Access to abstract permanently restricted to Ball State community only / Access to thesis permanently restricted to Ball State community only / Department of Biology

Escherichia coli O157:H7 é um dos patógenos alimentares mais importantes da atualidade, e, recentemente, diversas cepas desse microrganismo foram isoladas no sul do Brasil. O objetivo deste trabalho foi caracterizar duas cepas de E. coli O157:H7, através da avaliação de sua resistência térmica, ácida e comportamento frente a diferentes desinfetantes e procedimentos de higienização de vegetais folhosos. Resultados demonstraram a redução significativa das contagens bacterianas, após 3 minutos a 60ºC, 2 minutos a 65º, 1 minuto a 70, 72º C e 75ºC. Contudo, após adaptação ácida, nenhuma das cepas foi inativada a 60ºC, por até 3 minutos. A 70ºC foi observado aumento significativo da resistência térmica apenas para a CC. Em relação à resistência ácida, ambas as cepas sobreviveram quando expostas ao meio TSBm a diferentes pH entre 2,0 a 9,5 ajustados com ácido clorídrico e ácido propiônico (AP). Apenas, o meio com pH 2,0, ajustado com AP, foi capaz de reduzir significativamente às contagens de ambas as cepas. Na avaliação da resistência aos desinfetantes, álcool etílico (96ºGl e 70%) e quaternário de amônio foram capazes de inativar ambas as cepas, mesmo na presença de matéria orgânica. O ácido orgânico, na concentração recomendada pelo fabricante e o dobro dessa concentração, reduziu cerca de 90% das contagens, após 5 minutos de exposição. O dicloroisocianurato de sódio só apresentou reduções significativas quando foram utilizadas duas vezes a concentração recomendada pelo fabricante. Todos os procedimentos de lavagem e desinfecção de alfaces, artificialmente contaminadas com E. coli O157:H7, reduziram as contagens em 2,97±1,21logUFC/g, apenas o tratamento conduzido a 10ºC, diferiu significativamente dos demais, apresentando maior redução 6,27±0,50logUFC/g. Esses resultados demonstram que as cepas de E. coli O157:H7 foram resistentes a diferentes situações de estresse, sendo portanto importantes do ponto de vista epidemiológico, visto que estão presentes no sul do Brasil e podem se tornar agentes etiológicos de surtos alimentares. / Escherichia coli O157:H7 is a major food pathogens today, and recently, several strains of this organism were isolated in southern Brazil. The objective of this study was to characterize two strains of E. coli O157: H7, by evaluating its thermal and acid resistance and behavior among different disinfectants and cleaning procedures on leafy vegetables. The results showed a significant reduction in bacterial counts after 3 minutes at 60 ° C, 2 min at 65 ° and 1 min at 70, 72 º C and 75 º C. However, after acid adaptation, none of the strains was inactivated at 60 ° C among 3 minutes. At 70 ° C significant increase in heat resistance was observed only for CC. Regarding acid resistance, both strains survived when exposed to TSBm medium at different pH adjusted from 2.0 to 9.5 with hydrochloric acid and propionic acid (PA). Only when the medium was adjusted with AP at pH 2.0 it was able to significantly reduce the counts of both strains. Evaluating the resistance to disinfectants, Ethyl Alcohol Free (96ºGl and 70 %) and quaternary ammonium were able to inactivate both strains, even in the presence of organic matter. For the orgnic acid in the concentration recommended by the manufacturer and at the double concentration there was reduced around 90 % of the counts after 5 minutes of exposure. The sodium dichloroisocyanurate only showed significant reductions when used in the double concentration recommended by the manufacturer. All procedures for cleaning and disinfecting the lettuces artificially contaminated with E. coli O157 : H7 counts decreased by 2.97 ± 1.21 log CFU / g , only the treatment conducted at 10 ° C reduced significantly from the others (6 , 27 ± 0.50 log CFU / g). The results demonstrate that the strains of E. coli O157 : H7 were resistant to different stress situations and therefore are important as an epidemiological point of view, as it is present in southern Brazil and can become etiologic agents of food borne outbreaks.

Escherichia coli O157:H7 é um dos patógenos alimentares mais importantes da atualidade, e, recentemente, diversas cepas desse microrganismo foram isoladas no sul do Brasil. O objetivo deste trabalho foi caracterizar duas cepas de E. coli O157:H7, através da avaliação de sua resistência térmica, ácida e comportamento frente a diferentes desinfetantes e procedimentos de higienização de vegetais folhosos. Resultados demonstraram a redução significativa das contagens bacterianas, após 3 minutos a 60ºC, 2 minutos a 65º, 1 minuto a 70, 72º C e 75ºC. Contudo, após adaptação ácida, nenhuma das cepas foi inativada a 60ºC, por até 3 minutos. A 70ºC foi observado aumento significativo da resistência térmica apenas para a CC. Em relação à resistência ácida, ambas as cepas sobreviveram quando expostas ao meio TSBm a diferentes pH entre 2,0 a 9,5 ajustados com ácido clorídrico e ácido propiônico (AP). Apenas, o meio com pH 2,0, ajustado com AP, foi capaz de reduzir significativamente às contagens de ambas as cepas. Na avaliação da resistência aos desinfetantes, álcool etílico (96ºGl e 70%) e quaternário de amônio foram capazes de inativar ambas as cepas, mesmo na presença de matéria orgânica. O ácido orgânico, na concentração recomendada pelo fabricante e o dobro dessa concentração, reduziu cerca de 90% das contagens, após 5 minutos de exposição. O dicloroisocianurato de sódio só apresentou reduções significativas quando foram utilizadas duas vezes a concentração recomendada pelo fabricante. Todos os procedimentos de lavagem e desinfecção de alfaces, artificialmente contaminadas com E. coli O157:H7, reduziram as contagens em 2,97±1,21logUFC/g, apenas o tratamento conduzido a 10ºC, diferiu significativamente dos demais, apresentando maior redução 6,27±0,50logUFC/g. Esses resultados demonstram que as cepas de E. coli O157:H7 foram resistentes a diferentes situações de estresse, sendo portanto importantes do ponto de vista epidemiológico, visto que estão presentes no sul do Brasil e podem se tornar agentes etiológicos de surtos alimentares. / Escherichia coli O157:H7 is a major food pathogens today, and recently, several strains of this organism were isolated in southern Brazil. The objective of this study was to characterize two strains of E. coli O157: H7, by evaluating its thermal and acid resistance and behavior among different disinfectants and cleaning procedures on leafy vegetables. The results showed a significant reduction in bacterial counts after 3 minutes at 60 ° C, 2 min at 65 ° and 1 min at 70, 72 º C and 75 º C. However, after acid adaptation, none of the strains was inactivated at 60 ° C among 3 minutes. At 70 ° C significant increase in heat resistance was observed only for CC. Regarding acid resistance, both strains survived when exposed to TSBm medium at different pH adjusted from 2.0 to 9.5 with hydrochloric acid and propionic acid (PA). Only when the medium was adjusted with AP at pH 2.0 it was able to significantly reduce the counts of both strains. Evaluating the resistance to disinfectants, Ethyl Alcohol Free (96ºGl and 70 %) and quaternary ammonium were able to inactivate both strains, even in the presence of organic matter. For the orgnic acid in the concentration recommended by the manufacturer and at the double concentration there was reduced around 90 % of the counts after 5 minutes of exposure. The sodium dichloroisocyanurate only showed significant reductions when used in the double concentration recommended by the manufacturer. All procedures for cleaning and disinfecting the lettuces artificially contaminated with E. coli O157 : H7 counts decreased by 2.97 ± 1.21 log CFU / g , only the treatment conducted at 10 ° C reduced significantly from the others (6 , 27 ± 0.50 log CFU / g). The results demonstrate that the strains of E. coli O157 : H7 were resistant to different stress situations and therefore are important as an epidemiological point of view, as it is present in southern Brazil and can become etiologic agents of food borne outbreaks.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal. / Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated attaching/effacing (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains. Concerning the bacterial interaction with human enterocytes cultivated in vitro (Caco-2) we verified that both bovine and human strains showed almost identical ability to invade and to persist in the intracellular compartment of the Caco-2 cells. However, in comparison with the human strains, the bovine strains showed a reduced capacity to produce A/E lesions according to the FAS test. A quantitative FAS test confirmed the relative inefficiency of bovine strains to induce A/E lesions. We also used qPCR to follow the transcription of three genes (eae, espA and tir) of selected bovine and human strains, during the infection of Caco-2 cells. We verified differences in the gene expression, especially for espA, between bovine and human strains and these latter showed a larger expression, in line with the findings of the actin-aggregation tests. Through cloning and expression of recombinant proteins, we purified the Eae, EspA and Tir proteins and obtained specific antibodies, employed to follow the expression of those proteins, by immunofluorescence, along the infection of Caco-2 cells. We found that all proteins are detected both in bovine and human strains, but on these protein labeling occurs early and becomes more intense with the progress of the infection. Our results indicate that EHEC O157:H7 strains isolated from the bovine reservoir in Brazil shows, in comparison to strains isolated from human disease, important differences in relation to the toxigenic profile and the ability to induce A/E lesions. Our findings concerning the ability of the microorganism to invade and to multiply inside enterocytes can explain the persistence of the pathogen in the animal reservoir and its ability of horizontal transmission.

As Escherichia (E.) coli produtoras de toxinas Shiga (STEC) compõem um dos mais importantes grupos de patógenos alimentares do mundo. Dentre as STEC, a E. coli O157:H7 tem sido a mais amplamente estudada, uma vez que pode causar diarréia sanguinolenta, anemia hemolítica, síndrome urêmica hemolítica (HUS) e púrpura trombótica trombocitopênica (TTP), sendo que a carne bovina tem sido um dos principais veículos desse microrganismo. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de E. coli O157:H7 em amostras de carne moída coletadas no Estado do Rio Grande do Sul (RS), sul do Brasil. Para tanto, 95 amostras de carne moída foram coletadas em diferentes municípios do RS. Dentre essas amostras, três isolados foram identificadas como prováveis E. coli O157:H7, segundo os testes recomendados pelo USDA/FSIS. Nesses métodos as cepas cresceram em meio TSB adicionado de novobiocina e casaminoácido, foram positivas para o teste de “screening” utilizando anticorpos específicos, desenvolveram colônias típicas nos meios SMAC (MacConkey sorbitol) e SMAC-CT (Cefixina-telurito), após terem sido submetidas à separação imunomagnética (IMS), aglutinaram o anti-soro para a E. coli O157 e não apresentaram atividade de ß-glucoronidase. Após a caracterização genotípica por PCR Multiplex, investigando genes de virulência (rfbO157, stx1 e stx2), no Laboratório de referência para a vigilância regional de HUS e diarréias sanguinolentas no cone sul, do Ministério da Saúde da Argentina (INEI-ANLIS), os resultados apontaram que os três isolados foram negativos para os fatores de virulência, não produziram Shiga toxinas, não sendo classificados como E. coli 0157:H7. Cabe ressaltar que a caracterização genotípica dessas cepas dificilmente é realizada em indústrias de alimentos, e mesmo resultados falso-positivos para E. coli O157, como os demonstrados nesse trabalho, poderiam afetar significativamente o comércio nacional e internacional de carne bovina brasileira. / The Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is one of the most important food pathogen groups worldwide. Among the STEC, E. coli O157:H7 has been the most widely studied, once it may cause bloody or nonbloody diarrhea, hemolytic anemia, hemolytic uremic syndrome (HUS), and thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), being beef one of the main carriers of this microorganism. The aim of the present study was to investigate the presence of E. coli O157:H7 in ground beef samples collected in the State of Rio Grande do Sul (RS), Southern Brazil. Thus, 95 ground beef samples were collected in different cities of RS. Among the samples, three isolates were identified as probable E. coli O157:H7, according to tests recommended by USDA/FSIS. In these methods, the strains grew in TSB medium added to novobiocine and casamino acid, were positive in the screening test using specific antibodies, developed typical colonies in SMAC (MacConkey sorbitol) and SMAC-CT (Cefixime tellurite) media, after being subjected to Immunomagnetic Separation (IMS), agglutinated the antiserum to E. coli O157 and did not show ß-glucoronidase activity. After the genotypic characterization by PCR Multiplex, investigating virulence genes (rfbO157, stx1 and stx2), at the Reference laboratory for regional surveillance of HUS and bloody diarrheas in the Southern Cone, from the Ministry of Health of Argentina (INEI-ANLIS), the results demonstrated that the three isolates were negative for the virulence factors, did not produce Shiga toxins, not being classified as E. coli 0157:H7. It is worth mentioning that the genotypic characterization of these strains is hardly performed in food industries, and even false-positive results for E. coli O157, as the ones presented in this study, could significantly affect the national and international trade of Brazilian beef.

As Escherichia (E.) coli produtoras de toxinas Shiga (STEC) compõem um dos mais importantes grupos de patógenos alimentares do mundo. Dentre as STEC, a E. coli O157:H7 tem sido a mais amplamente estudada, uma vez que pode causar diarréia sanguinolenta, anemia hemolítica, síndrome urêmica hemolítica (HUS) e púrpura trombótica trombocitopênica (TTP), sendo que a carne bovina tem sido um dos principais veículos desse microrganismo. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de E. coli O157:H7 em amostras de carne moída coletadas no Estado do Rio Grande do Sul (RS), sul do Brasil. Para tanto, 95 amostras de carne moída foram coletadas em diferentes municípios do RS. Dentre essas amostras, três isolados foram identificadas como prováveis E. coli O157:H7, segundo os testes recomendados pelo USDA/FSIS. Nesses métodos as cepas cresceram em meio TSB adicionado de novobiocina e casaminoácido, foram positivas para o teste de “screening” utilizando anticorpos específicos, desenvolveram colônias típicas nos meios SMAC (MacConkey sorbitol) e SMAC-CT (Cefixina-telurito), após terem sido submetidas à separação imunomagnética (IMS), aglutinaram o anti-soro para a E. coli O157 e não apresentaram atividade de ß-glucoronidase. Após a caracterização genotípica por PCR Multiplex, investigando genes de virulência (rfbO157, stx1 e stx2), no Laboratório de referência para a vigilância regional de HUS e diarréias sanguinolentas no cone sul, do Ministério da Saúde da Argentina (INEI-ANLIS), os resultados apontaram que os três isolados foram negativos para os fatores de virulência, não produziram Shiga toxinas, não sendo classificados como E. coli 0157:H7. Cabe ressaltar que a caracterização genotípica dessas cepas dificilmente é realizada em indústrias de alimentos, e mesmo resultados falso-positivos para E. coli O157, como os demonstrados nesse trabalho, poderiam afetar significativamente o comércio nacional e internacional de carne bovina brasileira. / The Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is one of the most important food pathogen groups worldwide. Among the STEC, E. coli O157:H7 has been the most widely studied, once it may cause bloody or nonbloody diarrhea, hemolytic anemia, hemolytic uremic syndrome (HUS), and thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), being beef one of the main carriers of this microorganism. The aim of the present study was to investigate the presence of E. coli O157:H7 in ground beef samples collected in the State of Rio Grande do Sul (RS), Southern Brazil. Thus, 95 ground beef samples were collected in different cities of RS. Among the samples, three isolates were identified as probable E. coli O157:H7, according to tests recommended by USDA/FSIS. In these methods, the strains grew in TSB medium added to novobiocine and casamino acid, were positive in the screening test using specific antibodies, developed typical colonies in SMAC (MacConkey sorbitol) and SMAC-CT (Cefixime tellurite) media, after being subjected to Immunomagnetic Separation (IMS), agglutinated the antiserum to E. coli O157 and did not show ß-glucoronidase activity. After the genotypic characterization by PCR Multiplex, investigating virulence genes (rfbO157, stx1 and stx2), at the Reference laboratory for regional surveillance of HUS and bloody diarrheas in the Southern Cone, from the Ministry of Health of Argentina (INEI-ANLIS), the results demonstrated that the three isolates were negative for the virulence factors, did not produce Shiga toxins, not being classified as E. coli 0157:H7. It is worth mentioning that the genotypic characterization of these strains is hardly performed in food industries, and even false-positive results for E. coli O157, as the ones presented in this study, could significantly affect the national and international trade of Brazilian beef.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal. / Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated attaching/effacing (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains. Concerning the bacterial interaction with human enterocytes cultivated in vitro (Caco-2) we verified that both bovine and human strains showed almost identical ability to invade and to persist in the intracellular compartment of the Caco-2 cells. However, in comparison with the human strains, the bovine strains showed a reduced capacity to produce A/E lesions according to the FAS test. A quantitative FAS test confirmed the relative inefficiency of bovine strains to induce A/E lesions. We also used qPCR to follow the transcription of three genes (eae, espA and tir) of selected bovine and human strains, during the infection of Caco-2 cells. We verified differences in the gene expression, especially for espA, between bovine and human strains and these latter showed a larger expression, in line with the findings of the actin-aggregation tests. Through cloning and expression of recombinant proteins, we purified the Eae, EspA and Tir proteins and obtained specific antibodies, employed to follow the expression of those proteins, by immunofluorescence, along the infection of Caco-2 cells. We found that all proteins are detected both in bovine and human strains, but on these protein labeling occurs early and becomes more intense with the progress of the infection. Our results indicate that EHEC O157:H7 strains isolated from the bovine reservoir in Brazil shows, in comparison to strains isolated from human disease, important differences in relation to the toxigenic profile and the ability to induce A/E lesions. Our findings concerning the ability of the microorganism to invade and to multiply inside enterocytes can explain the persistence of the pathogen in the animal reservoir and its ability of horizontal transmission.

Escherichia coli O157:H7 é um dos patógenos alimentares mais importantes da atualidade, e, recentemente, diversas cepas desse microrganismo foram isoladas no sul do Brasil. O objetivo deste trabalho foi caracterizar duas cepas de E. coli O157:H7, através da avaliação de sua resistência térmica, ácida e comportamento frente a diferentes desinfetantes e procedimentos de higienização de vegetais folhosos. Resultados demonstraram a redução significativa das contagens bacterianas, após 3 minutos a 60ºC, 2 minutos a 65º, 1 minuto a 70, 72º C e 75ºC. Contudo, após adaptação ácida, nenhuma das cepas foi inativada a 60ºC, por até 3 minutos. A 70ºC foi observado aumento significativo da resistência térmica apenas para a CC. Em relação à resistência ácida, ambas as cepas sobreviveram quando expostas ao meio TSBm a diferentes pH entre 2,0 a 9,5 ajustados com ácido clorídrico e ácido propiônico (AP). Apenas, o meio com pH 2,0, ajustado com AP, foi capaz de reduzir significativamente às contagens de ambas as cepas. Na avaliação da resistência aos desinfetantes, álcool etílico (96ºGl e 70%) e quaternário de amônio foram capazes de inativar ambas as cepas, mesmo na presença de matéria orgânica. O ácido orgânico, na concentração recomendada pelo fabricante e o dobro dessa concentração, reduziu cerca de 90% das contagens, após 5 minutos de exposição. O dicloroisocianurato de sódio só apresentou reduções significativas quando foram utilizadas duas vezes a concentração recomendada pelo fabricante. Todos os procedimentos de lavagem e desinfecção de alfaces, artificialmente contaminadas com E. coli O157:H7, reduziram as contagens em 2,97±1,21logUFC/g, apenas o tratamento conduzido a 10ºC, diferiu significativamente dos demais, apresentando maior redução 6,27±0,50logUFC/g. Esses resultados demonstram que as cepas de E. coli O157:H7 foram resistentes a diferentes situações de estresse, sendo portanto importantes do ponto de vista epidemiológico, visto que estão presentes no sul do Brasil e podem se tornar agentes etiológicos de surtos alimentares. / Escherichia coli O157:H7 is a major food pathogens today, and recently, several strains of this organism were isolated in southern Brazil. The objective of this study was to characterize two strains of E. coli O157: H7, by evaluating its thermal and acid resistance and behavior among different disinfectants and cleaning procedures on leafy vegetables. The results showed a significant reduction in bacterial counts after 3 minutes at 60 ° C, 2 min at 65 ° and 1 min at 70, 72 º C and 75 º C. However, after acid adaptation, none of the strains was inactivated at 60 ° C among 3 minutes. At 70 ° C significant increase in heat resistance was observed only for CC. Regarding acid resistance, both strains survived when exposed to TSBm medium at different pH adjusted from 2.0 to 9.5 with hydrochloric acid and propionic acid (PA). Only when the medium was adjusted with AP at pH 2.0 it was able to significantly reduce the counts of both strains. Evaluating the resistance to disinfectants, Ethyl Alcohol Free (96ºGl and 70 %) and quaternary ammonium were able to inactivate both strains, even in the presence of organic matter. For the orgnic acid in the concentration recommended by the manufacturer and at the double concentration there was reduced around 90 % of the counts after 5 minutes of exposure. The sodium dichloroisocyanurate only showed significant reductions when used in the double concentration recommended by the manufacturer. All procedures for cleaning and disinfecting the lettuces artificially contaminated with E. coli O157 : H7 counts decreased by 2.97 ± 1.21 log CFU / g , only the treatment conducted at 10 ° C reduced significantly from the others (6 , 27 ± 0.50 log CFU / g). The results demonstrate that the strains of E. coli O157 : H7 were resistant to different stress situations and therefore are important as an epidemiological point of view, as it is present in southern Brazil and can become etiologic agents of food borne outbreaks.

E. coli O157:H7 é um patógeno de importância em alimentos, tendo sido envolvido, nos últimos anos, em surtos de grandes proporções, principalmente por produtos cárneos. Entretanto sua ocorrência em alimentos, particularmente em carne crua, é baixa e poderia, eventualmente, ser atribuída à atividade antagônica expressa por outros microrganismos presentes. Assim sendo, foi avaliada a interferência de bactérias que fazem parte da microbiota normal de carne sobre a multiplicação de E. coli O157:H7 em carne bovina moída mantida em refrigeração e em temperatura ambiente. Com essa finalidade, foram realizados testes de desafio (\"challenge tests\") em porções de 25 g de carne bovina moída inoculadas com diferentes concentrações de E. coli O157:H7 (101, 103 e 106 CFC/g), desafiadas com diferentes inóculos de E. coli não patogênica, Pseudomonas putida e Leuconostoc spp. As cepas de Pseudamonas putida e de Leuconostoc spp., isoladas de carne, foram selecionadas em função de atividade inibitória contra E. calí O157:H7 observada \"in vitro\". Para o monitoramento de E. coli O157:H7, foram utilizados o método convencional, ou seja, plaqueamento em ágar Mac Conkey-sorbitol e identificação de colônias (testes bioquímicos e sorológicos), bem como um método considerado rápido, empregando o Petrifilm™ Kit-HEC. De maneira geral, não foram observadas interferências significativas da presença de diferentes inóculos de E. coli não patogênica, P. putida e Leuconostoc spp., sobre a multiplicação de diferentes inóculos de E. coli O157:H7 à temperatura ambiente e à temperatura de refrigeração. Paralelamente, o Petrifilm™ Kit-HEC revelou um alto índice de correlação com o ágar Mac Conkey-sorbitol (97,2%), com contagens da mesma ordem de grandeza. Os experimentos à temperatura ambiente revelaram um maior índice de correlação (99,0%), quando comparados àqueles à temperatura de refrigeração (94,9%). Aparentemente, a baixa ocorrência de E. coli O157:H7 em alimentos, particularmente em carne bovina crua, não pode ser atribuída à atividade antagônica de alguns microrganismos presentes. / Escherichia coli O157:H7 is a foodborne pathogen of increasing importance, since it has been involved in several threatening outbreaks, most of them associated with meat products. Though, it is possible that the low occurrence af E. coli O157:H7 in food, particularly in meat, may be due to antagonistic effects af other microorganisms present. Therefore, the influence of some bacteria isolated from meat, over E. coli O157:H7 in meat samples stored at chill and room temperatures was evaluated. For that purpose, studies were performed on 25 g of ground beef inoculated with different spiking levels of E. coli O157:H7 (101, 103 and 106 CFC/g), challenged with different spiking levels of non pathogenic E. coli, Pseudomonas putida or Leuconostoc spp. The Ps. putida and Leuconostoc spp. strains were selected based on deferred antagonism observed against E. coli O157:H7. Multiplication was monitored by means of cultural methods, employing sorbitol Mac Conkey agar and additional identification tests, and the rapid method Petrifilm™ Kit-HEC. No significant influence of non pathogenic E. coli, Pseudomonas putida and Leuconostoc spp. over the multiplication of E. coli O157:H7 was observed. Results on Petrifilm™ Kit-HEC showed high correlation with results on sorbitol Mac Conkey agar (97,2%). Experiments performed with meat kept at room temperatures resulted in higher correlation values (99,0%), when compared to those of meat kept at chill temperatures (94,9%). Apparently, the low occurrence of E. coli O157:H7 in food, particularly in raw meat, can\'t be attributed to antagonistic effects of other bacteria from natural microflora.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-14T17:16:12Z No. of bitstreams: 1 Lopes, Patricia Regina Kraschinski [Dissertação, 2016].pdf: 1353027 bytes, checksum: d3bd0a8823abd0576a16231891f91a13 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-14T17:16:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes, Patricia Regina Kraschinski [Dissertação, 2016].pdf: 1353027 bytes, checksum: d3bd0a8823abd0576a16231891f91a13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade microbiológica do leite bovino em diferentes etapas da cadeia produtiva de uma cooperativa de leite do Estado do Rio de Janeiro, e investigar a presença de STEC e STEC O157 no leite e nas fezes dos animais ordenhados. Foram coletadas 100 amostras de leite nas diferentes etapas da cadeia produtiva, sendo 54 amostras do galão de cada propriedade rural, 25 amostras de leite do tanque de refrigeração comunitário, 14 amostras dos carros-tanque isotérmicos e 7 amostras do tanque de resfriamento da indústria bem como 10 amostras de leite pasteurizado. Foram também avaliadas 63 amostras de swab retal do animal ordenhado e 35 amostras de leite recém ordenhado. Para conferir a eficiência da pasteurização foram realizados os testes de peroxidase e fosfatase alcalina. A maioria das amostras (75,9%) de leite cru coletadas nos galões dos produtores apresentou condições microbiológicas satisfatórias, contagem bacteriana total (CBT) < 5,5 log UFC/mL. No entanto, 72% das amostras de leite coletadas no tanque de refrigeração comunitário, 100% das amostras coletadas nos carros-tanque isotérmicos e 100% das amostras coletadas nos tanques de refrigeração da indústria apresentaram condições microbiológicas insatisfatórias. Todas as amostras de leite pasteurizado foram aprovadas quanto a CBT, além de apresentarem a enzina peroxidase ativa e a enzima fosfatase alcalina inativa. No entanto, 80% destas amostras foram classificadas em condições microbiológicas insatisfatórias por apresentarem coliformes totais e E. coli acima dos padrões estabelecidos pela legislação brasileira. Das 100 amostras de leite cru analisadas, 65 apresentaram o gene stx, sendo 33 (61,1%) amostras do galão do produtor, 13 (52%) amostras do tanque de refrigeração comunitário, 14 (100%) amostras dos carros-tanque isotérmicos e cinco (71,4%) amostras dos tanques de resfriamento da indústria. Cinquenta e seis (88,9%) amostras fecais e 17 (48,6%) amostras de leite recém-ordenhado apresentaram o gene stx. Com exceção de uma amostra, todas as amostras de leite recém ordenhado provinham de um animal carreador do gene stx. Foram isolados STEC O157:H7 em 11,9% das amostras de fezes bovinas stxpositivas. Todas as cepas STEC O157:H7 isoladas apresentaram os genes stx2c, eae , tir , espA , espB , ler, iha, astA, EHEC-hlyA e espP. A qualidade microbiológica dos produtos lácteos está diretamente relacionada à qualidade da matéria-prima, com isso, é necessário a adequação dos produtores rurais quanto à implementação de Boas Práticas Agropecuárias, além da implementação das Boas Práticas de Fabricação pela indústria de laticínios / The aim of this study was to evaluate the microbiological quality of cow's milk in different stages of the production chain of a cooperative state milk Rio de Janeiro, and to investigate the presence of STEC and STEC O157 on themilk and the faeces of milked animals. 100 milk samples at different stages of the production chain were collected, 54 samples of a gallon of each rural property, 25 milk samples of Community coolant tank, 14 samples of insulated tank cars and 7 samples of the industrial cooling tank; and 10 samples of pasteurized milk. It was also evaluated 63 samples of rectal swab of milking animals and 35 sample of freshly milked milk. To check the effectiveness of the pasteurization tests peroxidase and alkaline phosphatase were performed. The majority of samples (75.9%) of raw milk collected in gallons producers had satisfactory microbiological conditions, total bacterial count (TBC) < 5.5 log CFU/mL. However, 72% of milk samples collected in the Community coolant tank, 100% of the samples collected in the isothermal tank cars and 100% of the samples collected in the industrial cooling tanks had unsatisfactory microbiological conditions. All (100%) samples of pasteurized milk were approved as the TBC, besides having the peroxidase enzyme is of not presenting the enzyme alkaline phosphatase. However, 80% of these samples were classified as unsatisfactory microbiological conditions for presenting total coliforms and E. coli above the standards set by law. Of 100 raw milk samples analyzed, 65 showed the stx gene, 33 (61.1%) of the producer gallon, 13 (52%) of the community coolant tank, 14 (100%) of the isothermal tank cars and five (71.4%) of cooling tanks industry. Fifty-six (88.9%) and 17 faecal samples (48.6%) of freshly milked milk samples showed the stx gene. With the exception of one sample, all milk samples freshly milked, came from a carrier animal stx gene. They were isolated STEC O157: H7 in 11.9% of samples stx-positive cattle dung. All strains STEC O157: H7 isolated genes showed stx2c, eae , tir , espA , espB , read, iha, astA, EHEC-hlyA and espP. The microbiological quality of dairy products is directly related to the quality of the raw material, thus, the adequacy of farmers as the implementation of Best Practices of Agricultural is required in addition to the implementation of Good Manufacturing Practices by the dairy industry