SARM1 is an injury-induced nicotinamide adenine dinucleotide nucleosidase (NADase) that was previously shown to promote axonal degeneration in response to traumatic, toxic, and excitotoxic stressors. This raises the question of whether a SARM1-dependent program of axonal degeneration is central to a common pathway contributing to disease burden in neurological disorders. The degree to and mechanism by which SARM1 inactivation decreases the pathophysiology of such disorders is of interest to establish the rationale to pursue SARM1 as a therapeutic target. In this study, we compare the course and pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in Sarm1-knockout (KO) mice and wild-type littermates to test the contribution of SARM1-dependent axonal degeneration specifically in the context of chronic, immune-mediated central nervous system (CNS) inflammation. The question of whether SARM1 loss in Sarm1-KO mice would inhibit, promote, or have a negligible impact on EAE-induced axonal degeneration and more broadly CNS inflammation was explored using a variety of analyses: quantification of clinical score in a chronic EAE model, CNS immune infiltrate profile, axon initial segment morphology in layer V cortical neurons, axonal transport disruption and transection in the lumbar spinal cord. Additionally, we have proposed a method for detecting SARM1 activation in situusing a novel SARM1-mCitrine bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technique. Successful implementation of such a molecular tool would allow for a detailed, mechanistic approach to enhance our understanding of upstream intracellular signals that trigger SARM1 activation.

A growing body of evidence suggests that social stress contributes to the pathogenesis of neurodegenerative diseases, such as multiple sclerosis (MS). For example, prior research has shown that social disruption (SDR) stress behaviorally and immunologically exacerbates Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection. TMEV infection results in acute infection of the central nervous system (CNS) followed by a chronic demyelinating autoimmune disease, similar to that seen in MS. Research suggests that social stress exerts these effects by altering the immune response to infection. More specifically, it is hypothesized that SDR sensitizes the acute inflammatory response to infection and suppresses T cell effector function in the acute phase of disease. It was demonstrated that SDR is sufficient to alter inflammation. Exposure to a single session of SDR increases IL-­‐1β mRNA expression; however, IL-­‐6 mRNA expression, but not IL-­‐1β, is up regulated in response to chronic SDR. Furthermore, chronic SDR prior to infection resulted in increased infection related central IL-­‐6 and IL-­‐1β mRNA expression, and central administration of IL-­‐6 neutralizing antibody during SDR reverses this increase in neuroinflammation. This suggests that SDR sensitizes infection related CNS inflammation through an up-­‐regulation of IL-­‐6. Chronic SDR prior to infection also resulted in enhanced CNS viral titers and suppression of virus-­‐induced CD4 and CD8 T cell IFN-­‐γ release within the CNS. As a whole, this research indicates that SDR exacerbates the disease course of TMEV infection by altering the central innate and adaptive immune response to infection. This research enhances our understanding of the mechanisms by which social stress exacerbates neurodegenerative disease pathogenesis.

Microglia act as the frontline immune defense in the brain. Microglial responses can be either neurotoxic, through the release of reactive oxygen and nitrogen species and inflammatory cytokines, or neurotrophic. Microglial activation due to chronic ethanol exposure has been implicated in neuroinflammation. We use mass spectrometric metabolic labeling techniques to explore and quantify the microglial proteome in immortalized cell lines and in vivo enriched microglia. Our proteomic profiling and subsequent validation suggests that microglia do activate in response to ethanol exposure, but the activation falls short of the classical, or M1 state of inflammatory activation, as no downstream markers for reactive species nor inflammatory cytokines can be found. Additionally, proteomic profiling suggests a partial activation marked by increased cell engulfment and cell movement in addition to increased release of inf-gamma and tgf-beta.

Microglia activity has been detected in Parkinson’s disease (PD) post-mortem brains and experimental animal models; however the precise interplay between microglia and dopamine neurons of the SNpc is not well understood. In the blood plasma of PD patients, our laboratory found elevated levels of interferon-gamma (IFN-γ), a proinflammatory cytokine and potent activator of microglia. Given this, we sought to untangle the immune responses relevant to PD in mice, examining IFN-γ’s involvement and signaling mechanism using an inflammatory co-culture model of microglia and midbrain neurons treated with rotenone. By means of RT-PCR, we discovered IFN-γ mRNA transcripts are produced by microglia, and this expression increases upon exposure to rotenone. We delineated IFN-γ’s signaling mechanism in co-cultures using different IFN-γ receptor deficient cells, and showed it engages receptors in an autocrine (not paracrine) manner to further microgliosis and dopamine cell loss. After exploring the innate immune response in a model of PD, we subsequently shifted focus to an in vivo system to better investigate any involvement of the delayed humoral arm of the adaptive immune system. Needing a time appropriate death paradigm, we developed a protracted low dose regimen of MPTP, which elicits dopaminergic cell death after 2 weeks of treatment. Subjected to this paradigm, Rag 2 mutant mice (deficient in both T and B cells) exhibit resistance to dopamine cell loss, microglia activation and motor impairments. Further evidence in support of immune involvement came with the resensitization of Rag2 mice to MPTP after reconstitution with WT splenocytes. Additionally, mice deficient in Fcγ receptors exhibited neuroprotection in our protracted degeneration model. Taken together, these data indicate the innate and humoral arm can modulate the microglial response to dopaminergic degeneration and may participate in Parkinson's disease.

L'accumulation des peptides Aβ40-42 au niveau cérébral est un élément physiopathologique majeur de la Maladie d'Alzheimer (MA) et une cible thérapeutique potentielle. A l'issue de résultats encourageants de vaccination par Aβ dans des modèles murins de la MA, un essai clinique a été entrepris chez l'Homme. Mais il a dû être interrompu en raison de la survenue de méningo-encéphalites chez 6% des patients, supposées liées à une activation inappropriée de lymphocytes T. Une meilleure compréhension des réponses T CD4+ induites par la vaccination semble donc primordiale pour l'optimisation des stratégies vaccinales. Nous avons cherché à identifier les facteurs génétiques qui pourraient avoir un rôle sur l'amplitude et la nature des réponses vaccinales T CD4+ anti-Aβ chez la souris. Nous avons mis en évidence que l'amplitude de la réponse variait en fonction des haplotypes H-2 mais aussi de facteurs génétiques indépendants du CMH et liés à la capacité de générer des réponses T régulatrices (Tregs) anti-Aβ. De plus, l'analyse des réponses vaccinales dans un modèle murin de MA (souris APPPS1) semble suggérer qu'une réponse Treg inhiberait des réponses T CD4 effectrices anti- Aβ spontanées. Ces observations nous ont conduits à rechercher l'impact de ces réponses effectrices et régulatrices dans la physiopathologie de la maladie. En inactivant les cellules Tregs, nous avons pu mettre en évidence les fonctions anti-neuroinflammatoires et les effets bénéfiques de ces cellules sur la pathologie amyloïde et la cognition. Ensemble, nos résultats suggèrent donc que les réponses Treg pourraient limiter l'efficacité vaccinale mais auraient une action neuroprotectrice dans la physiopathologie de la MA.

Epilepsy is a chronic neurological disease characterized by recurrent, unprovoked seizures. Evidence suggests that inflammation plays a role in the pathophysiology of seizures. Although cysteinyl leukotrienes (CysLTs) have been implicated in seizures, no study has investigated whether blocking of CysLT1 receptors potentiates the anticonvulsant action of classic antiepileptic drugs, as well as the expression of CysLT receptors is altered by inflammation. In this study we showed that the inverse agonist of CysLT1 receptor, montelukast, synergistically increases the anticonvulsant action of phenobarbital against seizures induced in a model of acute injection of pentylenetetrazole (PTZ). Furthermore, it is shown that LTD4 (leukotriene D4) prevents the effect of montelukast. Isobolographic analysis revealed an ED50 mix value for a fixed-ratio combination (1:1 proportion) of montelukast plus phenobarbital of 0.06 ± 0.02 μmol, whereas the calculated ED50 add value was 0.49 ± 0.03 μmol. The interaction index was 0.12, indicating a synergistic interaction. Montelukast significantly decreased the antiseizure DE50 for phenobarbital (0.74 and 0.04 μmol in the absence and presence of montelukast, respectively) and, consequently, phenobarbital-induced sedation at equieffective doses. We also investigated whether the CysLT1 inverse agonist montelukast and a classical anticonvulsant, phenobarbital, decrease seizures in PTZ-kindled mice and CysLT receptor expression. Montelukast (10 mg/kg, s.c.) and phenobarbital (20 mg/kg, s.c.) increased the latency to generalized seizures in kindled mice. Montelukast increased CysLT1 immunoreactivity only in non-kindled PTZ-challenged mice. Interestingly, PTZ challenge decreased CysLT2 immunoreactivity only in kindled mice. CysLT1 antagonists seem to emerge as promising adjunct therapeutic agents in the treatment of refractory seizures. Notwithstanding, additional studies are necessary to evaluate the clinical implications of this work. / A epilepsia é uma doença que se manifesta por crises epilépticas recorrentes, não provocadas. Evidências sugerem que a inflamação desempenha um papel na patofisiologia destas crises. Embora os leucotrienos cisteínicos (CysLTs) tenham sido implicados no desenvolvimento de crises convulsivas, nenhum estudo investigou se o bloqueio dos receptores CysLT1 potencializa a ação anticonvulsivante de antiepilépticos clássicos, assim como se a expressão dos receptores de CysLT é alterada por inflamação. Neste estudo mostramos que o agonista inverso de CysLT1, montelucaste, sinergicamente aumenta a ação anticonvulsivante do fenobarbital contra crises convulsivas induzidas em um modelo de injeção aguda de pentilenotetrazol (PTZ). Além disso, é mostrado que o LTD4 (leucotrieno D4) previne o efeito do montelucaste. A análise isobolográfica revelou que o valor de DE50 mix, calculado experimentalmente para uma combinação de proporção 1: 1 de montelucaste e fenobarbital foi de 0,06 ± 0,02 umol, ao passo que o valor de DE50 add, calculado foi de 0,49 ± 0,03 umol. O índice de interação encontrado foi de 0,12, indicando uma interação sinérgica. A associação dos fármacos diminuiu significativamente o DE50 para o efeito anticonvulsivante do fenobarbital de 0,74 para 0,04 umol (na ausência e na presença de montelucaste, respectivamente) e, consequentemente, a sedação induzida por fenobarbital em doses equieficazes. Posteriormente foi avaliado se o montelucaste e o fenobarbital diminuem as crises convulsivas em animais previamente abrasados, assim como se o tratamento farmacológico ou o abrasamento alteram a expressão de receptores CysLTs. O montelucaste (10 mg/kg; s.c.) e o fenobarbital (20 mg/kg, s.c.) aumentaram a latência para crises convulsivas generalizadas em camundongos abrasados. O montelucaste aumentou a imunorreatividade do receptor CysLT1 em camundongos não abrasados e que foram desafiados por PTZ que não foram abrasados. Entretanto, o desafio de PTZ diminuiu a imunorreatividade do receptor CysLT2 apenas em camundongos abrasados. Antagonistas do receptor CysLT1 parecem emergir como agentes terapêuticos adjuntos promissores no tratamento de crises refratárias. Não obstante, estudos adicionais são necessários para avaliar as implicações clínicas deste trabalho.

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No. of bitstreams: 1 TeseMRL.pdf: 1847541 bytes, checksum: 576104fec459fe5ca5cf29dbd41b2979 (MD5) Previous issue date: 2017-03-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Arterial hypertension (AH) is a multifactorial disease, characterized by increased levels of arterial pressure (AP) that causes an increased risk of coronary disease, stroke and congestive heart failure. Several studies have addressed the possible causes and mechanisms of hypertension in the attempt to seek new treatments for this disease. Studies have already showed the participation of oxidative stress, caused by increased production of reactive oxygen species (ROS) in the development and maintenance of hypertension. ROS like hydrogen peroxide (H2O2) are produced endogenously and may participate in intra- and extracellular signaling, including mediation of angiotensin II (ANG II) responses. Intracerebroventricular injection of H2O2 or the increase of endogenous H2O2 using the catalase inhibitor ATZ reduced the pressor responses to central ANG II in normotensive and hypertensive rats. In the present study, we investigated the effects of acute or chronic subcutaneous (sc) administration of ATZ on mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) in normotensives, spontaneously hypertensive rats (SHR) and 2-kidney, 1clip hypertensive rats (2K1C). We also studied the possible changes of autonomic modulation of systolic arterial pressure (SAP) and the pulse interval (PI), the renal sympathetic nerve activity, the baroreflex, the genic expression of inflammatory cytokines, components of the renin-angiotensin system (RAS), NADPH oxidase isoforms and microglia activity (CD11) in the hypothalamus in rats treated with sc ATZ. In addition, it was also tested the pressor response to noradrenaline or ANG II injected intravenously (iv), the hypotensive response to the ganglionic blockade with hexamethonium, food and water intake and urinary excretion in normotensive and hypertensive rats treated with sc administration of ATZ. Male normotensive Holtzman, 2K1C hypertensive Holtzman rats and SHR were used. MAP and HR were recorded in conscious, unrestrained rats, except in rats used to record sympathetic activity. The sc injection of ATZ (300 mg/kg of body weight) acutely reduced MAP in SHR (192 ± 4 mmHg pre-injection of ATZ vs. 173 ± 6 mmHg after ATZ) and in 2K1C rats (170 ± 8 mmHg pre-injection of ATZ, vs. 158 ± 13 mmHg after ATZ) for at least 4 h and also slightly reduced HR. Chronic daily treatment with ATZ (600 mg/kg of body weight/day) sc for 9 days also reduced MAP in SHR (ATZ: 172 ± 8 mmHg, vs. saline: 198 ± 2 mmHg) and in 2K1C rats (ATZ: 137 ± 12 mmHg, vs. saline: 181 ± 9 mmHg) without altering HR, the impairment of baroreflex present in hypertensive rats, food and water intake and urinary excretion. The treatment with ATZ sc chronically reduced sympathetic modulation of SAP in SHR (ATZ: 2.6 ± 1.2 mmHg2, vs. saline: 6.3 ± 3.4 mmHg2) and in 2K1C rats (ATZ: 3.2 ± 0.4 mmHg2, vs. saline: 7.6 ± 1.5 mmHg2) and PI, enhanced the parasympathetic modulation of PI in SHR (ATZ: 90.5 ± 4.5 un, vs. saline: 76.5 ± 7.8 un) and 2K1C rats (ATZ: 85.3 ± 2.9 un vs. saline: 68.6 ± 3 un) and improved the sympatho-vagal balance in SHR (ATZ: 0.11 ± 0.05, vs. saline: 0.35 ± 0.17) and in 2K1C rats (ATZ: 0.19 ± 0.05, vs. saline: 0.52 ± 0.09). Chronic treatment with ATZ sc for 9 days in 2K1C hypertensive rats also reduced the mRNA expression of interleukin-6 (IL-6) (ATZ: 0.80 ± 0.06, vs. saline: 2.32 ± 0.36 fold change), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and AT1 receptor (AT1r) (ATZ: 0.74 ± 0, 04, vs. saline: 1.19 ± 0.22 fold change) in the hypothalamus. ATZ chronically in SHR also decreased mRNA expression of IL-6 (ATZ: 1.17 ± 0.07, vs. saline: 1.53 ± 0.11 fold change), AT1r (ATZ: 0.81 ± 0.03, vs. saline: 1.0 ± 0.04 fold change), NADPH oxidase isoform NOX2 (ATZ: 0.85 ± 0.06, vs. saline: 1.52 ± 0.27 fold change) and the microglia activation indicator gene (CD11) (ATZ: 1.47 ± 0.06, vs. saline: 1.79 ± 0.08 fold change) in the hypothalamus. The injection of ATZ (300 mg/kg of body weight) sc in 2K1C hypertensive rats acutely reduced renal sympathetic nerve activity (-51.5 ± 10%) and the hypotensive response to iv injection of the ganglionic blocker hexamethonium (ATZ: -58 ± 5 mmHg; vs. saline: -106 ± 7 mmHg), without changing the pressor responses to noradrenaline or ANG II iv, in rats treated with sc ATZ. Therefore, the present results suggest that increasing the availability of endogenous H2O2 by the acute or chronic administration of ATZ sc produces anti-hypertensive effects due to decreases in sympathetic nerve activity that are associated with a decrease in neuroinflammation, AT1 receptor and NADPH oxidase mRNA and activation the microglia in the hypothalamus. These effects might result from an impairment of the central action of ANG II as demonstrated in a previous study (LAUAR et al., 2010). / A hipertensão arterial (HA) é uma doença multifatorial, caracterizada pelo aumento dos níveis de pressão arterial (PA) que ocasiona um aumento de risco de doenças coronarianas, derrame cerebral e insuficiência cardíaca. Vários estudos visam compreender as possíveis causas e mecanismos da hipertensão na tentativa de se buscar novos tratamentos para esta doença. Estudos já demonstraram a participação do estresse oxidativo, causado pelo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no desenvolvimento e a manutenção da hipertensão. As EROs como peróxido de hidrogênio (H2O2) são produzidas endogenamente e podem participar da sinalização intra e intercelular, incluindo a mediação das respostas à angiotensina II (ANG II). Injeções intracerebroventriculares de H2O2 ou o aumento de H2O2 endógeno utilizando o inibidor da catalase, o ATZ, reduziram a resposta pressora produzida pela injeção central de ANG II em ratos normotensos e hipertensos. No presente estudo, investigamos os efeitos da administração subcutânea (sc) aguda ou crônica do ATZ na pressão arterial média (PAM) e na frequência cardíaca (FC) de ratos normotensos, ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e com hipertensão do tipo 2 rins, 1 clipe (2R1C). Estudamos também a modulação autonômica da pressão arterial sistólica (PAS) e do intervalo de pulso (IP), da atividade nervosa simpática renal (ANSr), o barorreflexo, a expressão gênica de citocinas inflamatórias, de componentes do sistema renina-angiotensina (SRA), das isoformas da NADPH oxidase e da ativação da micróglia (CD11) no hipotálamo em ratos normotensos e/ou hipertensos tratados com ATZ sc. Adicionalmente foram testados a resposta pressora da noradrenalina ou ANG II injetadas intravenosamente (iv), a resposta hipotensiva causada pelo bloqueio ganglionar com hexametônio, a ingestão de água e alimento e excreção urinária em ratos normotensos e hipertensos tratados com ATZ sc. Foram utilizados ratos Holtzman normotensos, ratos Holtzman com hipertensão 2R1C e SHR. A PAM e FC foram registradas em ratos conscientes e com livre movimentação, exceto ratos que foram usados para registro de atividade simpática. A injeção sc de ATZ (300 mg/kg de peso corporal) agudamente reduziu por pelo menos 4 horas a PAM em SHR (192 ± 4 mmHg pré-injeção de ATZ, vs. 173 ± 6 mmHg após ATZ) e em ratos com hipertensão 2R1C (170 ± 8 mmHg pré-injeção de ATZ, vs. 158 ± 13 mmHg após ATZ) por pelo menos 4 horas e também reduziu a FC. O tratamento crônico com ATZ (600 mg/kg de peso corporal/dia) sc por 9 dias também reduziu a PAM em ratos SHR (ATZ: 172 ± 8 mmHg, vs. salina: 198 ± 2 mmHg) e em ratos 2R1C (ATZ: 137 ± 12 mmHg, vs. salina: 181 ± 9 mmHg), sem alterar a FC, o comprometimento do barorreflexo presente em animais hipertensos, a ingestão de água e alimento e a excreção urinária. O tratamento com ATZ sc cronicamente reduziu a modulação simpática da PAS em ratos SHR (ATZ: 2,6 ± 1,2 mmHg2, vs. salina: 6,3 ± 3,4 mmHg2) e em ratos 2R1C (ATZ: 3,2 ± 0,4 mmHg2, vs. salina: 7,6 ± 1,5 mmHg2) e do IP, aumentou a modulação parassimpática do IP em ratos SHR (ATZ: 90,5 ± 4,5 un, vs. salina: 76,5 ± 7,8 un) e em ratos 2R1C (ATZ:85,3 ± 2,9 un vs. salina: 68,6 ± 3 un) e melhorou o balanço simpato-vagal em ratos SHR (ATZ: 0,11 ± 0,05, vs. salina: 0,35 ± 0,17) e em ratos 2R1C (ATZ: 0,19 ± 0,05, vs. salina: 0,52 ± 0,09). O tratamento crônico com ATZ sc por 9 dias em ratos com hipertensão 2R1C também reduziu a expressão de RNAm para interleucina 6 (IL-6) (ATZ: 0,80 ± 0,06 número de vezes, vs. salina: 2,32 ± 0,36 número de vezes), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e do receptor AT1 (AT1r) (ATZ: 0,74 ± 0,04 número de vezes, vs. salina: 1,19 ± 0,22 número de vezes) no hipotálamo. ATZ cronicamente em ratos SHR também reduziu a expressão de RNAm da IL-6 (ATZ: 1,17 ± 0,07 número de vezes, vs. salina: 1,53 ± 0,11 número de vezes), AT1r (ATZ: 0,81 ± 0,03 número de vezes, vs. salina: 1,0 ± 0,04 número de vezes), da isoforma NOX2 da NADPH oxidase (ATZ: 0,85 ± 0,06 número de vezes, vs. salina: 1,52 ± 0,27 número de vezes) e da ativação da micróglia (CD11) (ATZ: 1,47 ± 0,06 número de vezes, vs. salina: 1,79 ± 0,08 número de vezes) no hipotálamo. A injeção de ATZ (300 mg/kg de peso corporal) sc em ratos com hipertensão 2R1C reduziu agudamente a atividade nervosa simpática renal (-51,5 ± 10%) e a resposta hipotensiva produzida pela injeção iv do bloqueador ganglionar hexametônio (ATZ: Δ -58 ± 5 mmHg, vs. salina: Δ -106 ± 7 mmHg), sem alterar a resposta pressora da noradrenalina ou ANG II iv, o que sugere que os efeitos anti-hipertensivos do ATZ seriam mais provavelmente causados pela redução da atividade simpática por uma ação central desta droga e não por uma ação vascular direta do ATZ. Portanto, os presentes resultados sugerem que o aumento da disponibilidade de H2O2 endógeno pela administração aguda ou crônica de ATZ sc produz efeitos anti-hipertensivos que são devidos a uma diminuição da atividade nervosa simpática que está associada com a diminuição da neuroinflamação, de receptores AT1, RNAm para NADPH oxidase e da ativação da micróglia no hipotálamo. Estes efeitos podem ser resultados de um bloqueio ou comprometimento das ações centrais da ANG II como demonstrado em estudo anterior (LAUAR et al., 2010). / FAPESP: 2013/05189-4

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.