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Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes. / Autoimmune diabetes results from the destruction of the insulin-secreting pancreatic beta cells by the T lymphocytes of the immune system. This leads to a hormonal deficiency that can be regulated with daily injections of exogenous insulin. However, to date, there is no cure for autoimmune diabetes. A healthy immune system generally recognizes a multitude of antigens in order to ensure our defence against different pathogens and tumor cells. Yet, depending on genetic and/or environmental factors, individuals may develop T cells that are aberrantly activated following the recognition of self-antigens. This break in tolerance leads to the development of autoimmune pathologies, such as autoimmune diabetes. In order to limit autoimmunity, rigorous selection mechanisms eliminate the vast majority of the T lymphocytes that present a high affinity for self-antigens during their thymic development. However, some of these auto-reactive lymphocytes escape from the elimination processes and migrate to the periphery where they might encounter a self-antigen. It is then essential that peripheral mechanisms maintain the immune tolerance by abrogating the activation and the proliferation of these self-specific T lymphocytes. One of the means to inhibit aberrant immune responses is the generation of regulatory T lymphocytes. These cells, which can be of thymus or peripheral origin, display various phenotypes and can mediate their action through several mechanisms in order to inactivate and/or eliminate the cells that are implicated in the development of autoimmune diseases. The use of transgenic mouse models made it possible to identify a poorly characterized population of T lymphocytes that exhibit a regulatory potential, namely CD4-CD8- (double negative, DN T cells). Indeed, the proportion of DN T cells in lymphoid organs is inversely correlated to autoimmune predisposition. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells, as well as to reveal the genetic factors underlying the regulation of the proportion of DN T cells. iv We observed that through the release of cytolytic granules containing granzyme B and perforin, DN T lymphocytes exert a cytotoxic activity towards B cells in an antigen-specific manner. In addition, we have established that a single injection of those DN T cells is sufficient to inhibit the development of autoimmune diabetes in highly susceptible transgenic mice. The use of CD47 deficient mice also demonstrated that the CD47-Sirp pathway is essential to maintain DN T cell proportion. Also, we identified that the autoimmune diabetes susceptibility locus Idd13, which contains Sirp participates in defining the proportion of DN T cells. Finally, a genetic analysis revealed that other loci are implicated in the control of the DN T cell population. Among those, the role of a locus situated in the proximal region of chromosome 12 has been validated through to the generation of congenic mice. The results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the biology and genetic regulation of DN T lymphocytes. This knowledge constitutes an important step towards the creation of innovative cellular therapies that may prevent and cure a diversity of autoimmune pathologies.

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Superviseur : Dr. Piet Van Vliet Collaborateurs: Dr. Alexandre Dubrac, Dr. Martin Smith / Résumé INTRODUCTION : Les maladies valvulaires du cœur surviennent dans 2% de la population, impliquant souvent un reflux sanguin dû au rétrécissement de la valve. Nous avons récemment identifié deux familles non apparentées étant atteintes par une sténose aortique. Le séquençage exomique des familles a révélé une mutation entrainant une perte de fonction homozygote pour le gène ADAMTS19. La relation entre la perturbation du gène ADAMTS19 et la sténose a été reproduite et donc confirmée grâce à une souris ADAMTS19-LACZ KO/KO. Cette souris montre également que ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les cellules valvulaires interstitielles (VICs) dans les valves. Le rôle d’ADAMTS19 durant le développement des valves reste inconnu. Pour analyser le patron d’expression d’ADAMTS19 pendant le développement du cœur, nous avons obtenu un modèle de souris transgénique contenant une CRE-tamoxifen inductible (Cre-ERT2) qui est exprimé sous l’influence du promoteur humain ADAMTS19. HYPOTHESE/OBJECTIF : Nous émettons l’hypothèse que le promoteur humain d’ADAMTS19 inséré dans la souris ADAMTS19-Cre-ERT2 contient toutes les séquences régulatrices permettant d’exprimer le gène ADAMTS19 et que ADAMTS19 est principalement exprimé au niveau des cellules valvulaires interstitielles dans les valves. L’objectif est de caractériser le patron d’expression d’ADAMTS19 en analysant sa distribution durant le développement grâce à une souris reportrice tdTomato. Comme ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les VICs, cet outil transgénique permettrait d’étudier ces cellules durant le développement. METHODE/RESULTAT : Suite à une étude in silico le promoteur ADAMTS19 est apparu comme extrêmement conservé. Par conséquent, pour analyser l’expression d’ADAMTS19 nous avons obtenu une souris BAC ADAMTS19-Cre-ERT2 contenant la séquence conservée que nous avons croisé avec une souris reportrice tdTomato. Le Tamoxifen est administré aux femelles gestantes par gavage aux jours embryonnaires E9,5, E11,5 ainsi que E13,5, et les cœurs sont extrait a E16,5. Des coupes de cœurs embryonnaires vont permettre d’identifier la localisation et la morphologie des cellules marquées. L’expression d’ADMATS19 dans les cellules valvulaires interstitielles est consistant avec le fait qu’ADAMTS19 est connu pour affecter les valves durant le développent et dans le cas de maladie valvulaire. Cependant, le patron des valves n’est pas reproductible au travers des générations. De plus, nous observons qu’ADAMTS19 est marqué dans des cellules des oreillettes et ventricule dans une lignée et dans une sous population de cellules de l’artère pulmonaire dans une autre. CONCLUSION : L’analyse des séquences de chaque lignée par séquençage permettre d’investiguer la raison de ses différents patrons et de mettre en évidence des régulateurs spécifiques. / BACKGROUND: Valvular heart disease (VHD) occurs in ~2% of the general population, often resulting in reduced or disturbed blood flow. We recently identified two unrelated families with recessive inheritance patterns of progressive polyvalvular heart disease in absence of any clear syndromic phenotype. Exome sequencing revealed homozygous, rare, loss of function (LOF) alleles in both families for the gene ADAMTS19. The relation between ADAMTS19 mutation and aortic stenosis were confirm via an ADAMTS19-LacZ KO/KO mouse model. This model also shows that ADAMTS19 is specific of VICs during valve development. The ADAMTS protein family includes 19 proteases that are involved in matrix remodeling, and tissue homeostasis in development and disease. However, the role of ADAMTS19 specifically during valve development remains unknown. We aim to characterize ADAMTS19 expression using a BAC transgenic ADMTS19-CRERT2 mouse. HYPOTHESE/OBJECTIVE We hypothesize that the BAC used to make the ADMTS19-CRERT2 mouse contains all the regulatory elements to express it and also that its expression will be specific to the VICs. The objective is to establish the ADAMTS19- CREERT2 and therefore to create a new tool to study VICs in vivo. METHODS/RESULTS: In silico analysis of the human and mouse ADAMTS19 genomic regions showed a high level of conservation. Thus, to analyze ADAMTS19 expression patterns during mouse development, we obtained a BAC transgenic mouse model containing a tamoxifen inducible Cre (CreERT2) that is expressed under the influence of the human ADAMTS19 promoter and surrounding genomic region. We crossed males from several lines created in parallel with Rosa-tdTomato reporter females to generate offspring in which expression of the fluorescent tdTomato reporter is activated in ADAMTS19-expressing cells upon tamoxifen administration. Surprisingly, whole mount imaging of embryos induced at E13.5 and isolated at E16.5 revealed strong, but distinct labelling patterns in offspring from different ADAMTS19CreERT2 sublines. Whereas one line exclusively labelled VICs, consistent with ADAMTS19 in situ RNA expression data from the Eurexpress database, another line specifically labelled cells in atrial and ventricular, but not VICs. A third line seems to label only a subset of cells in the pulmonary artery. Labeling of ADAMTS19-positive VICs is consistent with ADAMTS19 affecting valve development and VHD. In addition, we observed exclusive ADAMTS19-dependent labelling in atrial and ventricular cells or in a subset of pulmonary artery cells in two different sublines. CONCLUSION: The distinct expression patterns in offspring from different ADAMTS19-Cre-ERT2 lines indicates that although regulation of ADAMTS19 is conserved between human and mouse, expression in VICs versus other cells may be dependent on mutually exclusive regulatory mechanisms.

Epidermal homeostasis, including proper turnover of keratinocytes, plays important role in the barrier function and serine proteases and their inhibitors are the key players. Activated proteases cleave desmosomes in uppermost layer and thus shed the cells from the epidermal surface. Therefore the serine protease inhibitors are secreted in lower epidermal layers to prevent premature activation of proteases and consequent disruption of epidermal barrier. The most studied inhibitors in epidermis belong to Serine proteases inhibitors Kazal-type family (SPINK). This diploma thesis is aimed to investigate function of murine SPINK6 in epidermal compartment in vivo. To achieve this, the transgenic mice overexpressing mSPINK6 under modified human involucrin promoter was generated. Two of five transgenic lines exhibited higher expression of mSPINK6 at mRNA and protein levels. The mSPINK6 transgenic mice are viable with no apparent phenotype. The small but in most cases not significant differences were observed on microscopic level among mSPINK6 transgenic and wild type animals In conclusion, this work showed that mSPINK6 does not play major role in skin homeostasis but gains significant importance under specific challenges of epidermal barrier. Therefore mSPINK6 transgenic mice, in combination with other deletion or...

Les cardiomyopathies sont une atteinte du myocarde qui se présente sous différentes formes telles que l’hypertrophie ou la dilatation des chambres cardiaques. Ces maladies du muscle cardiaque peuvent affecter la contraction cardiaque et dégénèrer en insuffisance cardiaque. Aussi, l’hypertrophie et l’insuffisance cardiaques sont associées à une augmentation de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires principalement due au remodelage électrique et à la survenue d’arythmies. De plus, le retard de repolarisation, associé à une diminution des courants K+, est un des troubles cardiaques les plus couramment observés lors de ces pathologies cardiaques. L’angiotensine II (Ang II) et la norépinéphrine, principaux effecteurs du système rénine-angiotensine et du système nerveux sympathique, peuvent tous deux agir directement sur le cœur en liant les récepteurs de type 1 de l’Ang II (AT1) et les récepteurs adrénergiques. L’Ang II et la norépinéphrine sont associées au développement des cardiomyopathies, au remodelage cardiaque et à une prolongation de la durée du potentiel d'action cardiaque. Deux modèles de souris trangéniques surexprimant spécifiquement au niveau cardiaque les récepteurs AT1 (la souris AT1R) ou les récepteurs α1B-adrénergiques (la souris α1B-AR) ont été créés afin d’étudier les effets de ces stimuli sur le cœur. Ces deux modèles de souris développent du remodelage cardiaque, soit de l’hypertrophie chez les souris AT1R (cardiomyopathie hypertrophique) ou une dilatation des chambres cardiaques chez les souris α1B-AR (cardiomyopathie dilatée). Au stade avancé de la maladie, les deux modèles de souris transgéniques sont insuffisants cardiaques. Des données préliminaires ont aussi montré que les souris AT1R et les souris α1B-AR ont une incidence accrue d’arythmies ainsi qu’une prolongation de la durée du potentiel d’action. De plus, ces deux modèles de souris meurent subitement et prématurément, ce qui laissait croire qu’en conditions pathologiques, l’activation des récepteurs AT1 ou des récepteurs α1B-adrénergiques pouvait affecter la repolarisation et causer l’apparition d’arythmies graves. Ainsi, l’objectif de ce projet était de caractériser la repolarisation ventriculaire des souris AT1R et α1B-AR afin de déterminer si la suractivation chronique des récepteurs de l’Ang II ou des récepteurs 1B-adrénergiques pouvait affecter directement les paramètres électrophysiologiques et induire des arythmies. Les résultats obtenus ont révélé que les souris AT1R et les souris α1B-AR présentent un retard de repolarisation (prolongation de l’intervalle QTc (dans l’électrocardiogramme) et de la durée du potentiel d’action) causé par une diminution des courants K+ (responsables de la repolarisation). Aussi, l’incidence d’arythmies est plus importante dans les deux groupes de souris transgéniques comparativement à leur contrôle respectif. Finalement, nous avons vu que les troubles de repolarisation se produisent également dans les groupes de souris transgéniques plus jeunes, avant l’apparition de l’hypertrophie ou du remodelage cardiaque. Ces résultats suggèrent qu’en conditions pathologiques, l’activation chronique des récepteurs de l’Ang II ou des récepteurs α1B-adrénergiques peut favoriser le développement d’arythmies en retardant la repolarisation et cela, indépendamment de changements hémodynamiques ou du remodelage cardiaque. Les résultats de ces études pourront servir à comprendre les mécanismes responsables du développement d’arythmies cardiaques lors du remodelage et de l’insuffisance cardiaques et pourraient aider à optimiser le choix des traitements chez ces patients atteints ou à risque de développer de l’hypertrophie ou du remodelage cardiaque. / Cardiomyopathies are diseases of the myocardium that may have several causes and comes in different forms such as cardiac hypertrophy or dilatation. Cardiomyopathies are often progressive diseases that cause a loss of heart function and lead to heart failure. In addition, hypertrophy and heart failure are associated with increased morbidity and mortality mainly due to electrical remodeling and arrhythmias. Delayed repolarization associated with a decrease of K+ currents, is one of the most common cardiac disorders associated with cardiac remodeling. Angiotensin II (Ang II) and norepinephrine, the main effectors of the renin-angiotensin system and of the sympathetic nervous system, can both act directly on the heart by binding the Ang II type 1 receptor (AT1) and the adrenergic receptors. Ang II and norepinephrine are both associated with the development of cardiomyopathy, cardiac remodeling and prolongation of action potential duration. Two transgenic mouse models overexpressing the AT1 receptors (AT1R mouse) or the α1B-adrenergic receptors (α1B-AR mouse) specifically in the myocardium have been developed to study the effects of these stimuli on the heart. These two mouse models developed cardiac remodeling such as hypertrophy for the AT1R mice (hypertrophic cardiomyopathy) and dilatation of cardiac chambers for α1B-AR mice (dilated cardiomyopathy). In advanced stage of the disease, the two transgenic mouse models exhibit heart failure. Preliminary data showed that both transgenic mouse models experience cardiac arrhythmias and have a prolongation of the action potential duration. Moreover, AT1R and α1B-AR mice die suddenly and prematurely, which suggested that in pathological conditions, activation of the Ang II type 1 receptor or of the α1B-adrenergic receptor may affect repolarization and can be responsible for the incidence of serious arrhythmias causing the death of these mice. Base on these informations, the objective of this project was to characterize the ventricular repolarization in AT1R and α1B-AR mice to see if an increase of the activation of the Ang II type 1 receptor or of the 1B-adrenergic receptor could directly affect electrophysiological parameters and lead to severe arrhythmias. Results showed that both AT1R mice and α1B-AR mice have a delayed ventricular repolarization (prolongation of the QTc interval and action potential duration) caused by a decrease in outward K+ currents (responsible for the repolarization). In addition, the incidence of arrhythmias is higher in both groups of transgenic mice compared with their respective control. Finally, we have seen that repolarization disorders also occur in younger mice of both models of cardiomyopathy that do not present sign of hypertrophy and cardiac remodeling. These results suggest that under pathological conditions, the overactivation of the Ang II type 1 receptor or of the α1B-adrenergic receptor can directly promote the development of arrhythmias by delaying the repolarization independently of hemodynamic variations and pathological phenotype. The results of these studies can be useful to understand the mechanisms underlying the development of cardiac arrhythmias in patients suffering from cardiac hypertrophy or failure and may help to choose the best treatment for these patients.

Thèse en cotutelle avec Université de Nantes - Pays de La Loire - France (2005-2010) / Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. L’hypertrophie cardiaque est un processus de remodelage provoqué par une surcharge de travail du muscle cardiaque afin de mieux répondre à la demande de l’organisme. Bien que bénéfique à court terme, une hypertrophie trop accentuée conduira à long terme, à une insuffisance cardiaque. L’hypertrophie est associée à un remodelage électrique qui conduit généralement à un allongement du potentiel d’action, une des causes des arythmies ventriculaires et de la mort subite. Généralement, le mécanisme causal est la fibrillation ventriculaire, un trouble du rythme irréversible dont les mécanismes sont complexes et méconnus. Si les conséquences fonctionnelles in vitro des mutations génétiques ou du remodelage ionique sont relativement simples à étudier ou à prévoir, leur rôle dans les mécanismes des troubles du rythme in vivo sont plus difficiles à appréhender. Parmi les nombreux modèles animaux développés pour la recherche sur les troubles du rythme, la souris est de plus en plus utilisée en raison de notre capacité à muter, invalider ou sur-exprimer les gènes d'intérêt chez ces animaux. L'objectif de mon travail de thèse était de mieux comprendre le rôle des canaux ioniques en physiopathologie cardiaque, en particulier dans la survenue des troubles du rythme in vivo. Ces travaux ont permis d'améliorer notre connaissance du rôle des anomalies génétiques impliquant des canaux ioniques et du remodelage ionique dans la physiopathologie des troubles du rythme et pourrait ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement anti-remodelage cardiaque et la prévention de la mort subite. / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world each year. If no action is taken to improve cardiovascular health and current trends continue, WHO estimates that 25% more healthy life years will be lost to cardiovascular disease globally by 2020. Cardiac hypertrophy is the consequence of an excessive workload of the heart muscle leading to cardiac remodeling process. As the workload increases, the ventricular walls grow thicker, lose elasticity and eventually may fail to pump with as much force as a healthy heart. Furthermore, hypertrophied myocardium is not physiologically normal and may confer a predisposition to potentially fatal arrhythmias. Generally, the causal mechanism is ventricular fibrillation, a cardiac rhythm disorder which is irreversible but the pathophysiological mechanisms are complex and poorly understood. The functional consequences of mutations or ionic remodeling are relatively simple to study in vitro, but their role in the pathophysiology of arrhythmias in vivo is more difficult to grasp. Among the different animal models developed in cardiac arrhythmias research, the mouse is increasingly used because of our ability to mutate, knock-out or over-express genes of interest. The objective of my thesis was to study the role of ion channels in physiology as well as cardiac pathophysiology, particularly in the involvement of the occurrence of cardiac arrhythmias in vivo. This thesis will improve our understanding of the role of genetic abnormalities involving ionic remodeling in the pathogenesis of the heart and may also open new therapeutic perspectives in the treatment of cardiac remodeling as well as sudden cardiac death.