A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.

Introdução. O complexo amigdalianohumano é formado por diversos núcleos. Pouco se sabe sobre núcleo cortical da amigdala, o qual faz parte da denominada amígdala vomeronasal. Pouco é conhecido de seus componentes celulares, suas conexões e funções em seres humanos até o momento. Objetivos. Descrever os componentes neuronais presentes no núcleo cortical da amígdala humana, buscando obter dados sobre sua morfologia, caracterizando-os pelo formato do soma, número de dentritos primários e padrão de ramificação, além da presença, distribuição, densidade e forma dos espinhos dendríticos locais. Materiais e métodos. Foram estudadas peças anatômicas do lobo temporal de muitos hemisférios cerebrais obtidas de homens adultos post-mortem (N= 8, 47-68 anos) e submetidas à técnica de tionina, à técnica de imunohistoquimica para a proteína ácida fibrilar glial e à técnica de Golgi adaptada para o tecido humano fixado em formol a 10% por longa data. A obtenção de imagens foi realizada empregando-se microscópio de luz acoplada a computador com programa de análise de imagem (image-Pro Plus 7.0). Para a elaboração das imagens dos neurônios e sua forma geral bidimensional foi utilizado o programa Adobe Photoshop CS3 (EUA). Para a reconstrução tridimensional dos espinhos dendríticos foi desenvolvido algorítmo de processamento de imagens. Resultados Foram observados astrócitos protoplasmáticos e identificadas 10 formas neuronais diferentes no núcleo cortical da amigdala humana, a saber: neurônios piramidal modificado (pyramidal-like), fusiforme, angular-esférico, triangular, retangular, poligonal-estrelado, redondo-cônico, pear shaped, fork-like e "pequeno". Espinhos com formato fino (thin), achatado (stubby), espesso (wide), de tipo cogumelo (mushroom), ramificado (ramified), atípico ou de transição (atypical or trasitional) foram observados em todos os neurônios estudados, guardadas particularidades de ramificação dedrítica de cada um deles. Conclusão. O núcleo cortical da amígdala humana apresenta neurônios tipo piramidal-like. Isso lhe confere características de área de transição para o alocórtex e de área de surgimento evolutivo de tais neurônios no continuum subcortical-alocórtex-neocórtex. Muito importante toda a diversificada celularidade encontrada neste núcleo pode significar que esta região desempenhe múltiplas funções de integração e processamento de informações em seres humanos.

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T01:57:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MariaFernandadeAndrade_M.pdf: 2919034 bytes, checksum: c3f7796b55fb5ad53b9eaf2ee58536d5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas AMPK e mTOR são as principais moduladoras do balanço energético intracelular, e exercem influência decisiva sobre a ação hipotalâmica da leptina. O exercício agudo, através da produção de IL-6, está associado ao aumento da sensibilidade à ação anorexigênica da leptina. Visando investigar a possível influência das vias AMPK e mTOR, neste aumento da sensibilidade hipotalâmica à leptina induzido pelo exercício agudo, ratos Wistar foram submetidos à natação e posteriormente receberam injeção intracerebroventricular de IL-6, ativadores e/ou inibidores da AMPK e mTOR. A IL-6 reduziu a ingestão alimentar dos animais não exercitados; no entanto, o pré-tratamento com ativador da AMPK ou inibidor da mTOR bloqueou esta ação da IL-6. Ativadores da AMPK aumentaram a ingestão alimentar de forma mais significativa nos animais não exercitados. Inibidores da AMPK reduziram a ingestão mais expressivamente nos animais exercitados. A injeção central de leptina reduziu a ingestão de ratos exercitados mais expressivamente do que foi observado nos animais controle. Tanto o pré-tratamento com inibidor da IL-6, como com ativador da AMPK ou inibidor da mTOR, reverteram esta ação da leptina. O exercício também está associado à redução da fosforilação da via da AMPK e à maior fosforilação da via da mTOR, no hipotálamo. A da resposta das vias em questão ao estímulo com leptina provavelmente seja um dos principais determinantes da modulação do set point hipotalâmico pelo exercício agudo / Abstract: AMP-activated protein kinase (AMPK) and mammalian Target of Rapamycin (mTOR) are key regulators of cellular energy balance and of the effects of leptin on food intake. Acute exerci se is associated with increased sensitivity to the effects of leptin on food intake in an IL-6-dependent manner. To determine whether exerci se ameliorates the AMPK and mTOR response to leptin in the hypothalamus in an IL-6-dependent manner, rats performed two 3-h exercise bouts, separated by one 45-min rest períod. Intracerebroventrícular IL-6 infusion reduced food intake and pretreatment with AMPK activators and mTOR inhibitors prevented IL-6-induced anorexia. Activators of AMPK increased food intake in control rats to a greater extent than that observed in exercised ones, whereas inhibitors of AMPK had the opposite effect. Exercise was associated with both reduced phosphorylation of the AMPK/ ACC signaling pathway and increased phosphorylation of proteins involved in mTOR signal transduction Ín the hypothalamus. The regulatory role of IL-6 in mediating the modulation in AMPK and mTOR pathways in the hypothalamus was also investigated. Treatment with leptin reduced food intake in exercised rats that were pretreated with vehicle, although no increase in sensitivity to leptin-induced anorexia after pretreatment with anti-IL6 antibody, AICAR or Rapamycin was detected. Improved responses of AMPK and mTOR to leptin may contribute to the appetite suppressive actions of exercise / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T03:10:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_CatarinaRaposoDias_M.pdf: 5524356 bytes, checksum: 004e2cd5a35766528eaa3a890eef3854 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Recentemente foi demonstrado em nosso laboratório que o veneno bruto da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), Keyserling (1891) (Ctenidae, Araneomorphae), é capaz de alterar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), quando injetado sistemicamente em ratos (observações feitas das 18 horas aos 9 dias). Afora a presença de edema vasogênico e de pés astrocitários edematosos, não foram detectadas alterações nos neurônios e células gliais, que indicassem a ação do veneno no interior do parênquima cerebral. O presente trabalho se propôs a avaliar se, em fases agudas do envenenamento, o PNV afeta a BHE e o tecido neural. Os parâmetros observados por microscopia eletrônica de transmissão (através do uso de traçador extracelular injetado na circulação e estudo quantitativo) e microscopia de luz (imunohistoquímica e estudo quantitativo) foram: alterações de permeabilidade vascular na microcirculação cerebral, alterações na expressão da laminina na membrana basal endotelial, ativação neuronal através da expressão da proteína c-FOS, modulação da síntese de óxido nítrico, através da expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS). Ratos Wistar machos, jovens (200-300 g) foram injetados pela veia da caudal com solução salina estéril (0.9%), ou com veneno (850 µg/Kg). Para análise da integridade da BHE, após 15 min, 1, 2 e 5 h, cerebelo e hipocampo foram coletados. Os resultados mostraram que o PNV provocou extravasamento significativo do traçador nitrato de lantano a partir de 1 h após a injeção (p.i.) e teve o seu maior pico em 2 h p.i. (p< 0,05). O cerebelo mostrou-se bem mais resistente ao aumento de permeabilidade vascular do que o hipocampo. Por outro lado, freqüentemente observou-se entumecimento dos pés-vasculares astrocitários no cerebelo, mesmo em vasos sem extravazamento do traçador, o que não ocorreu no hipocampo. Houve desaparecimento total da expressão da laminina dos capilares já aos 15 min p.i., seguida por recuperação gradativa, até que às 2 h p.i., sua expressão assemelha-se à mostrada pelos controles e 5 h p.i., a expressão dessa proteína estava acima da fisiológica, na membrana basal. A ativação de neurônios, avaliada às 2 h p.i. pela expressão da c-FOS, ocorreu em áreas relacionadas com atividade motora (substância cinzenta periaqueductal ¿ partes ventral e dorso lateral, córtex frontal e parietal e núcleo talâmico periventricular) e em áreas envolvidas com stress agudo (córtex rinal e núcleo septal lateral) (p< 0,05). Todas as áreas com significativo aumento de neurônios imunoreativos, também apresentaram neurônios positivos para nNOS, porém apenas a substância cinzenta periaqueductal parte dorsolateral, o córtex parietal e o núcleo talâmico periventricular apresentaram aumento no número de neurônios marcados para essa enzima. Nós concluímos que o veneno de P. nigriventer possui componentes neurotóxicos capazes de alterar a permeabilidade da BHE em tempos agudos após a intoxicação, cujo mecanismo precisa ser esclarecido. O veneno pode ser uma ferramenta importante para analisar as respostas dos componentes estruturais da BHE, bem como mapear as áreas cerebrais reativas, possibilitando esclarecer as vias do SNC envolvidas no envenenamento por Phoneutria. O conhecimento de vias relacionadas com neurotoxinas específicas do veneno pode ser útil para estudos relacionados com estrutura-função / Abstract: It was recently demonstrated in our laboratory that the Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), Keyserling (1891) (Ctenidae, Araneomorphae), is capable of altering the permeability of the blood brain barrier (BBB) when injected systemically in rats (observations done from 18 hours to 9 days). Apart from the presence of vasogenic edema and swollen atrocytic end-feet processes, no neuronal or glial cells alterations were detected, which would indicate the action of the venom within the cerebral parenchyma.The present work, intended to evaluate if at acute phases of the envenoming, the PNV affects the BBB. The parameters observed by transmission electron microscopy (by the use of electron opaque extracellular tracer injected in the circulation, and quantitative study) and by light microscopy (using immunohistochemistry and quantitative study) were: alterations of vascular permeability in the cerebral microcirculation, alterations of the expression of laminin at the endothelial basement membrane, neuronal activation seen through the expression of c-FOS protein, modulation of nitric oxide synthesis, trough the expression of the neuronal nitric oxide synthase (nNOS). Young male Wistar rats (200-300 g) were injected by the tail vein with sterile saline solution (0.9%), or with venom (850 µg/Kg). For BBB integrity analysis, after 15 min, 1, 2 and 5 h, cerebellum and hippocampus were collected. The results showed that the PNV provoked significant extravasation of LaNO3 tracer at 1 h post injection (p.i.) which peaked at 2 h p.i. (p< 0.05). The cerebellum showed to be more resistant to prevent vascular permeability increase than hippocampus. On the other hand, swollen vascular end-feet processes were more frequently seen in the cerebellum, even in vessels without vascular extravasation, what was not seen in hippocampus. There was complete vanishment of laminin immunolabeling of capillaries soon at 15 min p.i., followed by a gradual restoration to control levels at 2 h p.i. At 5 h p.i., the expression of the protein was upregulated in the basement membrane, compared to the physiologic control. The neuronal activation, evaluated through the expression of c-FOS at 2 h p.i., occurred at motor-related areas (periaqueductal gray matter pars ventral and dorsolateral, frontal and parietal cortex and paraventricular thalamic nuclei), and with acute stress-related areas (rhinal cortex and septal lateral nuclei) (p< 0.05). All cerebral areas with significant increase of c-FOS immunoreactive neurons, also exhibited nNOS-positive neurons, however only the pars ventral and dorsolateral of the periaqueductal gray matter, frontal and parietal cortex and paraventricular thalamic nuclei areas presented increase in the labeled-cells number. We conclude that P. nigriventer venom possesses neurotoxic components capable of altering the BBB permeability at acute stages of intoxication, whose mechanism needs clarification. The venom can be an important tool to analyse the responses of structural components of BBB, and to map the reactive cerebral areas, therefore shedding light to pathways involved with Phoneutria envenoming in CNS. The knowledge of the pathways related to specific venom containing neurotoxins may be useful for structure-function-related studies / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Para evitar a presença de microorganismos nas rações fornecidas para animais de laboratório, são utilizados processos de esterilização como a autoclavagem, porém esta ocasiona perda de nutrientes, como as proteínas, devido à alta temperatura usada. A deficiência protéica pode afetar a atividade celular, provocando diferentes alterações nos tecidos. Por estes fatos, objetivou-se avaliar a ação da ração autoclavada sobre os neurônios do plexo mioentérico do jejuno de ratos em período de crescimento. Para tanto, foram utilizados ratos em período dedesmame (21 dias) provindos de mães que receberam ração autoclavada ou não autoclavadadurante a gestação e lactação e ratos em período de pós-desmame (21 a 70 dias) alimentados com o mesmo tipo de dieta que as mães recebiam. Para a mensuração do perfil do corpo celular e contagem do número de neurônios por área, estes foram evidenciados pelo método de nadh-diaforase. O peso corpóreo dos animais não apresentou diferença significativa em relação ao tipo de alimentação (p > 0,05). Houve uma diminuição do comprimento jejuno-íleo em ratos alimentados com ração autoclavada (p > 0,05). O número de neurônios por área aumentou aproximadamente 10% para ratos que receberam ração autoclavada (p > 0,05). Já a área do perfil dos corpos dos neurônios apresentou um aumento para ratos alimentados com ração autoclavada, sendo este significativo para animais em período de desmame. Todos os fatores observados apresentaram diferença significativa em relação às idades / Autoclaving is the most common sterilization process to avoid the presence of pathogens in the diet of laboratory animals. However, it may cause the loss of nutrients such as proteins due to the high temperature used. The protein deficiency can affect cellular activity, leading todifferent changes in the tissues. Due to these facts, this research aimed to verify the effect of autoclaved diet in the jejunum neurons of the myenteric plexus in rats during their growing phase. The experiment groups were constituted by rats in weaning period (21 days) from mothers that received autoclaved or not diets during the gestation and lactation, and rats in post weaning period (21 to 70 days) fed the same diet the mothers received. In order to measure the neurons body profile and to quantify the number of neurons by area, they were stained by the nadh-diaphorase method. No significant changes were observed to the weight body in animals with autoclaved diet (p > 0.05). There was a decrease in the length of jejunum-ileum in rats treated with autoclaved diet (p > 0.05). The number of neurons by area increased approximately 10% in the rats supplied with autoclaved diet (p > 0.05). The neuron body profile area increased in the rats that received autoclaved diet and it was significant in the animals in weaning period. Nevertheless, all factors observed showed significant differences when related to animal age

Os astrócitos são células conhecidas por sua capacidade dinâmica e versatilidade, participando não somente da manutenção da homeostase cerebral em condições fisiológicas, mas também respondendo em condições patológicas, como por exemplo, na encefalopatia hepática (EH). Esta patologia neurológica está associada principalmente à hiperamonemia, decorrente de uma falência hepática aguda ou crônica. A toxicidade da amônia no sistema nervoso central (SNC) é mediada por uma série de alterações celulares e metabólicas, principalmente nas células astrogliais. Nesse sentido, a busca por moléculas com potencial terapêutico no SNC é extremamente relevante. Trabalhos do nosso grupo mostraram que o resveratrol e o ácido lipoico, duas moléculas conhecidas pelos seus efeitos antioxidantes, modulam importantes funções gliais, relacionadas principalmente ao metabolismo glutamatérgico, à defesa antioxidante e à resposta inflamatória. Neste sentido, esta tese teve como objetivo avaliar os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico em células astrogliais e neuronais expostas à amônia, assim como seus possíveis mecanismos protetores. Primeiramente, nós observamos que o resveratrol e o ácido lipoico foram capazes de prevenir as alterações induzidas pela amônia em células astrogliais C6, sobre parâmetros do metabolismo glutamatérgico, dentre os quais podemos destacar a captação de glutamato, a atividade da enzima glutamina sintetase (GS) e o conteúdo de glutationa (GSH). Além disso, o ácido lipoico também exerceu um efeito antiinflamatório nestas células, prevenindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL- 1β, IL-6, IL-18) e da proteína S100B, através da diminuição da ativação do fator de transcrição NFκB. Nós também verificamos que a maioria dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico foram dependentes da heme oxigenase 1 (HO1), uma enzima associada com a defesa celular em situações de estresse. Por fim, foram avaliados os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico sobre células neuronais expostas à amônia. Novamente, ambos apresentaram um efeito benéfico, prevenindo tanto o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) quanto a diminuição do conteúdo de GSH induzidos pela amônia. Nas células neuronais, a proteína HO1 também participou dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico. Em conjunto, esses resultados nos mostram que o resveratrol e o ácido lipoico são capazes de modular positivamente o funcionamento tanto de células astrogliais quanto de células neuronais em situações de hiperamonemia, compartilhando também alguns mecanismos de ação, como a indução da HO1. Este estudo in vitro sugere que o resveratrol e o ácido lipoico são potenciais agentes terapêuticos para doenças do SNC, as quais envolvam produção de espécies reativas e resposta inflamatória, como a EH. / Astrocytes are dynamic and versatile cells which participate in the maintenance of brain homeostasis in physiological conditions and also in response to pathological conditions, such as hepatic encephalopathy. This neurological disease is mainly associated with hyperamonnemia, resulting from acute or chronic liver failure. Ammonia toxicity in the central nervous system (CNS) is mediated by several cellular and metabolic alterations, primarily in astroglial cells. In this sense, the search for molecules with therapeutical potential for CNS becomes highly relevant. Our group has shown that resveratrol and lipoic acid, two molecules known for their antioxidant activities, are able to modulate important glial functions mainly related to glutamate metabolism, antioxidant defense and inflammatory response. In this sense, this study aimed to evaluate the effects of resveratrol and lipoic acid in astroglial and neuronal cells exposed to ammonia, as well as their possible protective mechanisms. Firstly, we observed that resveratrol and lipoic acid were able to prevent ammonia-induced alterations in C6 astroglial cells functioning, such as glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and intracellular GSH content. Moreover, lipoic acid also exerted an anti-inflammatory effect in C6 astroglial cells, preventing the ammonia-stimulated release of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-1β, IL-6, IL-18) and S100B protein, by decreasing the activation of the transcription factor NFκB. We also verified that the most protective effects of resveratrol and lipoic acid involved the heme oxygenase 1 (HO1), an enzyme associated with protection against stressful conditions. Finally, we evaluated the effects of resveratrol and lipoic acid on neuronal cells exposed to ammonia. Again, both showed beneficial roles, preventing the increase of reactive oxygen species (ROS) and decrease of GSH content induced by ammonia. In neuronal cells, HO1 also mediated the protective effects of resveratrol and lipoic acid. Taken together, these results show that resveratrol and lipoic acid are able to positively modulate the functioning of both astroglial and neuronal cells in hyperamonemmia conditions, sharing some mechanisms of action, such as HO1. This study in vitro suggests that resveratrol and lipoic acid may represent potential therapeutic agents for CNS, during oxidative and inflammatory damages, as the induced by ammonia.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The nitric oxide (NO) constitutes one of the most important mediators of the processes intra and extracellular. Amongst its biological functions, there is a role of neuromodulador. In Podarcis hispanica, diverse research had described the citoarchitecture of the cerebral cortex of this animal, however, there isn't data published about neurons that producers neuronal nitric oxide synthetase (nNOS). The aim of this work was to identify the positive NADPHd/nNOS neurons in the cerebral cortex of P. hispanica. For such, it was used the histochemistry technique NADPHd and imunochemistry to nNOS and soluble Guanylyl Cyclase (sGC α1). The results showed that the cerebral cortex of P. hispanica has a population of 1897 diaphorase positive neurons, being, 1090 (57,5%) in young animals, 528 (27,8%) in adults and 279 (14,7%) in age. Among the telencephalics levels, pre-comisural, comisural and post-comisural showed 423 (22,3%); 459 (24,2%) and 1015 (53,5%) neurons, respectively. In relation the cortical areas, the medial cortex (CM), dorsomedial (CDM), dorsal (CD) and lateral (CL) showed 86 (4,5%), 530 (27,9%), 1243 (65,5%) and 38 (2%) neurons, respectively. Inner and outer plexiforme layers showed, respectively, 1264 (66,6%), 533 (28,1%) and 100 (5.3%) neurons. 1737 (91,5%) NADPHd positive neurons had been found in the regions Timm-positive and 160 (8,5%) in the Timm-negative. 15 types of morphological NOS positive neurons were identified: piramidal, bouquet double, deep stellate, sarmentous, polymorphous, ectopic vertical multipolar, coral, granular unipolar, large radial, horizontal bipolar, horizontal unipolar, smooth vertical, spheroidal and fusiforme. In conclusion, the cerebral cortex of Podarcis hispanica showed neurons with NADPHd activity, as well as immunoreactive to the anti-nNOS and sGC α1 antibodies; NADPHd positive neurons are of three types: Type I, II and III; There is a significant difference in the number of NADPHd positive neurons among animals of different ages and among the cortical areas and layers and were found mainly in the Timm-positive regions. / O óxido nítrico (NO) constitui um dos mais importantes mediadores dos processos intra e extracelulares. Dentre suas funções biológicas, destaca-se seu papel de neuromodulador. Em Podarcis hispanica, diversos trabalhos descreveram a citoarquitetura do córtex cerebral desse animal, no entanto, nenhuma informação referente aos neurônios produtores da isoforma óxido nítrico neuronal (nNOS) nessa região telencefálica foi publicada até o presente momento. Neste trabalho, objetivou-se identificar os neurônios NADPHd/nNOS positivos no córtex cerebral do referido animal. Para tal, utilizou-se a técnica histoquímica NADPHd e imunohistoquímica frente a nNOS e Guanilil Ciclase Solúvel (sGC α1). Os resultados demonstraram que o córtex cerebral de P. hispanica apresenta uma população de 1897 neurônios diaforase positivos, sendo, 1090 (57,5%) em animais jovens, 528 (27,8%) em adultos e 279 (14,7%) em senis. Entre os níveis telencefálicos, o pré-comissural, o comissural e o pós-comissural apresentaram 423 (22,3%); 459 (24,2%) e 1015 (53,5%) neurônios, respectivamente. Em relação as áreas corticais, o córtex medial (CM), dorsomedial (CDM), dorsal (CD) e lateral (CL) apresentaram 86 (4,5%), 530 (27,9%), 1243 (65,5%) e 38 (2%) neurônios, respectivamente. Nas camadas plexiformes interna e externa e camada celular foi verificado, respectivamente, 1264 (66,6%), 533 (28,1%) e 100 (5,3%) neurônios. 1737 (91,5%) neurônios NADPHd positivos foram encontrados nas regiões Timm-positivas e 160 (8,5%) nas Timm-negativas. 15 tipos morfológicos de neurônios NOS positivos foram identificados, são eles: piramidal, buquê duplo, estrelado, sarmentoso, polimorfo, ectópico vertical, multipolar, coral, granular unipolar, radial grande, horizontal bipolar, horizontal unipolar, vertical liso, esferoidal e fusiforme. Então, concluiu-se que: o córtex cerebral de Podarcis hispanica apresenta neurônios com atividade NADPHd, como também imunorreativos aos anticorpos anti-nNOS e sGC α1; os neurônios NADPHd positivos são de três tipos: Tipo I, II e III; há uma diferença significativa na expressão do número de neurônios NADPHd positivos entre animais de diferentes faixas etárias e entre as áreas e camadas corticais; córtex cerebral de P. hispanica apresenta uma variedade de 15 morfologias de neurônios NADPHd positivos; os neurônios NADPHd positivos foram encontrados principalmente nas zonas Timm-positivas.

Orientador: Francesco Langone / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rogerio_Fabio_D.pdf: 6070171 bytes, checksum: 09dbd001354ef5fc115682fa346982ee (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Morte neuronal pode ser induzida em ratos neonatos por axotomia periférica. A privação de fatores tróficos sintetizados por células alvo seria uma importante causa, pois favoreceria a ocorrência de estresse oxidativo. No presente estudo, ratos com dois dias de vida (P2) foram submetidos a secção unilateral do ciático, tratados diariamente com o antioxidante melatonina e sacrificados entre P2 e P7, período em que ocorre maior perda celular. Na intumescência lombar, foram avaliadas a expressão e distribuição tecidual das isoformas 1 e 2 da superóxido dismutase (SODI e 2), das isoformas neuronal (nNOS), endotelial (eNOS) e induzível (iNOS) da óxido nítrico sintase (NOS) e da Bax e Bcl-2 (indutora e supressora da morte celular, respectivamente). Também foram investigadas a atividade da NOS e fragmentação de DNA. Cinco dias depois da lesão, a axotomia determinou perda de 55% dos motoneurônios. Após o mesmo período, o tratamento com melatonina garantiu a sobrevivência de 75% dos neurônios acometidos. Um dia depois da axotomia, a expressão da SODI foi reduzida em 25% nos ratos lesados. Por outro lado, a administração de melatonina aumentou a síntese desta enzima em 25%. A axotomia elevou a atividade da nNOS e eNOS 1 e 6 horas após a lesão. A melatonina aumentou a atividade da nNOS e eNOS e diminuiu a da iNOS no terceiro dia. Os níveis de mRNA e de células positivas para Bax e a ocorrência de quebra de DNA aumentaram no primeiro dia. Esta última foi reduzida pelo tratamento com melatonina. A axotomia não alterou a expressão e imunomarcação para iNOS e para Bcl-2, nem aumentou a imunorreatividade para Bax em motoneurônios. O efeito neuroprotetor e antioxidante da melatonina no presente modelo experimental suporta sua investigação em alterações neurológicas associadas com estresse oxidativo / Abstract: Neuronal death may be induced in neonatal rats by peripheral axotomy. Deprivation of trophic factor produced by target cells would play a role, since it would favor oxidative stress. In the present study, rats at an age of two days postnatally (P2) were subjected to unilateral sciatic transection, daily treatment with the antioxidant melatonin and sacrificed at time points ranging from P2 to P7, when the majority of the axotomised cells is 10s1. Expression and immunohistochemical detection of superoxide dismutase isoforms 1 and 2 (SOD 1 and 2) were investigated in the lumbar enlargement. Neuronal (nNOS), endothelial (eNOS) and inducible (iNOS) isoforms of nitric oxide synthase (NOS) and Bax and Bcl-2 (cell death promoter and suppressor, respectively) were also evaluated. Finally, NOS activity and DNA fragmentation were assessed. Five days after lesion, 55% of the axotomised motoneurons died. Melatonin rescued 75% ofthe injured motoneurons. On the first day, SODl expression was reduced by 25% in axotomised rats, whereas melatonin administration yielded an increase of 25% in such expression. nNOS and eNOS activity rose at 1 and 6 hours after lesion. Melatonin increased nNOS and eNOS activity and reduced iNOS catalytic rate on the third day. Bax mRNA levels, number of Bax-positive cells and DNA fragmentation augmented on the first day. The latter was decreased by melatonin. Axotomy did not alter immunostaining for and expression of iNOS and Bcl-2. In addition, the injury did not induce Bax expression in motoneurons. The neuroprotective and antioxidant effect of melatonin in the present experimental model support the investigation of this neurohormone in neurological diseases associated with oxidative stress / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T06:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emirandetti_Amanda_M.pdf: 4129268 bytes, checksum: 6b46598f867a92cb0663cb6e4cabb3ae (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Astrócitos são elementos fundamentais para o funcionamento normal do sistema nervoso central (SNC). Estas células exibem inúmeras funções, podendo modular a excitabilidade neural e a transmissão de impulsos nervosos através de seus processos lamelares finos que se localizam nas adjacências das sinapses. Todavia, astrócitos também podem desempenhar funções na integridade da fisiologia do sistema nervoso (SN) após uma lesão. A astrogliose após lesão nervosa é caracterizada pela hiperplasia e hipertrofia do corpo celular e dos processos astrocitários, os quais bloqueiam a regeneração axonal. No entanto, a reatividade astrocitária também possui aspectos positivos, como a produção de fatores neurotróficos. Apesar de a plasticidade sináptica após lesão seja um fenômeno conhecido, os mecanismos envolvidos em tal evento ainda permanecem desconhecidos. Nesse sentido, células gliais, especialmente astrócitos, podem exibir importantes papéis nos processos de mudança do SN, influenciando a retração dos terminais sinápticos tanto quanto promovendo um ambiente peri-sináptico propício, afetando o reestabelecimento dos botões que foram retraídos. Nesse trabalho, estudou-se a resposta astrocitária após a axotomia em camundongos das linhagens C57BL/6J, Balb/cJ e A/J, utilizando-se técnicas de imunofluorescência, microscopia eletrônica de transmissão e cultura celular. Nesse sentido, foram apresentadas evidências de que camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6J, Balb/cJ e A/J exibem diferentes intensidades de reatividade astrocitária após lesão periférica in vivo, sendo estas diferenças significativas entre A/J (3,87 ± 0,07, média ± erro padrão, GFAP e 3,76 ± 0,16, ezrina) e C57BL/6J (2,35 ± 0,024, p<0,0001; GFAP e 2,69 ± 0,26, ezrina, p<0,001). Ainda, astrócitos derivados de córtices de camundongos cultivados in vitro exibiram diferença significativa na imunomarcação com anti-GFAP e anti-ezrina entre as linhagens A/J (22,60 ± 1,63, média ± erro padrão, GFAP e 18,47 ± 1,31, ezrina) e C57BL/6J (13.22 ± 1,80; p<0,001, GFAP, 13,95 ± 1,16, ezrina p<0,05). Adicionalmente, a astrogliose nas adjacências dos motoneurônios axotomizados foi menor em animais C57BL/6J quando comparado com A/J, sugerindo que a diferença da reatividade astrocitária possui influência direta na sinaptogênese in vitro. Ainda, a análise estrutural quantitativa indicou maior retração sináptica nas linhagens A/J e Balb/cJ em relação ao C57BL/6J, uma semana após a transecção do nervo isquiático. Nossos resultados demonstram que o aumento da astrogliose pode influenciar o grau de plasticidade sináptica na medula espinhal, que possivelmente influencia a regeneração axonal dos motoneurônios lesionados / Abstract: Astrocytes are of major importance for normal functioning of the central nervous system (CNS). These cells have been shown to play a large number of different functions in the brain. They can modulate the neural excitability and signal transmission by their thin lamellar process surrounding synapses. Moreover, astrocytes play a major role in preserving and restoring structural and physiological integrity following injury to the CNS. Astrogliosis is characterized by hyperplasia and hypertrophy of cell bodies and processes, which has been considered to block axonal regeneration, but reactiveness of glial cells at the lesion site has also positive aspects, such as the production of neurotrophic factors. Although synaptic plasticity is a widespread phenomenon, the underlying mechanisms leading to its occurrence are virtually unknown. In this sense, glial cells, especially astrocytes, may have a role in network changes of the nervous system, influencing the retraction of boutons as well as providing a proper perisynaptic environment, thereby affecting the replacement of inputs. In the present work, we have studied the astrocytic response after axotomy in C57BL/6J, Balb/cJ and A/J mice, using immunofluorescence, transmission electron microscopy and cell cultures techniques. In this sense, we present evidence that A/J, Balb/cJ and C57BL/6J isogenic mice display different astrocyte reactivity after a peripheral lesion in vivo (A/J; 3.87 ± 0.07- GFAP and 3.76 ± 0.16 ¿ezrin / C57BL/6J; 2.35 ± 0.024 - GFAP, p<0.0001 and 2.69 ± 0.26 - ezrin, p<0.001). Further, astrocytes from mice cortices were isolated and expanded in vitro, showing a significant difference in GFAP and ezrin labeling between AJ (22.60 ± 1.63 - GFAP and 18.47 ± 1.31 - ezrin) and C57BL/6J mice (13.22 ± 1.80 ¿ GFAP, p<0.001 and 13.95 ± 1.16 ¿ ezrin, p<0.05). Also, astrogliosis surrounding axotomized motoneurons C57BL/6J is lower than A/J mice and such a difference has a direct influence on in vitro synaptogenesis. Indeed, ultrastructural quantitative analysis showed more intense synaptic detachment in A/J and Balb/cJ strains after sciatic nerve transection than in C57BL/6J mice. Our findings demonstrate that an increased astrogliosis influences the degree of synaptic plasticity in the spinal cord, which may in turn contribute to the axonal regeneration of lesioned motoneurons / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lanza_DanielCarlosFerreira_D.pdf: 39179290 bytes, checksum: cbd84a5b7ba74e985bc1fc48595debd6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteína FEZ1 foi caracterizada inicialmente como um ortólogo da proteína UNC76 de C. elegans, responsável pelo desenvolvimento e fasciculação neuronal nesse verme. Estudos subsequentes demonstraram sua atuação em processos de desenvolvimento neuronal, polarização celular, mecanismos de transporte associado à kinesinas e transporte de vesículas e mitocôndrias. Outros trabalhos demonstraram que a superexpressão de FEZ1 interfere no ciclo de vida de alguns tipos de vírus como HIV e JCV. FEZ1 é capaz de interagir com mais de 51 proteínas diferentes, e participa em muitos processos celulares. Observamos que FEZ1 apresenta ausência de estrutura molecular rígida, sendo pertencente à classe das natively unfolded proteins, e é capaz de formar dímeros em solução. Essa observação condiz com sua extrema capacidade de interagir com muitas proteínas diferentes. A capacidade de FEZ1 interagir com outras proteínas é influenciada pela fosforilação da sua região C-terminal por diferentes isoformas de PKC. FEZ1 interage e colocaliza com NEK1 e com CLASP2 em células de mamífero, em uma região candidata ao centrossomo. Essas interações são dependentes da região coiled-coil presente na parte C-terminal de FEZ1, e ocorrem em regiões coiled-coil de CLASP2 e NEK1. A interação com CLASP2 é rompida quando FEZ1 é fosforilada por PKC. A superexpressão de FEZ1 causa o fenótipo flower like observado em células de alguns tipos de leucemia. Nós observamos que FEZ1 interage e colocaliza com a e ?-tubulinas e que a formação desse fenótipo em células HEK293 ocorre devido a uma alteração na organização dos microtúbulos causada pelo excesso de FEZ1. A formação do fenótipo flower like é influenciada por ativação das vias de PKC e PI3K. Os dados obtidos durante o nosso trabalho indicam que FEZ1 é uma proteína intrinsecamente desenovelada, que atua em processos celulares associados ao citoesqueleto e centrossomo em conjunto com NEK1 e CLASP2, e que defeitos em sua regulação, possivelmente pelas vias de PKC ou PI3K, causam alteração da organização dos microtúbulos originando núcleos flower like. / Abstract: FEZ1 was identified first as a orthologue of C elegans UNC-76 protein, that plays functions related to neuronal development in this worm. Subsequent studies, shows FEZ1 functions in neuronal development process, cell polarization, transport mechanisms associated to kinesins and vesicular and mitochondrial transports. Other works showed that FEZ1 superexpression interfere in the life cycle of some viral types such as HIV and JCV. FEZ1 is able to interact with more than 51 different proteins and participates in several cellular processes. We observed that FEZ1 has a mobile molecular structure, is a member of the natively unfolded protein class, and can form dimers in solution. This observation is in agreement with its capacity to interact with a large number of different proteins. The capacity of FEZ1 to interact with other proteins is influenced by different PKC isoforms phosphorylation in its C-terminal region. FEZ1 interacts and co-localizes with NEK1 and CLASP2 in a centrossomal candidate region of mammalian cells. These interactions are dependent of a coiled coil inside the C-terminal region of FEZ1, and occur in dependence of coiled coil regions of NEK1 and CLASP2. The interaction between FEZ1 and CLASP2 is abolished after FEZ1 phosphorylation by PKC. The FEZ1 overexpression causes the flower like phenotype observed in cells of some leukemias. We observed that FEZ1 interacts and co-localizes with _ and _-tubulins and that the phenotype formation in HEK293 cells is mediated by an atypical organization of microtubule spindles, caused by overexpression of FEZ1. The flower like phenotype formation is influenced by activation of PKC and PI3K pathways. The data generated by our work indicate that FEZ1 is an intrinsically unfolded protein, that works in cellular processes associated to the cytoskeleton in conjunct with NEK1 and CLASP2, and that defects in its regulation, maybe via the PKC or PI3K pathways, causes alterations in microtubule organization and formation of the "flower like" nuclei. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular