Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-28T14:54:49Z No. of bitstreams: 1 BIBIANA RIBAS.pdf: 831752 bytes, checksum: 996820e0c99836629d4fd8d1881772d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-28T14:55:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 BIBIANA RIBAS.pdf: 831752 bytes, checksum: 996820e0c99836629d4fd8d1881772d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-28T14:55:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BIBIANA RIBAS.pdf: 831752 bytes, checksum: 996820e0c99836629d4fd8d1881772d4 (MD5) Previous issue date: 2017-12-08 / Devido à grande necessidade em aumentar o material genético nos bovinos, as técnicas OPU/PIV vêm sendo aplicadas em larga escala com a finalidade de se obter um maior número de produtos nascidos por ano de fêmeas selecionadas. No entanto, alguns animais apresentam um baixo número de folículos disponíveis para a OPU, enquanto outros apresentam uma baixa taxa de conversão de oócitos em embriões. Neste contexto trabalhos que busquem maximizar os resultados de OPU/PIV são essenciais. Uma das alternativas é manipular farmacologicamente o desenvolvimento folicular para obter oócitos mais competentes para a fecundação in vitro e desenvolvimento embrionário. Por isso, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes doses de gonadotrofina coriônica equina (eCG) em um protocolo prévio à OPU, sobre o desenvolvimento folicular, número e qualidade dos oócitos recuperados assim como potencial de fecundação e desenvolvimento embrionário in vitro. Dezesseis vacas doadoras Braford foram submetidas a 4 sessões de OPU com intervalo de 15 dias entre cada aspiração (n=16 por tratamento; cross over), para avaliar o efeito da dose de eCG as doadoras foram dividas de acordo com os respectivos tratamentos (Controle = zero, eCG200 = 200UI de eCG, eCG400 = 400UI de eCG e eCG800 = 800UI de eCG). No início do protocolo de sincronização (D0), as doadoras receberam 2 mg de benzoato de estradiol IM, 12,5 mg de dinoprost trometamina IM e um dispositivo de liberação lenta de P4 intravaginal. No dia 3, as doadoras receberam uma dose de eCG de acordo com cada tratamento e no dia 6, o dispositivo de P4 foi removido e as doadoras submetidas a OPU. Antes da OPU, os vii folículos ovarianos foram visualizados, mensurados e classificados de acordo com o diâmetro em pequenos (<6mm), médios (6-10mm) e grandes (>10mm). Após a OPU, os oócitos viáveis de cada vaca foram levados a MIV e FIV em grupos de acordo com os tratamentos. A MIV foi realizada durante 24h à 39°C em TCM 199 modificado. Para a fecundação in vitro, os espermatozoides de um touro Bos taurus de fertilidade comprovada foram selecionados por gradientes de Percoll e co-incubados com os oócitos por 18h. Após a FIV, 50% dos prováveis zigotos foram avaliados quanto à taxa de fecundação por epifluorescência. O restante dos oócitos foram transferidos para gotas de SOFaaci e cultivados in vitro para avaliação da taxa de clivagem, momento da primeira clivagem e número de células às 48 horas em um sistema de monitoramento embrionário. As análises estatísticas foram realizadas com ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05). Não houve diferença no número de folículos, quantidade e qualidade morfológica dos oócitos obtidos entre os tratamentos (P <0,05). A taxa de recuperação de oócitos foi semelhante entre os grupos tratados com eCG, porém, inferior ao grupo Controle (p<0,0001). No entanto, o grupo eCG800 apresentou maior número de folículos médios e grandes (>6mm e >10mm; P <0,00001). Adicionalmente o grupo eCG800 apresentou maior taxa de fecundação normal (54,3±8,5) e menor taxa de polispermia (5.7±4.0) que os demais grupos (P < 0,05). Os grupos eCG800 e Controle tiveram maior taxa de clivagem que os demais tratamentos, 68,6±7,9 e 75,6±6,8, respectivamente. Não houve diferença no momento da primeira clivagem e no número médio de células às 48 h entre os tratamentos. Com base nestes dados, pode-se concluir que a dose de 800UI de eCG aumentou a proporção de folículos >6mm, proporcionando a maior taxa de fecundação normal e uma redução na taxa de polispermia em relação ao Controle e as demais doses de eCG, sem prejuízos a cinética de desenvolvimento embrionário até 48 horas. / Due to the great need to increase the genetic material in cattle, the OPU / PIV techniques have been applied in a large scale in order to obtain a larger number of products born per year of selected females. However, some animals have a low number of follicles available for OPU, while others have a low rate of oocyte conversion in embryos. In this context, works that seek to maximize OPU / PIV results are essential. One of the alternatives is to pharmacologically manipulate follicular development to obtain more competent oocytes for in vitro fertilization and embryonic development. Therefore, the objective of this study was to evaluate the effect of different doses of equine Chorionic Gonadotrophin (eCG) on a protocol prior to OPU, on the follicular development, number and quality of oocytes recovered as well as potential for fertilization and in vitro embryo development. Sixteen Braford donor cows were submitted to 4 OPU sessions with a 15 day interval between each aspiration (n = 16 per treatment, cross over), to evaluate the effect of the eCG dose the donors were divided according to the respective treatments (Control = zero, eCG200 = 200UI of eCG, eCG400 = 400UI of eCG, and eCG800 = 800UI of eCG). At the beginning of the synchronization protocol (D0), the donors received 2 mg of estradiol IM benzoate, 12.5 mg of dinoprost tromethamine IM and a slow intravaginal P4 release device. On day 3, the donors were given a dose of eCG according to each treatment and on day 6, the P4 device was removed and the donors were subjected to OPU. Before OPU, ovarian follicles were visualized, measured and classified according to the diameter in small (< 6 mm), medium (6-10 mm) and large (> 10 mm). After OPU, viable ix oocytes from each cow were taken to IVM and IVF in groups according to treatments. IVM was performed for 24 hours at 39°C in modified TCM 199. For in vitro fertilization, the sperm of a Bos taurus bull of proven fertility were selected by Percoll gradients and co-incubated with the oocytes for 18 h. After IVF, 50% of probable zygotes were evaluated for fertilization rate by epifluorescence. The remaining oocytes were transferred to drops of SOFaaci and cultured in vitro for evaluation of the cleavage rate, time of the first cleavage and cell number at 48 hours in an embryonic monitoring system. Statistical analyzes were performed using ANOVA and the means were compared by the Tukey test (P < 0.05). There was no difference in the number of follicles, quantity and morphological quality of the oocytes obtained between the treatments (P < 0.05). The oocyte recovery rate was similar between the eCG treated groups, but lower than the Control (p < 0.001). However, the eCG800 had a greater number of medium and large follicles (> 6 mm and > 10 mm, P <0.00001). In addition, the eCG800 had a higher normal fertilization rate (54.3 ± 8.5) and a lower rate of polyspermy (5.7 ± 4.0) than the other groups (P < 0.05). The eCG800 and Control had a higher cleavage rate than the other treatments (68.6 ± 7.9 and 75.6 ± 6.8), respectively. There was no difference at the time of the first cleavage and in the average number of cells at 48 h between treatments. Based on these data, it can be concluded that the dose of 800UI of eCG increased the proportion of follicles > 6mm, providing the highest rate of normal fertilization and a reduction in the rate of polyspermia in relation to Control and the other doses of eCG, without impairing the kinetics of embryonic development until at 48 hours.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001-07-18Bitstream added on 2014-06-13T19:17:44Z : No. of bitstreams: 1 dayan_a_me_botfmvz.pdf: 264427 bytes, checksum: 27a8348b7bcdc6cd677cb5317cbb7845 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As técnicas de aspiração folicular (OPU) e fecundação in vitro (FIV) vêm surgindo como uma alternativa importante para a produção de embriões bovinos. Estas técnicas aplicam-se tanto para vacas com problemas reprodutivos adquiridos, como para melhorar a performance de vacas saudáveis, gestantes, novilhas e animais de idade avançada. Vários trabalhos relatam fatores que interferem no processo de OPU-FIV. O presente trabalho tem como objetivo identificar alguns dos fatores que interferem na produção, como a influência da raça e da sazonalidade na recuperação de oácitos, produção de embriões e taxa de gestação; a influência do estádio de desenvolvimento embrionário e da sincronização da receptora no momento da transferência e, posteriormente, a 5 interação entre o estádio embrionário e a sincronização da receptora. Foram avaliadas 1.841 aspirações foliculares em 566 doadoras das raças Nelore, Brahman, Gir, Guzerá, Blond D'Aquitaine, Limousin, Holandesa e Pardo suíço em 29 propriedades. A idade das doadoras variou entre 12 e 240 meses. De um total de 19.~659 oócitos viáveis, foram produzidos 7.116~ embriões (36,20%), dos quais foram transferidos 3.572 embriões originando 1.147 gestações (32,11 %). As raças Nelore e Blond D'Aquitaine apresentaram maior produção de oócitos (15,52±3,15 e 14,85±2,40 respectivamente). A maior produção de embriões por sessão de OPU foi das raças Brahman, Blond D'Aquitaine e Nelore (5,54±2,36; 4,43±1,92; 4,04±2,47, respectivamente). No inverno a produção de oócitos foi superior ao outono (15,22±3,62 e 13,36±3,48, respectivamente), no entanto a produção de embriões foi melhor no verão e outono (4,35±2,38e 4,14±2,49, respectivamente) e pior no inverno e na primavera (3,46±2,31 e 3,83±2,54, respectivamente). A mesma relação foi observada na taxa de gestação para o verão, outono, inverno e...

Resumo: As técnicas de aspiração folicular (OPU) e fecundação in vitro (FIV) vêm surgindo como uma alternativa importante para a produção de embriões bovinos. Estas técnicas aplicam-se tanto para vacas com problemas reprodutivos adquiridos, como para melhorar a performance de vacas saudáveis, gestantes, novilhas e animais de idade avançada. Vários trabalhos relatam fatores que interferem no processo de OPU-FIV. O presente trabalho tem como objetivo identificar alguns dos fatores que interferem na produção, como a influência da raça e da sazonalidade na recuperação de oácitos, produção de embriões e taxa de gestação; a influência do estádio de desenvolvimento embrionário e da sincronização da receptora no momento da transferência e, posteriormente, a 5 interação entre o estádio embrionário e a sincronização da receptora. Foram avaliadas 1.841 aspirações foliculares em 566 doadoras das raças Nelore, Brahman, Gir, Guzerá, Blond D'Aquitaine, Limousin, Holandesa e Pardo suíço em 29 propriedades. A idade das doadoras variou entre 12 e 240 meses. De um total de 19.~659 oócitos viáveis, foram produzidos 7.116~ embriões (36,20%), dos quais foram transferidos 3.572 embriões originando 1.147 gestações (32,11 %). As raças Nelore e Blond D'Aquitaine apresentaram maior produção de oócitos (15,52±3,15 e 14,85±2,40 respectivamente). A maior produção de embriões por sessão de OPU foi das raças Brahman, Blond D'Aquitaine e Nelore (5,54±2,36; 4,43±1,92; 4,04±2,47, respectivamente). No inverno a produção de oócitos foi superior ao outono (15,22±3,62 e 13,36±3,48, respectivamente), no entanto a produção de embriões foi melhor no verão e outono (4,35±2,38e 4,14±2,49, respectivamente) e pior no inverno e na primavera (3,46±2,31 e 3,83±2,54, respectivamente). A mesma relação foi observada na taxa de gestação para o verão, outono, inverno e ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Orientador: Paulo Henrique Franceschini / Coorientador: Maria Denise Lopes / Mestre

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p&lt;0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p&gt;0,05). Observou-se efeito significativo (p&lt;0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p&gt;0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p&lt;0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p&lt;0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p&gt;0.05). A significant effect (p&lt;0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p&gt;0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p&lt;0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA079.pdf: 1198872 bytes, checksum: 45c625202a482ee64b00347aef9f38a0 (MD5) Previous issue date: 2011-06-30 / The Flemish cattle breed, originarily from the Northeast region of France, was imported to Brazil from Argentina in 1945, being allocated to an experimental Station in Lages, State of Santa Catarina (SC). The Flemish is a double purpose breed very well adapted to the altiplane. Such features contributed to a quick dissemination of this breed in the Southern region of Brazil. However, the introduction of more specialized breeds in the past decades caused a loss of interest in the Flemish breed, resulting in a drastic reduction in the herd size, with only about fifty animals still remaining, all located at the EPAGRI Experimental Station in Lages, SC. The high risk of extinction imposed to this small herd, along with its importance to biodiversity, justifies the need for its preservation. For that, the Ovum Pick Up (OPU)/in vitro embryo production (IVP) and the multiple ovulation and embryo transfer (MOET) procedures are among the available reproductive biotechnologies that could be readily applied for the maintenance and expansion of the breed. However, data regarding the oocyte retrieval efficiency by OPU and embryo yield either by IVP or MOET for Flemish cattle are still lacking. The aim of this study was to compare the efficiency of the in vivo and in vitro embryo production systems for the Flemish breed, using Holstein females as control counterparts. Eight multiparous Flemish females and eight Holstein females were allocated to two subgroups of four animals per breed. Each subgroup was subjected to 10 OPU sessions, at weekly intervals, or two MOET protocols, for two periods of 63 days. After the conclusion of one 63-days long period of OPU and MOET sessions, both procedures were repeated in a second period of 63 days, inverting the subgroups of animals for each procedure. The OPU was performed by ultrasonography for the transvaginal aspiration of &#8805;3 mm follicles. Recovered oocytes were morphologically graded and subjected to IVP procedures, including the in vitro maturation, fertilization and culture steps, up to Day 7 of development. For the MOET subgroups, a standard decreasing FSH dose treatment was used followed by AI, with embryo recovery performed by nonsurgical procedures on Day 7 after AI. Frozen semen from the same Flemish bull was used for the entire experiment. Quantitative data were analyzed using the PROC MIXED or by the Friedman test (SAS), whereas qualitative data were analyzed by the &#967;2 test, and data on the embryonic morphology and kinetics of development by the Kruskal-Wallis test (Minitab), for P<0.05. After 20 OPU sessions per breed, a total of 635 viable oocytes were obtained from Flemish females, with 8.0 ± 0.7 oocytes/animal/section, which was significantly higher than from Holstein cows (543 viable oocytes, 7.3 ± 0.7 oocytes/animal/section). The mean number of blastocysts per IVP procedure (3.9 ± 1.5 vs. 2.1 ± 1.2) and blastocyst rates (11.8% vs. 7.2%) were higher in Flemish than in Holstein females, respectively. After four MOET sessions (total of 32 flushings), Flemish females yielded more viable embryos than Holstein animals (111 vs. 48 viable embryos, with 7.5 ± 1.8 vs. 3.7 ± 1.4 embryos/female, respectively). In conclusion, Flemish females yielded more viable oocytes by OPU and more viable embryos by IVP or MOET than Holstein females. Also, MOET procedures were more efficient than OPU/IVP for the production of embryos, irrespective of the breed. Nevertheless, both reproductive biotechnologies, OPU/IVP and MOET procedures, were efficient as useful tools for the genetic conservation of Flemish cattle / Bovinos da raça Flamenga, originários da França, chegaram ao Brasil em 1945 oriundos da Argentina, sendo alocados em Lages, no Estado de Santa Catarina. Esta raça é de dupla aptidão e que, devido à perfeita adaptação às condições edafoclimáticas regionais, acabou compondo inúmeros rebanhos na região Sul do Brasil. Porém, a introdução de raças especializadas no decorrer das últimas décadas ocasionou desinteresse pela raça Flamenga, resultando na redução drástica do rebanho, com cerca de cinqüenta animais ainda remanescentes e lotados na EPAGRI de Lages. O risco de extinção imposto a este rebanho e sua importância para a biodiversidade justificam a necessidade de sua preservação. Dentre as biotécnicas reprodutivas que podem ser utilizadas para a expansão desta raça destacam-se a Ovum Pick Up (OPU)/produção in vitro de embriões (PIV) e a produção in vivo de embriões pela múltipla ovulação, inseminação artificial (IA) e transferência de embriões (TE). Informações sobre a eficiência de recuperação de oócitos obtidos por OPU para a PIV ou mesmo de embriões produzidos por TE na raça Flamenga são praticamente inexistentes. O objetivo deste estudo foi comparar as eficiências de produção in vitro vs. in vivo de embriões da raça Flamenga, utilizando-se a raça Holandesa como controle. Oito fêmeas da raça Flamenga e oito da raça Holandesa foram subdivididas em dois subgrupos de quatro animais/raça. Cada subgrupo foi submetido a um bloco de 10 seções de OPU/PIV com intervalo semanal ou a duas seções de TE, em um intervalo de 63 dias. Passado este primeiro período de 63 dias, ambos os procedimentos (OPU/PIV e TE) foram repetidos em um segundo período de 63 dias, invertendo-se os subgrupos de animais para cada procedimento. A OPU foi realizada por ultrassonografia transvaginal para a aspiração de folículos com diâmetro acima de 3 mm. Todos os CCOs foram avaliados morfologicamente e submetidos à PIV, a qual incluiu as etapas de maturação, fecundação e cultivo in vitro até o Dia 7 de desenvolvimento. Para a TE, realizou-se protocolo padrão com doses decrescentes de FSH, seguida de IA, com recuperação de embriões realizados por procedimento não-cirúrgico no dia 7 após a inseminação. Sêmen congelado do mesmo touro da raça Flamenga foi utilizado em todo o experimento. Os dados quantitativos foram analisados pelo PROC MIXED ou pelo teste de Friedman (SAS). Os dados qualitativos foram analisados pelo teste do &#967;2, e analisou-se os dados de morfologia embrionária e cinética de desenvolvimento pelo teste de Kruskal-Wallis (Minitab), para P<0,05. Após 20 seções de OPU/raça, o número total de oócitos viáveis e a média de oócitos/animal/seção na raça Flamenga (n=635 e 8,0 ± 0,7) foram superiores à raça Holandesa (n=543 e 7,3 ± 0,7), respectivamente. O número médio de blastocistos obtidos por rotina de PIV (3,9 ± 1,5 vs. 2,1 ± 1,2) e a taxa de blastocistos pela PIV (11,8% vs. 7,2%) foram maiores para fêmeas da raça Flamenga se comparadas a fêmeas da raça Holandesa, respectivamente. Após quatro seções de TE (32 coletas/recoletas totais), produziram-se 111 embriões viáveis na raça Flamenga, com média de 7,5 ± 1,8 embriões/fêmea, sendo superior à raça Holandesa, a qual obteve um total de 48 estruturas viáveis, com média de 3,7 ± 1,4 embriões viáveis/fêmea. Desta maneira, conclui-se que as fêmeas Flamengas forneceram mais oócitos viáveis por OPU e mais embriões viáveis por PIV ou TE do que fêmeas Holandesas. Além disso, o procedimento de TE apresentou maior eficiência que a OPU/PIV para a produção de embriões, independente da raça. Contudo, ambas as biotécnicas se mostraram eficazes como ferramentas úteis para a conservação genética de animais da raça Flamenga

Avaliou-se neste estudo o efeito do tratamento com somatotrofina recombinante bovina (bST) na população folicular, na taxa de recuperação e qualidade dos oócitos e na produção in vitro de embriões bubalinos. A hipótese foi de que o bST aumenta o número de folículos recrutados e a qualidade oocitária, melhorando a eficiência da técnica de aspiração folicular em fêmeas bubalinas. Foram utilizadas 10 novilhas bubalinas, sendo que o grupo bST (n=5) recebeu 500mg de bST em intervalos regulares, enquanto o grupo Controle (n=5) não recebeu tratamento adicional. Ambos os grupos foram submetidos a 10 sessões de aspiração duas vezes por semana. Foram quantificados o número total de folículos e o tamanho destes a cada sessão. Os oócitos recuperados foram quantificados e classificados de acordo com a sua qualidade (A, B, C, D, E), sendo os A+B+C considerados de boa qualidade. Os embriões produzidos foram vitrificados, e uma parte destes, transferidos em tempo fixo. Foram colhidas amostras de sangue para mensuração de IGF-I plasmático durante o estudo. O bST aumentou o número de folículos observados (12,2 vs. 8,7; p&lt;0,05) e o número de oócitos recuperados (5,2 vs. 4,1; p=0,07), no entanto não afetou a qualidade destes, bem como a sua capacidade de desenvolvimento (p&gt;0,05). Observou-se efeito significativo (p&lt;0,05) de sessão de aspiração no número de folículos observados, de folículos aspirados e de oócitos recuperados. As concentrações plasmáticas de IGF-I não apresentaram efeito de tratamento (p&gt;0,05), no entanto sofreram efeitos de sessão e também da interação entres sessão e tratamento (p&lt;0,05). Obteve-se taxa de concepção de 10,53 % (2/19) após a inovulação dos embriões, gerando o nascimento de dois bezerros normais. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com bST aumenta o número de folículos recrutados por onda de crescimento folicular, demonstrando seu potencial em aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular na espécie bubalina / The aim of this experiment was evaluated the effect of recombinant bovine somatotropin (bST) on follicular population, oocyte recovery rates and quality, and on in vitro buffaloes embryo production. The hypothesis was that bST improves the number of follicles per follicular growth wave and oocyte quality, enhancing the results in buffalos females submitted to ovum pick-up programs. A total of ten heifers were assigned in two experimental groups (bST Group that received 500mg of bST in regular intervals and Control Group that did not received any additional treatment). Both groups were submitted to 10 OPU sessions twice weekly (every 3 or 4 days). The number of follicles and its diameters were recoded in all OPU. The oocytes harvest were counted and classified in five categories (A, B, C, D, E). The A+B+C categories were considered as good quality oocyte. The embryos produced were vitrified and some of these embryos were transferred of fixed time. Blood samples for IGF-I were obtained every once weekly. The bST improved the follicular population (12.2 vs. 8.7; p&lt;0.05) and the number of oocytes per session (5.2 vs. 4.1; p=0.07), however the treatment did not affect the oocyte quality and its in vitro development capacity (p&gt;0.05). A significant effect (p&lt;0.05) of OPU session was observed in follicular population, number of aspirated follicles and number of oocyte recovered. The plasma IGF-I was not affected (p&gt;0.05) by treatment, however presented a significant effect of OPU session and also of the treatment by OPU session interaction (p&lt;0.05). The conception rate was 10.5% (2/19) and two healthy and normal calves were born from transferred embryo. These results indicate the viability of bST treatment to improve the follicular recruitment and its potential application in buffaloes donors submitted to OPU programs

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TatimaraMariaMiyauchi-dissertacao.pdf: 241249 bytes, checksum: 31d06c5c53ccc213a1ec299452cee268 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Efficiency of in vitro bovine embryo production has been affected by low quantity and quality of recovered oocytes from ultrasound-guided follicular aspiration (OPU). The objective of this study was to evaluate the effect of different synchronization of follicular wave protocols in the production of oocytes and embryos in vitro, of Bos taurus taurus and Bos taurus indicus and heifers. We used three hundred forty-four results of follicular aspiration. The management regime was semi- confinement of animals with positive energy balance ten days prior to the aspirations. Animals were randomly distributed in the following treatments: TI or control (N=81) - OPU independent of estrous cycle with no previous hormone treatment; TII (N=97) - Estradiol benzoate (3mg), four days before OPU; TIII (N= 97) - Estradiol benzoate (3mg), insertion of subcutaneous implant of Norgestomed and application of D-Chloprostenol Sodium (0.150 mg), four days before OPU; TIV (N= 69) the same treatment used in TIII, plus two doses of FSH (100 to 150 UI) one day before OPU, with an interval of 12 hours, OPU after 12 to 16 hours. Viable recovered oocytes were in vitro matured, fertilized and cultured and presumptive zygotes were cultured until the time of embryo transfer. Zebu showed greater recovery of viable oocytes and total production of embryos in relation to taurine respectively (14.2± 0.7 vs 8.8± 0.5; 17.7± 0.9 vs 11.9± 0.6; 4.3± 0.3 vs 2.1± 0.2). A significant increase in quality and oocyte recovery in groups III and IV in relation to control group, respectively (13.2± 1.0 vs 13.8± 1.1 vs 8.1± 0.8; 16.8± 1.2 vs 17.8± 1.4 vs 10.7± 1.0 , P <0.05). In relation to the total quantity and quality of embryos, all treatments were superior to control (P <0.05), but T IV was superior to other treatments according to the breeds studied. Treatments III and IV showed a greater recovered oocyte number in Bos taurus; the same was not observed in Zebu. A better average conversion was observed in Zebu cows. Bos indicus presented greater quality and recover rate of oocytes in summer compared to winter (15.7± 1.6 vs 12.0± 1.0; 19.3± 1.3 vs 15.3± 1.2). Bos indicus produced more embryos in both seasons and, in winter, both subspecies converted more oocytes into embryos compared with to summer (41.5± 3.5 vs 33.1± 2.4; 28.5± 3.2 vs 19.5± 2.6). Synchronization treatments were efficient in oocyte recovering of Bos taurus donors and Bos indicus embryos. Regarding the season of the year, winter has proved to be the most favorable period for conversion of embryos for the two subspecies. / A eficiência na produção in vitro de embriões bovinos é limitada pela quantidade e qualidade dos oócitos recuperados na aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU). Objetivou-se com o presente estudo avaliar os efeitos de diferentes protocolos de sincronização da onda folicular na recuperação de oócitos e produção de embriões bovinos in vitro, das subespécies Bos taurus taurus e Bos taurus indicus em diferentes épocas do ano. Foram utilizados trezentos e quarenta e quatro resultados de aspirações foliculares. O regime de manejo dos animais foi o semi- confinamento com balanço energético positivo dez dias antes das aspirações. Os animais foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: T I ou controle (N=81) - OPU independente do ciclo estral - sem tratamento hormonal prévio; T II (N=97) - Benzoato de Estradiol (3mg), cinco dias antes da OPU; T III (N= 97) - Benzoato de Estradiol (3mg), inserção de implante subcutâneo de Norgestomed e aplicação de D-Cloprostenol Sódico (0,150 mg), quatro dias antes da OPU; T IV (N= 69) - mesmo tratamento utilizado em TIII, acrescido de duas aplicações de FSH (100 a 150 UI) um dia antes da OPU, com intervalo de 12 horas, sendo a OPU realizada de 12 a 16 horas após a última aplicação. Os oócitos viáveis recuperados foram maturados, fertilizados e os prováveis zigotos foram cultivados até o momento da transferência dos embriões. Os animais do grupamento genético zebuíno apresentaram maior recuperação de oócitos viáveis, totais e produção de embriões em relação aos taurinos respectivamente (14,2± 0,7 vs 8,8± 0,5; 17,7± 0,9 vs 11,9± 0,6; 4,3± 0,3 vs 2,1± 0,2; P<0,05). Houve aumento significativo na qualidade e recuperação de oócitos nos tratamentos III e IV em relação ao controle, respectivamente (13,2± 1,0 vs 13,8± 1,1 vs 8,1± 0,8; 16,8± 1,2 vs 17,8± 1,4 vs 10,7± 1,0; P<0,05). Em relação à quantidade de embriões totais e qualidade, todos os tratamentos foram superiores ao controle (P<0,05), porém o T IV foi superior aos outros tratamentos de acordo com as raças estudadas (4,6± 0,6 e 1,5± 0,3). Em relação à recuperação de oócitos de acordo com as raças, os tratamentos III e IV recuperaram mais oócitos nos taurinos; o mesmo não foi observado nos zebuínos. Uma melhor conversão média em embriões foi observada nas fêmeas zebuínas. Nos Bos indicus houve melhor recuperação de oócitos no período do verão em relação ao inverno (15,69± 1,64 vs 12,04± 1,05; 19,32± 1,31 vs 15,30± 1,21; P<0,05). Fêmeas Bos indicus produziram mais embriões nas duas épocas do ano, e no inverno as duas subespécies converteram mais oócitos em embriões em relação ao verão (41,50± 3,50 vs 33,12± 2,40; 28,55± 3,25 vs 19,48± 2,64; indicus vs taurus, respectivamente). Os tratamentos de sincronização foram eficientes para recuperação de oócitos em doadoras taurinas e produção de embriões nas doadoras zebuínas. Quanto à época do ano, foi o inverno o período mais favorável para produção de embriões nas duas subespécies.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TatimaraMariaMiyauchi-dissertacao.pdf: 241249 bytes, checksum: 31d06c5c53ccc213a1ec299452cee268 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Efficiency of in vitro bovine embryo production has been affected by low quantity and quality of recovered oocytes from ultrasound-guided follicular aspiration (OPU). The objective of this study was to evaluate the effect of different synchronization of follicular wave protocols in the production of oocytes and embryos in vitro, of Bos taurus taurus and Bos taurus indicus and heifers. We used three hundred forty-four results of follicular aspiration. The management regime was semi- confinement of animals with positive energy balance ten days prior to the aspirations. Animals were randomly distributed in the following treatments: TI or control (N=81) - OPU independent of estrous cycle with no previous hormone treatment; TII (N=97) - Estradiol benzoate (3mg), four days before OPU; TIII (N= 97) - Estradiol benzoate (3mg), insertion of subcutaneous implant of Norgestomed and application of D-Chloprostenol Sodium (0.150 mg), four days before OPU; TIV (N= 69) the same treatment used in TIII, plus two doses of FSH (100 to 150 UI) one day before OPU, with an interval of 12 hours, OPU after 12 to 16 hours. Viable recovered oocytes were in vitro matured, fertilized and cultured and presumptive zygotes were cultured until the time of embryo transfer. Zebu showed greater recovery of viable oocytes and total production of embryos in relation to taurine respectively (14.2± 0.7 vs 8.8± 0.5; 17.7± 0.9 vs 11.9± 0.6; 4.3± 0.3 vs 2.1± 0.2). A significant increase in quality and oocyte recovery in groups III and IV in relation to control group, respectively (13.2± 1.0 vs 13.8± 1.1 vs 8.1± 0.8; 16.8± 1.2 vs 17.8± 1.4 vs 10.7± 1.0 , P <0.05). In relation to the total quantity and quality of embryos, all treatments were superior to control (P <0.05), but T IV was superior to other treatments according to the breeds studied. Treatments III and IV showed a greater recovered oocyte number in Bos taurus; the same was not observed in Zebu. A better average conversion was observed in Zebu cows. Bos indicus presented greater quality and recover rate of oocytes in summer compared to winter (15.7± 1.6 vs 12.0± 1.0; 19.3± 1.3 vs 15.3± 1.2). Bos indicus produced more embryos in both seasons and, in winter, both subspecies converted more oocytes into embryos compared with to summer (41.5± 3.5 vs 33.1± 2.4; 28.5± 3.2 vs 19.5± 2.6). Synchronization treatments were efficient in oocyte recovering of Bos taurus donors and Bos indicus embryos. Regarding the season of the year, winter has proved to be the most favorable period for conversion of embryos for the two subspecies. / A eficiência na produção in vitro de embriões bovinos é limitada pela quantidade e qualidade dos oócitos recuperados na aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU). Objetivou-se com o presente estudo avaliar os efeitos de diferentes protocolos de sincronização da onda folicular na recuperação de oócitos e produção de embriões bovinos in vitro, das subespécies Bos taurus taurus e Bos taurus indicus em diferentes épocas do ano. Foram utilizados trezentos e quarenta e quatro resultados de aspirações foliculares. O regime de manejo dos animais foi o semi- confinamento com balanço energético positivo dez dias antes das aspirações. Os animais foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: T I ou controle (N=81) - OPU independente do ciclo estral - sem tratamento hormonal prévio; T II (N=97) - Benzoato de Estradiol (3mg), cinco dias antes da OPU; T III (N= 97) - Benzoato de Estradiol (3mg), inserção de implante subcutâneo de Norgestomed e aplicação de D-Cloprostenol Sódico (0,150 mg), quatro dias antes da OPU; T IV (N= 69) - mesmo tratamento utilizado em TIII, acrescido de duas aplicações de FSH (100 a 150 UI) um dia antes da OPU, com intervalo de 12 horas, sendo a OPU realizada de 12 a 16 horas após a última aplicação. Os oócitos viáveis recuperados foram maturados, fertilizados e os prováveis zigotos foram cultivados até o momento da transferência dos embriões. Os animais do grupamento genético zebuíno apresentaram maior recuperação de oócitos viáveis, totais e produção de embriões em relação aos taurinos respectivamente (14,2± 0,7 vs 8,8± 0,5; 17,7± 0,9 vs 11,9± 0,6; 4,3± 0,3 vs 2,1± 0,2; P<0,05). Houve aumento significativo na qualidade e recuperação de oócitos nos tratamentos III e IV em relação ao controle, respectivamente (13,2± 1,0 vs 13,8± 1,1 vs 8,1± 0,8; 16,8± 1,2 vs 17,8± 1,4 vs 10,7± 1,0; P<0,05). Em relação à quantidade de embriões totais e qualidade, todos os tratamentos foram superiores ao controle (P<0,05), porém o T IV foi superior aos outros tratamentos de acordo com as raças estudadas (4,6± 0,6 e 1,5± 0,3). Em relação à recuperação de oócitos de acordo com as raças, os tratamentos III e IV recuperaram mais oócitos nos taurinos; o mesmo não foi observado nos zebuínos. Uma melhor conversão média em embriões foi observada nas fêmeas zebuínas. Nos Bos indicus houve melhor recuperação de oócitos no período do verão em relação ao inverno (15,69± 1,64 vs 12,04± 1,05; 19,32± 1,31 vs 15,30± 1,21; P<0,05). Fêmeas Bos indicus produziram mais embriões nas duas épocas do ano, e no inverno as duas subespécies converteram mais oócitos em embriões em relação ao verão (41,50± 3,50 vs 33,12± 2,40; 28,55± 3,25 vs 19,48± 2,64; indicus vs taurus, respectivamente). Os tratamentos de sincronização foram eficientes para recuperação de oócitos em doadoras taurinas e produção de embriões nas doadoras zebuínas. Quanto à época do ano, foi o inverno o período mais favorável para produção de embriões nas duas subespécies.

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: No ciclo estral das vacas ocorre uma série de eventos que se repetem até o impedimento da luteólise, pela presença do embrião no útero, que provoca alterações no organismo materno de ordens hormonais, anatômicas e comportamentais. Apesar disso, a colheita de oócitos em vacas gestantes é uma alternativa para a produção in vitro de embriões. No entanto, em vista do perfil hormonal durante a gestação, os fatores envolvidos no desenvolvimento folicular podem ser comprometidos. Em vista disso, este estudo objetivou descrever o perfil proteico do líquido folicular de vacas gestantes. Foram colhidos ovários de 36 vacas gestantes em terço inicial de gestação. O líquido folicular foi puncionado e o diâmetro de cada folículo foi mensurado pela ultrassonografia, sendo classificados em três categorias ≤6,4mm, 6,5mm a 8,9mm e ≥9. Após duas centrifugações para remoção dos componentes celulares, as proteínas totais foram mensuradas e a eletroforese unidimensional realizada sob condições desnaturantes e redutoras. As bandas foram recortadas e a digestão in gel realizada objetivando a espectrometria de massas. A concentração de estrógeno e progesterona foi mensurada no líquido folicular para determinar a viabilidade dos folículos. Foram encontradas 46 bandas de proteínas na eletroforese em 67 amostras de líquido folicular. A média da concentração ± desvio padrão da progesterona foi de 71,32 ± 80,06 ng/mL e estrógeno de 27,57 ± 30,62 ng/mL, considerando todos os folículos. Hou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Research on in vitro embryo production (IVP) in the equine is impeded by the limited availability of mature oocytes as the mare is mono ovulating and superovulation is still difficult (Dippert and Squires, 1994; Bezard et al., 1995; Alvarenga et al., 2001b). Despite recent improvement in IVM of equine oocytes, success rates of IVM in that species remain low in all culture media tested compared to other species (Goudet et al., 2000b). However, most studies have focused on the percentage of oocytes reaching the metaphase II stage (nuclear maturation) but few concentrated on the final oocyte competence as measured by its ability to develop into a blastocyst and further establish a pregnancy. Blastocyst production rate is influenced not only by culture environment but also by oocyte maturation conditions. Under in vitro culture conditions, oxidative modifications of cell components via increased ROS represent a major culture induced stress (Johnson and Nasr-Esfahani, 1994). Anti-oxidant systems can attenuate the deleterious effects of oxidative stress by scavenging ROS (Del Corso et al., 1994). Glutathione, a tripeptide thiol, is the major non-protein sulfydryl compound in mammalian cells that plays an important role in protecting the cell from oxidative damage (Meister and Tate, 1976; Meister and Anderson, 1983). It has been suggested that GSH content in oocytes may serve as a reservoir protecting the zygote and the early embryos from oxidative damage before genomic activation and de novo GSH synthesis occur (Furnus et al., 1998; de Matos and Furnus, 2000). The addition of GSH synthesis precursors, such as cysteamine, a thiol compound, to IVM media has been shown to improve IVP in various species (Takahashi et al., 1993; de Matos et al., 1995; Grupen et al., 1995; de Matos et al., 2002a; de Matos et al., 2002b; de Matos et al., 2003; Gasparrini et al., 2003; Oyamada and Fukui, 2004; Balasubramanian and Rho, 2007; Anand et al., 2008; Singhal et al., 2008; Zhou et al., 2008). Very little information on the use of thiol compounds in the equine is available. Conventional in vitro fertilization (IVF) has not been successful in the mare, and a repeatable IVF technique has not yet been developed (Alm et al., 2001). To overcome the limitation of conventional IVF procedures, other methods to produce embryos from oocytes, either in vivo or in vitro, have been investigated. Among these, intra cytoplasmic sperm injection (ICSI) has permitted efficient equine in vitro blastocyst production (Galli et al., 2002; Lazzari et al., 2002; Choi et al., 2006a; Choi et al., 2006c). However, ICSI requires specific equipment and skills. Transfer of an immature oocyte into the preovulatory follicle of an inseminated recipient mare (Intra-Follicular Oocyte Transfer, IFOT) has produced embryos but the success rate was low (Hinrichs and Digiorgio, 1991). Similarly, oocyte transfer (OT) into the oviduct of an inseminated recipient mare was investigated (McKinnon et al., 1988; Carnevale, 1996; Hinrichs et al., 1997; Carnevale et al., 2001; Carnevale et al., 2003; Carnevale, 2004), and commercial programs using OT for mares with reproductive abnormalities are now available (Carnevale et al., 2001). Unfortunately, IFOT is poorly documented in the literature and reports of OT have been published by various laboratories and under various conditions, making comparisons between results and choosing among these as substitutive techniques to ICSI or embryo transfer difficult. The first aim of the present work was to investigate if there is an influence of supplementation with 100 µM of cysteamine on conventional IVF success rate. Cumulus oocytes complexes (COCs) retrieved by transvaginal ultrasound guided aspiration were matured in vitro with or without cysteamine supplementation and were then submitted to conventional IVF using either calcium ionophore or heparin as capacitation treatment for spermatozoa. A total of 131 oocytes were evaluated for evidence of sperm penetration. Both techniques (ionophore or heparin) yielded 6% of IVF and results were similar both for the cysteamine and the control group. This success rate of IVF is low compared to some published data (Palmer et al., 1991; Dell'Aquila et al., 1996; McPartlin et al., 2009) but similar to what others reported in the literature (Choi et al., 1994; Dell'Aquila et al., 1997a). Although, it seems likely that cysteamine did not significantly improve IVF rates under our conditions, our general success rates for IVF procedures may be too low for us to conclude definitely about the effect of cysteamine. As ICSI was not available to us, the second aim of this work was to determine what in vivo technique could best bypass the lack of an efficient conventional IVF procedure. We compared embryo production following transfer of in vivo recovered oocytes (1) into a recipients oviduct or (2) into her preovulatory follicle either immediately after ovum pick up or (3) after in vitro maturation. Recipients were inseminated with fresh semen of a stallion with a known normal fertility. Ten days after transfer, rates of embryos collected in excess to the number of ovulations were calculated and compared for each group. Embryo collection rates were 32.5% (13/40), 5.5% (3/55) and 12.8% (6/47) for OT, post-IVM and immediate IFOT respectively. OT significantly yielded more embryos than immediate and post-IVM IFOT did. These results show that, when ICSI is not an option, intra-oviductal oocyte transfer is to be preferred to IFOT, as an in vivo alternative, to bypass the inadequacy of conventional in vitro fertilization and to assess oocyte developmental competence. After it was established that in comparison to IFOT, OT is the most reliable in vivo alternative to in vitro fertilization where ICSI technology is not available, this technique was used to assess the effect of cysteamine supplementation on nuclear maturation and oocyte competence. The third aim of this work was to investigate the influence of supplementation with 100 µM of cysteamine on in vitro nuclear and cytoplasmic maturation by specific DNA staining and the ability of oocytes to undergo in vivo fertilization after OT. Oocytes were collected by transvaginal ultrasound guided aspiration and matured in vitro with (cysteamine group) or without (control group) cysteamine. The nuclear stage after DNA Hoechst staining and the embryo yield following OT were used as a criterion for assessing nuclear and cytoplasmic maturation, respectively. Overall maturation rate was 52%, which is rates reported in the literature ranging from 40 to 70% in the equine (Goudet et al., 1997a; Bogh et al., 2002; Hinrichs et al., 2005; Galli et al., 2007). Nuclear maturation was not statistically different (p>0.05) between oocytes cultured with or without cysteamine (55% and 47% respectively). From 57 oocytes transferred to the oviduct in each group, the number of embryos collected was 10 (17%) in the control group and 5 in the cysteamine group (9%). Those two percentages were not statistically different (p>0.05). Contrary to the data described in other domestic species, there was no effect of cysteamine on in vitro nuclear maturation, or in vivo embryonic development under our conditions. Under our conditions, the addition of 100 µM of cysteamine to a classic culture medium does not improve equine oocyte maturation or embryonic development after OT. The same dose failed to increase GSH content in the equine (Luciano et al., 2006). However, the effect of cysteamine supplementation is highly species and concentration dependant. The inadequacy of the chosen concentration may explain that equine embryo production has not been increased by the cysteamine under our conditions as opposed to what has been observed in many other species. Alternatively, we can hypothesize that some substances present in the IVM medium can interfere with GSH synthesis. This has been suggested for FSH and estradiol (Bing et al., 2001) and, although our maturation medium is not supplemented with gonadotropins or estradiol, factors contained in fetal calf serum or EGF might also have an effect on GSH synthesis. Considering its beneficial effects in many other species, supplementation with cysteamine to different IVM media should be further investigated in the equine. Ideally combining different concentrations and ICSI or OT in order to determine an optimal concentration and its effects on oocyte developmental competence.