Na primeira parte do estudo camundongos Swiss foram imunizados por diferentes vias de imunização com OMVs de Neissera meningitidis com DDA-BF ou HA como adjuvantes . Os adjuvantes e diferentes vias foram comparados quanto às respostas imunes por meio de ELISA ,Immunoblot ,HTT e análise histopatológica. Os animais imunizados apenas com adjuvantes não produziram títulos de anticorpos. Após única dose e decorridos 15 dias, a imunização com HA e antígeno apresentou títulos de IgG mais altos em relação ao DDA-BF nas vias subcutânea, intraperitoneal e intramuscular. Após 2 doses e 66 dias, todas as vias exibiram títulos de IgG, sendo as que receberam o HA com OMVs produziram títulos discretamente mais altos e ainda altos índices de avidez. O perfil da resposta imune quanto ao padrão Th1/Th2 foi avaliado. Ambos adjuvantes promoveram a produção de IgG2a, as respostas variaram de acordo com as vias de imunização utilizada. Enquanto as vias subcutânea e intramuscular induziram títulos semelhantes de IgG2a para ambos adjuvantes, a via intraperitoneal com DDA teve título mais alto. A produção de IgG1 foi modulada apenas por HA, sendo mais robusta na via subcutânea, seguida pela intramuscular com valores muito próximos aos da intraperitoneal. Camundongos isogênicos Balb/c H2d e C57Bl/6J H2b foram imunizados pela via subcutânea. Foram avaliadas as produções de anticorpos do tipo IgG, IgG1 e IgG2a, bem como o índice de avidez de IgG. De modo geral, os grupos de OMVs HA induziram maior produção de anticorpos que OMVs DDA ou apenas OMVs, enquanto os controles HA, DDA e salina não apresentaram níveis de anticorpos. Pelas técnicas utilizadas no estudo não observamos uma diferença significante entre os dois adjuvantes utilizados independente da via e da linhagem de camundongos utilizados. / In the first part of the study Swiss mice were immunized by different routes of immunization with OMVs of Neisseria meningitidis with DDA-BF or HA as adjuvants. Adjuvants and different routes were compared regarding immune responses through ELISA, Immunoblot, HTT and histopathological analysis. Animals immunized with only adjuvants did not produce evidence of antibodies. After single dose and 15 days, of immunization with HA presented antigen specific IgG higher in relation to the DDa-BF in the subcutaneous, intraperitoneal and intramuscular immunization . After 2 doses and 66 days, all exhibited IgG, and the bonds that received the HA with OMVs produced titles discreetly higher and still high levels of antibodies. The profile of the immune response to Th1/Th2 pattern has been evaluated. Both adjuvants promoted the production of IgG2a, the responses varied according to the immunization routes used. While the subcutaneous and intramuscular routes induced similar titles of IgG2a to both adjuvant intraperitoneal route with had highest title. IgG1 production was modulated only by HA, being more robust in subcutaneous injection, followed by intramuscular with values very close to those of intraperitoneal. Isogenic Balb/c and C57Bl/6J H2d H2b mice were immunized by subcutaneous administration. Been evaluated antibody production of type IgG, IgG1 and IgG2a, as well as the IgG avidity index. In General, the greater production of OMVs HA induced antibodies that OMVs DDA or just OMVs, while the controls .DDA-BF and controls showed no antibody levels. The techniques used in the study did not observe a significant difference between the two adjuvants used independent of the route and of mice strains used.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Neisseria meningitidis é uma das principais causas de meningite bacteriana e septicemia em todo o mundo, acometendo principalmente crianças menores de 4 anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A imunidade protetora contra o meningococo caracteriza-se pela presença e persistência de anticorpos bactericidas, porém pouco se sabe sobre os mecanismos de desenvolvimento desta memória sorológica. Avaliamos em modelo animal e em humanos, a geração e manutenção das células secretoras de anticorpos (ASC) e dos linfócitos B de memória (LBm) após vacinação contra MenB. Utilizamos como referência a vacina diftérica (dT ou DTP), considerada ter ótima eficácia em humanos. Para o estudo em modelo animal, grupos de 6 a 8 camundongos suíços, fêmeas, de 5 a 6 semanas, foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC ou DTP, via intramuscular, com intervalo de 2 semanas entre as doses. Aproximadamente 2, 4 ou 6 meses após a última dose, os animais receberam a dose reforço. A vacina anti-MenB induziu uma resposta primária de ASC maior que a resposta à dose reforço. Ao contrário, a resposta de ASC à vacina dT foi maior após o booster. A resposta de LBm anti-MenB permaneceu constante (média de 1%) ao longo de todo o estudo, mas a resposta ao toxóide diftérico (TD) foi maior após o booster (média de 1,9%) que após a imunização primária. A concentração de IgG, anticorpos bactericidas e opsonizantes contra MenB foi dose-dependente e foi reativada após a administração das doses reforços. Esses resultados sugerem que os LBm presentes no baço foram responsáveis pela forte resposta de anticorpos observada após a dose reforço. Para o TD, ambos ASC e LBm foram importantes na manutenção da memória sorológica. Para o estudo em humanos, seis voluntários foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC, via intramuscular, com intervalo de 6 a 7 semanas entre as doses. Seis meses após a imunização primária, os indivíduos receberam uma dose reforço. Outro grupo de voluntários (n = 5) foi imunizado com uma dose reforço da vacina dT. Somente após a terceira dose da vacina anti-MenB foi possível detectar a presença de LBm em todos os indivíduos. Seis meses após a imunização primária, a frequência de LBm voltou ao seu nível basal e não foi reativada após a dose booster. A vacina dT também induziu uma resposta de LBm heterogênea, mas esta foi 5 vezes maior que a induzida por VA-MENGOC-BC. A resposta de anticorpos funcionais anti-MenB foi de curta duração com pequena reativação após a dose reforço. As duas vacinas induziram diferentes frequências de LT de memória central (TCM) e de memória efetora (TEM) após a vacinação primária e após o booster. A resposta à dose booster foi caracterizada pelo aumento da população de linfócitos TCM e diminuição de TEM. A população de linfócitos TCM apresentou maior ativação (CD69+) que os linfócitos TEM, especialmente após a vacinação contra MenB. Concluindo, os dados desta tese indicam que a administração de 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC teve uma eficiência limitada em humanos e sugerem que a baixa eficácia da vacina, quando utilizada na década de 90 em São Paulo e no Rio de Janeiro, pode estar relacionada à deficiência na geração e manutenção de LBm específicos.

A doença meningocócica (DM) é, ainda hoje, um sério problema de saúde pública, estando associada a elevadas taxas de morbidade e letalidade no mundo. A DM evoca proteção imunológica persistente contra a doença em pessoas com sistema imunológico normal. Em contraste, a proteção induzida por vacinas meningocócicas sempre requer a administração de doses reforço (booster) da vacina. No Brasil, Neisseria meningitidis dos sorogrupos C (MenC) e B (MenB) são as principais causas de DM durante os últimos anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem sido apontada como um fator de risco para a mortalidade da DM. Um dos pilares do tratamento do HIV é a utilização de vacinas para doenças imuno-preveníveis. A vacina conjugada anti-MenC é frequentemente recomendada para crianças e adolescentes infectados pelo HIV no Brasil e em muitos outros países. Poucos estudos têm abordado os mecanismos pelos quais as vacinas meningocócicas geram e sustentam a memória imunológica. Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de linfócito T (LT) CD4 de memória contra o meningococo após a infecção; 2) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de LT CD4 de memória e linfócito B de memória (LBm) contra o meningococo após o booster da vacina cubana VA-MENGOC-BC em voluntários imunizados há aproximadamente 17 anos; 3) investigar a resposta de anticorpos funcionais (bactericidas e opsonizantes) após imunização com a vacina conjugada anti-MenC (CRM197) em indivíduos infectados pelo vírus HIV. Após a infecção, 83% dos pacientes diagnosticados como tendo DM pelo teste de látex e/ou cultura tiveram títulos de anticorpos bactericidas protetores, mas não houve uma associação entre os títulos de anticorpos bactericidas e a concentração de imunoglobulina total específica. Houve aumento na frequência de linfócitos T de memória central (TCM) (mediana de 15%) ativados, principalmente após estímulo com a cepa MenC. Nos voluntários pré-vacinados, 3 de 5 indivíduos soroconverteram 7 ou 14 dias após a administração da dose booster. Houve um aumento importante da população TCM 14 dias após o booster, mas sem ativação celular diferenciada dos grupos controles. Observamos resposta positiva de LBm na maioria dos voluntários, mas sem correlação com os anticorpos bactericidas. Em relação aos pacientes HIV positivos, os resultados mostraram a necessidade de uma segunda dose da vacina, já que apenas 15% soroconverteram a uma única dose e a segunda dose resultou em soroconversão de cerca de 55% dos indivíduos. Observamos correlação positiva (r= 0,43) e significativa (P= 0,0007) entre os anticorpos opsonizantes e bactericidas após a vacinação. Não observamos diferenças significativas quando relacionamos os títulos de anticorpos bactericidas com o número absoluto de LT CD4 P= 0,051) e LT CD4 nadir (P= 0,09) entre os pacientes que soroconverteram (n= 43) ou não soroconverteram (n= 106) após a primeira dose. Desta forma, os resultados desta tese indicaram que: 1) os pacientes convalescentes da DM adquirem anticorpos bactericidas após infecção por N. meningitidis; 2) nos voluntários vacinados, a dose booster da vacina anti-MenB não foi plenamente eficaz em ativar a memória imunológica através da produção de anticorpos bactericidas ou ativação de LTm; 3) os pacientes HIV positivos necessitam de uma dose booster da vacina conjugada anti-MenC. / Meningococcal disease (MD) is still a serious public health problem and is associated with high morbidity and mortality rates worldwide. MD evokes persistent immune protection against disease in people with normal immune systems. In contrast, protection induced by meningococcal always requires booster injections of the vaccine. In Brazil, Neisseria meningitidis serogroup C (MenC) and B (MenB) have been the main causes of MD for the past years. Currently, there is no universal vaccine against serogroup B. HIV infection has been implicated as a risk factor for the mortality of meningococcal disease. One of the cornerstones of HIV treatment is the use of vaccines for immunopreventable diseases. The anti-MenC conjugated vaccine is often recommended for children and adolescents infected with HIV in Brazil and many other countries. Few studies have addressed the mechanisms by which meningococcal vaccines generate and sustain immunological memory. The aims of this study were: 1) to evaluate the response of bactericidal antibody and memory CD4 T lymphocyte against meningococcus after infection; 2) to evaluate the bactericidal antibody response and memory T cells and memory B cells against meningococcal booster after the Cuban vaccine VA-MENGOC-BC in volunteers immunized for about 17 years; 3) to investigate the functional antibody response (bactericidal and opsonizing) after immunization with anti-MenC conjugated vaccine (CRM197) in individuals infected with HIV. After infection, 83% of patients diagnosed as having DM by latex and/or culture test, had protective titers of bactericidal antibodies, but there was no association between the titers of bactericidal antibodies and the total specific immunoglobulin concentration and an increase in frequency of TCM (median of 15%) activated mainly after stimulation with MenC strain. In pre-vaccinated volunteers, 3 of 5 subjects seroconverted 7 or 14 days after administration of the booster dose. There was a significant increase in TCM population 14 days after the booster dose but without differentiated cell activation of control groups. We observed positive response of memory B lymphocyte in most volunteers, but no correlation with bactericidal antibodies. Regarding HIV infected patients, the results showed the need for a second vaccine dose in this population since only about 15% responded to a single dose and second dose resulted in seroconversion in about 55 % of individuals. We observed a positive (r= 0,43) and significant (P= 0,0007) correlation between the opsonizing and bactericidal antibody after vaccination. No significant differences when we relate the titles of bactericidal antibodies with the absolute number of CD4 (P= 0,051) and CD4 nadir (P= 0,09) among patients who seroconverted (n= 43) or not seroconverted (n= 106) after the first dose. Thus, the results indicated that: 1) convalescent patients of DM acquire bactericidal antibodies after infection with N. meningitides; 2) in vaccinated volunteers, the booster dose of anti-MenB vaccine was not fully effective in activating the immune memory by production of bactericidal antibodies or activation of memory CD4 T lymphocyte; 3) HIV-positive patients need a booster dose of the anti-MenC conjugated vaccine.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Neisseria meningitidis é uma das principais causas de meningite bacteriana e septicemia em todo o mundo, acometendo principalmente crianças menores de 4 anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A imunidade protetora contra o meningococo caracteriza-se pela presença e persistência de anticorpos bactericidas, porém pouco se sabe sobre os mecanismos de desenvolvimento desta memória sorológica. Avaliamos em modelo animal e em humanos, a geração e manutenção das células secretoras de anticorpos (ASC) e dos linfócitos B de memória (LBm) após vacinação contra MenB. Utilizamos como referência a vacina diftérica (dT ou DTP), considerada ter ótima eficácia em humanos. Para o estudo em modelo animal, grupos de 6 a 8 camundongos suíços, fêmeas, de 5 a 6 semanas, foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC ou DTP, via intramuscular, com intervalo de 2 semanas entre as doses. Aproximadamente 2, 4 ou 6 meses após a última dose, os animais receberam a dose reforço. A vacina anti-MenB induziu uma resposta primária de ASC maior que a resposta à dose reforço. Ao contrário, a resposta de ASC à vacina dT foi maior após o booster. A resposta de LBm anti-MenB permaneceu constante (média de 1%) ao longo de todo o estudo, mas a resposta ao toxóide diftérico (TD) foi maior após o booster (média de 1,9%) que após a imunização primária. A concentração de IgG, anticorpos bactericidas e opsonizantes contra MenB foi dose-dependente e foi reativada após a administração das doses reforços. Esses resultados sugerem que os LBm presentes no baço foram responsáveis pela forte resposta de anticorpos observada após a dose reforço. Para o TD, ambos ASC e LBm foram importantes na manutenção da memória sorológica. Para o estudo em humanos, seis voluntários foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC, via intramuscular, com intervalo de 6 a 7 semanas entre as doses. Seis meses após a imunização primária, os indivíduos receberam uma dose reforço. Outro grupo de voluntários (n = 5) foi imunizado com uma dose reforço da vacina dT. Somente após a terceira dose da vacina anti-MenB foi possível detectar a presença de LBm em todos os indivíduos. Seis meses após a imunização primária, a frequência de LBm voltou ao seu nível basal e não foi reativada após a dose booster. A vacina dT também induziu uma resposta de LBm heterogênea, mas esta foi 5 vezes maior que a induzida por VA-MENGOC-BC. A resposta de anticorpos funcionais anti-MenB foi de curta duração com pequena reativação após a dose reforço. As duas vacinas induziram diferentes frequências de LT de memória central (TCM) e de memória efetora (TEM) após a vacinação primária e após o booster. A resposta à dose booster foi caracterizada pelo aumento da população de linfócitos TCM e diminuição de TEM. A população de linfócitos TCM apresentou maior ativação (CD69+) que os linfócitos TEM, especialmente após a vacinação contra MenB. Concluindo, os dados desta tese indicam que a administração de 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC teve uma eficiência limitada em humanos e sugerem que a baixa eficácia da vacina, quando utilizada na década de 90 em São Paulo e no Rio de Janeiro, pode estar relacionada à deficiência na geração e manutenção de LBm específicos.

A doença meningocócica (DM) é, ainda hoje, um sério problema de saúde pública, estando associada a elevadas taxas de morbidade e letalidade no mundo. A DM evoca proteção imunológica persistente contra a doença em pessoas com sistema imunológico normal. Em contraste, a proteção induzida por vacinas meningocócicas sempre requer a administração de doses reforço (booster) da vacina. No Brasil, Neisseria meningitidis dos sorogrupos C (MenC) e B (MenB) são as principais causas de DM durante os últimos anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem sido apontada como um fator de risco para a mortalidade da DM. Um dos pilares do tratamento do HIV é a utilização de vacinas para doenças imuno-preveníveis. A vacina conjugada anti-MenC é frequentemente recomendada para crianças e adolescentes infectados pelo HIV no Brasil e em muitos outros países. Poucos estudos têm abordado os mecanismos pelos quais as vacinas meningocócicas geram e sustentam a memória imunológica. Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de linfócito T (LT) CD4 de memória contra o meningococo após a infecção; 2) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de LT CD4 de memória e linfócito B de memória (LBm) contra o meningococo após o booster da vacina cubana VA-MENGOC-BC em voluntários imunizados há aproximadamente 17 anos; 3) investigar a resposta de anticorpos funcionais (bactericidas e opsonizantes) após imunização com a vacina conjugada anti-MenC (CRM197) em indivíduos infectados pelo vírus HIV. Após a infecção, 83% dos pacientes diagnosticados como tendo DM pelo teste de látex e/ou cultura tiveram títulos de anticorpos bactericidas protetores, mas não houve uma associação entre os títulos de anticorpos bactericidas e a concentração de imunoglobulina total específica. Houve aumento na frequência de linfócitos T de memória central (TCM) (mediana de 15%) ativados, principalmente após estímulo com a cepa MenC. Nos voluntários pré-vacinados, 3 de 5 indivíduos soroconverteram 7 ou 14 dias após a administração da dose booster. Houve um aumento importante da população TCM 14 dias após o booster, mas sem ativação celular diferenciada dos grupos controles. Observamos resposta positiva de LBm na maioria dos voluntários, mas sem correlação com os anticorpos bactericidas. Em relação aos pacientes HIV positivos, os resultados mostraram a necessidade de uma segunda dose da vacina, já que apenas 15% soroconverteram a uma única dose e a segunda dose resultou em soroconversão de cerca de 55% dos indivíduos. Observamos correlação positiva (r= 0,43) e significativa (P= 0,0007) entre os anticorpos opsonizantes e bactericidas após a vacinação. Não observamos diferenças significativas quando relacionamos os títulos de anticorpos bactericidas com o número absoluto de LT CD4 P= 0,051) e LT CD4 nadir (P= 0,09) entre os pacientes que soroconverteram (n= 43) ou não soroconverteram (n= 106) após a primeira dose. Desta forma, os resultados desta tese indicaram que: 1) os pacientes convalescentes da DM adquirem anticorpos bactericidas após infecção por N. meningitidis; 2) nos voluntários vacinados, a dose booster da vacina anti-MenB não foi plenamente eficaz em ativar a memória imunológica através da produção de anticorpos bactericidas ou ativação de LTm; 3) os pacientes HIV positivos necessitam de uma dose booster da vacina conjugada anti-MenC. / Meningococcal disease (MD) is still a serious public health problem and is associated with high morbidity and mortality rates worldwide. MD evokes persistent immune protection against disease in people with normal immune systems. In contrast, protection induced by meningococcal always requires booster injections of the vaccine. In Brazil, Neisseria meningitidis serogroup C (MenC) and B (MenB) have been the main causes of MD for the past years. Currently, there is no universal vaccine against serogroup B. HIV infection has been implicated as a risk factor for the mortality of meningococcal disease. One of the cornerstones of HIV treatment is the use of vaccines for immunopreventable diseases. The anti-MenC conjugated vaccine is often recommended for children and adolescents infected with HIV in Brazil and many other countries. Few studies have addressed the mechanisms by which meningococcal vaccines generate and sustain immunological memory. The aims of this study were: 1) to evaluate the response of bactericidal antibody and memory CD4 T lymphocyte against meningococcus after infection; 2) to evaluate the bactericidal antibody response and memory T cells and memory B cells against meningococcal booster after the Cuban vaccine VA-MENGOC-BC in volunteers immunized for about 17 years; 3) to investigate the functional antibody response (bactericidal and opsonizing) after immunization with anti-MenC conjugated vaccine (CRM197) in individuals infected with HIV. After infection, 83% of patients diagnosed as having DM by latex and/or culture test, had protective titers of bactericidal antibodies, but there was no association between the titers of bactericidal antibodies and the total specific immunoglobulin concentration and an increase in frequency of TCM (median of 15%) activated mainly after stimulation with MenC strain. In pre-vaccinated volunteers, 3 of 5 subjects seroconverted 7 or 14 days after administration of the booster dose. There was a significant increase in TCM population 14 days after the booster dose but without differentiated cell activation of control groups. We observed positive response of memory B lymphocyte in most volunteers, but no correlation with bactericidal antibodies. Regarding HIV infected patients, the results showed the need for a second vaccine dose in this population since only about 15% responded to a single dose and second dose resulted in seroconversion in about 55 % of individuals. We observed a positive (r= 0,43) and significant (P= 0,0007) correlation between the opsonizing and bactericidal antibody after vaccination. No significant differences when we relate the titles of bactericidal antibodies with the absolute number of CD4 (P= 0,051) and CD4 nadir (P= 0,09) among patients who seroconverted (n= 43) or not seroconverted (n= 106) after the first dose. Thus, the results indicated that: 1) convalescent patients of DM acquire bactericidal antibodies after infection with N. meningitides; 2) in vaccinated volunteers, the booster dose of anti-MenB vaccine was not fully effective in activating the immune memory by production of bactericidal antibodies or activation of memory CD4 T lymphocyte; 3) HIV-positive patients need a booster dose of the anti-MenC conjugated vaccine.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:59:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_AliceTavaresReis_M.pdf: 3292132 bytes, checksum: ee5318f5b87992964c9d97bedc343f00 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Em 1998, foi relatada a transferência lateral do gene sodC do gênero Haemophilus para a espécie Neisseria meningitidis. Sabe-se que, nestes dois grupos a dinâmica deste gene é bastante distinta. Este trabalho tem por objetivo estimar árvores filogenéticas que possam apontar qual a espécie do gênero Haemophilus compartilhou o gene sodC com a espécie N. meningitidis. Testes de seleção positiva foram empregados no intuito de avaliar quais forças evolutivas estão subjacentes ao processo de diversificação molecular do gene nestas espécies ao longo do tempo. Além disso, foi realizada uma modelagem protéica computacional por homogia para avaliar quais substituições de aminoácidos tinham impacto no processo adaptativo da enzima nas espécies consideradas. Ao se reconstruir uma filogenia para o gene sodC, foi constatado que a origem deste gene na espécie H. influenzae é distinta. Um grupo de linhagens recebeu o gene, provavelmente por transferência lateral, da espécie H. haemolyticus, enquanto o outro grupo recebeu o gene da espécie H. parainfluenzae. Neste grupo, o gene sofreu pseudogeneização. Foi observado também que as sequências de N. meningitidis agrupam com as sequências que compartilham um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, porém as sequências do meningococo formam um ramo distinto dentro deste clado. Dada à alta clonalidade das sequências de N. meningitidis, foi constatado que o evento de transferência lateral de genes foi muito recente na escala do tempo. O teste de seleção positiva demonstrou que seleção positiva está atuando especificamente no ramo da árvore que compartilha um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, através da modificação de uma alanina por uma serina na posição 72, embora a nota geral da árvore tenha sido menor que 1. Sabe-se que pseudogenes, por não codificarem uma proteína ativa e, portanto, por não estarem sob nenhum tipo de restrição funcional, estão sob uma ação maior da deriva genética. Portanto, diferentes forças evolutivas estão governando a evolução deste gene nas espécies consideradas. A modelagem protéica concluiu que tal modificação contribuiu para o aumento do potencial redox do sítio ativo. Desta forma, a ação da seleção positiva sob um único resíduo de aminoácido foi benéfica para a função da enzima como um todo / Abstract: In 1998, it was reported the lateral transfer of the sodC gene from the genus Haemophilus to Neisseria meningitidis. It is known that this two groups show a quite distinct dynamics of this gene. This study aims to estimate phylogenetic trees that might point to which species of the genus Haemophilus shared the sodC gene with N. meningitidis. In addition, tests of positive selection were employed in order to assess which evolutionary forces are governing the process of molecular diversification of the gene in these species through time. Moreover, we performed a computational protein modeling by homology to asses which amino acids substitutions had an impact on the adaptative process of the enzyme in the species considered. A phylogeny of the sodC gene was reconstructed and it was found that this gene in H. influenzae has two different origins. A group of lineages has received the gene, probably by lateral transfer, from H. haemolyticus, whereas the other group has received the gene from H. parainfluenzae. In the latter, the gene has become a pseudogene. It was also observed that the sequences from N. meningitides group together with those sequences that share a common ancestor with H. haemolyticus, but they form a distinct branch within this clade. Given the high clonality of the sequences from N. meningitidis, it was found that the lateral gene transfer event is very recent in the time scale. A test of positive selection showed that positive selection is acting specifically in the branch that shares a common ancestor with H. haemolyticus through the substitution of an alanine to a serine at position 72, though the overall score of the tree is less than one. It is known that pseudogenes do not encode active proteins and therefore they are not under any kind of functional constraints, so they are under greater influence of genetic drift. Thus, it was concluded that different forces are driving the evolution of this gene in the species considered here. Protein modeling concluded that this modification contributed to the increase in the redox potencial of the active site. Thus the action of positive selection under a single amino acid residue was beneficial to the function of the enzyme as whole / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Les infections bactériennes touchant la circulation sanguine conduisent à un vaste éventail de graves pathologies, comme les chocs septiques ou les infections locales (endocardites et méningites). Neisseria meningitidis colonise avec succès l’endothélium vasculaire et cause des sepsis sévères. Ces infections résultent de la colonisation des cellules endothéliales de l’hôte, étape clef de la pathophysiologie à laquelle les travaux présentés dans ce manuscrit se sont intéressés. La colonisation de l’endothélium par N. meningitidis est un processus complexe qui implique l’adhésion et la multiplication des bactéries à la surface des cellules endothéliales dans le contexte particulier de la circulation sanguine, où des forces mécaniques sont générées par le flux sanguin sur les objets circulants. Bien que de nombreuses études se soient intéressées à l’interaction entre les cellules endothéliales et N. meningitidis, plusieurs aspects demeurent incertains comme par exemple l’impact des contraintes générées par le flux sanguin et la participation relative des deux partenaires de l’interaction dans la colonisation de l’endothélium par N. meningitidis.L’adhésion de la bactérie à la surface des cellules endothéliales est dépendante de facteurs bactériens (les pili de type IV, PT4) et induit une réponse de la part de la cellule hôte, qui se traduit par un remodelage de la membrane plasmique et une réorganisation du cytosquelette d’actine sous les microcolonies. Dans un premier temps, ces travaux de thèse montrent que la réponse cellulaire induite par N. meningitidis participe activement à la colonisation. En effet, la formation de projections membranaires permet à chaque bactérie de la microcolonie d’établir des contacts avec la cellule hôte, nécessaires à la résistance des microcolonies face aux forces mécaniques générées par le flux sanguin. De plus, nous montrons que la protéine PilV, composant des PT4, est impliquée dans le remaniement de la membrane plasmique et la réorganisation du cytosquelette. Nous avons développé une méthode combinant vidéo-microscopie et analyse de fluorescence pour décrypter les événements précoces prenant place lors du contact entre les bactéries et la surface des cellules hôtes. Nous avons alors montré que le remodelage de la membrane induit par N. meningitidis ne dépend pas de la réorganisation du cytosquelette d’actine au site d’infection mais plutôt des propriétés intrinsèques de la bicouche lipidique.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux étapes tardives de l’infection, c'est-à-dire à l’initiation d’un nouveau cycle de colonisation. Bien que solidement ancrées à la surface des cellules par l’intermédiaire des projections membranaires, quelques bactéries se détachent des microcolonies pour coloniser des nouveaux sites au sein de l’hôte. Nous avons démontré l’importance de modifications post-traductionnelles de la piline majeure dans cette étape de l’infection et caractérisé les mécanismes impliqués.Cette étude a permis d’affiner les mécanismes impliqués dans l’induction de la réponse cellulaire induite par N. meningitidis et son impact sur la colonisation efficace de l’endothélium par ce pathogène. / Bacterial infections targeting the bloodstream lead to a wide array of severe clinical manifestations, such as septic shock or focal infections (endocarditis and meningitis). Neisseria meningitidis colonizes successfully the vascular wall and causes severe sepsis. Such infections result from an efficient colonization of host endothelial cells, a key step in meningococcal diseases which has been the subject of the work presented here. Endothelium colonization by N. meningitidis is a complex process implying bacterial adhesion and multiplication on the endothelial cell surface in the specific context of the bloodstream, where mechanical forces generated by the blood flow are applied on circulating bacteria. Even though many studies focused on the interaction between N. meningitidis and the endothelial cell, many aspects remain elusive, such as the impact of shear stress generated drag forces and the relative contribution of the two partners involved in this interaction.Adhesion to the endothelial cell surface is dependent on bacterial factors called type IV pili (Tfp) and leads to induction of a host cell response, characterized by a local remodeling of the plasma membrane and reorganization of actin cytoskeleton underneath bacterial microcolonies. First, we have shown that the cellular response induced by N. meningitidis actively participate in the colonization process. Indeed, membrane deformation allows contact with every bacterium inside the microcolony, which is necessary for microcolony resistance to mechanical forces. Additionally, we have demonstrated that the PilV protein, a Tfp component, is involved in plasma membrane remodeling and actin cytoskeleton reorganization. We designed a method combining high resolution live-cell fluorescence video-microscopy and fluorescence quantification to decipher the early events induced on contact of bacterial aggregates with the host cell surface. Using this technique we have shown that membrane remodeling does not rely on actin cytoskeleton reorganization but rather on intrinsic properties of the lipid bilayer. Second, we focused on latter steps of the infection process when initiation of a new colonization cycle is initiated. While firmly attached to the host cell surface through the membranous projections, some bacteria can detach from the microcolony to disseminate throughout the host. We have demonstrated the importance of post-translational modification of the major piline in this step and characterized the underlying mechanisms.This work allows refinement of the molecular mechanisms involved in the induction of the cellular response induced by N. meningitidis and its impact on successful endothelium colonization by this pathogen.

Les pili de type IV (PT4), certainement les organelles les plus répandues des bactéries à Gram-négatif, sont des machineries à multiples fonctions qui jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de nombreux pathogènes humains, notamment notre modèle Neisseria meningitidis. L’assemblage des PT4 nécessite une machinerie complexe incluant au moins vingt protéines localisées dans la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. Certaines de ces protéines ne sont pas nécessaires pour la biosynthèse des PT4, mais supportent les fonctions qui leur sont associées. Ces protéines, appelées pilines mineures, sont au nombre de trois. Par l’analyse phénotypique des mutants dans les gènes codant pour les pilines mineures, le rôle de chacune a pu être déterminée. Ainsi la piline mineure ComP est nécessaire pour la compétence pour la transformation d’ADN, PilV est requise pour la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte et PilX est essentielle pour l’adhésion des bactéries sur les cellules épithéliales et endothéliales, la formation d’agrégats bactériens et la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte. De nombreuses similarités avec la piline majoritaire laissent penser que les pilines mineures s’insèrent dans la fibre des PT4 pour exercer leurs fonctions, bien que ceci n’a jamais été démontré. Si on connait bien les fonctions des pilines mineures, leur mode d’action n’est toujours pas compris. L’objectif global de ce travail de thèse a été de comprendre comment une fibre protéique peut assurer une diversité de fonctions aussi importante. Pour y parvenir, l’étude du mode d’action des pilines mineures a été entreprise. Contrairement à ce qui prévalait dans le modèle dominant, les pilines mineures PilV et PilX exercent leur fonction à partir de l’espace périplasmique pour moduler la quantité de pili exprimés en surface. En effet, les mutants pilV et pilX présentent respectivement des défauts de piliation de l’ordre de 39% et de 63% par rapport à la souche sauvage. Ces défauts expliquent cependant les phénotypes des mutants. En effet, l’ensemble des fonctions dépendantes des PT4 nécessite une forte quantité de PT4, soit au moins 40% pour l’agrégation et l’adhésion et 70% pour le déclenchement de la réponse cellulaire. Ces résultats révèlent que les pilines mineures sont impliquées dans la biogenèse des PT4 plutôt que dans le support biochimique direct de leurs propriétés. Le défaut de piliation de ces mutants est restauré par l’absence de rétraction, indiquant que les pilines mineures PilV et PilX jouent un rôle dans la stabilité des PT4. Nous avons également montré que la piline mineure ComP est nécessaire pour la piliation et qu’elle présente une fonction redondante avec la piline mineure PilV. Afin de comprendre comment les pilines mineures PilV et PilX exercent leur rôle sur la quantité de pili exprimés en surface, nous avons réalisé une étude structure/fonction de ces deux protéines. Nous avons observé une absence de piliation, en bloquant les pilines PilV et PilX dans la membrane interne, indiquant une interaction directe avec la machinerie des PT4 probablement via la piline majeure PilE. Nous avons également montré qu’il existe une interaction entre les pilines mineures et PilE au niveau de la membrane interne et en amont de l’assemblage des pili. Ces résultats, obtenus par une technique de pontage disulfure, ont cependant besoin d’être confirmés par des contrôles supplémentaires. Par une stratégie de mutagenèse, nous avons enfin mis en évidence que la région D de PilV et les boucles α/β et β2/β3 de PilX sont nécessaires à leur fonctionnement. Ces travaux ont permis de montrer que la quantité de pili exprimés par la bactérie est un facteur déterminant pour définir les propriétés des PT4. Les pilines mineures agissent au niveau du périplasme pour promouvoir la biosynthèse des pili, ce qui met en avant le rôle direct de la piline majeure PilE dans les fonctions associées aux PT4. / Type IV Pili (TFP) are widespread filamentous organelles extending from the surface of many Gram-negative bacteria that mediate multiple functions and play a key role in the pathogenesis of several important human pathogens, including our model, Neisseria meningitidis. The assembly of TFP requires a complex machinery composed by at least twenty proteins that are localized in the inner membrane, the outer membrane and the periplasm. Three of these proteins, called minor pilins, are not required for the biosynthesis of the TFP, but support their functions. Based on the phenotypes associated with the mutants, their role on TFP functions has been determined. The minor pilin Comp is required for natural competence for DNA transformation, PilV is required for the deformation of the host cell plasma membrane and PilX is essential for the adhesion of bacteria to epithelial and endothelial cells, the bacterial aggregation and the deformation of the host cell plasma membrane. Many similarities with the major pilin PilE suggests that minor pilin are inserted into the fiber of TFP to exert their functions, although it has never been demonstrated. How these proteins carry out their functions mechanistically is not elucidated. The general objective of this thesis was to understand how a single fiber can provide such a variety of functions. To achieve this, the study of the mode of action of minor pilins was undertaken. Contrarily to what has been previously proposed, the PilV and PilX minor pilins seem to exert their functions from the periplasmic space to modulate the amount of surface exposed pili. Indeed, pilV and pilX strains show piliation defects of 39 % and 63 % respectively compared to the wild type. Besides, we have shown that TFP functions require a large amount of TFP, at least 40 % for the aggregation and adhesion and 70% to induce the reorganization of the plasma membrane. Thus these modest decreases in the amount of pili explain the phenotypes of these mutants. These results indicate that the minor pilins are involved in the biogenesis of TFP rather than in the direct support of their biochemical properties. Moreover, the piliation defect of these mutants is restored in the absence of retraction, indicating that the PilV and PilX minor pilins play a role in the stability of TFP. To understand how PilV and PilX minor pilins modulate surface exposed pili level, we performed a structure/ function analysis of these two proteins. Blocking the PilV and PilX minor pilins in the inner membrane abolishes piliation, indicating a direct interaction with the machinery of TFP, probably via the major pilin PilE. We have also shown that an interaction between the minor pilins and the major pilin occurs in the inner membrane and upstream of the pilus assembly. However, these results, obtained by biochemical techniques, need to be confirmed by additional controls. By a mutagenesis strategy, we finally demonstrated that the D region of PilV and the α/β and β2/β3 loops of PilX are necessary for their functions. This study has shown that a relatively modest decrease in the amount of pili displayed on the bacterial surface leads to a strong effect on the functions carried by TFP. Minor pilins act in the periplasm to promote the biosynthesis of pili, which highlights the direct role of the major pilin in the TFP-dependent functions.

Cette thèse issue d'une collaboration entre l'Université Lyon 1 et Sanofi Pasteur (SP) porte sur l'étude du procédé de dépolymérisation et d'activation d'un polyoside capsulaire. Cette réaction est la première étape du couplage d'un vaccin (Menactra®) antiméningococcique conjugué (polyoside du méningocoque de groupe C conjugué à l'anatoxine diphtérique). L'objectif de ce travail, réalisé dans le cadre d'un programme d'amélioration de la conformité et de la robustesse des procédés de SP, est la compréhension du mécanisme et l'optimisation des paramètres clés de cette réaction. Le procédé de couplage de ce vaccin tel qu'il est décrit par SP comporte 3 étapes clés : la dépolymérisation/activation du polyoside par le peroxyde d'hydrogène, la dérivatisation par un "linker" et le greffage à la protéine. Si les 2 dernières étapes sont des réactions chimiques bien connues, la première qui permet, à la fois de réduire la masse molaire du polyoside et de générer des groupements réducteurs, est plus obscure. Une stratégie a été élaborée afin de comprendre cette réaction. Dans un premier temps, l'étude poussée du procédé a permis d'identifier les paramètres impactant la cinétique de dépolymérisation et l'activité réductrice. Ensuite, l'analyse structurale, par diverses techniques, du polyoside dépolymérisé a confirmé l'activation. Enfin, la caractérisation de modifications chimiques de macromolécules étant relativement complexe, de plus petits modèles (monomère, tétramère) ont été utilisés et ont permis d'établir un mécanisme réactionnel de la dépolymérisation du polyoside. A partir de ces résultats, plusieurs solutions ont été proposées à l'industriel pour améliorer le rendement et/ou la robustesse du procédé / This PhD work, initiated by Sanofi Pasteur in collaboration with the University of Lyon 1, concerns the study of the Menactra® vaccine, a glycoconjugate vaccine produced by covalently coupling Neisseria meningitidis serogroups A, C, W135, Y capsular polysaccharides to diphtheria toxoid. The objective was to better understand the chemistry involved in the conjugation process of the vaccine, in order to improve the process robustness and the overall conjugated yields with particular emphasis on the serogroup C. The conjugation process can be divided into 3 key steps: depolymerization/activation by hydrogen peroxide, derivatization, and conjugation. While the 2 last steps of the process are well known in bioconjugation chemistry, the exact mechanism of the first step, which serves 2 purposes, first to reduce the polysaccharide molecular weight and second, to generate the reducing groups on the polysaccharide chain, is poorly understood. An overall strategy for the characterization of the serogroup C polysaccharide depolymerization process was successfully applied to understand this reaction. We first provided a process description of this step, identified and optimized the key process parameters. Then, the structural comparison of the polysaccharide before and after the depolymerization obtained with specified analytical methods gave important information on the mechanism. Finally, well defined sialic and tetrasialic acids were reacted with H2O2 to complete the elucidation of this complex mechanism. From these results, several solutions were proposed to the industrial to improve the yield and the robustness

Neisseria meningitidis é um diplococo Gramnegativo, aeróbio e encapsulado, causador mais comum de meningite e septicemia. Este agente é o principal causador de infecções bacterianas invasivas no mundo. Apesar de existirem 13 sorogrupos de N. meningitidis, apenas 6 são capazes de causar infecção: A, B, C, W135, X e Y. O sorogrupo B difere dos outros sorogrupos patogênicos por sua cápsula polissacáride ter composição idêntica ao ácido policiálico, presente em muitas glicoproteínas humanas, particularmente encontrados no tecido cerebral fetal, e bioquimicamente homóloga com a estrutura molecular de adesão do neurônio. Sendo assim, a cápsula polissacáride não pode ser usada em vacinas conjugadas, pois pode causar autoimunidade, sendo pouco imunogênica. Doenças meningocócicas causadas pelos sorogrupos A, C, Y e W135 podem ser prevenidas pelas vacinas que contêm polissacarídeos capsulares específicos conjugados. Para que uma vacina seja eficaz contra o sorogrupo B, é importante que esta abranja todos os sorotipos e seja capaz de promover imunidade duradoura, principalmente em crianças abaixo de dois anos, as mais acometidas. Vacinas baseadas em vesículas de membrana externa (OMVs, do inglês Outer Membrane Vesicles) de N. meningitidis B são amplamente estudadas. No presente estudo, OMVs de meningococo B (B:4:P1.9) foram associadas a um lipídio catiônico, o dioctadecildimetilamônio (DDA-BF) em preparação antigênica testada em camundongos fêmeas não isogênicos, e comparamos os títulos de anticorpos IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b com os anticorpos produzidos por camundongos imunizados com a mesma OMVS associada ao hidróxido de alumínio, por ELISA. As análises foram realizadas com soros de cada animal colhidos individualmente, após 60 dias de imunização. A avidez dos anticorpos também foi analisada por ELISA. Immunoblot e Dot-ELISA avaliaram a reação específica entre a cepa homóloga usada na imunização e a reação a antígenos cruzados com outras cepas de meningococo. A hipersensibilidade tardia (HTT) foi comparada entre os dois grupos experimentais, após o desafio com cepa homóloga em uma das patas, depois de 24 horas da injeção, após 14 dias da primeira dose de imunização. / Neisseria meningitidis is an encapsulated Gram-negative aerobic diplococcus, the most commom meningitidis and sepsis agent , and the major bacterial invasive disease agent worldwide. Infections are caused by only 6 of 13 pathogenic serogroups: A,B,C, W135 and Y. Meningococcal serogroup B differs from the other pathogenic serogroups because it has a capsular polysaccharide identical to the polysialic acid present in many human glycoproteins, in particular, it is similar to carbohydrates found in fetal brain tissue. This is the reason that it does not allow the use of polysaccharide protein in conjugate vaccine, and for its low immunogenic. An effective meningococcal B vaccine development should cover all serotypes and be able to promote long term immunity, mainly in children under 2 years, the most affected age. Meningococcal outer membrane vesicles (OMVs) vaccines are widely studied. In this present study, meningococcal serogroup B OMVs (B:4:P1.9) was associated with a cationic lipid, dioctadecyldimetylammonium (DDA-BF) in an antigenic preparation tested in female outbred mice. Individual serum was collected, and antibodies titles IgG, IgG1, IgG2a were compared with animals immunized with OMVs and aluminium hydroxide, analyzed by ELISA. Analyses were carried out 60 days after first immunization. Antibodies avidity index were also analyzed by ELISA. Immunoblot and Dot-ELISA were carried out to evaluate specific reaction for homologous stranis and cross-reactive antigens present in other meningococcal strains. Delayed type hypersensitivity (DTH) was compared between two experimental groups, 24 hours before injection of homologous strain challenge.