This thesis is devoted to designing and applying advanced algorithmical and statistical tools for analysis of NGS data related to cancer and infection diseases. NGS data under investigation are obtained either from host samples or viral variants. Recently, random peptide phage display libraries (RPPDL) were applied to studies of host's antibody response to different diseases. We study human antibody response to breast cancer and mouse antibody response to Lyme disease by sequencing of the whole antibody repertoire profiles which are represented by RPPDL. Alternatively, instead of sequencing immune response NGS can be applied directly to a viral population within an infected host. Specifically, we analyze the following RNA viruses: the human immunodeficiency virus (HIV) and the infectious bronchitis virus (IBV). Sequencing of RNA viruses is challenging because there are many variants inside population due to high mutation rate. Our results show that NGS helps to understand RNA viruses and explore their interaction with infected hosts. NGS also helps to analyze immune response to different diseases, trace changing of immune response at different disease stages.

Le syndrome de Marfan (MFS) est une maladie génétique rare. Les signes cliniques sont principalement squelettiques, oculaires et cardiovasculaires. Le premier gène identifié est FBN1. Une LSDB UMD créée en 1995 a permis de colliger les mutations identifiées chez les patients. D’autres gènes ont été identifiés comme causant des syndromes apparentés : FBN2, TGFBR1, TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 et MYLK. Ma thèse avait pour but de mettre à jour ces différentes bases et de créer celles des nouveaux gènes. Les techniques de séquençage nouvelle génération dans la pratique clinique amènent des médecins non spécialistes à rapporter des variations secondaires dans ces gènes « actionable ». Il s’agit de la ressource la plus complète pour les cliniciens et les généticiens pour interpréter les variants associés au MFS et ses pathologies associées pour les variants primaires et secondaires.La bicuspidie de la valve aortique (2 feuillets au lieu de 3) est la malformation cardiovasculaire la plus fréquente touchant 0,6 à 2 % de la population. Ma thèse avait pour but d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la BAV. Grâce à une cohorte de 200 patients, le gène HOXA1, un facteur de transcription, a pu être examiné de manière plus approfondie. Alors qu’il contient une répétition de 10 histidines, les individus hétérozygotes mutés en présentent 11. Mes études ont permis de démontrer l’imputabilité de cette mutation. Dans un second temps, un séquençage d’exomes entiers a permis de mettre en évidence de nouveaux variants prédits pathogènes. Ces données permettront de mieux comprendre le rôle physiologique d’HOXA1 et des nouveaux gènes candidats dans la pathogénèse de la BAV chez l’humain. / Marfan Syndrome is a rare genetic disorder. Clinical signs are mainly skeletal, ocular and cardiovascular. The first gene identified is FBN1. A LSDB UMD was created in 1995 to colligate all the mutations identified in. Thereafter, several others genes were identified involved in related disorders : FBN2, TGFBR1 and TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 and MYLK. The objectives of my PhD were to update these databases and to create new ones for genes. Next generation sequencing in clinical practice leads non-specialized doctors to report pathogenic secondary variants in “actionable” genes. Our databases are the only resources providing access to the full spectrum of known pathogenic mutations with checked and interpreted data from many reference diagnostic laboratories and research centers worldwide, and the most comprehensive resources for clinicians and geneticists to interpret variations linked to Marfan syndrome and related disorders not only primary but also secondary variants.Bicuspid Aortic Valve is the most common cardiovascular malformation affecting 0.6-2% of the population (2 leaflets instead of 3). Thanks to a cohort of 200 BAV patients, HOXA1 gene, a transcription factor, has been screened. While HOXA1 contains a string of 10 histidine repeats, these individuals are heterozygous for an 11 histidine repeat variant. My studies showed the imputability of this mutation. In a second phase, whole exome sequencing allow us to highlight new variants predicted pathogenic. Studies are still ongoing to confirm their imputability. These data contribute to our better understanding of the physiological of HOXA1 and new candidate genes in the pathogenesis of BAV disease in humans.

Les ataxies héréditaires représentent un groupe hétérogène de maladies neurodégénératives caractérisées par des anomalies de la coordination des mouvements associées à des troubles de l’équilibre et de la marche. L’immense diversité fonctionnelle des protéines touchées dans les ataxies autosomiques récessives (AR) souligne que celles-ci ne peuvent pas être classées selon les voies physiopathologiques en cause. De ce constat résulte une classification émergente des AR en fonction de la raison expliquant la nature « modérée » de l’atteinte neurologique, à savoir : (i) les mutations avec perte de fonction partielle, (ii) la présence redondante de protéines de la même famille fonctionnelle, (iii) la présence redondante d’autres voies détoxifiantes. L’objectif de ce travail était d’identifier de nouveaux gènes responsables d’AR syndromiques grâce à une stratégie couplant la cartographie par homozygotie et l’analyse d’exomes de larges familles consanguines. L’analyse par génotypage de l’une de ces familles nous a permis d’identifier 2 régions homozygotes partagées par les 3 enfants atteints par le syndrome de Lichtenstein-Knorr (ataxie-surdité). Parmi les variants présents dans ces régions, j’ai identifié une mutation faux-sens dans le gène SLC9A1 codant pour l'échangeur Na+/H+1, NHE1. Cette mutation transforme la Glycine 305, un petit acide aminé très conservé et localisé dans le 8ème domaine transmembranaire, en Arginine, acide aminé chargé positivement. Bien que NHE1 soit une protéine exprimée de façon ubiquitaire, 2 modèles souris « knock-out » de ce gène ont montré sa fonction essentielle au niveau des noyaux profonds cérébelleux, vestibulaires et cochléaires où a été observé une dégénérescence spécifique suite à l’inactivation du gène Slc9a1. Nous avons ensuite apporté la preuve de l’effet délétère de la mutation p.Gly305Arg en montrant une réduction importante mais pas totale de l’activité de l’échangeur muté ainsi qu’une abolition de son expression à la surface cellulaire, démontrant ainsi que SLC9A1 est le gène impliqué dans le syndrome de Lichtenstein-Knorr (Guissart et al. Hum Mol Genet 2015). L’analyse de l’exome d’une famille consanguine multi-générationnelle présentant une ataxie spino-cérébelleuse, une cécité et une surdité et dont le locus avait été identifié par notre équipe en 2000 sur le chromosome 6p23-p21 (SCAR3 ; MIM #271250) m’a permis d’identifier la mutation faux-sens homozygote p.Gly306Arg dans le gène SLC52A2, pourtant située sur le chromosome 8qter et déjà décrite chez des patients atteints du syndrome de Brown-Vialetto-Van Laere type 2, indiquant que la liaison génétique initialement publiée pour cette famille était due au hazard. Le séquençage d’exome d'une autre famille avec 2 enfants atteints d’une AR progressive et d’une rétinite pigmentaire et présentant une région homozygote partagée en 6p23-p21 m’a permis d’identifier la mutation faux-sens p.Ala912Val dans le gène PEX6. L'analyse rétrospective des marqueurs du peroxysome a montré un taux d’acide phytanique sérique très modérément augmenté, alors que les fibroblastes m’ont permis de confirmer le caractère pathogène de la mutation p.Ala912Val par l'absence de marquage à la catalase, la présence de structures peroxysomales anormales et une nette augmentation des AGTLC, indiquant une perte de fonction partielle de la protéine PEX6. Par conséquent, en dépit d’une liaison génétique initiale erronée, l’entité SCAR3 est confirmée et est causée par certaines mutations du gène PEX6 (Guissart et al. Eur J Hum Genet 2016). En conclusion, la présence des mutations faux-sens hypomorphes dans ces familles et les données de la littérature démontrent le concept selon lequel de nombreuses AR sont causées par des mutations de type « perte de fonction partielle » touchant une grande variété de voies physiopathologiques, ceci en raison de l’extrême sensibilité des neurones cérébelleux, spino-cérébelleux et sensitifs profonds, à des désordres métaboliques même légers. / Inherited ataxias are a heterogeneous group of neurodegerative diseases that are characterized by incoordination of movement and unsteadiness. The huge functional diversity of affected proteins in autosomal recessive ataxia highlights that these disorders cannot be classified according to relevant physiopathological pathways. Rather, current knowledge shows that no specific physiopathological pathway explains directly the appearance of the symptoms. This gives rise to an emerging recessive ataxia classification based on the reason explaining the “moderate” nature of neurological involvement, namely: (i) partial loss of function mutation, (ii) the presence of redundant functional family member proteins, (iii) the presence of redundant detoxifying pathways. The purpose of this work was to identify new causative genes for syndromic recessive ataxia using a strategy combining homozygosity mapping and exome analysis in large consanguineous families. Genotyping analysis of one of those families has enabled us to identify 2 significant regions of homozygosity shared by the 3 siblings affected by Lichtenstein-Knorr syndrome (ataxia-deafness): one of 23.6 Mb on chromosome 1 and the other of 5.5 Mb on chromosome 7. Among the variants located in the shared homozygous regions, I rapidly identified a missense mutation located in the SLC9A1 gene encoding for NHE1, the Na+/H+ exchanger family member 1. This mutation replaces Glycine 305, a small neutral highly conserved amino-acid, located in the 8th transmembrane segment and conserved in all investigated metazoans by Arginine, a positively charged amino acid. Despite NHE1 is ubiquitously expressed, extensive analysis of 2 Slc9a1 knock-out mice models revealed its crucial role in 3 regions of the central nervous system: vestibular nuclei, cochlear nuclei, and most prominently deep cerebellar nuclei. We then demonstrated the deleterious effect of the p.Gly305Arg mutation showing a significant but not complete reduction of the proton pump activity of NHE1 as well as absence of expression at the cell surface, thus demonstrating that SLC9A1 is the causative gene in Lichtenstein-Knorr syndrome (Guissart et al. Hum Mol Genet 2015). Exome analysis of a multigenerational consanguineous family with spinocerebellar ataxia, blindness and deafness for which we identified linkage to chromosome 6p23-p21 in 2000 (SCAR3; MIM #271250) allowed me to identify in all patients the homozygous p.Gly306Arg missense mutation in SLC52A2, yet located on chromosome 8qter and previously found mutated in patients with Brown-Vialetto-Van Laere type 2, indicating that the genetic linkage published for the SCAR3 family was a false positive result. High recombination rate in the telomeric region and use of widely spaced microsatellite markers explain why correct linkage was initially missed. Exome sequencing of another family with 2 children affected with progressive ataxia and retinitis pigmentosa and with linkage to 6p23-p21 revealed the p.Ala912Val mutation in PEX6. Retrospective analysis of peroxisomal markers showed very moderate increase of serum phytanic acid levels, but fibroblasts allowed me to confirm the pathogenicity of the p.Ala912Val mutation by absent peroxisomal catalase immunostaining, presence of peroxisomal ghosts with abnormal structure and markedly increased very long-chain fatty acids, indicating a partial loss of function of the PEX6 protein. Therefore, despite initial false genetic linkage, the SCAR3 locus is confirmed and is caused by some PEX6 mutation (Guissart et al. Eur J Hum Genet 2016). In conclusion, the identification of these hypomorphic missense mutations in ataxia families as well as literature data lend credence to the concept that numerous recessive ataxias are caused by partial loss of function mutations in a large variety of pathophysiological pathways, as a consequence of an exquisite sensitivity of cerebellar, spinocerebellar and deep sensory neurons to even mild metabolic insults.

Les ataxies (HCA) et paraparésies spastiques héréditaires constituent les deux extrémités du spectre des entités neurodégénératives spinocérébelleuses (SCE). Elles sont marquées par une forte hétérogénéité clinique, avec des signes associés variés, et génétique. Elles peuvent se transmettre sur tous les modes d'hérédité, et des mutations ont été décrites dans une myriade de gènes. Les SCE sont donc une entité qui bénéficie particulièrement des avancées technologiques de la Nouvelle Génération de Séquençage. Ce travail décrit des résultats obtenus sur de grandes cohortes, par séquençage de panel de gènes ciblés ou de l'exome entier, ainsi que des études de familles. Celles-ci nous ont permis de décrire de nouveaux modes de transmission de mutations dans des gènes déjà connus en pathologie humaine, avec un dans un cas une dysfonction similaire, dans l'autre un gain versus une perte de fonction. Nous rapportons aussi deux gènes nouvellement impliqués, dans une forme autosomique dominante de HCA (CACNA1A), et dans un sous-type autosomique récessif de dystonie avec atrophie cérébelleuse (TOR1AIP1). Nos résultats illustrent bien la refonte nosologique en marche dans les maladies génétiques complexes, qui remettent en permanence les corrélations génotype-phénotype en question. Nous discutons du pourquoi et du comment du diagnostic moléculaire dans cette nouvelle ère du séquençage. / Hereditary cerebellar ataxias (HCA) and spastic paraplegias constitute both ends of the neurodegenerative spectrum of spinocerebellar entities (SCE). Theses diseases are marked by a pronounced heterogeneity, both clinically, with various additional neurological or extraneurological signs, and genetically. They can indeed follow all transmission modes, and mutations in a myriad of genes have been described. SCE is hence a group of diseases that benefit greatly from Next-Generation Sequencing technologies. This work reports both screenings of large cohorts of patients with either panel or whole exome sequencing, as well as family studies. The latter allowed us to describe new modes of transmission for genes previously involved in human pathology, with either similar protein dysfunction, or loss- versus gain-of-function. We also describe two new genes implicated in a form of autosomal dominant HCA (CACNA1A), and an autosomal recessive subtype of dystonia and cerebellar atrophy (TOR1AIP1). Our results are illustrative of the genetic remodelling underway in complex genetic diseases, with permanent questioning of genotype-phenotype correlations. We discuss the how and the why of molecular diagnosis in this new era of sequencing.

De nombreux et divers micro-organismes vivent dans les tissus interne et externe desfeuilles des plantes, la phyllosphère. Ils influencent de nombreux traits, les interactions biotiques,le flux d’énergie, la tolérance au stress de leur hôte et en fin de compte la valeur sélectivede leurs hôtes. Il a été montré que plusieurs traits quantitatifs de plantes structurentla communauté microbienne de la phyllosphère. Ainsi des Loci de ces traits quantitatifs(Quantitative Trait Loci QTL) liés à la structure de cette communauté étaient attendus.L’objectif principal de ce travail était de rechercher des régions génomiques chez le chêne(Quercus robur L.), dont l’effet se prolonge jusqu’au niveau de la communauté, influençantainsi le microbiote de la phyllosphère. Tout d’abord, nous avons étudié la composition etle réseau d’interactions du microbiote de la phyllosphère partant un intérêt particulier àErysiphe alphitoides, un agent pathogène majeur pour les chênes. Nous avons montré quel’infection par E. alphitoides est accompagnée par des changements dans la composition dela communauté fongique foliaire, mais pas dans le composition de la communauté bactérienne.Nous avons souligné certains partenaires d’interaction d’E. alphitoides et nous avonsmontré que le réseau d’interactions microbiennes, contrairement aux résultats précédents,été dominé par des interactions positives. Ensuite nous avons effectué une analyse QTLde descripteurs de la communauté microbienne dans une population de pleins frères. Nousavons trouvé 8 QTL correspondant à des traits de la communauté microbienne: compositionfongique et bactérienne, diversité fongique, pourcentage de Erysiphe alphitoides. Troisd’entre eux sont colocalisés avec un QTL de sensibilité à E. alphitoides, suggèrent un fortdéterminisme génétique de la résistance à l’oïdium chez Q. robur. Enfin, nous présentonsles résultats préliminaires d’une étude d’association génétique et discutons nos résultatsavec une perspective évolutive. / Numerous and various microorganisms inhabit inner and outer tissues of plant leaves, thephyllosphere. They influence many plant traits, biotic interactions, energy flux, host stresstolerance and ultimately the fitness of their hosts. Many plant quantitative traits wereshown to structure the phyllosphere microbial community. Hence quantitative trait loci(QTLs) linked to the structure of this community were expected. The main objective ofthis work was to search for genomic regions in oak (Quercus robur L.), whose effect extendsto the community level, influencing the phyllosphere microbiota. First, we studied thecomposition and the interaction network of oak phyllosphere microbiota with specific focuson Erysiphe alphitoides, a major biotrophic pathogen of oak. We showed that infection byE. alphitoides is accompanied by changes in the foliar fungal community composition butnot in the bacterial community composition. We highlighted likely interaction partners ofE. alphitoides and we showed that the complex microbial interaction network, in contrastto previous findings, was dominated by positive interactions. Next we performed QTLanalysis of microbial community descriptors in a full-sib mapping population of oak. Wefound 8 QTLs for microbial community traits: fungal and bacterial composition, fungaldiversity, and percentage of Erysiphe alphitoides reads. Three of these QTLs colocalizedwith a QTL for powdery mildew sensibility, suggesting for strong genetic determinism ofpowdery mildew resistance in Q. robur. Finally we present preliminary results of a geneticassociation study and discuss our findings within an evolutionary perspective.

Venous thromboembolism (VTE) is a common cardiovascular disease that frequently recurs and is associated with significant numbers of death annually. The influence of the hereditary risk factors is not yet firmly established but twin and family studies suggest that heritability is about 50%. Several genetic risk factors have been identified by genomeHwide association studies (GWAS) but they do not explain all of the missing heritability of VTE. NextHgeneration sequencing (NGS) has revolutionized the genetic analysis of disease and has been used to discover the genes underlying unsolved Mendelian disorders. It has also been used to identify rare alleles which may help explain the missing heritability for complex diseases. The study population of this study consisted of 32 randomly chosen VTE patients from the MATSHstudy (Malmö Thrombophilia Study). The seventeen genes that in earlier studies have been shown to be associated with VTE were examined and the identified VTEHrelated mutations were compared to the general population. The results showed that Ion TorrentHsequencing effectively provided good coverage and read depth in all of the sequenced genes. Optimization of the primer panels resulted in higher and more balanced coverage and the quality of the results in this study was on an overall high level. A total of 215 variants were detected – 62 in exons, 8 in splice and 145 in introns. One Mendelian mutation was detected in PROC and rare variants were found in F2 and FGG. The most common risk factor (F5 Leiden) was highly enriched with 25% in this study compared to 3% in a background population. / Venös tromboembolism (VTE) är en vanlig, ofta återkommande, kardiovaskulär sjukdom som associeras med åtskilliga dödsfall årligen. De ärftliga riskfaktorernas påverkan är inte fullständigt kartlagda ännu men tvillingH och familjestudier antyder att ärftligheten kan vara runt 50%. Ett flertal genetiska riskfaktorer har identifierats genom genome$wide association studies (GWAS) men de förklarar inte hela den saknade ärftlighetskomponenten för VTE. NästaHgenerationsHsekvensering (NGS) har revolutionerat den genetiska sjukdomsanalysen och har använts för att upptäcka de gener som ligger bakom tidigare olösta Mendelska sjukdomstillstånd. Man har även använt NGS för att identifiera rara alleler som kan hjälpa till att förklara de saknade ärftlighetskomponenterna för nedärvning av komplexa sjukdomar. Studiepopulationen I den här undersökningen utgjordes av 32 slumpmässigt utvalda VTEHpatienter från Malmö Thrombophilia Study (MATS). De sjutton gener som I tidigare studier har visat sig vara associerade med VTE undersöktes och de identifierade VTEHrelaterade mutationerna jämfördes med en normalpopulation. Resultaten visade att Ion TorrentHsekvensering ger bra täckningsgrad och läsdjup i alla de sekvenserade generna. Optimering av primerHpanelerna resulterade i en mer balanserad täckningsgrad och resultatkvaliteten i den här studien var på en generellt hög nivå. Totalt 215 varianter detekterades – 62 i exon, 8 i splice och 145 i introner. En Mendelsk mutation detekterades I PROC och rara varianter hittades i F2 och FGG. Den starkaste och vanligaste riskfaktorn (F5 Leiden) var högt anrikad i den här studien med 25% jämfört med 3% i en bakgrundspopulation.

A mastite bovina é considerada a doença de maior impacto nos rebanhos leiteiros, exercendo efeito econômico negativo sobre a produtividade e perdas significativas à indústria de laticínios. Tendo em vista os impactos na sanidade animal e os prejuízos econômicos acarretados, o objetivo deste estudo foi caracterizar de forma mais abrangente a comunidade microbiana presente em rebanhos leiteiros com mastite subclínica utilizado o sequenciamento parcial do gene 16S ribossomal RNA (rRNA). Especificamente, foram caracterizadas as comunidades bacterianas presentes em amostras de leite vindas de três fazendas comerciais, sendo que cada fazenda contribuiu com amostras com alta contagem de células somáticas (CCS > 200.000 cel./mL) e com baixa contagem (CCS < 200.000 cel./mL) perfazendo um total de 57 animais. O DNA total foi extraído e amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores da região V3 e V4 do gene 16S rRNA. O sequenciamento foi realizado utilizando a tecnologia de sequenciamento de nova geração através do equipamento MiSeq (Illumina - San Diego, EUA). Para efeito de comparação, alíquotas de todas as amostras foram destinadas ao cultivo microbiológico para identificação de bactérias causadoras da mastite. Os fragmentos amplicons de todas as amostras foram submetidos a uma série de análises computacionais utilizando o programa QIIME. Após a avaliação adicional das sequências em nível de espécie, verificou-se que em geral as bactérias diagnosticadas por cultura geralmente não corresponderam com as sequências mais abundantes detectadas pelo sequenciamento. A análise da composição da microbiota de amostras de leite provenientes de animais saudáveis revelou a presença de uma grande diversidade de espécies bacterianas, mesmo que nenhuma bactéria tenha sido detectada por técnica de cultura. A espécie bacteriana mais abundante em todas as amostras foi Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus também foi detectada na grande maioria das amostras As diferenças na composição microbiana foram observadas entre as amostras quando a comparação foi feita de forma individual. Estas diferenças foram notórias em composição taxonômica e foram refletidas por intermédio das estimativas de alfa e beta diversidade. Quando a comparação foi realizada por separação de grupos com alta e baixa CCS, essa diferença não foi tão evidente. Com este estudo será possível compreender a diversidade dos microrganismos presentes na glândula mamária de animais saudáveis e com mastite subclínica. Essas informações podem ser úteis podendo contribuir no planejamento de medidas terapêuticas e preventivas mais eficazes da doença. / Bovine mastitis is considered the most impact disease in dairy herds, exerting negative economic effect on productivity and significant losses to the dairy industry. In view of the impact on animal health and carted economic losses, the objective of this study was to characterize more comprehensively the microbial community present in dairy herds with subclinical mastitis using the partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene (rRNA). Specifically, the bacterial communities present in samples of milk coming from three commercial farms were identified, and each farm contributed samples with high somatic cell count (SCC> 200,000 cel./mL) and low count (SCC <200,000 cel./ml) for a total of 57 animals. Total DNA was extracted and amplified with primers of the V3 and V4 region of the 16S rRNA gene. Sequencing was performed using the new generation of sequencing technology through MiSeq equipment (Illumina - San Diego, USA). For comparison, aliquots of all samples were intended for microbiological culture for identification of bacteria which cause mastitis. The amplicon fragments of all samples were subjected to a series of computer analyzes using the QIIME program. After further evaluation of the sequences at the species level, it was found that in general the bacteria do not generally diagnosed by culture corresponded to the most abundant sequences identified by sequencing. The analysis of milk samples from microbial composition from healthy animals revealed the presence of a diversity of bacterial species, even though no bacteria have been detected by culture technique. The most abundant bacterial species in all samples was Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus was also detected in most samples differences in microbial composition were found between the samples when a comparison was made individually. These differences were noticeable in taxonomic composition and were reflected by means of the estimates of alpha and beta diversity. When comparison was performed by separation of high and low groups with CCS, this difference was not so evident. This study will be possible to understand the diversity of microorganisms present in the mammary gland of healthy animals and with subclinical mastitis. This information can be useful and can contribute in the planning of more effective therapeutic and preventive measures of the disease.

La capacidad de Mycobacterium tuberculosis para sobrevivir dentro del macrófago contribuye grandemente a su patogenicidad, latencia y persistencia durante la infección. Este bacilo induce alteraciones en el ambiente intrafagosomal e inhibe la maduración del fagosoma, favoreciendo su supervivencia intracelular. M. tuberculosis PknG secuestra al macrófago precisamente al evitar la fusión fagosoma-lisosoma. En este sentido, PknG representa una familia de dianas novedosas para enfrentar la necesidad de nuevos antimicrobianos para la tuberculosis latente. Aquí, apuntamos a: (i) elucidar la base estructural-molecular del ATP y Mg2+ como cofactores de PknG; (ii) caracterizar los parámetros cinéticos que gobiernan la formación del complejo PknG:ATP; e, (iii) identificar péptidos capaces de unirse a PknG para investigar experimentalmente su interactoma usando enfoques combinatorios como “Phage Display”. Nuestros resultados confirman que PknG se une exclusivamente al ATP con una constante de disociación (KD) de 108.8  22.9 µM. El Mg2+ estabiliza térmicamente a PknG de forma ATP-dependiente. Análisis de estado pre-estacionario muestran que la unión y disociación del ATP es rápida en el complejo PknG:ATP. Usando PknGN-Ext, TPR resolvimos la estructura cristalina en el estado unido al ADP mientras que demostramos que el ATP imposibilita la cristalización. Los análisis bioinformáticos de las librerías enriquecidas por Phage Display identificaron 57 potenciales peptidos que interactuarían con PknG. Una comparación cercana con el proteoma de M. tuberculosis proporcionó un subconjunto de 20 proteínas que podrían interactuar con PknG. Nuestros resultados confirmaron cinco proteínas asociadas a PknG previamente reportadas: PknG, DnaK chaperona, transportador ABC Rv1747, Proteína Ribosomal L23 y Factor de Elongación Tu, resaltando la validez de nuestra plataforma para descubrir el interactoma de PknG. Así, nuestros resultados revelan interacciones proteína-proteína putativas que podrían participar en la supervivencia micobacteriana, mientras que también proporcionan bases sólidas para desarrollar drogas antituberculosas al interrumpir estas interacciones o explotar estos peptidos tipo compuesto líder. / The ability of Mycobacterium tuberculosis to survive inside the macrophage greatly contributes to its pathogenicity, latency and persistence during infection. This bacillus induces alterations in the intraphagosomal environment and inhibits phagosome maturation, thus promoting mycobacterial survival. M. tuberculosis PknG hijacks the macrophage precisely by avoiding phagosome-lysosome fusion. In this sense, PknG represents a family of novel targets to cope with the need for new antimicrobials for latent tuberculosis. Here, we aimed to: (i) elucidate the structural-molecular basis of ATP and Mg2+ as PknG cofactors; (ii) characterize the kinetic parameters governing PknG:ATP complex formation; and, (iii) identify PknG-binding peptides to experimentally query PknG’s interactome using combinatorial approach such as Phage Display. Our results confirm that PknG exclusively binds to ATP with a dissociation constant (KD) of 108.8  22.9 µM. Mg2+ thermally stabilizes PknG in an ATP-dependent manner. Pre-steady-state analyses show that ATP binding and dissociation are rapid in the PknG:ATP complex. Using PknGN-Ext, TPR we solved the ADP-state crystal structure while showing that ATP precludes crystallization. Phage Display and bioinformatic analyses identified 57 potential PknG binders. A close comparison to the M. tuberculosis proteome provided a subset of 20 proteins that may interact with PknG. Our results confirmed five previously reported PknG-associated proteins: PknG, DnaK chaperone, ABC transporter Rv1747, Ribosomal Protein L23 and Elongation Factor Tu, highlighting our platform’s validity to uncover the PknG interactome. Altogether, our results reveal putative protein-protein interactions that may play a role in mycobacterial survival, while also providing solid bases for the development of anti-tuberculosis drugs by disrupting these interactions or exploiting these lead-like peptide molecules. / Tesis

Les maladies à transmission vectorielle sont dues à des agents pathogènes transmis par des arthropodes hématophages. Ces vecteurs assurent une transmission active (mécanique ou biologique) d’un agent infectieux d’un vertébré vers un autre vertébré. A l’échelle mondiale, les tiques sont responsables de la transmission de la plus grande variété d’agents pathogènes, elles transmettent des microorganismes responsables de maladies bactériennes (borréliose de Lyme, rickettsioses) ou parasitaires (babésioses, theilérioses), ou même virales (encéphalite à tiques).Les Antilles se situent au cœur de la zone Néotropicale des Caraïbes, et constituent une zone à risque pour l’émergence de maladies vectorielles en raison des conditions climatiques favorables aux vecteurs et des échanges intercontinentaux importants (flux illégal d’animaux, oiseaux migrateurs,…). La situation épidémiologique de la zone Caraïbe vis-à-vis des maladies transmises par les tiques est très peu documentée. Les études menées sur le terrain portent essentiellement sur des agents pathogènes affectant les animaux comme Ehrlichia ruminantium, Babesia (bovis et bigemina) et Anaplasma marginale et sont donc loin de pouvoir répondre aux questions concernant le risque d’émergence ou de réémergence de maladies à tique. Ainsi, il est nécessaire et urgent de développer des outils efficaces de surveillance épidémiologique qui permettraient la détection des agents pathogènes, nouveaux, connus ou non suspectés présents dans les tiques. C’est dans ce contexte d’amélioration des performances de veille sanitaire des maladies à tiques dans les Caraïbes que prend place le projet de thèse. La visée de la thèse était de faire un état des lieux des agents pathogènes d’intérêt médical et vétérinaire présents dans les tiques caribéennes à l’aide de techniques de détection à haut débit. Pour cela nous avons d’abord réalisé un séquençage à haut débit d’ARN extraits de tiques collectées en Guadeloupe et en Martinique afin de réaliser un inventaire sans a priori des agents pathogènes (bactéries, parasites, et virus) présents. Cette analyse a permis de mettre en évidence une grande diversité en microorganismes pathogènes au sein de nos échantillons, révélant également la présence de quatre virus appartenant à de nouveaux genres viraux récemment décrits et associés aux arthropodes. Les informations obtenues via le séquençage, additionnées aux données disponibles dans la littérature ont permis de constituer ainsi une liste des agents pathogènes transmis par les tiques nécessitant une surveillance sanitaire dans les caraïbes. A partir de ce répertoire nous avons développé un système de dépistage à haut-débit d’agents infectieux applicable à toute la zone des caraïbes. L’outil de détection est un support microfluidique de type puce à ADN, basé sur la technologie BioMarkTM dynamic arrays (Fluidigm Corporation) qui permet de réaliser de la PCR en temps réel à haut débit afin de détecter simultanément 48 à 96 cibles au sein de 48 à 96 échantillons. Deux puces ont été développées, une première pour le suivi des bactéries et parasites, et une deuxième pour le suivi des virus. Leur performance a été testée sur des échantillons de tiques collectées en Guadeloupe et en Martinique. Ce dépistage à grande échelle a donné un aperçu complet de la situation épidémiologique de 45 bactéries, 17 parasites and 31 virus potentiellement transmis par les tiques dans les Antilles Françaises. La méthode de surveillance développée durant cette thèse représente une amélioration majeure des techniques de veille épidémiologique, permettant la détection rapide et concomitante d’un large panel d’agent pathogène. Elle sera prochainement appliquée au criblage à haut débit des agents infectieux présent dans des tiques collectées à travers la Caraïbe, provenant notamment de Trinité-et-Tobago, Saint-Kitts, la Barbade, et Sainte-Lucie, grâce à la collaboration du réseau CaribVet, et de vétérinaires locaux / Vector-borne diseases are illnesses caused by pathogens transmitted by haematophagous arthropods which provide active transmission (mechanical or biological) of infectious agents from one vertebrate to another. Among these vectors, ticks are known to carry and transmit the greatest variety of pathogens of public health and veterinary importance. They transmit microorganisms responsible for bacterial (Lyme borreliosis, rickettsioses), parasitic (babesiosis, theileriosis), or viral diseases (tick-borne encephalitis).The Antilles are located in the heart of the Caribbean Neotropical Zone. This area can be considered at risk for the emergence of vector-borne diseases mainly due to favorable environmental conditions and intercontinental exchanges (e.g. legal and illegal animal trade, migratory birds). However, the epidemiological situation of the Caribbean area, with regard to tick-borne diseases, is still poorly documented. Indeed, most of field studies only focused on animal pathogens such as Ehrlichia ruminantium, Babesia (bovis and bigemina) and Anaplasma marginale and questions about the risk of emergence or re-emergence of tick-borne diseases remain unanswered. Thus, it is crucial to develop efficient epidemiological surveillance tools that would enable the detection of new, known or unexpected pathogens present in ticks. In this context, the main objective of my thesis was to obtain an overview of pathogens of medical and veterinary interest present in Caribbean ticks using new high-throughput technologies. We first used a high-throughput sequencing approach to determine pathogens present in ticks (bacteria, parasites, and viruses) collected in Guadeloupe and Martinique. This analysis revealed a great diversity of pathogenic agents in our samples and highlighted the presence of four viruses belonging to new viral families recently described and associated with arthropods. Results of sequencing combined with data available in the literature allowed us to make the most exhaustive list of pathogens potentially transmitted by ticks and requiring health surveillance in the Caribbean area. From this pathogen inventory, we developed a system of high-throughput screening of infectious agents applicable to the whole Caribbean area. This molecular tool is a microfluidic system based on the BiomarkTM dynamic arrays technology (Fluidigm Corporation), which enables high-throughput real-time PCR to simultaneously detect 48-96 targets within 48 to 96 samples. Two different chips have been developed, one for bacteria and parasites monitoring, and one for viruses. Their efficiency was tested on tick samples collected in both Guadeloupe and Martinique. This large-scale screening provided a comprehensive overview of the epidemiological situation of 45 bacteria, 17 parasites and 31 viruses potentially transmitted by ticks in the French West Indies. The high-throughput detection tool developed during my thesis represents a major improvement in epidemiological surveillance technology, enabling the rapid and concomitant monitoring of a wide range of pathogens. It will soon be applied to high-throughput screening of infectious agents found in ticks collected throughout the Caribbean, including Trinidad and Tobago, St. Kitts, Barbados, and St. Lucia, thanks to the collaboration with the CaribVet network, and local veterinarians

This master's thesis deals with the creation of a tool for the extraction of methylation level from transposon sequences. Transposons are DNA elements with ability to move or copy themselves and their activity is regulated by DNA methylation. Sequence methylation information is stored in the bisulfite data and their processing is done with parts of two existing tools in a combination with implemented modules. Created tool takes into consideration unique challenges brought in the methylation calling process by transposable elements and it's functionality is presented on a set of experiments with simulated and real data.