Abstract Macrophages found in the tumor microenvironment play a crucial role in initiating an immunosuppressive tumor microenvironment that negatively impacts immunotherapy efficacy and aids tumor progression and metastasis. Constituting the most abundant immune cell in tumor microenvironment (TME), tumor associated macrophages (TAMs) have emerged as an attractive approach for anti-cancer therapy. However, two major challenges need to be overcome for successfully utilizing macrophages for immunotherapy. First, tumors repolarize the TAMs predominantly to M2 tumor-aiding phenotype by secreting various immunosuppressive cytokines. Second, cancer cells overexpress a membrane protein CD47 that interacts with signal-regulating protein alpha (SIRPalpha) expressed on macrophages. This crosstalk provides a downregulatory signal in the form of activation of SHP1/2 that inhibits cancer cell phagocytosis, and CD47, therefore, functions as a “don’t-eat-me” signal. We rationalized that these challenges can be overcome by engineering a nanoparticle system that can deliver a rationale combination of immunomodulatory agents to the TAMs that can both repolarize the M2 macrophages to M1 phenotype efficiently and concurrently block CD47-SIRPalpha interactions by inhibiting SHP2 signaling. Herein, we designed a lipid nanoparticle (LNP) system loaded with amphiphilic R848-cholesterol in its hydrophobic lipid bilayer, while SHP099 gets encapsulated in the hydrophilic core. Our previous studies have shown that the conjugation of cholesterol to the inhibitor stabilizes the lipid bilayer at a high inhibitor concentration. The LNPs showed high optimal drug loading, size, and stability. In vitro studies showed that the M2 macrophages treated with the LNPs system repolarized to M1 phenotype and expressed co-stimulatory molecules while having enhanced phagocytic potential. In vivo efficacy studies in 4T1 tumor-bearing mice showed that LNPs exhibit superior anti-tumor efficacy compared to other treatments. We evaluated the effect of MARCO-targeted LPNs by the conjugating anti-MARCO antibody on the LPN surface. However, no comparable difference in treatment efficacy was observed between the targeted MARCO-LNPs and the non-targeted LNPs. These results demonstrate that the MARCO targeting system designed in this study is largely ineffective in the targeted delivery of its drug cargo specifically to TAMs. Thus, the lipid nanoparticle-mediated co-delivery of a rational combination of TLR7/8 agonist and SHP2 inhibitor in the TAMs increases M2 to M1 repolarization and phagocytosis potential of macrophages. Recommended Citation Malik, V., Ramesh, A. and Kulkarni, A.A. (2021), TLR7/8 Agonist and SHP2 Inhibitor Loaded Nanoparticle Enhances Macrophage Immunotherapy Efficacy. Adv. Therap., 4: 2100086. https://doi.org/10.1002/adtp.202100086

Le but du projet est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour le diagnostic et le traitement du cancer du rein. Nous avons évalué différentes techniques comprenant la tomographie en cohérence optique et l’imagerie moléculaire. Nous avons évalué différents marqueurs potentiels pour l’imagerie moléculaire en étudiant l’expression de différents marqueurs dans le cancer du rein et leur association avec le pronostic de la maladie. Enfin, nous avons évalué deux techniques d’imagerie moléculaire sur des modèles précliniques : l’Imagerie par Résonnance Magnétique moléculaire et l’échographie moléculaire. / The aim of this project is the development of new imaging techniques for renal cancer diagnostic and treatment.We have assessed several techniques including optical coherence tomography and molecular imaging. We assessed a series of potential markers for molecular imaging by measuring some pre-defined markers expressions by immunohistochemistry in renal cell carcinoma and their association with disease’s prognostic. Finally, we assessed two molecular imaging techniques in pre-clinical models: Molecular Magnetic Resonance Imaging and Molecular Ultrasound Imaging.

Le rétinoblastome est une tumeur maligne de la rétine qui touche essentiellement les nourrissons et jeunes enfants. Sa prise en charge est associée à la survenue d’effets secondaires sévères, certains traitements induisant le développement de tumeurs secondaires. Dans ce contexte, la thérapie photodynamique (PDT) apparaît comme une alternative prometteuse, car elle est non mutagène et génère des effets secondaires moins importants. Elle consiste à injecter un agent photosensibilisateur (PS) - une porphyrine par exemple – puis à illuminer la zone tumorale avec un laser. L'efficacité de la PDT nécessite l'accumulation de PS dans la tumeur. Cependant, la plupart des porphyrines sont hydrophobes et s'agrègent en milieu aqueux. Leur incorporation dans un nano-vecteur peut améliorer leur distribution au cytoplasme. Malheureusement, lorsqu'elles sont encapsulées dans le cœur des nanoparticules, les molécules de PS perdent leur phototoxicité en raison de leur auto-extinction. Dans ce travail, nous avons conçu des lipo-nanoparticules biodégradables (LNP) constituées d'une nanoparticule (NP) de poly (D,L)-lactide (PLA) recouverte d'une bicouche de phospholipides (POPC-DOTAP). Un principe actif anticancéreux, la bêta-lapachone et un agent photosensibilisateur ont ensuite été co-encapsulés dans notre système en vue de favoriser un effet synergique sur le rétinoblastome. Nous avons démontré la formation effective des LNPs et leur internalisation dans les cellules de rétinoblastome en quelques heures.Enfin, nous avons démontré une amélioration de l'activité antitumorale en combinant les deux traitement dans notre système par rapport au traitement simple par PDT ou chimiothérapie. / Retinoblastoma is a malignant tumor of the retina in infants. Conventional therapies are associated to severe side effects and some of them induce secondary tumors. Therefore, photodynamic therapy (PDT) appears as a promising alternative as it is non-mutagenic and generates minimal side effects. It consists in injection of a photosensitizer (PS) like a porphyrin, and then illumination of the tumor area with a laser. The effectiveness of PDT requires the accumulation of the PS in the tumor. However, most porphyrins are hydrophobic and aggregate in aqueous medium. Their incorporation into a nanocarrier may improve their delivery to the cytoplasm. Unfortunately, when incorporated into a nanoparticle core, PS molecules lose their phototoxicity due to self-quenching. In this work, we have designed biodegradable liponanoparticles (LNPs) consisting of a poly(D,L)-lactide (PLA) nanoparticle (NP) coated with a phospholipid (POPC/DOTAP) bilayer. An anticancer drug, beta-lapachone (β-Lap), and a photosensitizer were then co-encapsulated in these LNPs for achieving synergistic effect on retinoblastoma. We have first demonstrated the effective formation of the LNPs and their internalization in retinoblastoma cells within few hours. Then we studied the cyto/phototoxicity of the system.The hybrid nanoparticles showed an improved antitumor activity when the PS and β-Lap were combined, compared to the single treatment by PDT or chemotherapy.

Les thérapies ciblées ont amélioré la survie des patients atteints de mélanome cutané métastatique, toutefois certains patients échappent au traitement. La réponse au traitement met en jeu des paramètres dépendants du patient, de la biologie de la tumeur, et de la survenue de mécanismes de résistance largement étudiés.Le but de ce travail est d’étudier deux marqueurs mesurables en pratique clinique lors du suivi des patients, pour leur potentiel prédictif de réponse aux inhibiteurs de BRAF en monothérapie, l’un biologique et l’autre pharmacologique : la charge allélique mutée (CAM), définie par le rapport muté/total, des oncogènes BRAF et NRAS, et la concentration plasmatique de vemurafenib (CPV).Nous rapportons pour la première fois la prévalence et les mécanismes du déséquilibre allélique des oncogènes BRAF et NRAS, défini par une CAM élevée (>60%) ou faible (≤30%), par opposition à une CAM « hétérozygote » équilibrée (entre 30 et 60%). Des arguments in vitro et in vivo soutiennent l’hypothèse qu’une CAM BRAFV600E >60% puisse être associée à une meilleure réponse aux inhibiteurs de BRAF. La CAM de NRAS ne semble pas être un marqueur pronostique au moment du diagnostic de mélanome, toutefois sa valeur prédictive sur la réponse aux inhibiteurs de MEK sera intéressante à étudier.Nous montrons pour la première fois l’impact du dosage de la CPV lors du suivi des patients traités en monothérapie. Une CPV basse serait prédictive d’une progression ; ainsi, la CPV semble être un marqueur prédictif original de réponse, pour lequel la valeur seuil ainsi que les mécanismes pharmacogénétiques impliqués restent à déterminer. / Targeted therapies have improved survival in patients with metastatic cutaneous melanoma, but some patients escape treatment. Response to treatment involves parameters dependent of the patient, the tumor biology, and the occurrence of resistance mechanisms extensively investigated. The aim of this work is to study two measurable markers in clinical practice in patient monitoring, for their predictive potential of response to BRAF inhibitors monotherapy; the first one is biological and the other one is pharmacological: mutant allele burden (MAB), defined by the ratio mutant/total, of BRAF and NRAS oncogenes, and plasma vemurafenib concentration (PVC).We report for the first time the prevalence and the mechanisms of BRAF and NRAS oncogenic allelic imbalance, defined by a high (>60%) or a low (≤30%) MAB, as opposed to a balanced “heterozygous” MAB (30 to 60%). In vitro experiments and in vivo data support the hypothesis that a BRAFV600E MAB >60% may be associated with a better response to BRAF inhibitors. NRAS MAB does not seem to be a baseline prognostic marker, but its predictive value of response to MEK inhibitors will be interesting to investigate.We demonstrated for the first time the impact of CPV assay during the monitoring of patients treated with monotherapy. A low CPV would be predictive of progression; thus, CPV appears to be an original predictive marker of response, for which the threshold value and the involved pharmacogenetic mechanisms remain to be determined.

L’histiocytose langerhansienne (HL) est la plus fréquente des histiocytoses, liée à l’accumulation de cellules pathologiques de phénotype langerhansien. La découverte de la mutation somatique BRAFV600E dans environ 50% des cas à ouvert un nouveau champ d’investigation pour tirer bénéfice de ce statut moléculaire pour la prise en charge des patients.Tout d’abord, nous avons montré l’efficacité des inhibiteurs de BRAF sans rapporter de résistance dans les formes actives d’HL, en particulier dans les formes multisystémiques avec atteinte des organes à risque (MS OR+) du nourrissons, confirmant le rôle driver de cette mutation dans l’HL. Toutefois, après l’arrêt du traitement administré durant 2 à 6 mois, de nombreuses récidives ont été constatées.Ensuite, nous avons montré que pour les enfants atteints d’HL, la mutation BRAFV600E était significativement associée aux formes MS OR+, retrouvée dans 87,8% de ces cas. Comparés aux patients non mutés BRAF, les patients avec la mutation BRAFV600E présentaient un taux de résistance plus élevé à la chimiothérapie de première ligne velbé - corticoïde (21,9% contre 3,3%), un taux plus élevé de réactivation à 5 ans (42,8% contre 28,1%) et un taux de séquelles supérieur (27,9% contre 12,6%).Par ailleurs, nous avons montré que, pour les HL BRAFV600E mutées, la quantification de BRAFV600E dans l’ADN libre circulant par PCR digitale en gouttelette était un biomarqueur pertinent pour les cas d’HL MS OR+ et les présentations résistantes au traitement de première ligne.Enfin, après un criblage de points chauds mutationnels d’une série d’échantillons tissulaires d’HL ayant permis de mettre en évidence un cas avec la mutation somatique PIK3CAE542K, 9 couples d’échantillons tumeur/constitutionnel ont été étudiés par séquençage d’exome. Cela nous a permis de mettre en évidence une mutation récurrente (n=2) de BRAF au niveau du site d’épissage 5’ (donneur) de l’intron 12. Selon l’analyse de l’ARN, cette mutation conduirait à l’insertion de 3 acides aminés (LLR) dans le domaine kinase de la protéine mutée, dont l’analyse fonctionnelle est en cours. / Langerhans cell histiocytosis (LCH) is the most common type of histiocytosis owing to accumulation of pathologic CD1a+ CD207+ histiocytes. The identification of BRAFV600E in more than half of patients with LCH has launched a new field of investigation to study potential patient’s management benefits and implications from this molecular status.First, in BRAFV600E mutated LCH, we reported the effectiveness of BRAF inhibitors. Efficacy with no resistance to vemurafenib was reported in all cases with active LCH disease, especially for multi-system LCH with risk organ (MS RO+) involvement, confirming the driver status of this mutation in LCH. However, after discontinuation of this treatment administered during 2-6 months, many recurrences were observed.Then, we showed that children with BRAFV600E mutated LCH manifested more severe disease, comprised 87.8% of patients with MS RO+ involvement. Compared to patients with wild-type BRAF, patients with BRAFV600E more commonly displayed resistance to combined vinblastine and corticosteroid therapy (21.9% vs. 3.3%), showed a higher 5-year reactivation rate (42.8% vs. 28.1%) and had more long-term permanent consequences (27.9% vs. 12.6%).Moreover, we showed that BRAFV600E quantification in circulating cell-free DNA by droplet digital PCR is a relevant biomarker to monitor response to therapy for MS RO+ LCH and RO- LCH children who failed to respond to first line chemotherapy.Finally, after the screening of LCH biopsy (n=86) for the BRAF, KRAS, NRAS and PI3KCA most common mutations, leading to highlight one case with the PIK3CAE542K somatic mutation, 9 paired tumor-normal samples from children with LCH were analyzed by whole exome sequencing. Data showed a new BRAF recurrent mutation (n=2) in the 5′ splice sites of the intron 12. According to RNA analysis, this mutation would lead to the insertion of 3 amino acids (LLR) in the smaller N-terminal lobe of the BRAF kinase domain. Functional analysis is ongoing.

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Department of Pharmacology & Toxicology Student: Gabriela Burianova Supervisor: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Title of diploma thesis: Flow-cytometric analysis of inhibitory effect of novel targeted drugs on the activity of ABC drug efflux transporters Cancer is the second leading cause of death. Cancer treatment often combines conventional chemotherapy, radiation therapy and surgery. More recent approach to treatment is the use of targeted cancer therapy with a greater specificity towards cancer cells. Development of resistance is a major obstacle in the success of chemotherapy. Multidrug resistance (MDR) can be acquired through various mechanisms e.g. overexpression of efflux transporters. ATP binding cassette (ABC) transporters represents a large family of transmembrane proteins that use ATP to pump molecules across the membrane. The three main ABC proteins related to MDR are: P-glycoprotein (ABCB1), multidrug resistance-associated protein 1 (ABCC1) and breast cancer resistance protein (ABCG2). Use of ABC transporter inhibitors increases the amount of chemotherapeutical substrates accumulated within the cells. In this study we evaluated interactions of six synthetic small molecule inhibitors (alisertib, ensartinib, entrectinib, talazoparib,...

\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The study evaluated the development role of targeted development investments in South Africa and their risk adjusted performance over a 10-Year period, that is from 2008 to 2017. Targeted development investments as a subset of socially responsible investments have transformed the way capital is allocated towards development funding needs. In the South African context this study is relevant given it offers a contrast between investments made in the public sector where development impact is a key objective, versus private sector targeted investments that aim to achieve financial returns whilst also driving development impact objectives aligned to sustainable development goals. The role and impact of these investments in the post democratic era is put in the spotlight given the country is dealing with economic, social, and environmental challenges that have necessitated the need to assess the nature and role of the investment industry in solving these complex development challenges (Giampocaro & Pretorius, 2012). The study on the role of the public sector focused on the investments and development impact indicators tracked by the Top 3 public sector investment institutions or corporations. The analysis on the performance of the private sector TDI funds examined their risk adjusted performance using Treynor, Sharpe, Sortino, and Information ratios. The risk adjusted performance was used to test whether the TDI fund returns under or outperformed against five benchmark categories. The research findings showed mixed results where TDI funds either underperformed or outperformed against the benchmark categories. The findings highlighted the need for a hybrid development model where both the public and private sector actively play a role in the development landscape as guided by their respective investment mandates. The findings advocate for corporate and institutional investors to increase capital allocations and investments towards financing development needs given the scope to maximise investor returns, whilst considering socially responsible investing and issues relating to the development and empowerment of previously disadvantaged communities.

Targeted sanctions have become a commonly used conflict management tool over the last decades. Yet, operating in the state-centric context, previous research has highlighted the unintended negative effects of the instrument. What remains understudied is the effects of targeted sanctions on rebel groups' behavior. Acknowledging that sanctions are never imposed in isolation, this thesis seeks to explore the effects of targeted sanctions on rebel groups' violence against civilians and how the presence of peacekeeping influences this. This thesis argues that targeted sanctions increase a rebel group's violence against civilians through the mechanism of constrained resources and decreased capabilities to provide selective incentives to its fighters. Peacekeeping counter this mechanism by acting as a physical barrier between the combatants and the civilians, ultimately altering the cost-benefit analysis. UNITA in Angola and RUF in Sierra Leone are examined using a within-case and an across-case comparison. The findings lend mixed support to the notion that targeted sanctions increase a rebel group's violence against civilians. However, the results support the second hypothesis; peacekeeping appears to counterbalance the adverse effects of targeted sanctions on rebel groups' violence against civilians.

Le cancer du poumon est l’un des cancers les plus fréquents dans le monde et reste le plus meurtrier actuellement en terme d’incidence absolue. Les traitements employés chez les patients atteints d’un cancer du poumon consistent en une combinaison de chirurgie, de radiothérapie et de chimiothérapie. Alors qu’il y a quelques années, les guidelines de traitement étaient principalement basées sur le stade clinique de la maladie, le développement de nouvelles thérapies a mené à une classification plus appropriée des cancers du poumon. Cette nouvelle classification se base, en plus du stade clinique de la maladie, sur l’expression de différents biomarqueurs exprimés chez des sous-populations bien définies de patients. Ces biomarqueurs sont par exemple la mutation d’un gène ou l’expression d’une protéine. Au cours de ces dix dernières années, la recherche a été très active dans ce domaine avec l’arrivée de nouveaux traitements plus spécifiques pour ces sous-populations de patients. Des exemples concrets de ces nouvelles thérapies sont les chimiothérapies dites ciblées et l’immunothérapie. L’arrivée de tels traitements a parmi d’augmenter significativement le pronostic de la maladie et également de réduire considérablement les graves effets secondaires des chimiothérapies conventionnelles. Toutefois, le bénéfice en termes de survie reste modéré. Le taux de survie des patients à cinq ans est actuellement de 15%. Il y a donc toujours un besoin urgent de mettre au point de nouvelles stratégie de traitement.La chimiothérapie inhalée constitue une perspective de traitement adjuvant du cancer du poumon très intéressante, comparée à la chimiothérapie conventionnelle. En effet, elle permettrait d’administrer des doses d’anticancéreux plus importantes directement au niveau du site tumoral tout en limitant l’exposition systémique du médicament dans l’organisme, et donc, les toxicités importantes s’y rapportant. Toutefois, aucun médicament suivant cette approche n’est actuellement disponible sur le marché et ce, malgré quelques études cliniques de Phase I/II. Cela peut principalement s’expliquer par (i) l’incapacité d’administrer des doses inhalées efficaces d’agent anticancéreux avec les dispositifs d’inhalation utilisés (les nébuliseurs), (ii) les inquiétudes quant à une possible augmentation des toxicités pulmonaires des agents anticancéreux administrés par inhalation, (iii) les moyens devant être mis en place afin d’assurer la non-contamination de l’environnement et du personnel soignant lors d’une séance d’inhalation. Basée sur de nouvelles technologies pharmaceutiques (l’inhalation sous forme de poudre sèche, les nanomédecines, les thérapies ciblées, etc.) et sur une meilleure connaissance de la biologie des cancers, la stratégie scientifique que nous proposons pourrait permettre d’apporter une solution aux problématiques précitées. Ce travail décrit le développement de nouvelles formulations de poudre sèche pour inhalation (« dry powder for inhalation », DPI) à base de nanovecteurs ciblés contre le récepteur au folate (« folate receptor », FR) pour le traitement sélectif de cancers du poumon FR-positifs. Ces formulations permettraient le ciblage (i) du site tumoral par l’utilisation de l’administration pulmonaire et (ii) spécifique des cellules cancéreuses du poumon par les nanovecteurs ciblés. Trois parties constituent ce travail.Dans la première partie, deux nouveaux excipients folatés (c.à.d. sur lesquels ont été greffés des groupements folates) ont été synthétisés en trois étapes principales par une méthode de synthèse faisant appel à des dérivés de carbodiimide. Ces excipients comportent trois types de composants majeures relatifs à leur fonction :un ligand, le groupement folate, pour le ciblage des FRs ;un composé de charge, un polysaccharide, capable d’interagir avec l’agent anticancéreux ou une structure contenant celui-ci ;et un spacer, le poly(éthylène glycol), afin d’assurer une bonne flexibilité du folate et ainsi permettre une bonne interaction avec le FR. Ces nouveaux excipients folatés ont été caractérisés par RMN du proton, par spectrométrie de masse et par analyse thermique. L’excipient F-PEG-HMD (« folate-poly(ethylene glycol)-hydrophobically-modified dextran ») était capable de former des micelles caractérisées par une distribution de taille particulaire bimodale dans l’eau, avec un diamètre moyen d’environ 80 nm. F-PEG-HMD était caractérisé par une concentration micellaire critique de 4 x 10-7 M. L’excipient F-PEG-HTCC (« Folate-poly(ethylene glycol)-(N-[(2-hydroxy- 3-trimethylammonium)propyl] chitosan ») présentait des charges positives permettant de se solubiliser en milieu aqueux, indépendamment du pH.Dans la deuxième partie du travail, des formulations DPI ont été développées à base de l’agent anticancéreux témozolomide (TMZ). Celui-ci a été choisi comme premier modèle de principe actif pour son mécanisme d’action particulier qui lui confère une activité dans les cancers apopto-résistants, comme c’est le cas de beaucoup de cancers du poumon. De plus, l’administration d’une formulation de TMZ sous forme de nanovecteur permettrait de considérablement augmenter son activité en augmentant, par exemple, sa stabilité in vivo, ou encore son incorporation intracellulaire spécifique dans les cellules cancéreuses. Toutefois, le TMZ est caractérisé par des propriétés physicochimiques ne permettant que très difficilement son encapsulation dans des nanovecteurs. Le TMZ est une petite molécule, faiblement soluble dans l’eau sans toutefois être lipophile. Comme type de nanovecteur, les micelles polymériques pourraient présenter un bon profil pour encapsuler le TMZ. Des micelles composées de F-PEG-HMD et de TMZ ont été préparées par solubilisation de ces deux composés en présence. La solubilité dans l’eau du TMZ a pu ainsi être doublée en présence de F-PEG-HMD, ce qui pourrait mener à des concentrations de TMZ augmentées au sein du site tumoral. Les micelles polymériques présentaient un diamètre moyen de 50-60 nm, en fonction de la concentration en F-PEG-HMD utilisée. Les formulations DPI ont été préparées par spray-drying des micelles en présence de mannitol et de leucine. Le TMZ est resté stable durant l’étape de spray-drying, ainsi confirmé par des propriétés antiprolifératives in vitro des formulations DPI semblables à une solution de TMZ. Deux des formulations DPI développées présentaient de bonnes propriétés aérodynamiques, avec des fractions en particule fine jusqu’à 50%, et étaient capable de libérer les micelles polymériques rapidement en milieu aqueux. Toutefois, les taux d’encapsulation obtenus étaient relativement bas (inférieurs à 10%). Le travail s’est donc poursuivi avec un autre agent anticancéreux, le paclitaxel.Dans la troisième partie du travail, des formulations DPI à base de nanovecteurs chargés en paclitaxel (PTX). Le PTX a été choisi comme deuxième modèle d’agent anticancéreux car il s’agit d’une des molécules les plus couramment utilisées dans le traitement du cancer du poumon, et ce malgré les graves effets secondaires systémiques engendrés par l’administration intraveineuse de ce médicament. L’utilisation de la voie pulmonaire pourrait permettre d’optimiser les traitements à base de PTX, et ainsi, la qualité de vie des patients (réductions conséquentes des graves effets secondaires systémiques et meilleure réponse thérapeutique). Deux types de nanovecteurs ont été préparés avec des taux d’encapsulation en PTX d’approximativement 100%. Des micelles polymériques à base de F-PEG-HMD et de PTX ont été préparées par une méthode de dialyse avec un diamètre moyen de 50 nm et un potentiel zêta d’environ -4 mV dans le PBS. Des nanoparticules lipidiques solides (« solid lipid nanoparticle », SLN) chargées en PTX ont été préparées par une méthode de nanoprécipitation et les SLNs ont ensuite été enrobées par F-PEG-HTCC. La présence de l’enrobage a été confirmée par la taille et la charge des particules (diamètre moyen de 160 nm à 230 nm et potentiel zêta de -20 mV à + 30 mV, avant et après enrobage, respectivement). Les nanovecteurs étaient capables d’être incorporés, in vitro, dans les cellules HeLa et M109-HiFR, deux lignées de cellules cancéreuses exprimant le FR, et in vivo, après administration par inhalation sur un modèle orthotopique de cancer pulmonaire murin Ce modèle, le modèle M109, a été développé dans le cadre de ce travail à partir de la lignée M109-HiFR. Après administration par inhalation, les SLNs restaient enrobées dans les tissus pulmonaires et tumoraux. Les nanovecteurs ont montré une activité antiproliférative in vitro sur les deux lignées précitées. De plus, cette activité était significativement plus grande avec les SLNs enrobées chargées en PTX qu’avec la formulation commerciale contenant le paclitaxel, le Taxol®, avec des concentrations inhibitrices médianes de 60 et 340 nM, respectivement. L’activité anti-cancéreuse in vivo des SLNs enrobées, qui présentaient un meilleur profil que les micelles polymériques pour être étudiées in vivo (plus haute teneur en PTX, plus grande activité antiproliférative, et meilleure profil de libération du PTX in vitro), a été évaluée sur le modèle M109. Les SLNs enrobées, administrées par inhalation, seules ou en association avec le Taxol par intraveineuse, ont été comparées au Taxol®, administré par inhalation, par intraveineuse ou les deux, à la même dose de PTX totale. Les traitements à base des SLNs enrobées, en particulier en association avec le Taxol® en intraveineuse, ont menés un allongement significatif de la survie des souris M109, par rapport au Taxol en intraveineuse seul (survie médiane de 38 et 27 jours, respectivement). De plus, la mort de la dernière souris M109 a été observé au jour 61 pour le traitement SLN/Taxol en association, comparé au jour 33 pour le Taxol en intraveineuse, seul, à la même dose totale en PTX (10-8-8-8 mg/kg), et au jour 29 pour le contrôle négatif (c.à.d. les souris n’ayant pas reçu de traitement). Des études supplémentaires sont toutefois requises pour conclure une potentielle augmentation de l’activité anticancéreuse des SLNs inhalées par rapport au Taxol®. En effet, les doses de PTX en inhalation étaient trop grandes pour le modèle M109 menant à la mort d’une partie non négligeable des souris M109. Nous pouvons toutefois conclure que le traitement à base des SLNs inhalées en association avec le Taxol® en intraveineuse semble prometteur pour la suite du projet. Des formulations DPI ont ensuite été produites à partir des nanovecteurs chargés en PTX par spray-drying. Les formulations obtenues présentaient une large déposition in vitro dans les poumons, avec des fractions en particule fine allant jusqu’à 50% et de bonnes propriétés de libération des nanovecteurs en milieu aqueux. Quel que soit le principe actif ou le nanovecteur utilisé, les formulations DPI développées ont montré une large déposition pulmonaire in vitro dans les voies aériennes inférieures, où les adénocarcinomes pulmonaires sont le plus souvent trouvés. De plus, les formulations ne contenant que les excipients étaient bien tolérées in vivo après inhalation chez la souris saine. Cela a été vérifié par analyse des fluides bronchoalvéolaires en termes de concentration totale en protéine, de population de cellules, et de concentration en cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α. Ce travail montre dès lors également que les formulations DPI pourraient constituer un système de délivrance de médicament intéressant pour amener des nanovecteurs dans le tractus respiratoire où la tumeur réside. Toutefois, alors que de nombreuses caractéristiques intéressantes des formulations ont été démontrées (la tolérance des excipients, les profils de libération du PTX obtenus, l’incorporation intracellulaire des nanovecteur ainsi que leur bonne distribution dans du tissu tumoral in vivo et leur activité anticancéreuse, etc.), l’implication des FRs pour expliquer ces caractéristiques n’a pas pu être établie clairement. / Lung cancer is one of the most frequent cancers in the world, and remains the most deadly. Lung cancer therapy involves the combination of surgery, radiotherapy and chemotherapy. Whereas the treatment guidelines used to be related mainly to the stage of the disease, more recent treatments have introduced the concept of treating lung cancers according not only to the stage, but also to the specific characteristics of the tumors, i.e. a gene mutation, expression of a protein, etc. In the last decade, scientific and clinical research has been very active in this field, with recurrent introduction of new treatments, including new chemotherapies (e.g. targeted chemotherapies and immunotherapies). Many of these new treatments certainly induce better therapeutic responses and a sharp reduction in the adverse effects of conventional chemotherapies for well-defined subpopulations of patients. However, the benefit in terms of survival rates is only moderate. The five-year survival rate is currently ~15%. There is therefore no doubt that new treatment approaches and strategies are needed. One interesting approach is aerosolized chemotherapy. The pulmonary delivery of anti-cancer drugs could potentially be an interesting alternative to conventional adjuvant chemotherapy in lung cancer treatment, for many reasons. Among them, it could enhance the therapeutic ratio significantly by decreasing systemic severe toxicities and increasing anti-tumour efficacy. However, despite interesting clinical trial reports, all the strategies describing an aerosolized anti-cancer treatment have failed to bring new medicine on the market so far. The failures have been related mainly to (i) the inability to deliver proper and efficient drug doses in the lungs with the inhalation devices used in clinical trials (i.e. nebulizers), (ii) concerns about potential increase in lung toxicities engendered by these anti-cancer drug-based aerosols, and (iii) the requirement for adapted facilities to perform the inhalation procedure safely. Based on new pharmaceutical technologies (i.e. dry powder for inhalation (DPI) technology, nanomedicine, drug targeting, etc.) and on a better knowledge of cancer biology, a plausible and feasible answer to the aforementioned causes of failure was proposed. In this work, new nanomedicine-based DPI formulations were designed and developed for proposal as adjuvant chemotherapy for lung cancer treatment, especially for folate receptor (FR)-positive adenocarcinomas. These formulations would potentiate chemotherapy by means of a dual-targeting approach, i.e. the targeting of (i) lung tumor site(s) with pulmonary delivery and (ii) lung cancer cells with FR-targeted nanocarriers. To set up this approach, the work included three parts.In the first part, two new folate-grafted excipients were synthesized using carbodiimide-mediated chemistry in three main steps. These excipients consisted of three main components with a defined function: a ligand bringing selectivity, i.e. folate groups; a loading compound able to interact non-covalently with the anti-cancer drug or a drug delivery system, i.e. polysaccharides; and a spacer ensuring good flexibility of the ligand to allow its binding to the target, i.e. poly(ethylene glycol). The excipients were characterized by 1H-NMR, mass spectrometry and thermal analysis. Folate-polyethylene glycol-hydrophobically-modified dextran (F-PEG-HMD), a new folate-grafted self-assembling copolymer, presented a critical micellar concentration in water of 4 x 10-7 M. F-PEG-HMD micelles were characterized by a trimodal particle size distribution with a Z-average diameter of about 80 nm in water. Folate-polyethylene glycol-(N-[(2-hydroxy- 3-trimethylammonium)propyl] chitosan) (F-PEG-HTCC) presented positive charges and was easily dissolved in water, regardless of the pH.In the second part, dry powders were developed with the anti-cancer drug temozolomide (TMZ). TMZ was chosen as the first anti-cancer drug model due to its interesting anti-cancer activity in poor prognosis, apopto-resistant cancers, as is the case for many lung cancers. In addition, TMZ delivery via a nanocarrier might present many advantages such as prolonged lifetime and specific improved intracellular delivery into cancer cells. However, TMZ is characterized by poor properties for encapsulation into nanocarriers. It presents poor water solubility and low lipophilicity. Because of these properties, polymeric micelles presented the best profile for entrapping TMZ. TMZ-loaded F-PEG-HMD micelles were prepared by co-dissolution of TMZ and F-PEG-HMD. TMZ solubility in water was increased in the presence of F-PEG-HMD (a two-fold increase in molar solubility) which could potentially lead to increased local concentrations in the tumor site. The TMZ-loaded F-PEG-HMD micelles were characterized by Z-average diameters in the range of 50-60 nm, depending on the F-PEG-HMD concentration used. The micelles were spray dried to produce dry powders. TMZ remained stable during all the formulation steps, confirmed by similar in vitro anti-proliferative properties for the DPI formulations and a TMZ solution. Two of the developed DPI formulations were characterized by good aerodynamic properties (with a fine particle fraction of up to 50%) and were able to release the F-PEG-HMD micelles quickly in aqueous media. However, as presumed, poor entrapment efficiency values were obtained (less than 10%). A second anti-cancer compound was therefore chosen to pursue in the study, the lipophilic paclitaxel.In the third part, nanocarrier-loaded dry powders were developed with the poorly water-soluble anti-cancer drug paclitaxel (PTX) and the new folate-grafted excipients. PTX was chosen as a model drug because it is an effective anti-cancer drug currently used in lung cancer therapy and it causes severe systemic toxicities when delivered by the conventional intravenous route. Pulmonary delivery of PTX might therefore optimize treatment efficacy and/or quality of life in lung cancer patients. Two types of PTX-loaded nanocarrier were prepared with an encapsulation efficiency of approximatively 100%. PTX-loaded F-PEG-HMD micelles were prepared by a dialysis method. These had a Z-average diameter of about 50 nm and a zeta potential of about -4 mV in PBS. F-PEG-HTCC-coated solid lipid nanoparticles (SLNs) loaded with PTX were prepared in two main steps. PTX-loaded SLNs were first prepared using a nanoprecipitation method and the SLNs were then coated with F-PEG-HTCC. Efficient coating was confirmed by particle size and zeta potential (Z-average diameter of 160 nm to 230 nm and zeta potential of -20 mV to +30 mV before and after F-PEG-HTCC coating, respectively). The nanocarriers were able to enter HeLa and M109-HiFR, two FR-expressing cancer cell lines, in vitro, and in vivo after administration by inhalation to orthotopic M109-HiFR lung tumor grafted mice. This orthotopic model, i.e. the M109 model, was developed in the study. The SLNs remained coated with F-PEG-HTCC in lung tissues and tumors after inhalation. The PTX contained in the nanocarriers remained active against HeLa and M109-HiFR in vitro, as observed by means of the colorimetric MTT assays. Moreover, PTX-loaded SLNs were characterized by significantly higher anti-proliferative properties than Taxol®, with half-maximal inhibitory concentrations of 60 and 340 nM, respectively. Afterwards, the in vivo anti-cancer activity of the coated SLNs, which led to better profile than the polymeric micelles to be studied in vivo (i.e. higher PTX loading, higher anti-proliferative properties, and better release profile of PTX in vitro), was evaluated using the M109 model. The coated SLNs, administered by inhalation, alone or combined with intravenous Taxol®, were compared with Taxol®, administered by inhalation, IV or both, at the same PTX-relative doses. Interestingly, we observed much longer survivals for the SLN inhaled treatments, especially when combined with intravenous Taxol®, than for intravenous Taxol alone (median survivals of 38 and 27 days, respectively). Moreover, the last tumor-bearing mouse death occurred at day 61 for the SLN combined therapy, compared with day 33 for the intravenous therapy alone, at the same total PTX-relative dose (i.e. 10-8-8-8 mg/kg), and with day 29 for negative control (i.e. non-treated mice). However, further evaluations are needed to conclude that there is any improvement in terms of therapeutic response compared with intravenous Taxol®. Indeed, bias related to the fact that the aerosolized PTX doses were too high was included in the survival rate analysis and was revealed by unacceptable treatment-related deaths. Nevertheless, the combination of aerosolized, loaded SLNs and intravenous Taxol seemed to be an interesting strategy of treatment to follow. Dry powders embedding the PTX-loaded nanocarriers were developed by spray-drying. In vitro, good deposition profiles were obtained, with a fine particle fraction of up to 50% and good ability to re-disperse the nanocarriers in aqueous media.Whatever the drug or the nanocarrier adopted, the developed DPI formulations showed wide in vitro pulmonary deposition in the lower respiratory tract, where adenocarcinomas are more often found. Moreover, nanocarrier-based dry powders without drugs were well-tolerated in vivo, as assessed in healthy mice by determination of total protein content, cell count, and cytokine IL-1β, IL-6, and TNF-α concentration in bronchoalveolar lavage fluids. The present work therefore also shows that dry powders for inhalation could constitute an interesting drug delivery system able to release nanocarriers in the respiratory tract where the tumor is growing and spreading. However, in contrast to the undeniable improvements in terms of drug delivery system (e.g. safety of the excipients, drug release profile, the cell binding and uptake of the nanocarriers and their distribution into tumor in vivo, anti-cancer activity), no substantial effect linked to an implication of the FRs was observed to explain the aforesaid improvements. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished