La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Responses of activated T cells are suppressed upon engagement of the receptor programmed cell death-1 (PD-1) with its ligands (PD-L1 and PD-L2). Experiments using the mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated that the PD-1/PD-Ls interaction contributes to attenuate disease severity. However, the expression and the role of PD-1 and PD-Ls have been partially documented in inflammatory murine models and human CNS data are still incomplete. We determined that primary cultures of human astrocytes, microglia, oligodendrocytes, or neurons expressed low or undetectable PD-L1 levels under basal conditions, but inflammatory cytokines significantly induced such expression, especially on astrocytes and microglia. Blocking PD-L1 expression in astrocytes using specific siRNA in co-culture led to significantly increased CD8 T cell responses (proliferation, cytokines, lytic enzyme). Thus, our results establish that inflamed human glial cells can express sufficient and functional PD-L1 to inhibit CD8 T cell responses. Extensive immunohistochemical analysis of post-mortem brain tissues demonstrated a significantly greater PD-L1 expression in MS lesions compared to control tissues, which co-localized with astrocyte and microglia/macrophage cell markers. However, more than half of infiltrating CD8 T lymphocytes in MS lesions did not express PD-1, the cognate receptor. Similar results were obtained in EAE mice. Even though CNS cells expressed PD-L1 at the peak of the disease, PD-1 intensity on infiltrating T cells decreased throughout EAE disease development. This reduction of PD-1 level on activated T cells prevented these cells to receive PD-L1 inhibitory signal. We also investigated whether human brain endothelial cells (HBECs), which form the blood brain barrier (BBB), can express PD-L1 or PD-L2 and thereby modulate T cells. HBECs expressed PD-L2 under basal conditions, whilst PD-L1 was not detected. Both ligands were up-regulated under inflammatory conditions. Blocking PD-L1 and PD-L2 led to increased transmigration and enhanced responses by human CD8 T cells in co-culture assays. Similarly, PD-L1 and PD-L2 blockade significantly increased CD4 T cell transmigration. Brain endothelium in normal tissues and MS lesions did not express detectable PD-L1; in contrast, all blood vessels in normal brain tissues were PD-L2-positive, while only about 50% expressed PD-L2 in MS lesions. Therefore, our results demonstrate that under basal conditions, PD-L2 expression by HBECs impedes the migration of activated immune T cells through the BBB, and inhibits their activation. However, such impact is impaired in MS lesions due to down-regulation of PD-L2 levels on the endothelium. The majority of infiltrating CD8 T cells is devoid of PD-1, thus insensitive to PD-L1 inhibitory signal providing by CNS cells once they have entered the CNS.

Le trafic membranaire est essentiel dans les neurones pour la morphogénèse, le recyclage des vésicules synaptiques et des récepteurs. L’exocytose des récepteurs AMPA contenus dans les endosomes de recyclage (ER) est nécessaire pour l’expression de la plasticité synaptique à long terme (PLT). Pour étudier ce mécanisme, nous avons visualisé l’exocytose par microscopie de fluorescence sur des neurones en culture transfectés avec le récepteur de la transferrine (TfR), un marqueur des ER, fusionné à la phluorine. Un examen systématique des événements d'exocytose a révélé des différences de comportement. Dans la plupart des cas, les récepteurs diffusent rapidement dans la membrane plasmique après exocytose (discharge), mais dans environ 25% des cas, les récepteurs restent concentrés (display). L’utilisation de changements rapides de pH extracellulaire autour de la cellule montre que l’exocytose est transitoire : après quelques secondes (médiane 2.6s) les récepteurs sont réinternalisés. Ce mécanisme a pu être étendu aux récepteurs AMPA et β2-adrenergique, pour lesquels l’exocytose de type display avait déjà été décrite. L’imagerie deux couleurs montre que Rab11, un marqueur des ER, est enrichie au site d’exocytose. L’expression d’un dominant négatif de Rab11 connu pour inhiber la PLT provoque une diminution spécifique de la fréquence des évènements discharge. Dans nos recherches sur le mécanisme de l’exocytose, nous avons testé l’implication des protéines SNARE dans la fusion membranaire. Ainsi VAMP4 est enrichie avec le TfR dans les ER qui sont exocytés à une fréquence équivalente. De plus, elle est requise pour le recyclage du TfR. / Membrane trafficking is essential for neuronal function: from growth of neurons and synapse formation to recycling of synaptic vesicles and receptors, questions concerning exocytosis and endocytosis are stimulating neurobiology research. In particular, trafficking of glutamate receptors present in recycling endosomes (REs) is necessary for the expression of long term potentiation (LTP). To investigate the mechanism of exocytosis in dendrites, we have imaged cultured rat hippocampal neurons transfected with transferrin receptor, a classical marker of REs, tagged with phluorin. As for AMPA receptors or β2-adrenegric receptors, single exocytic events has revealed two main behaviors: in most cases, receptors diffuse quickly in the plasma membrane after exocytosis (discharge events), but receptors can also remain clustered (display events). Using fast extracellular pH changes around the recorded cell, we show that for display events exocytosis is transient: after a few seconds (median 2.6 s) receptors are internalized. Moreover, using two color imaging of single exocytosis events with markers of neuronal compartments, we found that Rab11 is enriched at the exocytosis site, confirming the endosomal origin of the vesicles. Overexpression of a dominant negative form of Rab11 known to impair LTP decreases selectively the frequency of discharge events. As SNARE proteins are involved in virtually all membrane fusion processes, we investigated the role of Vamp proteins in somatodendritic exocytosis events. We found that Vamp4, unlike Vamp2 or Vamp7, is enriched in TfR containing compartments and can undergo exocytosis at high frequency and is required for TfR exocytosis.

L’utilisation de réseaux de neurones artificiels pour divers types de traitements d’information bio-inspirés est une technique de plus en plus répandue dans le domaine de l’intelligence artificielle. Leur fonctionnement diffère avantageusement de celui des ordinateurs conventionnels en permettant une plus grande parallélisation des calculs, ce qui explique pourquoi autant d’efforts sont déployés afin de réaliser une plate-forme matérielle dédiée à leur simulation. Pour ce projet, une architecture matérielle flexible simulant efficacement un réseau de neurones à décharges est présentée. Celle-ci se distingue des architectures existantes notamment parce qu’elle utilise une approche de simulation à événements discrets et parce qu’elle permet une détection efficace des événements simultanés. Ces caractéristiques en font une plate-forme de choix pour la simulation de réseaux de neurones à décharges de plus de 100 000 neurones où un niveau important de synchronie des décharges neuronales est atteint. Afin d’en démontrer les performances, une application en traitement d’images utilisant cette architecture a été réalisée sur FPGA. Cette application a permis de démontrer que la structure proposée pouvait simuler jusqu’à 2[indice supérieur 17] neurones et traiter des dizaines de millions d’événements par secondes lorsque cadencé à 100 MHz.

Neurodegeneration is a progressive loss of neuron function or structure, including death of neurons, and occurs at many different levels of neuronal circuitry. In this thesis I discuss Parkinson’s Disease (PD), the second most common neurodegenerative disease (NDD). PD is a devastating progressive NDD often with delayed diagnosis due to detection methods that depend on the appearance of visible motor symptoms. By the time cardinal symptoms manifest, 60 to 80 percent or more of the dopamine-producing cells in the substantia nigra are irreversibly lost. Although there is currently no cure, earlier detection would be highly beneficial to manage treatment and track disease progression. However, today’s clinical diagnosis methods are limited to subjective evaluations and observation. Onset, symptoms and progression significantly vary from patient to patient across stages and subtypes that exceed the scope of a standardized diagnosis. The goal of this thesis is to provide the basis of a more general approach to study the brain, investigating early detection method for NDD with focus on PD. It details the preliminary development, testing and validation of tools and methods to objectively quantify and extrapolate motor and non-motor features of PD from behavioral and cognitive output during everyday life. Measures of interest are categorized within three domains: the motor system, cognitive function, and brain activity. This thesis describes the initial development of non-intrusive tools and methods to obtain high-resolution movement and speech data from everyday life and feasibility analysis of facial feature extraction and EEG for future integration. I tested and validated a body sensor system and wavelet analysis to measure complex movements and object interaction in everyday living situations. The sensor system was also tested for differentiating between healthy and impaired movements. Engineering and design criteria of the sensor system were tested for usability during everyday life. Cognitive processing was quantified during everyday living tasks with varying loaded conditions to test methods for measuring cognitive function. Everyday speech was analyzed for motor and non-motor correlations related to the severity of the disease. A neural oscillation detection (NOD) algorithm was tested in pain patients and facial expression was analyzed to measure both motor and non-motor aspects of PD. Results showed that the wearable sensor system can measure complex movements during everyday living tasks and demonstrates sensitivity to detect physiological differences between patients and controls. Preliminary engineering design supports clothing integration and development of a smartphone sensor platform for everyday use. Early results from loaded conditions suggest that attentional processing is most affected by cognitive demands and could be developed as a method to detect cognitive decline. Analysis of speech symptoms demonstrates a need to collect higher resolution spontaneous speech from everyday living to measure speech motor and non-motor speech features such as language content. Facial expression classifiers and the NOD algorithm indicated feasibility for future integration with additional validation in PD patients. Thus this thesis describes the initial development of tools and methods towards a more general approach to detecting PD. Measuring speech and movement during everyday life could provide a link between motor and cognitive domains to characterize the earliest detectable features of PD. The approach represents a departure from the current state of detection methods that use single data entities (e.g.one-off imaging procedures), which cannot be easily integrated with other data streams, are time consuming and economically costly. The long-term vision is to develop a non-invasive system to measure and integrate behavioral and cognitive features enabling early detection and progression tracking of degenerative disease.

La science a avancé depuis le XIX ème siècle. Des nouveaux outils sont apparus : la microscopie optique nous donne la vision des cellules, la microscopie électronique nous entraine au cœur de celles-ci. L’imagerie par résonance magnétique est apparue dans les années soixante-dix. Depuis son évolution, l’IRM nous entraine de plus en plus loin dans les profondeurs secrètes de nos cerveaux. La possibilité d’observer l’activité neuronale à l’aide de l’imagerie fonctionnelle est une grande révolution. Cette thèse montrera la possibilité que l’on a d’observer l’activité d’un neurone individuel sans modification de son réseau grâce à l’imagerie rehaussée au manganèse. L’étude sera effectuée sur des Aplysies à très haut champ (17T). Ces animaux sont des mollusques marins gastropodes qui possèdent une particularité : leurs neurones sont de tailles importantes, ils peuvent atteindre 1 mm de diamètre. Leurs neurones sont regroupés en plusieurs ganglions. Mon étude portera sur le ganglion buccal, qui est le ganglion le plus étudié dans les recherches en électrophysiologie. Avant de réaliser les acquisitions, j’ai dû concevoir plusieurs antennes de tailles microscopiques adaptées à la taille des ganglions. En réduisant la taille des antennes, le rapport signal sur bruit augmente. Dans un deuxième temps, une double antenne a été développée permettant l’acquisition de deux échantillons simultanément. Cette antenne a nécessité de créer des préamplificateurs fonctionnant à 730 MHz. La première série d’expériences a permis d’observer l’évolution de l’activité neuronale selon différents stimulus liés au comportement alimentaire des aplysies in-vivo. J’ai montré grâce à la technique mise en place que l’on peut distinguer par IRM l’activité de chaque neurone face à un stimulus. Par la suite, pour continuer ce travail, une deuxième série d’expériences a été effectuée in-vitro. J’ai étudié le comportement des neurones selon les neuro-stimulateurs perfusés : la dopamine et la sérotonine, tous les deux présents naturellement dans l’aplysie. Globalement les neurones ont été activés mais après les avoir observés individuellement, j’ai remarqué quelques différences selon les neurotransmetteurs. Cette technique peut maintenant être utilisée pour étudier d’autres conduites de l’aplysie comme le comportement compulsif. L’étude sur la mémoire peut être aussi envisagée. Les origines comportementales ont probablement des mécanismes identiques entre les différentes espèces animales et donc avec l’Homme comme l’a démontré les études d’Eric Kandel sur la mémoire. / Science has evolved since the 19th century. New tools have appeared such as optical microscopy which gives us the vision of cells and electronic microscopy which leads us into their hearts. The magnetic resonance imaging appeared in the seventies. Evolving over time, the MRI has taken us farther and farther into the secret depths of our brains. The possibility of observing the neuronal activity thanks to the functional imaging is a major evolution. This thesis will show the possibility we have to observe the activity of a single neuron without modification of its network thanks to the manganese enhanced magnetic resonance imaging technique. The study was done on the Aplysia at very high field magnet (17T). These animals are marine gastropod mollusks with a peculiarity: their neurons are of important size and can reach 1 mm in diameter. Their neurons are grouped into several ganglia. My study concerns the buccal ganglion which is the most studied ganglia in the research in electrophysiology. Before making any acquisitions, I had to conceive several microscopic coils adapted to the size of the ganglions. By reducing the size of the coils, the signal of the noise ratio increases. Then, a double coil allowing the simultaneous acquisition of two samples was built. This antenna required the construction of pre-amplifiers operating at 730 MHz. The first series of experiments helped observe the evolution of the neuronal activity according to different stimuli linked to the eating habits of the Aplysia in vivo. Thanks to the technique implemented, I shall show that, using MRI, it is possible to distinguish the activity of each neuron with respect to a stimulus. Afterwards, to continue this work, a second series of experiments was made in vitro. I studied the behavior of neurons when perfused with neural stimulators: dopamine and serotonin, both naturally present in the Aplysia. Generally, all neurons were activated but when observing them individually, I noticed some differences. Studies in electrophysiology will allow us to get a better understanding and a confirmation of the results of this study. The MEMRI technique can be used in the future to study various disorders such as compulsive behaviors, which are present in the Aplysia, and probably have the same origins as in humans, given that many fundamental processes (such as memory studied by Eric Kandel who he demonstrated that human and Aplysia memories works with the same mechanism) are similar between the two species.

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Le disulfure de diméthyle (DMDS), molécule volatile libérée par les Allium, est un fumigant prometteur en remplacement du bromure de méthyle. Par l'utilisation des techniques d'électrophysiologie (patch-clamp), de biologie moléculaire et d'imagerie calcique sur neurones d'insectes, nous avons identifié de nouvelles cibles altérées par le DMDS à une faible concentration (1 µM). Le DMDS modifie l'activité spontanée régulière des DUM neurones en des bouffées de potentiels d'action séparées par des phases de silence. Cette altération de fréquence est la conséquence d'effets sur plusieurs cibles. Nous avons montré que le DMDS décale la dépendance vis-à-vis du potentiel de l'activation et de l'inactivation du courant Na2 vers de potentiels plus négatifs, rendant la cellule plus excitable. Dans un deuxième temps nous avons mis en évidence que le DMDS induit une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire via l'activation des canaux TRPg et une sortie de calcium des stocks intracellulaires. Cette variation de calcium module, en cloche, les courants potassium dépendants du calcium (KCa). Grâce à l'étude du mode d'action du DMDS sur DUM neurones et au développement de nouvelles techniques associant la biologie moléculaire à l'électrophysiologie, nous avons apporté de nouveaux arguments en faveur de l'existence de deux courants KCa distincts. Parallèlement, grâce à une technique d'électroencéphalographie par télémétrie sur souris, nous avons révélé que le DMDS est susceptible d'engendrer des anomalies de l'activité électroencéphalographique.

Les neurones émettent des impulsions électriques suivant une loi dite ''tout-ou-rien'' : un potentiel d'action stéréotypé est généré et propagé pour des amplitudes suffisamment grandes du stimulus, autrement aucune décharge n'a lieu. L'amplitude minimale au-delà de laquelle une impulsion est générée est appelée seuil d'excitabilité. Des expériences in vivo récentes, dans lesquelles l'activité membranaire des neurones du système nerveux central a été enregistrée, ont mis en évidence une variabilité significative de ce seuil. De plus, il a été observé une adaptation du seuil à la dynamique de l'activité membranaire précédant l'initiation des impulsions. Ces observations nous ont intéressées car elles concernaient à la fois les hypothèses fondamentales de la biophysique de l'excitabilité et les conceptions classiques de l'intégration synaptique. Nous nous sommes alors demandé dans quelle mesure et comment les différents mécanismes biophysiques impliqués dans l'excitabilité contribuent à la variabilité du seuil. Nous nous sommes aussi demandé quelle est l'influence spécifique sur la dynamique du seuil d'un mécanisme classique de régulation de la décharge, l'inactivation du canal sodium. Nous avons abordé ces questions à partir d'analyses mathématiques et de simulations numériques de modèles d'excitabilité. Nous avons montré qu'il est possible d'obtenir un seuil variable dans le cadre des hypothèses classiques et de le prédire quantitativement à partir des variables biophysiques de l'excitabilité. Nous avons aussi confirmé que l'inactivation du canal sodium permet de rendre compte des différentes caractéristiques du seuil. Ainsi, notre travail confirme la pertinence des modèles à seuil pour décrire la dynamique de l'excitabilité neuronale.

Les douleurs viscérales sont des douleurs diffuses et irradiantes dont le traitement est souvent problématique faute d'étiologie bien identifiée. En particulier, les douleurs abdominales observées dans les troubles fonctionnels digestifs (TFI) s'expriment en l'absence d'atteinte organique ce qui rend difficile la compréhension des mécanismes physio-pathologiques de ces troubles. Cette problématique est un enjeu de santé publique puisque les TFI, et en premier lieu le syndrome de l'intestin irritable (SII), concerneraient 20% de la population occidentale. Les études cliniques fournissent des pistes de recherche sur l'origine des troubles dans les TFI mais sont souvent insuffisantes pour décortiquer leurs mécanismes physio-pathologiques. Les modèles animaux apparaissent comme une voie alternative permettant de tester des hypothèses diverses sur l'origine des douleurs viscérales. Nous avons ainsi utilisé un modèle animal de SII développé au laboratoire, le modèle butyrate, qui se base sur des données cliniques rapportant un excès de butyrate, un acide gras à chaîne courte, dans le côlon des patients atteints de SII. Ce modèle consiste en 6 instillations intra-coliques de butyrate 200mM, réalisées sur une durée de 4 jours, qui induisent une hyper-sensibilité colique (HSC) chez le rat dès la fin des instillations. L'HSC induite par le butyrate est évaluable par le test de distension colo-rectale (DCR). Elle est persistante et ne s'accompagne pas de lésion de la muqueuse colique ce qui est en accord avec les caractéristiques cliniques du SII. Après avoir établi la pertinence du modèle butyrate pour l'étude du SII, l'équipe s'est attaché à l'étude des mécanismes par lesquels le butyrate induit une HSC. Un traitement néo-natal des rats par la capsaïcine, qui permet de détruire les fibres nociceptives de type C, empêche le développement de l'HSC induite par le butyrate chez ces rats devenus adultes. Les afférences coliques de type C transmettent donc le message douloureux viscéral induit par le butyrate. L'objectif premier de ce travail de thèse a été de déterminer par quel mécanisme le butyrate sensibilise ces afférences. Nous avons émis l'hypothèse que le nerve growth factor (NGF), une neurotrophine impliquée dans la nociception et dans les processus d'inflammation neurogène des nerfs entériques dans le SII, pourrait contribuer à la sensibilisation colique. Implication du NGF dans l'HSC Nous avons montré que l'administration répétée d'anticorps anti-NGF (voie i.p.) prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée lors du test de DCR. De plus, nous avons montré par immuno-histo-chimie (IHC) que le NGF est exprimé dans le côlon des rats traités avec du butyrate mais son expression n'y est pas augmentée. En revanche, le NGF est sur-exprimé dans les ganglions rachidiens dorsaux (GRD) innervant le côlon. Ces résultats indiquent que le NGF est impliqué dans l'HSC induite par le butyrate et que son action pourrait s'exercer principalement au niveau du système nerveux périphérique (GRD). En effet, le NGF est impliqué dans le développement des phénomènes d'hyperalgie en induisant l'expression de molécules jouant un rôle clé dans la nociception comme les canaux ioniques. Notre attention s'est portée sur les canaux ioniques sensibles à l'acide (ASIC) et le transient receptor potential vannilloid1 (TRPV1) car de nombreuses études ont montré l'implication de ces canaux dans les douleurs viscérales et leur modulation par le NGF. Implication des canaux ASIC dans l'HSC Nous avons montré que l'administration d'amiloride (antagoniste des canaux ASIC, voie i.v.) mais pas celle de capsazepine (antagoniste du TRPV1, voie i.p.) prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée lors du test de DCR. L'HSC induite par le butyrate implique donc un mécanisme dépendant des ASIC mais pas de TRPV1. De plus, nous avons montré par RT-PCR semi-quantitative que le niveau d'expression des ARNm des gènes codant les sous-unités ASIC1A et ASIC1B est augmentée dans les GRD des rats butyrate. L'augmentation du niveau d'expression des ARNm a été corrélée à une augmentation de l'expression de la protéine ASIC1A dans les GRD, quantifiée par IHC. En déterminant la proportion de neurones immuno-réactifs (IR) à la protéine ASIC1A, nous avons montré que sa sur-expression est restreinte aux neurones de petit diamètre. Ces résultats montrent que le canal ASIC1A est impliqué dans l'HSC induite par le butyrate. Nous avons ensuite voulu savoir si, en accord avec la bibliographie, la sur-expression de ASIC1A pouvait être la conséquence de celle du NGF. Modulation de l'expression de ASIC1A par le NGF dans l'HSC Nous avons tout d'abord montré par microscopie confocale que le NGF et son récepteur de haute affinité (trkA) sont colocalisés avec ASIC1A dans les neurones sensoriels et en particulier dans ceux exprimant le calcitonin gene-related peptide. Nous avons ensuite montré par IHC et par Western blot que la sur-expression de ASIC1A dans les GRD est prévenue par le blocage du NGF grâce à l'administration répétée d'anticorps anti-NGF (voie i.p.). Ces résultats indiquent que la sur-expression de ASIC1A dans l'HSC induite par le butyrate est dépendante du NGF. Nous pouvons conclure que le NGF et le canal ASIC1A interviennent dans les GRD (et probablement dans les neurones sensoriels de type nociceptif) où ils participent aux phénomènes de sensibilisation concourant au développement de l'HSC induite par le butyrate. Nous ne rapportons pas de variation d'expression du NGF ou de ASIC1A au niveau colique. Ce résultat suggère que la mise en jeu de ces molécules ne se fait pas au niveau des terminaisons libres coliques mais plutôt dans l'élément pré-synaptique de la première synapse nociceptive centrale où elles pourraient amplifier l'activité synaptique médullaire. Nous avons ainsi émis l'hypothèse que l'HSC induite par le butyrate est associée à une sensibilisation centrale de la moëlle épinière (MEp). Sensibilisation centrale dans l'HSC Nous avons utilisé la méthodologie Fos, un marqueur de l'activité neuronale, afin d'évaluer l'état d'excitation de la MEp chez les rats butyrate. L'étude de l'expression spinale de la protéine Fos chez les rats soumis à une DCR nocive répétée a montré que les rats traités avec du butyrate présentent une densité de neurones Fos-IR augmentée par rapport aux rats contrôles dans les couches superficielles de la corne dorsale de la MEp. L'HSC induite par le butyrate s'accompagne spécifiquement du recrutement des segments thoraciques T10-T11-T12 de la MEp dans lesquels nous avons observé une une hyper-réactivité neuronale en réponse à la DCR. De plus, en l'absence de stimulation colique, les rats butyrate présentent hyper-activité basale dans les segments T10-T11-T12. Comme le canal ASIC1A spinal participe aux courants provoqués par un stimulus douloureux, nous avons ensuite voulu savoir si cette hyper-activité de la MEp pouvait être la conséquence d'une transmission synaptique accrue impliquant ASIC1A. Nous avons montré que l'administration de PcTx1 (antagoniste des canaux ASIC1A, voie i.t.) prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée lors du test de DCR. Ce résultat indique que les canaux ASIC1A participent aux mécanismes centraux de l'HSC dans le modèle butyrate. Nous avons également montré par RT-PCR et Western blot que le canal ASIC1A est sur-exprimé dans la MEp des rats butyrate. De plus, il est exprimé dans les neurones spinaux activés par la DCR où il est co-localisé avec Fos. ASIC1A pourrait donc participer à la transmission du message nociceptif viscéral dans la corne dorsale de la MEp. L'expression des ARNm codant les sous-unités ASIC2A et ASIC2B a également été trouvée augmentée dans la MEp par RT-PCR ce qui suggère que l'hyper-excitabilité spinale observée dans le modèle butyrate pourrait résulter d'une augmentation des conductances ioniques générées par l'activation des canaux hétéromériques de type ASIC1/ASIC2. Tout comme à la périphérie, la sur-expression de ASIC1A pourrait être sous dépendance du NGF. Nos résultats montrent en effet que le NGF est exprimé dans la MEp et que l'administration systémique répétée d'anticorps anti-NGF prévient la sur-expression des ARNm et de la protéine ASIC1A dans la MEp des rats traités avec du butyrate. En conclusion, ce travail de thèse suggère que le NGF et le canal ASIC1A jouent un rôle critique dans le développement de douleurs viscérales en contribuant à la fois aux phénomènes de sensibilisations périphérique et centrale. La meilleure compréhension des mécanismes d'interaction ASIC-NGF dans l'HSC pourrait donc ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement des douleurs viscérales d'étiologie inconnue comme le SII en se basant sur des stratégies visant à diminuer l'effet potentialisateur du NGF sur les ASIC.

Lipids are important for structural and physiological functions of neuronal cell membranes. They exhibit a range of biological effects many are bioactive lipid mediators derived from polyunsaturated fatty acids such as sphingolipids, fatty acid ethanolamides (FA-EA) and endocannabinoids (EC). These lipid mediators and oxysterols elicit potent bioactive functions in many physiological and pathological processes of the brain and neuronal tissues. They have been investigated for biomarker discovery of ageing, neuroinflammation and neurodegenerative disorders. The n-3 fatty acids EPA and DPA are thought to exhibit a range of neuroprotective effects many of which are mediated through production of such lipid mediators. The aims of this study were to evaluate the effects of n-3 EPA and n-3 DPA supplementation on RBC membranes and in this way assess dietary compliance and to investigate brain sphingomyelin species of adult and aged rats supplemented with n-3 EPA and n-3 DPA to evaluate the effects and benefits on age-related changes in the brain. Furthermore, to study the effects of lithium on the brain FA-EAs and ECs to further understand the neuroprotective effects of lithium neuroprotective action on neuroinflammation as induced by LPS. Finally to examine if circulating oxysterols are linked to the prevalence of ALS and whether RBC fatty acids are markers of this action in relation to age and disease stages. These analytes were extracted from tissue samples and analysed with GC, LC/ESI-MS/MS and GC-MS. It was found that aged rats exhibited a significant increase in brain AA and decrease in Σn-3 and Σn-6 PUFAs when compared to adult animals. The observed increase of brain AA was reversed following n-3 EPA and n-3 DPA supplementation. Sphingomyelin was significantly increased when aged animals were supplemented with n-3 DPA. LPS treatment following lithium supplementation increased LA-EA and ALA-EA, while it decreased DHA-EA. Both oxysterols 24-OH and 27-OH increased in ALS patients and SOD1-mice. Eicosadienoic acid was different in ASL-patients compared to aged SOD1-mice. These studies demonstrated that dietary intake of n-3 EPA and n-3DPA significantly altered RBC fatty acids and sphingolipids in rat brain. They suggest that n-3 DPA can be a potential storage form for EPA, as shown by retro-conversion of n-3 DPA into EPA in erythrocyte membranes, ensuring supply of n-3 EPA. Also, n-3 EPA and n-3 DPA supplementation can contribute to an increase in brain sphingomyelin species with implications for age effects and regulation of brain development. Effects of lithium highlight novel anti-neuroinflammatory treatment pathways. Both 24-hydroxycholesterol and eicosadienoic acid may be used as biomarkers in ALS thereby possibly helping to manage the progressive stages of disease.