvolvimento de novas medicamentos. O ácido chiquímico (ACH) é um composto natural originalmente extraído da Illicium verum Hook. f., uma planta medicinal usada no tratamento de doenças inflamatórias. Apesar do ACH ter sido usado como um precursor químico na síntese do antiviral Tamiflu®, o seu potencial como um composto anti-inflamatório e antioxidante, já enraizado pelo uso popular, ainda permanece desconhecido. Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do ACH em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente as propriedades físico-químicas do ACH foram avaliadas e a atividade antioxidante comprovada, bem como seu potencial de proteger a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio em células de neuroblastoma SH-SY5Y. O ACH atenuou a inflamação induzida pelo LPS em macrófagos RAW 264.7, foi capaz de inibir a produção de citocinas (TNF-α e IL-β) e de NO, assim como a ativação das MAPKs (ERK1/2 e P38) induzida pelo LPS, sugerindo que o ACH pode exercer uma atividade anti-inflamatória. In vivo, o ACH bloqueou a hiperalgesia mediada pela carragenina (CG), TNF-α, prostaglandinas (PEG2) e dopamina (DA) em camundongos. Esses resultados sugerem que o efeito antinociceptivo do ACH pode ser atribuído, em parte, a sua ação antioxidante e anti-inflamatória, dois mecanismos que sustentam a transdução do sinal doloroso. / The investigation of the therapeutic potential of natural non-toxic compounds capable of counteracting oxidative stress associated with inflammatory disease and painful conditions, has been of key interest in drug development. Shiquimic acid (SA) is a nature-derived compound originally extracted from Illicium verum Hook. f., a chinese medicinal herb used to treat inflammatory diseases. Even though SA has currently been used as a chemical precursor for synthesis of the antiviral Tamiflu, its potential as an anti-inflammatory and antioxidant compound – already rooted by its popular use - remains unknown until now. Based on that, the aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and anti-nociceptive activity of SA in vitro and in vivo models. Initially the physic-chemical properties of SA were evaluated and proven antioxidant activity, as well as its potential to protect hydrogen peroxide-induced cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells. SA attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages, SA was capable of inhibiting TNF-α and IL-1β cytokines production, NO production as well as LPS-induced activation of MAPKs (p38 and ERK1/2), thus suggesting that SA may exert anti-inflammatory activity. In vivo, SA blocked carrageenan, TNF-alpha-, prostaglandin (PE2)-, and dopamine-induced hyperalgesia in mice. These results suggest that anti-nociceptive effect of SA could be attributed, at least in part, to their antioxidant and anti-inflammatory actions, two mechanisms underpinning painful signal transduction.

Le gène ALK code pour un récepteur à activité tyrosine kinase exprimé principalement dans le système nerveux central et périphérique au cours du développement chez le mammifère. Ces informations font suspecter un rôle développemental du récepteur ALK bien que ses fonctions précises ne sont pas connues. De la même manière, ses ligands et les voies de signalisation qui lui sont associés demeurent mal caractérisés. En 2008, des mutations ponctuelles du gène ALK ont été identifiées dans des formes sporadiques et familiales de neuroblastome. Deux hotspots de mutation sont situés dans le domaine tyrosine kinase. Ces travaux de thèse ont permis d’étudier l’implication du gène ALK dans l’oncogenèse du neuroblastome sous des aspects cellulaires, génomiques et fonctionnels. L’étude de la régulation de l’activation et de l’adressage de la protéine ALK a révélé qu’à la différence des récepteurs sauvages, l’activation constitutive conduit à une rétention intracellulaire associée à une maturation incomplète des récepteurs mutés. Par ailleurs, la caractérisation complète du locus ALK dans le neuroblastome a mis en évidence une fréquence élevée de réarrangements chromosomiques. Ce travail a notamment identifié un réarrangement chromosomique conduisant à l’expression d’un variant du récepteur ALK tronqué pour une partie du domaine extracellulaire. Ce variant, associé à l’agressivité tumorale, est activé de façon constitutive et présente des propriétés oncogéniques. Enfin, l’analyse de souris knock-in exprimant les mutations AlkF1178L et AlkR1279Q a révélé un rôle majeur du gène Alk dans le développement du système nerveux sympathique. En effet, ces souris présentent une hyperplasie des ganglions sympathiques mise en place chez l’embryon et associée à une augmentation de la prolifération cellulaire à la naissance. Ce travail a aussi mis en évidence la coopération oncogénique in vivo entre les mutations du gène Alk et la surexpression du gène MYCN dans le neuroblastome. Les tumeurs générées chez les souris partageant ces deux altérations se développent après une courte période de latence et avec une pénétrance complète. L’analyse des tumeurs a mis en évidence des propriétés conférées aux tumeurs par les mutations du gène Alk. En effet, ces tumeurs expriment des marqueurs cholinergiques et montrent des signes de différenciation. Ces animaux permettent de mieux comprendre le rôle du gène ALK dans l’oncogenèse du neuroblastome et constituent de bons modèles d’étude préclinique des neuroblastomes dépendants de ALK. / The ALK protein is a receptor tyrosine kinase mainly expressed in the central and peripheral nervous system during the development in mammals. These informations suggest that the ALK receptor might have a developmental role even though its functions remain unknown. Ligands and signaling pathways associated to this receptor are also poorly characterized. In 2008, point mutations of the ALK gene have been identified in sporadic and familial cases of neuroblastoma with two main hotspots of mutation in the kinase domain. This thesis project allowed to study the involvement of the ALK gene in neuroblastoma oncogenesis under cellular, genomic and functional aspects.The study of ALK protein activation and subcellular localization revealed that the constitutive activation of the kinase domain lead to an intracellular retention and to a lack of glycosylation. The genomic characterization of the ALK locus pointed out the high frequency of chromosomal rearrangements in neuroblastoma cell lines. This work notably identified the expression of a chromosomal rearrangement leading to a truncated protein variant of ALK lacking a part of the extracellular domain. This variant, associated with the tumoral aggressiveness, is constitutively activated and harbor oncogenic properties. Finally, the analysis of the knock-in mice expressing the two AlkF1178L and AlkR1279Q mutations demonstrated that the ALK gene has a key role in the regulation of the developing sympathetic nervous system. Indeed, these mice have an hyperplasia of sympathetic ganglia set up during embryogenesis and associated with an increased neuroblast proliferation at birth. This work also described the oncogenic cooperation between ALK mutations and MYCN overexpression in neuroblastoma. Tumors, generated in mice sharing those two alterations, arise with a full penetrance and a short latency. Histological and transcriptomic analysis of tumors identified specific properties provided by ALK mutations. Indeed, these tumors express cholinergic markers and harbor signs of differentiation. Those animals allow to better understand the role of the ALK gene in neuroblastoma oncogenesis and constitute good preclinical models for ALK dependant neuroblastoma.

La télomérase, enzyme qui permet le maintien de la longueur des télomères est activée dans la majorité des cellules cancéreuses. Du fait de son rôle dans l’immortalité cellulaire, elle a été proposée comme cible de nouvelles stratégies anticancéreuses; il est donc fondamental d’identifier les mécanismes de sa régulation. Des travaux récents du laboratoire ont démontré, en utilisant une lignée de leucémie aiguë promyélocytaire résistante à la différenciation par les rétinoïdes (NB4-LR1), que l’acide rétinoïque tout trans (ATRA) induit une répression transcriptionnelle de hTERT, sous-unité catalytique de la télomérase, indépendamment de la différenciation. Cette répression est également associée à la mort des clones résistants. Il a également été montré lors du traitement par l’ATRA de cellules résistantes à cette répression, NB4-LR1SFD, qu’il existait une hyperméthylation de la région distale du promoteur de hTERT associée à la persistance de sa transcription et à la prolifération cellulaire. Ceci nous a conduit à proposer un modèle de régulation de hTERT dans lequel l'induction de modifications épigénétiques de la région distale de son promoteur empêcherait la fixation d'éventuels répresseurs. Des résultats récents suggèrent que WT1, facteur connu pour contribuer à la répression de hTERT, pourrait être un de ces facteurs. WT1 code pour un facteur de transcription à doigt de zinc et a été décrit pour la première fois comme délété dans les tumeurs de Wilms (tumeurs rénales de l’enfant). Cependant le rôle de WT1 dans développement tumoral varie en fonction des modèles cellulaires ; il peut avoir un rôle d’oncogène ou au contraire agir comme un gène suppresseur de tumeur. Dans le but d’élucider les mécanismes de régulation de la télomérase, nous avons donc voulu étudier le rôle de WT1 dans la répression de hTERT. Pour ce travail, nous avons utilisé deux modèles cellulaires :• La Leucémie aigue promyélocytaire (LAP) : leucémie aigue myéloblastique caractérisée par un transcrit de fusion impliquant le récepteur aux rétinoïdes.• Le neuroblastome : tumeur solide extra crânienne la plus fréquente chez l’enfant. Cette maladie est très hétérogène aussi bien au niveau biologique que clinique ; en effet certaines formes peuvent régresser spontanément alors que d’autres, très agressives, sont résistantes à toutes les thérapeutiques actuelles. Cette hétérogénéité clinique est notamment liée à la différenciation de la tumeur et également à la présence ou non de l’amplification de l’oncogène N-Myc qui a un rôle pronostic majeur dans cette maladie. Les voies de signalisations impliquées dans le fort pouvoir tumorigène des neuroblastomes ne sont pas encore clairement identifiées.Nous avons pu montrer dans ces modèles que WT1 réprime hTERT et que cette répression semble fonction de l'état de méthylation de la région distale du promoteur de hTERTLa 2ème partie de mon travail a été d’étudier le rôle de WT1 dans les neuroblastomes. Les résultats de nos travaux montrent que WT1 est plus exprimé dans les tumeurs sans amplification de N-Myc et dont la différenciation est stromale. Cependant la surexpression de WT1 dans des tumeurs sans amplification de N-Myc semble associée à un moins bon pronostic. L’étude de l’expression de WT1 pourrait constituer un outil pronostic intéressant dans ces tumeurs. / Telomerase is expressed and active in most immortalized cells. Whereas telomerase becomes activated during neoplastic transformation, its activity decreases during differentiation of various immortal cells in response to pharmacological agents, including retinoids. We showed using both an Acute Promyelocytic Leukemia (APL) cellular model (NB4 cell model) and Neuroblastoma cells that all-trans-retinoic acid (ATRA) induced a transcriptional repression of the catalytic subunit of telomerase, hTERT, associated with differentiation. This repression also occurred independently of differentiation, as demonstrated during long term treatment of ATRA-induced maturation resistant NB4-LR1, leading to telomere shortening, growth arrest and cell death. Changes in chromatin environment of hTERT promoter and binding of transcriptional factors have been demonstrated in differentiating cells when hTERT is repressed. However, it is not clear whether these changes are directly involved in hTERT repression or only linked to differentiation. A variant cell line was isolated from NB4-LR1 cells, (NB4-LR1SFD), which bypassed the death step because of a re-activated telomerase and resisted to hTERT repression despite the continuous presence of ATRA. Using both NB4-LR1 and NB4-LR1SFD cells, it was shown that the mechanisms of ATRA-induced hTERT repression involved: 1) a switch from c-myc to mad1 binding at the proximal domain of hTERT promoter, 2) epigenetic modifications of the distal domain of hTERT promoter (-600 -250 nucleotides). Indeed, the persistence of hTERT transcription was associated with an hypermethylation of the distal domain in ATRA-treated NB4-LR1SFD. Interestingly, the binding of a known hTERT repressor, WT1, to this distal domain, was defective in NB4-LR1SFD. The first part of my thesis was to investigate the role in hTERT transcriptionnal regulation of both c-myc and WT1, two transcription factors, which bind to the proximal and the distal region of hTERT promoter, respectively. The second part was to determine the role of WT1 in neuroblastoma. Neuroblastoma is the most common extra cranial solid tumor in childhood and the most frequently diagnosed neoplasm during the infancy. A striking feature of this tumor is its clinical heterogeneity. Among tumor progression markers delineated so far, MYCN amplification occurs in about 25% of total neuroblastoma cases and this percentage increases at 30% in advanced stage NEUROBLASTOMA. Despite the fact that MYCN amplification is strongly correlated with neuroblastoma of poor outcome, MYCN status cannot predict all cases of poor survival in neuroblastoma. In addition, neuroblastoma without MYCN amplification (about 70-80% of neuroblastoma) are far to display favorable behavior. WT1 was initially identified as a tumor suppressor gene involved in the development of a pediatric renal tumor (Wilm’s tumor). Here, we describe an inverse correlation between WT1 expression and MYCN amplification and expression. However and most notably, our results show that WT1 gene expression is associated with a poor outcome for patients showing non-MYCN-amplified tumors. Thus WT1 expression may be a prognostic marker for a better risk-stratification and for an optimized therapeutic management of neuroblastoma.

<p>The Mad/Max/Myc transcription factor network takes part in the control of vital cellular functions such as growth, proliferation, differentiation and apoptosis. Dimerization with the protein Max is necessary for the Myc-family of oncoproteins and their antagonists, the Mad-family proteins, to regulate target genes and carry out their intended functions. Myc functions as a positive regulator of proliferation, antagonized by the growth inhibitory Mad-proteins that potentially functions as tumor supprerssors. Deregulated Myc expression is found in a variety of tumors and signals negatively regulating Myc expression and/or activity could therefore be of potential use in treating tumors with deregulated Myc.</p><p>Our aim was to therefore to investigate possible negative effects on Myc expression and activity by growth inhibitory cytokines and by the Myc antagonists, the Mad-family proteins.Two different cellular model systems of neuronal and hematopoietic origin have been utilized for these studies.</p><p>Our results show that Mad1 is upregulated during induced neuronal differentiation of SH-SY5Y cells. Further, the growth inhibitory cytokine interferon-g (IFN-g) was shown to cooperate with retinoic acid (RA) and the phorbol ester TPA in inducing growth arrest and differentiation in N-<i>myc</i> amplified neuroblastoma cell lines. In contrast to treatment with either agent alone, the combined treatment of TPA+IFN-g and RA+IFN-g led to upregulation of Mad1 and to downregulation of N-Myc, respectively, thus correlating with the enhanced growth inhibition and differentiation observed after combination treatment. Ectopic expression of an inducible Mad1 in monoblastic U-937 cells led to growth inhibition but did not lead to differentiation or enhancement of differentiation induced by RA, vitamin D3 or TPA. In v-Myc transformed U-937 cells Mad1 expression reestablished the TPA-induced G1 cell cycle arrest, but did not restore differentiation, blocked by v-Myc. The growth inhibitory cytokine TGF-b was found to induce Mad1 expression and Mad1:Max complex formation in v-Myc transformed U-937 cells correlating with reduced Myc activity and G1 arrest. </p><p>In conclusion, our results show that the Myc-antagonist Mad1 is upregulated by growth inhibitory cytokines and/or differentiation signals in neuronal and hematopoietic cells and that enforced Mad1 expression in hematopoietic cells results in growth inhibition and increased sensitivity to anti-proliferative cytokines. Mad1 and cytokine-induced signals therefore seem to cooperate in counteracting Myc activity.</p>