O crescimento de uma camada neoíntima é o marcador central do processo aterosclerótico, bem como do remodelamento vascular associado à reestenose após intervenções vasculares terapêuticas, tais como angioplastia ou colocação de stents. A célula neointimal é essencialmente uma célula com fenótipo muscular liso indiferenciado, cuja origem pode ser múltipla e com característica ação secretora de matriz extracelular. Dentre os fatores que coordenam a (des)diferenciação, proliferação e migração destas células, há evidências de que processos redox tenham papel preponderante, porém os mecanismos de tais processos não estão claros. A compreensão mais profunda de tais mecanismos redox tem sido dificultada pela falta de modelos de células neointimais cultivadas. Os objetivos específicos deste trabalho são: 1) Desenvolver um modelo de cultura de células neointimais de artéria ilíaca de coelho obtidas após lesão por catéter-balão. 2) Avaliar em tais células índices do estado redox e potenciais fontes enzimáticas de ERO, com ênfase no complexo NAD(P)H oxidase. 3)Avaliar marcadores de estresse do retículo endoplasmático e sua correlação com os índices do estado redox. 4) Estudar o efeito de estímulos proapoptóticos como deprivação de soro, estressores do RE e particularmente administração exógena de NO na viabilidade e estado redox de células neointimais. Os resultados obtidos demonstram que: é possível obter células neointimais em cultura de modo reproduzível e estável. Células provenientes da artéria lesada mantém um estado persistente de aumento do estresse oxidativo. O estresse oxidativo nessas células decorre de produção aumentada de radical superóxido e ativação do complexo da NADPH oxidase vascular. Diferentemente do observado em vasos lesados, os marcadores do estresse do reticulo endoplasmático não se apresentam alterados se comparados a células musculares lisas normais. Células neointimais têm resposta aumentada a agonistas da NADPH oxidase e estressores celulares. A exposição a óxido nitrico promove aumento da produção de superóxido, particularmente acentuado em células neointimais. As curvas de viabilidade celular indicam uma sensibilidade aumentada a estressores do RE, doadores de NO e particularmente a oxidantes exógenos. Em conjunto, estes resultados permitem concluir que o fenótipo neointimal é um fenótipo de estresse oxidativo acentuado e persistente, mesmo em condições de cultura celular, e que este estresse oxidativo decorre pelo menos em parte da ativação do complexo NADPH oxidase no contexto de uma adaptação à resposta celular integrada ao estresse. Estes dados indicam novas perspectivas no entendimento dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia redox da neoíntima, podendo suscitar o desenho de intervenções terapêuticas racionais. / Formation of a neointimal layer is the hallmark of most vascular diseases, such as atherosclerosis and restenosis after angioplasty. Neointimal cells display an undifferentiated noncontractile smooth muscle phenotype with marked extracellular matrix secretion. Their origin can be multiple. Among factors that govern the (de)differentiation, proliferation and migration of neointimal cells, there is evidence for a key role of redox processes, but the underlying mechanisms are unclear. Advancing the knowledge about such redox mechanisms has been difficulted by the absence of a reproducible method of neointimal cell culture. The objectives of this work are: 1) To develop a model of neointimal cell culture, in which cells are harvested from rabbit iliac arteries 14 days after overdistention balloon injury. 2) To assess the redox status in such neointimal cells and the possible enzymatic source of reactive oxygen, with emphasis in the NAD(P)H oxidase complex. 3) To investigate the expression of endoplasmic reticulum stress markers and their corralation with redox status. 4) To investigate the effects of proapoptotic stimuli such as serum deprivation, endoplasmic reticulum stressors and particularly the exogenous administration of nitric oxide in viability and redox status of neointimal cells. Our results show that it is possible to harvest and cultivate neointimal cells after balloon injury. The neointimal cells in culture, even after several passages, exhibit increased indexes of oxidative stress. Oxidative stress in such cells is associated with increased activation of the vascular NAD(P)H oxidase complex. Contrarily to what was observed in healing arteries harvested from in vivo rabbits, markers of ER stress did not show any change when compared with primary smooth muscle cells kept in similar conditions. Oxidative stress response was increased after NADPH oxidase agonists; in particular, exposure to exogenous nitric oxide markedly increased superoxide radical production in neointimal cells. Cell viability curves showed increased sensitivity to ER stressors, NO donors and, particularly, exogenous oxidants. Therefore, the neointimal phenotype is a phenotype of intrinsic sustained oxidative stress even after several passages in culture. Such oxidative stress is due at least in part to activation of the NAD(P)H oxidase complex in the context of adaptation to an integrated stress response. This data provide new perspectives to understand redox mechanisms associated with neointimal pathophysiology and can lead to development of rational therapeutic interventions.

Especies reativas de oxigenio/nitrogenio (ERO/ERN) produzidas por neutrofilos atraves do complexo NADPH oxidase (Nox2) estao diretamente associadas as acoes deleterias surgidas quando a inflamacao escapa do controle da homeostase. A ativacao da NADPH oxidase de neutrofilos requer o acoplamento das subunidades citosolicas aos componentes de granulos e translocacao do complexo a membrana do fagossoma. A PDI (Proteina Dissulfeto Isomerase, EC 5.3.4.1) e uma chaperona envolvida no trafego proteico celular, sendo encontrada na superficie de diversas celulas procarioticas e eucarioticas. Trabalhos previos sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsaveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o transito das subunidades ate a membrana do fagossoma. Neste trabalho foi testada a atividade de Nox2 de neutrofilos inflamatorios correlacionada a atividade redutase de PDI de membrana e o efeito do nitroxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxil (Tempol) sobre esses processos. Neutrofilos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e nao foi detectado consumo de oxigenio associado ao sistema Nox2, conforme ensaios realizados com uso de um pseudo-substrato para PDI e monitoramento com eletrodo de Clark, respectivamente. Sob estimulo de forbol (PMA), os fagocitos consumiram quantidade significativa de oxigenio (6.5„b0.58 nmol.min-1) e apresentaram alta atividade de PDI, cerca de quatro vezes maior que as celulas dormentes. Quando os fagocitos foram previamente tratados com Tempol houve decrescimo dose-dependente da atividade de Nox2 (ED50: 45 ƒÝg/106 neutrofilos), em correlacao direta com o decrescimo da atividade de PDI. Testes com inibidores padroes de PDI (bacitracina e acido ditionitrobenzoico- DTNB) confirmaram que a inibicao de PDI determina decrescimo da atividade de Nox2, resultados obtidos atraves de ensaios espectrofotometricos (reducao de citocromo c, 550 nm) e quimioluminescentes (sistema luminol-peroxidase). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente a atividade de Nox2 em neutrofilos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona esta diretamente associada a ativacao e/ou manutencao da atividade da oxidase fagocitaria. Adicionalmente, esse trabalho mostrou que o nitroxido Tempol e capaz de modular negativamente a atividade de Nox2, cujo efeito, ao menos em parte, e decorrente da inibicao de PDI, sugerindo um novo mecanismo anti-inflamatorio dos nitroxidos. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) is an ubiquitously expressed enzyme that catalyses the rearrangement of disulfide bonds in target proteins. Previous studies suggest that PDI, which is a chaperone involved in protein trafficking and translocates to the cell surface, may regulate the phagocytic NADPH oxidase complex (Nox2). This study examines whether the nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) inhibits the regulatory activity of PDI interconnected to Nox2 in inflammatory neutrophils. Phorbol-triggered superoxide anion release was correlated with the PDI reductase activity detected in neutrophils, as determined by oxygen consumption and cleavage of a fluorescent probe, respectively. Both events were significantly inhibited in a concentration-dependent manner when neutrophils were pre-treated with Tempol, which has an ED50 of 45 M. To substantiate that Tempol’s action on PDI activity is related to Nox2 downregulation, assays with the known PDI inhibitors bacitracin and dithionitrobenzoic acid were performed to confirm their ability to decrease the neutrophil respiratory burst. This study shows that Tempol’s inhibition of Nox2 activity is correlated with decreased PDI reductase activity at the neutrophil cellular membrane, suggesting a close association between the enzymes of activated phagocytes and pointing to a novel anti-inflammatory mechanism for Tempol. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A ação de espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio (ERO/ERN), produzidas por neutrófilos através do complexo NADPH oxidase (Nox2) e óxido nítrico sintase (iNOS), estão diretamente associadas à capacidade microbicida de fagócitos. Entretanto, se a produção destes oxidantes escapa ao controle da homeostase bioquímica, ocorrem danos oxidativos aos tecidos circunvizinhos do foco inflamatório, quando, então, há necessidade de intervenção farmacológica. Neste trabalho foi testado o efeito dos nitróxidos piperídinicos 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Tempo) e 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Ac-Tempo) sobre a atividade de Nox2 de neutrófilos inflamatórios e suas consequências sobre a capacidade fungicida dos fagócitos. Neutrófilos isolados de cavidade peritoneal de camundongos foram incubados (37°C, 10 min) com Tempo (50-400 μM) ou Ac-Tempo (25-200 μM) e estimulados com Candida albicans (ATCC 10231) opsonizadas (107 C. albicans/105 neutrófilos). A atividade de Nox2 foi determinada polarograficamente, pelo consumo de oxigênio mensurado através de eletrodo de Clark, ou espectrofotometricamente, medindo-se a redução de citocromo c (550nm). A atividade de Nox2 (119,311,6 nmol de O2-•.min-1) foi diminuída pelo tratamento com ambos os nitróxidos, de forma dose-dependente, embora Ac-Tempo tenha sido mais eficaz (ED50 31 M) que Tempo (ED50 160 M). Paralelamente, foi verificada a fluorescência (λexc361, λemi440) emitida pelo grupo acridina após reação de espécies radicalares com Ac-Tempo, corroborando a hipótese de que nitróxidos depletam radicais produzidos por neutrófilos estimulados com C. albicans. O nitróxido Tempo não mostrou nenhuma ação direta sobre culturas de C. albicans, conforme análises de antifugigramas padrões. Entretanto, testes de capacidade microbicida de neutrófilos mostraram que o tratamento prévio das células com Tempo (300 µM) causou decréscimo de 80% na efetividade fungicida sobre C. albicans. Testes in vivo mostraram que Tempo administrado em dose oral única (26,52 mg/kg) foi capaz de diminuir o edema de pata originado em resposta à inoculação do fungo (107 C. albicans) cujo ponto máximo de efeito foi 18 horas após a administração do nitróxido, bem como determinou significativa diminuição de nitração de proteínas em tecido muscular das patas dos animais, conforme resultados de ensaios com anticorpos anti-nitrotirosina. Em conjunto, os resultados corroboram a premissa de que a atividade de Nox2 é essencial para a resposta do hospedeiro a C. albicans e que a administração de nitróxidos para modular a produção de oxidantes nos focos infecciosos pode diminuir a resposta do sistema imune à infecção fúngica. / Production of oxidants species by neutrophils through NADPH oxidase complex (Nox2) is directly associated with the microbicidal activity of phagocytes. In this work we tested the effect of the nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-piperidine-1-oxil (Tempo) and 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-1-oxil (Ac-Tempo) on the activity of inflammatory neutrophil Nox2 complex and the consequences on the fungicidal phagocytes capability. Neutrophils were incubated with Tempo (50-400 mM) or Ac-Tempo (25-200 mM) and stimulated with Candida albicans. Nox2 activity was determined polarographically by oxygen consumption measured by Clark electrode. Oxidase activity decreased by treatment with both nitroxides in a dose-dependent manner. However, Ac-Tempo was more effective (ED5044M) that Tempo (ED50160M). In parallel, the fluorescence intensity elicited by acridine after reaction with free radicals was determined. Neutrophils stimulation elicited significant fluorescent response in direct correlation with Ac-Tempo doses (R2=0.997), supporting the hypothesis that nitroxide is consumed by free radicals neutrophils-released. Fungicidal neutrophils activity assay explicited that pretreatment of cells with Tempo caused 80% decrease in the effectiveness on C. albicans death. Oral administration of a Tempo single dose was able to reduce paw edema elicited in response to inoculation of the fungus. Also, a significant decrease in protein nitration in paw tissues was found in this condition. Together, the results support the premise that Nox2 activity is essential for the host response against C. albicans and that nitroxides cause a decrease on the oxidant immune response to fungal infection.

Durante algumas das reações que levam à formação de AGEs, espécies reativas de oxigênio são geradas e concorrem paralelamente com o estresse oxidativo e com os danos estruturais e funcionais às macromoléculas. A formação de AGEs in vivo pode envolver os neutrófilos, que após estímulo inflamatório, induzem importantes enzimas geradoras de ERO, como o sistema NADPH oxidase. Entretanto ainda permanecem questionamentos sobre a relação entre o Sistema NADPH oxidase de neutrófilos e os AGEs. O presente trabalho visa contribuir para o entendimento do papel do sistema NADPH oxidase e da geração de ERO na formação de AGEs e o impacto da formação destes produtos na função renal destes animais. Foi utilizado um modelo experimental de diabetes induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 5 grupos: controle, diabético, diabético tratado com aminoguanidina (AG), diabético tratado com apocinina (AP) e diabético tratado com apocinina e aminoguanidina (AP+AG). A AG é um conhecido inibidor da formação de AGEs, e a AP é inibidor do sistema NADPH oxidase. Os inibidores, ou água foram administrados aos animais por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de ERO reflete a atividade de NADPH oxidase e foi mensurada em neutrófilos peritoneais por quimiluminescência e pelo ensaio de redução do citocromo C. A expressão das subunidades p47phox e a p67phox do sistema NADPH oxidase foi avaliada por imunofluorescência. Os AGEs circulantes foram avaliados por fluorescência e a função renal foi avaliada pela dosagem da uréia e creatinina séricas e análises histológica dos rins. Pelos parâmetros avaliados neste estudo, verificamos que o tratamento com AP, diminuiu a geração de ERO tanto no grupo controle, quanto diabético, mas não afetou a via de formação de AGEs. O que indica que, provavelmente, não há interrelação entre as vias do sistema da NADPH oxidase de neutrófilos e a formação de AGEs, no nosso modelo experimental. O tratamento com a AP atenuou a glomerulonefrite do grupo diabético. A AG, na dose e no tempo administrado, 100mg/Kg por 50 dias, melhorou o perfil glicêmico dos animais diabéticos, preveniu a formação de AGEs e o dano glomerular. Além disso, o tratamento com a AG aumentou a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão das subunidades citosólicas p47phox e a p67phox do sistema. Não podemos afirmar que o aumento da atividade e expressão do sistema NADPH oxidase seja devido à diminuição dos AGEs no nosso sistema ou um efeito isolado da aminoguanidina, ainda não descrito na literatura. A compreensão do papel desta enzima em modelo experimental de diabetes pode ajudar na compreensão do processo inflamatório persistente que ocorre devido ao acúmulo desses produtos nas complicações da doença, permitindo uma melhor adequação da abordagem clínica e tratamento desses pacientes. / Chronic hyperglycemia observed in diabetes disease leads to the advanced glycation end products (AGEs) formation, which are able to damage the patient organs, especially the kidney. Some AGEs formation reactions may also generate reactive oxygen species (ROS) and they are able to compete with oxidative stress and structural and functional macromolecules damages. Neutrophils are immune cells capable of expressing great amount of important ROS generator enzymes such as NADPH oxidase just after inflammatory stimuli. There are still questions about the relationship between the neutrophil NADPH oxidase system and AGEs despite the information that in vivo AGEs formation may involve neutrophils. The present study aims to contribute to the understanding of NADPH oxidase role and its ROS generation in AGEs formation and what is the impact of these products formation in renal function of rat model. Our experimental diabetes model was reached by alloxan i.p. injection in rats. These animals were divided in five groups: control, diabetic, diabetic treated with aminoguanidine (AG), diabetic treated with apocynin (AP) and diabetic treated with apocynin and aminoguanidine (AG + AP). AG is an AGEs formation inhibitor, and AP is a NADPH oxidase inhibitor. The inhibitors compounds or the vehicle (water) were administered by gavage for 50 days after DM confirmation. ROS formation reflects the NADPH oxidase activity and it was measured by chemiluminescence assay and by cytochrome C reduction in peritoneal neutrophils. The expression of NADPH oxidase p47phox and p67phox subunits was assessed by immunofluorescence. Circulating AGEs were analyzed by fluorescence and the renal function was evaluated by serum urea and creatinin concentration and by kidney histological sections. Our results showed that AP treatment decreased ROS generation in both control and diabetic groups, but did not affect the process of AGEs formation. This may indicate that in our experimental model there is no interrelation between the neutrophil NADPH oxidase system and the AGEs formation. It was also observed that the AP attenuated glomerulonephritis in diabetic mice. AG, at the administered dose and time, 100mg/Kg for 50 dias, improved glycemic control, prevented the AGEs formation and prevented glomerular damage. Furthermore, AG treatment increased the NADPH oxidase activity and its p47phox and p67phox cytosolic subunits expression. We are not able to confirm if the increased activity and expression of NADPH oxidase were caused by the AGEs decrease in our system or by an isolated effect of aminoguanidine not yet described. Understanding the NADPH oxidase role in experimental diabetes could improve the knowledge about the persistent inflammatory process that occurs due to these products accumulation during the disease complication, allowing a better clinical approach and treatment of these patients. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o principal causador da tuberculose (TB), continua a representar um grave problema de saúde pública, principalmente em países de baixa e média renda. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mtb, com aproximadamente oito milhões de casos novos e quase três milhões de mortes anualmente por TB. Após a infecção pelo Mtb, a resposta imune desempenha papel preponderante para impedir o inicio da doença infecciosa, a TB, bem como de seu curso. Assim, os oxidantes (espécies reativas do oxigênio/nitrogênio [EROs/ERNs]) gerados no burst oxidativo de células fagocíticas como, os neutrófilos, são essenciais para uma efetiva resposta ao patógeno. O uso indiscriminado de suplementação antioxidante, atualmente muito comum entre a população, ou o uso terapêutico durante o tratamento da TB, poderia comprometer a resposta imune frente às micobactérias, portanto, predispondo a uma maior susceptibilidade ao Mtb e/ou TB. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar ex vivo a influência do antioxidante sintético da classe dos nitróxidos, o 4-Hidroxi-2,2´,6,6´-tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol), sobre a resposta microbicida de neutrófilos contra M. tuberculosis. Neutrófilos humanos foram isolados por gradiente de densidade a partir de sangue total de voluntários saudáveis. Para avaliar o burst oxidativo na ausência ou presença do Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) foi incubado a 37 ºC com neutrófilos a multiplicidades de infecções (MOI) variando de 1 a 100. A liberação de anions superóxido (O2•-) pelos neutrófilos foi avaliada através do ensaio de redução do citocromo c. O ensaio de quimioluminescência amplificada com o Luminol foi utilizado para avaliar EROs/ERNs total e com Isoluminol para extracelular. Complementarmente, o ensaio de killing foi realizado para verificar a capacidade microbicida total dos neutrófilos tratados ou não com Tempol. Neste teste, foi adotado o protocolo "dois passos", em que, Mtb foi incubado com neutrófilos (por 10, 30 e 90 min a 37 ºC) e, através de uma centrifugação diferencial (100 x g, 5 min) e lise dos neutrófilos com H2O pH 11, as micobactérias intracelular e extracelular foram quantificadas e os resultados reportados em Unidades Formadoras de Colônia (UFC), após uma incubação das micobactérias por 21 dias a 37 ºC. Através deste protocolo, as taxas de fagocitose (Kp) e morte intracelular (Kk) do Mtb foram calculadas. Paralelamente foi avaliada a possível atividade tóxica do Tempol sobre neutrófilos, tendo sido observado que Tempol a uma concentração de 500 µM não foi citotóxico. O burst oxidativo dos neutrófilos contra Mtb foi significativamente diminuído na presença do Tempol (450 µM, p < 0,05) para todos os oxidantes avaliados. Esta concentração também foi capaz de diminuir a capacidade microbicida dos neutrófilos, em que o número de UFC de M. tuberculosis no grupo tratado com Tempol foi significativamente maior que no grupo controle (p < 0,05). Curiosamente, Tempol diminuiu o KK dos neutrófilos, mas não teve nenhum efeito sobre a seu Kp. Este estudo fornece informações sobre a influência de antioxidantes sobre a resposta imune contra o M. tuberculosis, de modo que as implicações clínicas para a prevenção e tratamento da tuberculose deve levar em conta estes achados. / Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main cause of tuberculosis (TB), remains as a serious public health problem, chiefly in low- to middle-income countries. It is estimated that about one-third of the world's population has latent TB, with about eight million new cases and roughly three million deaths each year from TB. The innate immune response following Mtb infection plays a crucial role in preventing the onset of active TB, as well as its course. Thus, phagocytes-derived reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) during the oxidative burst (e.g., generated by neutrophils) are essential to an effective response to the pathogen. The indiscriminate use of antioxidant supplements, currently very common among the population, or their use as adjuvant therapy during TB treatment, could compromise the immune response to Mtb accordingly potentially increasing the host's susceptibility to Mtb/TB. In this context, the aim of this study was to investigate the ex vivo effect of the cyclic nitroxide tempol (4-hydroxy-2,2,6,6-tetra-methyl-1-piperidinyloxy), an antioxidant with superoxide dismutase mimetic properties, on the microbicide response of neutrophils against M. tuberculosis. Human neutrophils were isolated from venous blood of healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation. To assess the oxidative burst in the absence or presence of Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) was incubated at 37 ° C with neutrophils at multiplicity of infection (MOI) ranging from 1 to 100. ROS generation (O2•-) by neutrophils was evaluated by using the cytochrome c reduction assay. The total and extracellular ROS were determined using the luminol- and Isoluminol-amplified chemiluminescence assay. Complementarily, the killing assay was performed to check the total microbicide capacity of neutrophils treated or not with Tempol. In this test, the "two-step" protocol was adopted in which, Mtb was incubated with neutrophils (for 10, 30, and 90 min at 37 °C) and, by differential centrifugation (100 x g 5 min) and lysis of neutrophils with H2O pH 11, the intracellular and extracellular mycobacteria were incubated for 21 days at 37 ° C and, mycobacteria were quantified and results the ensuing reported as number of Colony Forming Units (CFU). Through this protocol, were calculated the phagocytosis (Kp) and intracellular killing (Kk) rates for M. tuberculosis. The possible toxic activity of Tempol was evaluated on neutrophils and, was observed that 500 µM tempol was not cytotoxic. The oxidative burst of neutrophils against Mtb was significantly decreased in the presence of 450 µM Tempol, for all evaluated oxidants (p < 0.05). Treatment of neutrophils with 450 µM Tempol decreased the total microbicidal activity against M. tuberculosis, since colony-forming units of these mycobacteria in the treated group were significantly higher than those for the untreated group (p < 0.05). Strikingly, Tempol (450 µM) decreased the kk of neutrophils, but had no effect on their kp. This study provides insights of the influence of antioxidants on the immune response to M. tuberculosis, so that clinical implications for the prevention and treatment of TB should take into account these findings. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Já foi demonstrado que a aminoguanidina (AG), um conhecido inibidor de AGEs (Produtos Finais de Glicação Avançada), aumenta a atividade de NOX2 (Sistema NADPH oxidase fagocítico) em neutrófilos peritoneais de ratos diabéticos. Experimentos adicionais demonstraram que o mesmo efeito ocorre em neutrófilos de ratos não diabéticos. Visando elucidar o mecanismo e a importância deste aumento de NOX2 pela AG em neutrófilos, utilizou-se um modelo experimental de ratos diabéticos e não diabéticos e um modelo in vitro com neutrófilos humanos isolados de sangue periférico ou HUVEC, uma linhagem de células endoteliais. Para isso, ratos machos Wistar diabéticos e não diabéticos foram tratados ou não por gavagem com AG (100mg/kg/dia) por 50 dias. Os neutrófilos foram recrutados e isolados do peritônio após 4 horas da injeção de caseinato de sódio e foram usados para avaliar a produção de superóxido, ERO e as atividades fagocítica e candicida destas células. No modelo in vitro, neutrófilos isolados de sangue periférico ou HUVEC foram ou não incubados com AG ou Metformina (MET) por 18h em estufa de CO2. O tratamento in vivo com a AG, mostrou aumento na produção de superóxido em comparação com grupos tratados com água, em ambos os grupos, diabéticos e não diabéticos. O aumento de atividade e expressão de NOX2 (p47phox e p67 phox) pela AG aumentou as atividades fagocíticas e candicida de Candida albicans, entretanto este aumento foi menos pronunciado no grupo diabético. Adicionalmente, os resultados demonstram a eficácia do tratamento com a AG na prevenção de glicação de proteínas, reduzindo os níveis de HbA1C e AGEs, além de reduzir os níveis de ureia e manter os níveis de creatinina no soro dos animais. O tratamento com AG reduziu a pressão arterial e a produção de nitratos no soro dos animais, mas a atividade das enzimas antioxidantes foi mantida. Verificou-se que as HUVEC tratadas com AG ou MET no estado basal ou estimuladas com LPS, tiveram menor produção de ERO. Neutrófilos humanos incubados com AG aumentaram a produção de ERO e de superóxido, enquanto o tratamento com MET manteve a produção de ambos. Além disso, o tratamento com AG aumentou a fagocitose e a atividade candicida de neutrófilos humanos nos tempos avaliados. O tratamento de neutrófilos humanos com MET manteve a expressão das subunidades avaliadas e o tratamento com AG aumentou a expressão de gp91phox. A liberação de IL-8 foi diminuída nos neutrófilos humanos tratados com a MET, e a AG aumentou a liberação de IFN-y . Em HUVEC a liberação de IL-8 e INF-y foram mantidas com ambos os tratamentos. Pode-se sugerir que a AG aumentou a atividade e a expressão de NOX2 em neutrófilos humanos e de ratos e que isso contribuiu diretamente para o aumento da atividade microbicida dos neutrófilos. Além disso, nos neutrófilos humanos, o aumento da liberação de IFN-y pode ter contribuído para o aumento da expressão de gp91phox. Adicionalmente, a influência da AG em células em processo de diferenciação para um estado mais maduro pode ser diferente dos seus efeitos in vitro, em células já maduras. / It has been showed that aminoguanidine (AG), a known inhibitor of AGE (Advanced Glycation End Products) increases the activity of NOX2 (phagocyte system NADPH Oxidase) peritoneal neutrophils of diabetic rats. Additional experiments demonstrated that the same effect occurs in non-diabetic rat neutrophils. To elucidate the mechanism and significance of NOX2 increase in neutrophils by AG, it was used an experimental model of diabetic and non-diabetic rats and an in vitro model in which human neutrophils isolated from peripheral blood or HUVEC endothelial cell lineage. For this, Wistar rats diabetic and non-diabetic were treated or not with AG by gavage (100 mg / kg / day) for 50 days. Neutrophils were recruited and isolated from the peritoneum 4h after injection of sodium caseinate and were used to evaluate superoxide generation, ROS and phagocytic and candicida activity of these cells. In vitro model, neutrophils isolated from peripheral blood or HUVEC were incubated or not with AG or Metformin (MET) for 18h in CO2 incubator. In vivo treatment with AG showed an increase in superoxide production compared with groups treated with water, in both groups diabetics and non-diabetics. The increased activity and expression of NOX2 (p47phox and p67phox) by AG increased phagocytic and candicida activity of Candida albicans, however this increase was less pronounced in the diabetic group. Additionally, the results demonstrate the effectiveness of treatment with AG on preventing glycation of proteins, reducing HbA1c and AGEs, in addition to reducing levels of urea and maintain the creatinine levels in serum of animals. The treatment with AG reduced the blood pressure and the production of nitrates and antioxidant enzymes activity were maintained in animals. It was found that HUVEC treated with AG or MET at baseline, or stimulated with LPS had lower production of ROS. Human neutrophils incubated with AG increase ROS and superoxide while treatment with MET remained the production of both. In addition, treatment with AG increased phagocytosis and candicidal activity of human neutrophils at times evaluated. In addition, treatment with AG increased phagocytosis and candicida activity of human neutrophils at times evaluated. The MET treatment maintained the expression of subunits assessed, and treatment with AG caused increased expression of gp91. The release of IL-8 by human neutrophils was decreased by treatment with MET, and AG increased the release of IFN-y The release of IL-8 was reduced in human neutrophils treated with MET, and AG increased IFN-y . In HUVEC the release of IL-8 and IFN-y were maintained with both treatments. It can be suggested that the AG used to inhibit the formation of AGEs increased activity and NOX2 expression in human and rat neutrophils and that directly contributed to the increased microbicidal activity by neutrophils. In addition, the human neutrophils the increased of IFN-y may have contributed to the increased expression of gp91phox. In addition, the influence of AG in cells in differentiation process to more mature state may be different of in vitro effects on cells already mature.

Lee Yiu Fai. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (leaves 178-183). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgements --- p.ii / Abstract --- p.iii / Abstract (Chinese version) --- p.vi / Table of contents --- p.viii / List of Abbreviations --- p.xvi / List of Figures --- p.xviii / List of Tables --- p.xxiv / Chapter Chapter 1 --- INTRODUCTON / Chapter 1.1 --- Cytochrome P450 (P450) --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Cytochrome P450 family --- p.1 / Chapter 1.1.2 --- Role in metabolism --- p.4 / Chapter 1.1.3 --- P450 catalytic cycle --- p.6 / Chapter 1.2 --- NADPH-cytochrome P450 reductase (RED) --- p.6 / Chapter 1.2.1 --- Characterization and distribution --- p.6 / Chapter 1.2.2 --- Structural and functional domains --- p.8 / Chapter 1.2.3 --- Role in P450 catalytic cycle --- p.10 / Chapter 1.3 --- Drug metabolism --- p.10 / Chapter 1.3.1 --- Understanding of drug metabolism is important for drug development --- p.10 / Chapter 1.3.2 --- Role of P450 in drug metabolism --- p.12 / Chapter 1.4 --- Production of RED knockout in vivo mouse model for screening of P450-dependent new drugs --- p.13 / Chapter 1.4.1 --- Background --- p.13 / Chapter 1.4.2 --- Gene targeting --- p.13 / Chapter 1.4.3 --- Gene targeting vector --- p.15 / Chapter 1.4.3.1 --- Classical knockout --- p.15 / Chapter 1.4.3.2 --- Conditional knockout --- p.19 / Chapter 1.4.4 --- Gene knockout mice and its use --- p.21 / Chapter Chapter 2 --- OBJECTIVES --- p.22 / Chapter Chapter 3 --- MATERIALS AND METHODS --- p.24 / Chapter 3.1 --- Preparation of RED cDNA by RT-PCR --- p.24 / Chapter 3.1.1 --- Total RNA isolation --- p.24 / Chapter 3.1.1.1 --- Materials --- p.24 / Chapter 3.1.1.2 --- Methods --- p.24 / Chapter 3.1.2 --- Reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR) --- p.25 / Chapter 3.1.2.1 --- Materials --- p.25 / Chapter 3.1.2.2 --- Methods --- p.25 / Chapter 3.1.3 --- T/A cloning of RED cDNA --- p.28 / Chapter 3.1.3.1 --- Materials --- p.28 / Chapter 3.1.3.2 --- Methods --- p.28 / Chapter 3.1.4 --- Midi-preparation of RED cDNA clone --- p.32 / Chapter 3.1.4.1 --- Materials --- p.33 / Chapter 3.1.4.2 --- Methods --- p.33 / Chapter 3.1.5 --- Confirmation of RED cDNA clone --- p.34 / Chapter 3.1.5.1 --- Restriction enzyme mapping --- p.34 / Chapter 3.1.5.1.1 --- Materials --- p.34 / Chapter 3.1.5.1.2 --- Methods --- p.34 / Chapter 3.1.5.2 --- DNA sequencing of RED cDNA sequence --- p.35 / Chapter 3.1.5.2.1 --- Materials --- p.35 / Chapter 3.1.5.2.2 --- Methods --- p.35 / Chapter 3.1.6 --- Preparation and purification of RED cDNA for probe labeling --- p.38 / Chapter 3.1.6.1 --- Materials --- p.38 / Chapter 3.1.6.2 --- Methods --- p.38 / Chapter 3.1.7 --- Non-radioactive random-primed labeling of RED cDNA --- p.39 / Chapter 3.1.7.1 --- Materials --- p.39 / Chapter 3.1.7.2 --- Methods --- p.39 / Chapter 3.2 --- Isolation of RED gene by genomic library screening --- p.40 / Chapter 3.2.1 --- Titering of genomic library --- p.41 / Chapter 3.2.1.1 --- Materials --- p.41 / Chapter 3.2.1.2 --- Methods --- p.41 / Chapter 3.2.2 --- Primary screening of genomic library by RED cDNA probe --- p.42 / Chapter 3.2.2.1 --- Plaque lift --- p.42 / Chapter 3.2.2.1.1 --- Materials --- p.42 / Chapter 3.2.2.1.2 --- Methods --- p.42 / Chapter 3.2.2.2 --- Proteinase K treatment --- p.43 / Chapter 3.2.2.2.1 --- Materials --- p.43 / Chapter 3.2.2.2.2 --- Methods --- p.43 / Chapter 3.2.2.3 --- "Pre-hybridization, hybridization and detection" --- p.44 / Chapter 3.2.2.3.1 --- Materials --- p.44 / Chapter 3.2.2.3.2 --- Methods --- p.44 / Chapter 3.3 --- Isolation of RED by hybridization screening by Genome System Inc. --- p.45 / Chapter 3.4 --- Characterization of BAC clones containing RED genomic DNA fragments commercially obtained from Genome System Inc. --- p.45 / Chapter 3.4.1 --- Large scale preparation of BAC DNA --- p.45 / Chapter 3.4.1.1 --- Materials --- p.47 / Chapter 3.4.1.2 --- Methods --- p.47 / Chapter 3.4.2 --- Restriction enzyme mappings and Southern blotting analysis of BAC DNA fragments --- p.47 / Chapter 3.4.2.1 --- Materials --- p.48 / Chapter 3.4.2.2 --- Methods --- p.48 / Chapter 3.4.3 --- Shot-gun sub-cloning of RED genomic DNA fragments from BAC clone in pGEM®-3Z vector --- p.49 / Chapter 3.4.3.1 --- Preparation of cloning vector and DNA insert for ligation --- p.50 / Chapter 3.4.3.1.1 --- Materials --- p.50 / Chapter 3.4.3.1.2 --- Methods --- p.50 / Chapter 3.4.3.1.2.1 --- Cloning vectors --- p.50 / Chapter 3.4.3.1.2.2 --- DNA inserts --- p.52 / Chapter 3.4.3.2 --- Preparation of competent cells and transformation --- p.52 / Chapter 3.4.3.2.1 --- Materials --- p.52 / Chapter 3.4.3.2.2 --- Methods --- p.53 / Chapter 3.4.3.3 --- Screening for positive recombinant clones --- p.54 / Chapter 3.4.3.3.1 --- Picking of colonies randomly from the agar plates (method 1) --- p.54 / Chapter 3.4.3.3.1.1 --- Materials --- p.54 / Chapter 3.4.3.3.1.2 --- Methods --- p.54 / Chapter 3.4.3.3.2 --- Colony lifts and hybridization with RED cDNA probes (method 2) --- p.55 / Chapter 3.4.3.3.2.1 --- Materials --- p.55 / Chapter 3.4.3.3.2.2 --- Methods --- p.55 / Chapter 3.5 --- Restriction enzyme mappings and Southern blotting analysis of RED gene subcloned in pGEM®-3Z vector --- p.56 / Chapter 3.5.1 --- Materials --- p.56 / Chapter 3.5.2 --- Methods --- p.56 / Chapter 3.6 --- Exon mappings of the RED genomic DNA fragments by PCR --- p.57 / Chapter 3.6.1 --- Materials --- p.57 / Chapter 3.6.2 --- Methods --- p.57 / Chapter 3.7 --- Construction of gene targeting vector --- p.57 / Chapter 3.7.1 --- Gene targeting vectors la and lb derived from clone H (strategy 1) --- p.60 / Chapter 3.7.1.1 --- Sub-cloning 3.65 kb Hind Ill/Hind III RED gene fragment to pGEM®-3Z vector --- p.60 / Chapter 3.7.1.1.1 --- Materials --- p.62 / Chapter 3.7.1.1.2 --- Methods --- p.62 / Chapter 3.7.1.2 --- Deletion of exonic sequence of RED gene and modification of the digested restriction end to Xho I site --- p.62 / Chapter 3.7.1.2.1 --- Materials --- p.63 / Chapter 3.7.1.2.2 --- Methods --- p.63 / Chapter 3.7.1.3 --- Preparation of neo cassette --- p.63 / Chapter 3.7.1.3.1 --- Materials --- p.64 / Chapter 3.7.1.3.2 --- Methods --- p.64 / Chapter 3.7.1.4 --- Cloning of neo cassette --- p.66 / Chapter 3.7.1.4.1 --- Methods --- p.66 / Chapter 3.7.1.5 --- Sub-cloning the neo cassette containing RED genomic fragment to pMCI-Thymidine kinase (TK) Poly A vector --- p.67 / Chapter 3.7.1.5.1 --- Materials --- p.67 / Chapter 3.7.1.5.2 --- Methods --- p.67 / Chapter 3.7.2 --- "Gene targeting vectors 2a/2b, 3a/3b and 4a derived from clone X8 (strategy 2,3 and 4 respectively)" --- p.67 / Chapter 3.8 --- Preparation and testing the genomic probes for screening recombinant embryonic stem (ES) cells --- p.73 / Chapter 3.8.1 --- Cloning of genomic probes --- p.73 / Chapter 3.8.1.1 --- Materials --- p.73 / Chapter 3.8.1.2 --- Methods --- p.73 / Chapter 3.8.2 --- Purification of DNA for labeling --- p.78 / Chapter 3.8.2.1 --- Materials --- p.78 / Chapter 3.8.2.2 --- Methods --- p.78 / Chapter 3.8.3 --- ECF random prime labeling of genomic probes --- p.79 / Chapter 3.8.3.1 --- Materials --- p.79 / Chapter 3.8.3.2 --- Methods --- p.79 / Chapter 3.8.4 --- Restriction enzyme digestion of genomic DNA and Southern blotting --- p.80 / Chapter 3.8.4.1 --- Materials --- p.80 / Chapter 3.8.4.2 --- Methods --- p.80 / Chapter 3.8.5 --- Testing the specificity of genomic probes --- p.80 / Chapter 3.8.5.1 --- Materials --- p.80 / Chapter 3.8.5.2 --- Methods --- p.80 / Chapter Chapter 4 --- RESULTS --- p.86 / Chapter 4.1 --- Total RNA isolation and RT-PCR of RED cDNAs --- p.86 / Chapter 4.2 --- Confirmation of the RT-PCR RED cDNA clone --- p.86 / Chapter 4.2.1 --- Restriction enzyme mapping --- p.86 / Chapter 4.2.2 --- DNA sequencing --- p.86 / Chapter 4.3 --- Genomic library screening of RED gene --- p.90 / Chapter 4 4 --- Restriction enzyme mappings and Southern blotting analysis of RED Gene containing BAC clone from Genome System Inc. --- p.90 / Chapter 4.5 --- Shot-gun sub-cloning of RED gene containing genomic DNA fragments to pGEM®-3Z vectors --- p.93 / Chapter 4.5.1 --- Cloning of Hind III cut RED gene fragment --- p.93 / Chapter 4.5.2 --- Cloning of Xba I cut RED gene fragment --- p.93 / Chapter 4.5.3 --- Cloning of EcoR I cut RED gene fragment --- p.95 / Chapter 4.6 --- Identification of RED exons in the shot-gun sub-cloning clones by PCR --- p.95 / Chapter 4.7 --- Construction of restriction enzyme maps of the RED gene containing clones --- p.100 / Chapter 4.7.1 --- Clone H --- p.100 / Chapter 4.7.1.1 --- Single restriction enzyme digestions and Southern blotting --- p.100 / Chapter 4.7.1.2 --- Double restriction enzyme digestions and Southern blotting --- p.100 / Chapter 4.7.1.3 --- Restriction enzyme map --- p.101 / Chapter 4.7.2 --- Clone X8 --- p.101 / Chapter 4.7.2.1 --- Single restriction enzyme digestions and Southern blotting --- p.101 / Chapter 4.7.2.2 --- Double restriction enzyme digestion and Southern blotting --- p.104 / Chapter 4.7.2.3 --- Restriction enzyme map --- p.104 / Chapter 4.7.3 --- Clone El4 --- p.105 / Chapter 4.7.3.1 --- Single restriction enzyme digestions and Southern blotting --- p.105 / Chapter 4.7.3.2 --- Double restriction enzyme digestion and Southern blotting --- p.108 / Chapter 4.7.3.3 --- Restriction enzyme map --- p.108 / Chapter 4.8 --- Construction of gene targeting vector --- p.108 / Chapter 4.8.1 --- Gene targeting vector based on the clone H (strategy 1) with deletion of RED exon 16 --- p.113 / Chapter 4.8.1.1 --- Cloning a smaller RED genomic DNA into pGEM®-3Z vectors --- p.113 / Chapter 4.8.1.2 --- Replacement of exon of RED gene by neo cassette --- p.113 / Chapter 4.8.1.3 --- Cloning to TK vector --- p.113 / Chapter 4.8.2 --- Targeting vector based on the clone X8 --- p.124 / Chapter 4.8.2.1 --- Strategy 2 (deletion of RED exon 4) --- p.124 / Chapter 4.8.2.1.1 --- Cloning 3.9 kb Kpn I/Hinc II RED genomic DNA into pGEM®-3Z vectors --- p.124 / Chapter 4.8.2.1.2 --- Replacement of exon of RED gene by neo cassette --- p.124 / Chapter 4.8.2.1.3 --- Cloning to TK vector --- p.124 / Chapter 4.8.2.2 --- Strategy 3 (deletion of RED exon 5-8) --- p.136 / Chapter 4.8.2.2.1 --- Cloning the genomic DNA into pGEM®-3Z vectors --- p.136 / Chapter 4.8.2.2.2 --- Replacement of exon of RED gene by neo cassette --- p.136 / Chapter 4.8.2.2.3 --- Cloning to TK vector --- p.136 / Chapter 4.8.2.3 --- Strategy 4 (deletion of RED exon 7-10) --- p.136 / Chapter 4.8.2.3.1 --- Cloning the genomic DNA into pGEM®-3Z vectors --- p.136 / Chapter 4.8.2.3.2 --- Replacement of exon of RED gene by neo cassette --- p.152 / Chapter 4.8.2.3.3 --- Cloning to TK vector --- p.152 / Chapter 4.9 --- Testing for the specificity of genomic DNA probes --- p.152 / Chapter 4.9.1 --- Preparation of restriction enzyme digested genomic DNA --- p.152 / Chapter 4.9.2 --- Hybridization of the probes to genomic DNA --- p.163 / Chapter Chapter 5 --- DISCUSSION --- p.167 / Chapter 5.1 --- Proposed significant of RED knockout mice for new drug screening --- p.167 / Chapter 5.2 --- Experimental problems --- p.168 / Chapter 5.2.1 --- Genomic library screening --- p.168 / Chapter 5.2.2 --- Cloning --- p.168 / Chapter 5.3 --- RED gene targeting vector construction / Chapter 5.3.1 --- Isolation of RED gene for gene targeting vectors construction --- p.169 / Chapter 5.3.2 --- Deletion of different exons in different RED gene targeting vectors --- p.169 / Chapter 5.3.3 --- Components in the targeting vectors --- p.170 / Chapter 5.3.4 --- Enhancements of homologous recombination --- p.171 / Chapter Chapter 6 --- CONCLUSIONS --- p.173 / Chapter Chapter 7 --- FUTURE STUDIES --- p.175 / Chapter 7.1 --- Identification of the sizes of RED gene introns --- p.175 / Chapter 7.2 --- Production of RED knockout mice --- p.175 / Chapter 7.3 --- Characterization of RED knockout mice --- p.175 / Chapter 7.4 --- Conditional gene knockout for RED gene --- p.177 / REFERENCES --- p.178 / APPENDIX --- p.184

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases. / NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species (ROS) have emerged as critical mediators of several cell functions as diverse as migration, growth, proliferation and survival. Recent evidence has show that NAD(P)H oxidase activity is essential to melanoma proliferation and survival. We reported that NAD(P)H oxidase inhibitor diphenyleneiodonium (DPI) inhibited melanoma growth. NAD(P)H oxidase inhibition induced changes in cell shape with cell spreading decrease, rounding up and detachment. These phenomena were accompanied by rearrangement of actin network and a decrease in both focal adhesion (FAK) phosphorylation in Tyr397 residue and in FAK association to actin and c-Src, indicating that inhibition of ROS generation would down- modulate integrin-mediated signaling, what often results in a particular type of apoptotic cell death, known as anoikis. We observed that NAD(P)H oxidase inhibitor induced apoptosis in melanoma cells with activation of caspase-3. We results show that the effects promoted by NAD(P)H oxidase inhibition on melanoma growth were completely abolished by the pre-treatment of MV3 cells with the protein tyrosine phosphatases inhibitor sodium orthovanadate. In conclusion, our results strongly suggest that ROS generated by NAD(P)H oxidase complex transmit cell survival signals in melanoma cells through the FAK-Src pathway, probably inhibiting protein tyrosine phosphatases.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A nutrição inadequada é um dos principais fatores não-genéticos que afetam o desenvolvimento do encéfalo. O hipocampo é uma estrutura bastante sensível a alterações no aporte nutricional durante o desenvolvimento. No hipocampo a óxido nítrico sintase (ONS) é uma enzima altamente expressa e o óxido nítrico (ON) já foi apontado como tendo papel fundamental na potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), responsáveis pelo processo de memória e aprendizado. Neste trabalho estudamos o efeito da malnutrição no comportamento associado à memória e aprendizado e na distribuição da ONS, através da técnica da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-d). O presente trabalho foi aprovado pelo COMITÊ DE ÉTICA (CEA/055/2009). Foram utilizados ratos Wistar machos, divididos em dois grupos: grupo controle (GC) e grupo malnutrido (GM). A malnutrição se deu através da administração, para a mãe, de uma ração com 0% de proteína durante os 10 primeiros dias de lactação, iniciando-se no dia do nascimento dos filhotes. O GC recebeu ração comercial (22% de proteína). Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P10, P20, P30, P45 e P90 (n=5 para cada idade e grupo estudado), sendo então realizada a histoquímica da NADPH-d para avaliar a distribuição da ONS. A avaliação dos comportamentos associados à ansiedade foi realizada através do labirinto em cruz elevado (LCE), o comportamento associados à busca por novos estímulos foi medida através do campo vazado (CV) e a memória/aprendizado foi avaliada através do labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB) em animais P40 (n=10 para cada grupo) e P90 (n=11 para cada grupo). No GM em P10 observamos maior densidade de células NADPHd+ no giro denteado. Em P20, a marcação para NADPH-d no GM foi menor e esse padrão foi mantido em P30 e P45. No GM em P90 não observamos efeitos da dieta. Em P10, no GM observamos menor número de corpos marcados no stratum pyramidale (SPy). Em P20 o SPy encontrava-se intensamente marcado em ambos os grupos. Em P30 GM observamos maior número de células marcadas no SPy. Entretanto em P45, ambos os grupos apresentaram poucos corpos marcados. Em P90, o GM apresentou mais células marcadas no SPy. Não foram observadas diferenças significativas nas variáveis analisadas para o LCE. O GM em P90 explora maior número de orifícios, tanto na periferia (F=8,1; gl=1; P=0,014) quanto no número total (F=7,5; gl=1; P=0,017). Não foram observadas diferenças significativas para as variáveis analisadas no CV em P40. No teste de memória/aprendizagem foram observadas diferenças significativas entre o GM e o GC na latência de escape no 1 dia de testes em P90 (F=5,2; gl=1; P=0,033), com o GM apresentando melhor desempenho quando comparado ao GC. Esses valores podem ser explicados pela redução da latência para encontrar a plataforma de escape no GM. Não foram observadas diferenças significativas no LAROB em P40. Nossos resultados demonstram que a malnutrição protéica restrita aos 10 primeiros dias da lactação altera a distribuição da NADPH-d no hipocampo. A malnutrição afetou o comportamento dos animais em P40. Por outro lado, em P90 os primeiro dia de teste, sugerindo que o efeito observado está mais associado à novidade do ambiente de teste. / Undernutrition is one of the main epigenetic factors that affect brain development. The hippocampus is a very vulnerable structure that is selectively affected by alterations of food intake during the developmental period. Nitric oxide synthase is an enzyme highly expressed in this structure and nitric oxide has been postulated to have a role in hippocampal LTP and LTD. Here, we evaluated, in rats, the effects of protein malnutrition during the first 10 days of lactation on the distribution of NADPH-diaphorase and on the following behaviors: anxiety, novelty seeking and memory/learning. This study was approved by our University Ethics Committee (CEA/055/2009). Wistar male rats were divided into two groups: control group (CG) and malnourished group (MG). Dams were fed ad libitum with a normoprotein diet (22% protein) during gestation. During the first 10 days of lactation, MG dams received a protein free (0% protein) diet while CG dams received a normoprotein (22%protein) diet. After P10, all dams were fed with a normoprotein diet. On each age studied, P10 until P90 (n=5 for each group), the animals brains were processed histologically and then NADPH-d histochemistry was carried out. Behavioral tests were performed with one male from each litter. Anxiety-like effects were measured in the elevated plus maze (EPM) during 5 min. The time spent in and entries into the open arms were the measured variables. The hole board (HB) was used to assess novelty-seeking (number of nose pokes) for 5 min. Memory and learning were assessed in the 8-arm radial water maze (8-ARWM). The time needed to find a small platform (4 trials/day for 5 consecutive days) submerged in cloudy water was the measured variable. P10 MG animals showed more stained NADPH-d+ cells on the dentate gyrus. At P20, we observed fewer stained cells in MG and this pattern was also observed at P30 and P45. At P90 the staining pattern in the dentate gyrus was similar for both groups. P10 MG animals showed less stained cell bodies in the stratum pyramidale. At P20, the stratum pyramidale in both groups showed intense staining. P30 MG animals showed more stained NADPH-d cells, but, at P45, we observed few stained cells in both groups. Though P90 MG animals presented more stained cells in stratum pyramidale. No differences between groups were observed regarding the anxiety measures. Regarding novelty-seeking, P90 MG animals presented a significantly (ANOVA: P=0.014 and 0,017) higher number of nose pokes that CG ones. No differences were found between groups at P40. As for memory/learning, P90 MG animals had a significantly (P=0.032) reduced latency to find the platform than CG ones in the 8-ARWM. No differences were found between groups at P40. Our results demonstrate that protein malnutrition restricted to the first 10 days of lactation altered the distribution of NADPH-d on hippocampus. The malnourished animals did not display behavioral alterations at P40. Conversely, P90 malnourished animals displayed higher levels of novelty-seeking behavior and a better memory/learning performance, mainly in the first testing day, suggesting that the effect is highly dependent on the novelty of the testing situation.

A fotobiomodulação (PBM) utiliza a luz nas porções do espectro visível e infravermelho para estimular a produção de trifosfato de adenosina (ATP), síntese de ácidos nucleicos, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e proliferação celular, promovendo resultados teraupêuticos benéficos, como a aceleração do reparo tecidual, analgesia e ativação de células do sistema imune. Deste modo, a presente pesquisa visou elucidar os efeitos da PBM sobre monócitos humanos in vitro, a fim de possivelmente estimular o burst oxidativo e, consequentemente, potencializar a defesa imune celular contra micro-organismos, além de analisar a expressão gênica em nível de RNA mensageiro (mRNA) de CD68, CD80, CD163, CD204, IL-6, TNF-α, IL-10 e SOD1 em macrófagos derivados destas células. Neste contexto, culturas primárias de monócitos humanos foram irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (660nm)/ GaAlAs (780nm) - Twin Flex® (MMO, São Carlos, SP, Brasil), operando com potência de 40mW, área de feixe de 0,04cm2, densidade de potência de 1W/cm2 e doses independentes de 200J/cm2, 400J/cm2 e 600J/cm2. Após isto, as células foram submetidas ao ensaio de quimioluminescência para avaliação do burst oxidativo e quantificação da produção de ROS intracelulares e extracelulares. Ensaio da atividade microbicida foi realizado contra o fungo Candida albicans. Como controles positivo e negativo, utilizou-se o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e o diphenyleneiodonium (DPI), respectivamente. A viabilidade celular foi verificada por meio do reagente azul de Trypan. Adicionalmente, os monócitos humanos irradiados foram cultivados por 72 horas, a fim de observar a diferenciação destas células em macrófagos mediante estímulos relacionados a macrófagos ativados pela via clássica (M1) (LPS e Candida albicans) e a macrófagos ativados pela via alternativa (M2) (M-CSF). O RNA total foi extraído de cada grupo experimental e submetido à transcrição reversa e PCR em tempo real. GAPDH foi utilizado como controle endógeno e a expressão relativa de cada gene foi calculada utilizando o método 2-ΔCt. A produção de nitrito (NO2) também foi mensurada através da reação de Griess. Os resultados obtidos foram analisados por ANOVA e teste de Tukey ao nível de significância de 5%. Para dados com variâncias desiguais, utilizou-se o Kruskal-Wallis e pós-teste de Newman-Keuls. Desta forma, os monócitos irradiados apresentaram um aumento significativo na produção de ROS intracelulares e extracelulares comparativamente ao grupo controle (P < 0,001), sendo o comprimento de onda de 660nm e a dose de 400J/cm2, os parâmetros que mais se destacaram (P < 0,001). Como consequência deste perfil funcional elevado dos monócitos irradiados, a capacidade fungicida dos mesmos contra Candida albicans mostrou-se bastante aumentada (P < 0,001). Além disso, observou-se que a PBM (660nm; 400J/cm2) não causou danos à viabilidade celular dos monócitos nos dias subsequentes à irradiação laser. A análise da expressão gênica revelou que a PBM (660nm; 400J/cm2) aumentou significativamente a expressão da citocina pró-inflamatória TNF-α pelos monócitos irradiados (P = 0,0302), aproximando-os de uma resposta imune Th1. Complementarmente, um aumento significativo na produção de NO2 pelos monócitos irradiados também foi observado (P < 0,05). Portanto, a PBM, como empregada neste estudo, foi capaz de aumentar a geração de ROS e NO2, intensificar a atividade microbicida contra Candida albicans e aumentar a expressão de TNF-α, sugerindo uma modulação da PBM na indução de agentes pró-inflamatórios relacionados ao perfil funcional de M1. Vislumbramos em um futuro próximo, a reprodução desses resultados em monócitos humanos in vivo, colaborando no tratamento de candidoses orais, por exemplo. / Photobiomodulation (PBM) comprises the use of light within the visible and infrared spectrum to stimulate the production of adenosine triphosphate (ATP), nucleic acid synthesis, generation of reactive oxygen species (ROS) and cell proliferation, thus promoting beneficial therapeutical results, such as the acceleration of tissue repair, analgesia and activation of cells of the immune system. In that way, the present research aimed to elucidate the effects of PBM on human monocytes in vitro by possibly stimulating the oxidative burst of these cells and, consequently, enhancing the cellular immune defense against microorganisms, in addition to analyzing the gene expression at the messenger RNA (mRNA) level of CD68, CD80, CD163, CD204, IL-6, TNF-α, IL-10 and SOD1 in macrophages derived from these cells. Thus, primary cultures of human monocytes were irradiated with an InGaAlP (660nm)/ GaAlAs (780nm) - Twin Flex® diode laser (MMO, São Carlos, SP, Brazil), operating with power of 40mW, beam area of 0.04cm2, power density of 1W/cm2 and independent doses of 200J/cm2, 400J/cm2 e 600J/cm2. Cells were then submitted to the chemiluminescence assay for oxidative burst evaluation and quantification of intracellular and extracellular ROS production. A microbicidal activity assay was performed against the fungus Candida albicans. As positive and negative controls, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and diphenyleneiodonium (DPI) were used, respectively. Cell viability was verified by Trypan blue reagent. Besides, irradiated human monocytes were cultured for 72 hours in order to observe the differentiation of these cells into macrophages by stimuli related to macrophages activated by the classical pathway (M1) (LPS and Candida albicans) and macrophages activated by the alternative pathway (M2) (M-CSF). Total RNA was extracted from each experimental group and submitted to reverse transcription and real-time PCR. GAPDH was used as endogenous control and the relative expression of each gene was calculated using the 2-ΔCt method. The production of nitrite (NO2) was also measured by the Griess reaction. The results obtained were analyzed by ANOVA and Tukey's test at a significance level of 5%. For data with unequal variances, Kruskal-Wallis and Newman-Keuls post-test were used. In that way, irradiated monocytes presented a significant increase in intracellular and extracellular ROS production compared to the control group (P < 0.001). The wavelength of 660nm and the dose of 400J/cm2 were the most relevant parameters (P < 0.001). As a consequence of this high functional profile of the irradiated monocytes, the fungicidal capacity of the monocytes against Candida albicans was shown to be greatly increased (P < 0.001). In addition, it was observed that PBM (660nm; 400J/cm2) did not cause damage to the cell viability of monocytes in the days following laser irradiation. Analysis of the gene expression revealed that PBM (660nm; 400J/cm2) significantly increased the expression of the proinflammatory cytokine TNF-α by the irradiated monocytes (P = 0.0302), bringing them closer to a Th1 immune response. Additionally, a significant increase in NO2 production by irradiated monocytes was also observed (P < 0.05). Therefore, PBM, as employed in this study, was able to increase ROS and NO2 generation, enhance microbicidal activity against Candida albicans and increase TNF-α expression, suggesting a modulation of PBM in the induction of related pro-inflammatory agents to the functional profile of M1. We envisage in a near future, the reproduction of these results in human monocytes in vivo, which would collaborate to the treatment of oral candidoses, for example. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES