Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-16Bitstream added on 2014-06-13T18:31:05Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_rf_me_bauru.pdf: 1604676 bytes, checksum: cf097268a1496e0fea9d04066fefdcca (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Neste trabalho, investigou-se a fabricação e caracterização de filmes ultrafinos de poli(alilamina hidroclorada) PAH com as enzimas glicose oxidase (GOx) e invertase (INV) no desenvolvimento de biossensores amperométricos para a detecção de glicose e sacarose. Filmes nanoestruturados obtidos pela técnica layer-by-layer (LbL) possibilitaram estudar a imobilização de cada enzima juntamente com o polieletrólito, além de diversas arquiteturas bienzimáticas mais complexas, em eletrodos modificados com Azul da Prússia, no desenvolvimento do biossensor. O crescimento dos filmes produzidos foi acompanhado por técnicas de espectroscopia UV-vis e fluorescência; além de técnicas eletroquímicas de voltametria cíclica e amperometria na avaliação das propriedades e resposta do biossensor. Por fim, investigou-se o aprimoramento do biossensor e análises qualitativas preliminares na avaliação de bebidas comerciais / In this work, we investigated the fabrication and characterization of ultrathin films of poly(allylamine hydrochloride) PAH and the enzymes glucose oxidase (GOx) and invertase (INV) in the development of amperometric biosensors for glucose and sucrose detection. Nanostructured films obtained by layer-by-layer (LbL) technique were able to study the immobilization of each enzyme coupled with the polyelectrolyte, beyond different and more complex bienzimatic architectures, in Prussian Blue modified electrodes, for the biosensor development. The films’ growth was monitored by fluorescence and UV-vis spectroscopic techniques; moreover electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and amperometry were used on the evaluation of biosensor properties and response. At last, we investigated the biosensor improvement and qualitative initial analysis on the evaluation of commercial beverages

INTRODUCTION: The lysyl oxidase family consists of 5 members and oxidizes specific lysine residues in biosynthetic collagen and elastin maturation. Lysyl oxidase like-2 (LOXL2) is elevated in oral cancer and promotes metastasis and correlates with poor prognosis. The objective of this study was to determine the mechanism by which LOXL2 promotes the progression and invasiveness of oral squamous cell carcinoma. METHODS: In vitro: The effects of LOXL2 inhibitor (PXS-S1C) on human gingival fibroblasts treated with tumor cell conditioned medium (CM) were investigated. Cell proliferation assays, signaling arrays, gene knock down and western blots were used to evaluate the effect of PXS-S1C on CM-treated fibroblasts. The effects of PXS-S1C on cancer cell expression of LOXL2 and proliferation were determined. To find potential LOXL2 substrates, carbonyl-containing proteins of gingival fibroblasts treated with CM +/- PXS-S1C were affinity-labeled and then purified by affinity chromatography and identified by western blot. In vivo: The effects of PXS-S1C on cancer cell growth and metastasis in vivo were investigated using orthotopic oral tongue cancer mouse models in both immunodeficient and immunocompetent mice. PXS-S1C at 10 mg/kg and 30 mg/kg was injected immediately following tumor cell injections. Tumor growth was monitored by both caliper measurement and in vivo imaging (IVIS). The mice were sacrificed and their organs were subjected to immunohistochemical staining with proliferation markers. RESULTS: PXS-S1C significantly inhibited gingival fibroblast proliferation stimulated by tumor cell CM and attenuated phosphorylation of PDGFRβ at the Y771 and Y857, but not Y751 residues in response to CM treatment. PXS-S1C inhibited ERK1/2-signaling in fibroblasts but not AKT pathway in response to CM treatment. PDGFR activation by oral tumor cells was mimicked by PDGF-AB but not PDGF-BB. PXS-S1C decreased the expression of LOXL2 in HSC3 oral cancer cells in vitro, suggesting the existence of a positive autoregulatory loop. Assessing for direct LOXL2 substrates in fibroblasts with functional consequences identified PDGFR. In vivo studies: Caliper measurements, IVIS, and immunohistochemistry demonstrated that inhibition of LOXL2 by injections of PXS-S1C significantly decreased both progression and metastasis of oral cancers in vivo in both mouse models. Mice without PXS-S1C treatment developed larger tongue volumes (p<0.05), and in immunocompetent mice larger lymph nodes (9 out 12) were observed compared to the PXS-S1C-treated mice (4 out of 12). IVIS imaging of immunodeficient mice revealed inhibition of metastasis by PXS-S1C treatment. The expression of proliferation marker (Ki-67 or PCNA) and LOXL2 was lower in tongue tumors treated with PXS-S1C in both in vivo models (p<0.05). CONCLUSIONS: LOXL2 secreted by cancer cells stimulates fibroblast proliferation by oxidizing PDGFR and thereby enhancing PDGF-mediated signaling. Inhibition of LOXL2 can be used as a therapeutic strategy to suppress the growth and metastasis of oral cancers by modulating tumor microenvironment. / 2019-10-24T00:00:00Z

A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A diminuição na viabilidade foi mediada pela ativação da xantina oxidase, uma vez que concentrações elevadas de retinol induziram ativação desta enzima e aumentaram a produção de espécies reativas, e a inibição da xantina oxidase com alopurinol atenuou tanto a produção de espécies reativas quanto o dano oxidativo a proteínas e a citotoxicidade induzida pelo retinol. Além disso, demonstramos que a incubação da xantina oxidase com retinol promove a produção de superóxido in vitro, e investigamos alguns fatores envolvidos nesse evento. Por outro lado, o principal derivado ativo do retinol, o ácido retinóico, não apresentou qualquer efeito pró-oxidante ou proliferativo, nem ativou MAPKs. Ao contrário do retinol, o ácido retinóico apresentou efeitos antiproliferativos, diminuindo os níveis do inibidor de CDKs p21 e induzindo parada no ciclo celular. Os dados apresentados nesse trabalho podem contribuir para a elucidação dos efeitos pró-oxidantes, proliferativos/antiproliferativos e citotóxicos da vitamina A e seus derivados em sistemas biológicos. / Vitamin A (Retinol) and its derivatives, retinoids, are important regulators of the cell cycle, playing a role on proliferation, apoptosis and differentiation of diverse cell types. In recent years, the influence of retinoids on cell growth and differentiation has been investigated. There is a growing body of in vitro data demonstrating that active retinoids as retinoic acid antagonize cell growth in a variety of normal and tumour cells, characterizing them as potential chemotherapeutic agents. On the other hand, a growing body of evidence has suggested that retinoids present pro-oxidant properties in biological systems, which might induce cell damage, proto-oncogene activation and neoplasic transformation. These discordances stimulated us to investigate the proliferative/antiproliferative properties of two major intracellular retinoids, retinol and retinoic acid, and its mechanisms in a model of Sertoli cells, a major vitamin A physiological target. Our data showed that supra-physiological concentrations of retinol, but not retinoic acid, are able to increase reactive species production in Sertoli cells. These pro-oxidant effects may induce different cellular fates depending on of retinol concentrations. At low pro-oxidant levels (7 μM), retinol induced an oxidant-dependent proliferation, which was mediated by a rapid, nonclassic and redox-sensitive activation of the MAPKs JNK1/2, p38 and ERK1/2. The investigation of potential sites of reactives species production indicated that mitochondria act as a primary source of reactive species involved in retinol redox signaling. Retinol 7 μM induces dysfunction in the mitochondrial electron transfer system leading to increases in superoxide anion production. Inhibition of the mitochondrial-dependent superoxide formation blocked both reactive species production and MAPKs activation, characterizing a new mechanism of nongenomic action of the vitamin A. MAPKs inhibition blocked retinol-induced proliferation. On the other hand, at high concentrations (10 to 20 μM) the pro-oxidant effects of retinol were significantly high to induce extensive oxidative damage and decreases in cell viability. At high concentrations, retinol-induced decreases in cell viability were mediated by stimulation of the xanthine oxidase activity in Sertoli cells, since retinol treatment increased xanthine oxidase activity and reactive species production, and inhibition of the enzyme with allopurinol attenuated retinol-induced reactive species, protein oxidative damage and cytotoxicity. In addition, we showed that incubation of xanthine oxidase with retinol promotes superoxide generation in vitro, and investigated the potential factors involved in this effect. On the other hand, the principal retinol derivative, retinoic acid, induced neither reactive species production or proliferation nor MAPKs activation. In contrast to retinol, retinoic acid presented its well documented antiproliferative effects by decreasing DNA synthesis and increasing the level of the CDK inhibitor p21 leading to cell arrest. Data presented in this work, may contribute to elucidation of the mechanisms involved in pro-oxidants, proliferatives/antiproliferatives and cytotoxic actions of vitamin A and its derivatives in biologycal systems.

MORAIS, Isabel Cristina Oliveira de. Efeito nefrotóxico direto induzido pela fração L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops leucurus. 2015. 98 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-12-01T12:17:59Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_icomorais.pdf: 2308756 bytes, checksum: a19cf84310abf884525d01a755823c19 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-12-01T12:19:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_icomorais.pdf: 2308756 bytes, checksum: a19cf84310abf884525d01a755823c19 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-01T12:19:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_icomorais.pdf: 2308756 bytes, checksum: a19cf84310abf884525d01a755823c19 (MD5) Previous issue date: 2015 / The pit viper Bothrops leucurus (White-tailed-jararaca) is a poisonous snake habituating area in the northeast of Brazil. The biological effects due envenomation have similar profile than those observed with other Bothrops, such as important severe local and systemic effects such as Acute Renal Failure (ARF). Bothrops leucurus venom induces nephrotoxicity in the isolated perfused kidney of rats associated with cytotoxicity against renal tubular epithelia cells. In this study, it was evaluated the direct nefrotoxicity of L-aminoacid oxidase isolated of B. leucurus venom (LAAO-Bl) on renal epithelial cells (MDCK and HK2) and their potential nephrotoxic in isolated rat kidney. In these cells treated with LAAO-Bl, 1.56 – 100 µg/mL for 12 h, there was a decrease in their viability in a concentration-dependent manner after 12 hours of treatment. In MDCK cells LDH release was not observed after 12 h of LAAO-Bl exposure while LAAO-Bl induced membrane rupture in HK-2 cells at the highest concentrations studied when compared with untreated cells. In MDCK cells, LAAO-Bl significantly increased the percentage of early apoptotic (Annexin-V+, PI-), necrotic (Annexin-V-, PI+) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) when compared with control untreated cells. In HK-2 cells LAAO-Bl induced an increase in necrotic (PI+ cells) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) in a concentration-dependent manner. MDCK apoptosis induction was accompanied with Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, reactive oxygen species (ROS) generation, mitochondria dysfunction with enhanced expression of Bax protein levels. LAAO-Bl induced caspase-3 and caspase-7 activation in both cell lines. LAAO-Bl (10 µg/mL) exerts significant effects on the isolated kidney perfusion increasing perfusion pressure and urinary flow and decreasing the glomerular filtration rate and sodium, potassium and chloride tubular transport. Taken together our results suggest that LAAO-Bl contributes for the nephrotoxicity observed in the envenomation by Bothrops leucurus. Moreover, the cytotoxic of LAAO-Bl to renal epithelial cells might be responsible, least in part for the nephrotoxicity observed in isolated kidney. / A Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco) é uma serpente peçonhenta que habita a região Nordeste do Brasil. Os efeitos biológicos devido ao envenenamento por B. leucurus têm perfil semelhante àqueles apresentados por outras serpentes do gênero Bothrops, tais como, importantes efeitos locais e sistêmicos graves como a Insuficiência Renal Aguda (IRA). O veneno de Bothrops leucurus induziu nefrotoxicidade em sistema de perfusão de rim isolado de rato, associado com citotoxicidade em células tubulares epiteliais renais. Neste trabalho foi avaliado o efeito nefrotóxico direto da enzima L-aminoácido oxidase isolada do veneno de Bothrops leucurus (LAAO-Bl) sobre células epiteliais renais (MDCK e HK2) e o seu potencial nefrotóxico em rim isolado de rato. O tratamento com LAAO-Bl, 1.56 – 100 µg/mL induziu significativa morte celular de maneira concentração dependente em ambas às linhagens celulares após 12 horas de tratamento. Nas células MDCK não foi observada liberação de LDH após 12 horas de exposição à LAAO-Bl, enquanto nas células HK2 LAAO-Bl induziu ruptura de membrana nas maiores concentrações estudadas quando comparado ao controle não tratado. Nas células MDCK o tratamento com LAAO-Bl aumentou significativamente a porcentagem de células em apoptose (Anexina-V+, IP-), necrose (Anexina-V-, IP+) e necrose secundária (Anexina-V+, IP+). Nas células HK2 LAAO-Bl induziu um aumento na porcentagem de células em necrose (IP+) e necrose secundária (Anexina-V+, IP+) de maneira concentração dependente. A indução de apoptose nas células MDCK foi acompanhada de liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático, aumento de espécies reativas de oxigênio, disfunção mitocondrial e aumento de expressão de Bax. O tratamento com LAAO-Bl induziu ativação de caspase 3 e 7 em ambas as linhagens celulares. LAAO-Bl (10 µg/mL) exerce efeitos significativos no rim isolado de rato aumentando a pressão de perfusão e o fluxo urinário e diminuindo a taxa de filtração glomerular e os transportes tubulares de sódio, potássio e cloreto. Os nossos resultados sugerem que LAAO-Bl contribui para nefrotoxicidade observada no envenenamento por Bothorps leucurus. Além disso, os efeitos citotóxicos de LAAO-Bl nas células epiteliais renais podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pela nefrotoxicidade observada no rim isolado.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326598.pdf: 2853679 bytes, checksum: baef196ef4de6a3980796e04b08cac81 (MD5) Previous issue date: 2014 / A influência da segunda esfera de coordenação principalmente na eficiência catalítica de sistemas biológicos, tem sido um importante tema de estudos no contexto da química bioinorgânica. Através de novas estratégias sintéticas, a inserção de agentes intercalantes em ligantes pode ser uma alternativa para potencializar a eficiência de catálise de um complexo. Este trabalho aborda a síntese de dois novos complexos de Cu(II) com ligantes polidentados derivados do núcleo triazínico, utilizando 1,4-diaminobutano como unidade espaçadora e um destes com a unidade pireno como possível agente intercalante do DNA. Ambos foram devidamente caracterizados por técnicas espectroscópicas e eletroquímicas, e estudos cinéticos envolvendo atividade de catecolase dos dois complexos também foram realizados. Os parâmetros cinéticos dos compostos frente a oxidação do substrato modelo 3,5-DTBC mostraram que a inserção do espaçador 1,4-diaminobutano e do grupo pireno contribuiu de forma significativa para o aumento da eficiência catalítica desses sistemas. Na verdade, esses grupos influenciam no aumento de Kass, fazendo com que as interações entre o catalisador e o substrato sejam mais efetivas quando comparadas com o sistema no qual esses grupos estão ausentes. Testes preliminares em DNA plasmidial revelaram que ambos complexos, em baixas concentrações, são capazes de clivar a dupla fita até sua forma III, ou seja, sua forma totalmente linear. Sendo assim, estes complexos podem ser considerados não só como bons modelos miméticos para a enzima catecol oxidase, mas também como agentes de clivagem do DNA plasmidial.<br> / Abstract : The influence of the second coordination sphere on the catalytic efficiency of biological systems has been an important subject of studies in bioinorganic chemistry. By means of new synthetic strategies, the insertion of intercalating agents linked to polydentate ligands represents an interesting alternative to enhance the catalytic efficiency of a biomimetic complex. The work presented here focuses on the synthesis of two new Cu(II) complexes with polydentate ligands derived from a triazine core containing 1,4-diaminobutane as a spacer and a pyrene group as a possible DNA intercalating agent. The complexes were characterized by spectroscopic and electrochemical techniques, and catecholase-like activity of both were also carried out. The kinetic parameters of the complexes in the oxidation of the model substrate 3,5-DTBC revealed that insertion of the spacer 1,4-diaminobutane and the pyrene group, strongly contributed to increase the catalytic efficiency of these systems. In fact Kass becomes significantly increased, indicating that these groups influence the interactions between the complex and the substrate, which are much more effective when compared do the catalyst without such groups. Preliminary studies showed that both complexes, at very low concentrations, are capable of cleaving double-stranded plasmid DNA into its form II (circular) and form III (linear). Thus, these complexes can be considered good biomimetic models for catechol oxidase, and also as plasmid DNA cleavage agents.

Made available in DSpace on 2016-03-10T13:16:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 aline_gomes_ioc_dout_2014.pdf: 10648737 bytes, checksum: 93332a2b40290f53d7df0cb86ea92716 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Strigomonas culicis, um tripanossomatídeo monoxênico, apresenta uma relação mutualística com uma bactéria em seu citoplasma. Esta pode ser removida por tratamento com antibiótico, sendo o cinetoplastídeo mantido em laboratório sob a forma de cepa apossimbiótica. Comparações entre as duas cepas fazem parte de uma estratégia interessante para o estudo da relação mantida pelos dois organismos. A ciência dirigida por descoberta, da qual a tecnologia proteômica faz parte, gera um volume de dados abrangente que pode posteriormente ser utilizado para retroalimentar projetos de ciência dirigida por hipótese. Desta forma, o estudo comparativo das duas cepas através da geração dos perfis bidimensionais, em distintas etapas do desenvolvimento celular, possibilitou a identificação de um número abrangente de proteínas diferencialmente abundantes entre as cepas, e entre as etapas do crescimento celular de cada cepa. As diferenças entre as cepas estão relacionadas tanto a alterações quantitativas quanto a proteínas exclusivas de cada condição analisada. Para a cepa selvagem uma maior modulação foi observada entre o meio e o fim de fase logarítmica, enquanto para a cepa apossimbiótica a modulação maior ocorre entre o início de fase log e a fase estacionária. Comparações entre as cepas indicam menores diferenças no início de fase logarítmica, sendo a maior porcentagem de spots diferenciais representada por aqueles que apresentam abundância diferencial estatisticamente significante Após as identificações proteicas três processos foram detalhados: expressão de peptidases, síntese de heme e interação parasito-hospedeiro. Uma calpaína foi identificada sendo modulada não apenas entre as etapas de crescimento celular, como também entre cepas. Neste sistema sua função poderia estar relacionada ao remodelamento do citoesqueleto. A enzima coproporfirinogênio oxidase foi identificada em ambas as cepas, com abundância superior em cepa selvagem, assim como a subunidade IV do complexo citocromo c oxidase, ambos com maior abundância em início de fase log, um indicativo de diferenças de requerimento de heme e/ou hemeproteínas, bem como de metabolismo energético diferenciado, pelo menos em etapas de início de crescimento, entre as cepas. Proteínas relacionadas ao flagelo também foram identificadas, e poderiam contribuir para a sustentação de um panorama multifatorial que proporcionaria uma maior capacidade de interação da cepa selvagem com seus hospedeiros. O grande volume de dados gerados será ainda utilizado para a identificação de redes metabólicas influenciadas pelo simbionte permitindo, futuramente, um entendimento amplo da relação simbiontetripanossomatídeo / Strigomonas culicis, a monoxenic trypanosomatid, shares a mutualistic relationship with a cytoplasmic bacterium. This bacterium can be removed by antibiotic treatment, and the kinetoplastid can be maintained in laboratory as an aposymbiotic strain. Comparisons between the strains are part of an interesting strategy to study the relationship maintained by both organisms. Discovery-driven science, which encompasses the proteomic technology, generates an in-depth data volume, which can be used to feedback hypothesis-driven projects. Therefore, the comparative study of the distinct strains through two-dimensional gel profiles, at different stages of development, enabled the identification of a large number of proteins differentially abundant between strains and among the cell growth stages for each one. The differences between the strains are related to both quantitative alterations and exclusive proteins of each analyzed condition. For the wild strain, major modulation was observed between the mid- and late log phases, while for the aposymbiotic strain, the major modulation occurred between early log and stationary phases. Comparisons between the strains indicate minor differences at the early log phase, being the major percentage of differential spots represented by those that present statistically significant differential abundance. After protein identification three processes were detailed: peptidases expression, heme synthesis and parasite-host interaction. A calpain was identified being modulated not only between the stages of cellular growth, but also between strains. This protein could be related to cytoskeleton remodeling. Coproporphyrinogen oxidase enzyme and subunit IV of the cytochrome c oxidase were identified in both strains, with overabundance in the wild strain. Both proteins presented higher abundance at the early log phase, which suggests differences in heme and/or heme proteins requirement, as well as a differential energetic metabolism between the strains, at least for the early stages of the growth. Flagellar-related proteins were also identified, which supports the idea of a multifactorial process that contributes to understand the better interaction capacity of the wild strain with its host. The vast amount of data obtained will be further utilized for the identification of metabolic networks influenced by the symbiont, hopefully allowing a broad understanding of the symbiotic-trypanosomatid relationship.

PEREIRA, Ticiana Praciano. Efeito tripanocida da L-amino ácido oxidaseisolada do veneno da Bothrops marajoensis. 2015. 84 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-19T13:13:10Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_tppereira.pdf: 8126214 bytes, checksum: 9f53ffec393de789a339481a46476c8f (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-19T13:50:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_tppereira.pdf: 8126214 bytes, checksum: 9f53ffec393de789a339481a46476c8f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-19T13:50:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_tppereira.pdf: 8126214 bytes, checksum: 9f53ffec393de789a339481a46476c8f (MD5) Previous issue date: 2015 / Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, remains a p ublic health problem in the Americas. In the present study, we evaluated th e effects of L-amino acid oxidase from Bothrops marajoensis venom (BmLAAO) on the all evolutive forms of T. cruzi . Epimastigote forms of T. cruzi , were cultived in LIT medium, at 28ºC in BmLAAO pr esence for 48 and 72h. Trypomastigote were obtained from the supernat ants of infected LLC-MK 2 cells, resuspended in MEM with 2% FBS and treated for 24 h . BmLAAO showed significant activity against the epimastigote (IC 50 48h = 6.31μ g/mL; IC 50 72h = 5,85μ g μ g/mL.) and trypomastigote (LC 50 24h= 0.17μ g/mL) forms and decrease the amastigote s urvival within LLC-MK 2 . Analysis of the possible involvement of hydrogen peroxide was performed by catalase addition in medium, an enzyme that acts as H 2 O 2 scavenger. The cell death showed that the cytotoxic effect of BmLAAO is reduced but not completely abolished by the catalase presence. Confocal microscopy analysis of epimastig otes treated with BmLAAO showed staining with propidium iodide (PI), indicative of loss of membrane integrity, and loss of mitochondrial membrane potential, as observed by st aining of treated cells with Rhodamine 123 (Rho123). Besides, the flow cytometry with anne xin V and propidium iodide suggest decrease of membrane permeability. Ultrastructural analysis showed drastic morphological changes on the parasite mitochondrion with ruptured kDNA network. Increase of endoplasmic reticulum profiles, enhanced electrondensity of mit ochondrion and endoplasmic reticulum membranes, loss of the parasite inner organization, swelling of cell body with the appearance of dismantling organelles, formation of myelin-like structures indicative of autophagic activity, were also observed in treated parasites. In conclusion, the BmLAAO showed cytotoxic effects on T. cruzi and this action is only partially dependent on H 2 O 2 production by the BmLAAO. In addition, BmLAAO induced morphologic al and physiological alterations compatible with loss of viability and cell death / Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, continua a ser um problema de saúde pública nas Américas. No presente estudo, foram avaliados os efeitos da L-aminoácido oxidase isolatada do veneno da Bothrops marajoensis (LAAOBmar) sobre todas as formas evolutivas do T. cruzi. A atividade antiparasitária foi avaliada através da cultura de parasitas tratados com diferentes concentrações da fração em estudo. Epimastigotas foram cultivados em meio LIT, a 28ºC na presença LAAOBmar por 48 e 72 horas. Tripomastigotas foram obtidos a partir dos sobrenadantes de células LLC-MK2 infectadas, ressuspensos em meio MEM com 2% de FBS e tratados durante 24 h. LAAOBmar mostrou uma atividade significativa contra epimastigota (CI50 48h = 6,31μg/mL; CI50 72 h = 5,85μg/ml) e tripomastigotas (CL50 24h = 0,17μg/mL) e diminuiu a sobrevivência das formas amastigotas intracelular em células LLC-MK2. A análise do possível envolvimento do peróxido de hidrogênio foi realizada por adição de catalase no meio, uma enzima que atua como retirador de H2O2. A morte celular mostrou que o efeito citotóxico da LAAOBmar é reduzido, mas não completamente abolido pela presença da catalase. A análise por microscopia confocal de epimastigota tratados com LAAOBmar mostrou coloração com iodeto de propídio (IP), indicativo de perda de integridade da membrana, e perda do potencial de membrana mitocondrial, observado por coloração de células tratadas com rodamina 123 (Rod123) . Além disso, nos ensaios de citometria de fluxo com anexina V e iodeto de propídio sugerem diminuição da permeabilidade da membrana. A análise ultraestrutural de epimastigotas e tripomastigotas, mostrou alterações morfológicas drásticas na mitocôndria do parasita com a rede de kDNA rompido. O aumento de perfis de retículo endoplasmático, aumento da eletrondensidade das membranas mitocondriais, a perda da organização interna do parasita, inchaço do corpo da célula com o aparecimento de organelas deformada, formação de estruturas de mielina-like indicativo de atividade autofágica, também foram observados nos parasitas tratados. Em conclusão, o LAAOBmar mostrou efeitos citotóxicos em T. cruzi e esta ação é apenas parcialmente dependente da produção de H2O2 pela LAAOBmar. Além disso, LAAOBmar induziu alterações morfológicas e fisiológicas compatíveis com perda de viabilidade e a morte.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, 2017. / Made available in DSpace on 2017-10-24T03:20:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347958.pdf: 2708654 bytes, checksum: d59a2681f71254a53abfa1ed12171e98 (MD5) Previous issue date: 2017 / O estudo e investigação da reatividade de íons metálicos em sistemas biológicos vêm ganhando destaque nos últimos decênios. Com o propósito de elucidar o mecanismo de ação de diversas metaloenzimas, neste caso cita-se a metaloenzina catecol oxidase a qual é de interesse neste trabalho. Propõe-se a síntese e o desenvolvimento de ligantes e seguidamente, de complexos que tenham capacidade de mimetizar várias características, tanto estruturais quanto funcionais das metaloenzimas. No presente trabalho foram sintetizados dois ligantes macrocíclicos Lbut e Lt4am sendo caracterizados por diferentes técnicas, como ponto de fusão, RMN 1H, espectroscopia na região do IV e ESI-MS. A partir destes ligantes foram sintetizados dois complexos binucleares [Co2III(Lbut)(µ-OAc)](BPh4)2 ? C1 e [Co2III(Lt4am)(µ-OAc)]ClO4 ? C2 que foram caracterizados via espectroscopias no infravermelho e no UV-Vís, ESI-MS, condutividade molar, e eletroquímica. Os complexos foram estudados como catalisadores frente à oxidação do substrato 3,5-di-tercbutilcatecol na presença de O2, onde ambos os complexos apresentam atividade catalítica. Observou que complexo C1 exibiu uma eficiência catalítica cinco vezes maior que o complexo C2, o qual está associado ao seu menor valor de KM, ou seja, maior eficiência ao coordenar-se com o substrato, mostrando que estes complexos podem ser considerados como modelos bioinspirados para a catecol oxidase.<br> / Abstract : The study and investigation of metalic ions reactivity in biological systems have been receiving attention in the recent decades. In order to elucidate the mechanistic pathway of the catalytic reactions of various metalloenzymes, in this case the metalloenzyme catechol oxidase, the present work proposes the synthesis and development of new ligands and their complexes which have the capacity to mimick estructural and funtional caracteristics of metalloenzymes. This work reports the synthesis of two macrocyclic ligands Lbut and Lt4am and their characterization through different techniques such as melting point, 1H NMR, spectroscopy in region of the IR and ESI-MS. From these ligands, two binuclear complexes [Co2III(Lbut)(µ-OAc)](BPh4)2 ? C1 and [Co2III(Lt4am)(µ-OAc)]ClO4 ? C2 were synthesized and characterized by spectroscopy in region of the IR and UV-Vis, ESI-MS, molar and electrochemical conductivity. The complexes were studied as catalysts in the oxidation of 3,5-di-tertbutilcatechol using O2, where both complexes showed a catalytic activity. Moreover, it was observed that the catalytic activity of the C1 complex is five times greater than C2, and is associated with the small value of KM, that is, greater efficiency when coordinating with the substrate, showing that these complexes can be considered bioinspired models for a catechol oxidase.

A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A diminuição na viabilidade foi mediada pela ativação da xantina oxidase, uma vez que concentrações elevadas de retinol induziram ativação desta enzima e aumentaram a produção de espécies reativas, e a inibição da xantina oxidase com alopurinol atenuou tanto a produção de espécies reativas quanto o dano oxidativo a proteínas e a citotoxicidade induzida pelo retinol. Além disso, demonstramos que a incubação da xantina oxidase com retinol promove a produção de superóxido in vitro, e investigamos alguns fatores envolvidos nesse evento. Por outro lado, o principal derivado ativo do retinol, o ácido retinóico, não apresentou qualquer efeito pró-oxidante ou proliferativo, nem ativou MAPKs. Ao contrário do retinol, o ácido retinóico apresentou efeitos antiproliferativos, diminuindo os níveis do inibidor de CDKs p21 e induzindo parada no ciclo celular. Os dados apresentados nesse trabalho podem contribuir para a elucidação dos efeitos pró-oxidantes, proliferativos/antiproliferativos e citotóxicos da vitamina A e seus derivados em sistemas biológicos. / Vitamin A (Retinol) and its derivatives, retinoids, are important regulators of the cell cycle, playing a role on proliferation, apoptosis and differentiation of diverse cell types. In recent years, the influence of retinoids on cell growth and differentiation has been investigated. There is a growing body of in vitro data demonstrating that active retinoids as retinoic acid antagonize cell growth in a variety of normal and tumour cells, characterizing them as potential chemotherapeutic agents. On the other hand, a growing body of evidence has suggested that retinoids present pro-oxidant properties in biological systems, which might induce cell damage, proto-oncogene activation and neoplasic transformation. These discordances stimulated us to investigate the proliferative/antiproliferative properties of two major intracellular retinoids, retinol and retinoic acid, and its mechanisms in a model of Sertoli cells, a major vitamin A physiological target. Our data showed that supra-physiological concentrations of retinol, but not retinoic acid, are able to increase reactive species production in Sertoli cells. These pro-oxidant effects may induce different cellular fates depending on of retinol concentrations. At low pro-oxidant levels (7 μM), retinol induced an oxidant-dependent proliferation, which was mediated by a rapid, nonclassic and redox-sensitive activation of the MAPKs JNK1/2, p38 and ERK1/2. The investigation of potential sites of reactives species production indicated that mitochondria act as a primary source of reactive species involved in retinol redox signaling. Retinol 7 μM induces dysfunction in the mitochondrial electron transfer system leading to increases in superoxide anion production. Inhibition of the mitochondrial-dependent superoxide formation blocked both reactive species production and MAPKs activation, characterizing a new mechanism of nongenomic action of the vitamin A. MAPKs inhibition blocked retinol-induced proliferation. On the other hand, at high concentrations (10 to 20 μM) the pro-oxidant effects of retinol were significantly high to induce extensive oxidative damage and decreases in cell viability. At high concentrations, retinol-induced decreases in cell viability were mediated by stimulation of the xanthine oxidase activity in Sertoli cells, since retinol treatment increased xanthine oxidase activity and reactive species production, and inhibition of the enzyme with allopurinol attenuated retinol-induced reactive species, protein oxidative damage and cytotoxicity. In addition, we showed that incubation of xanthine oxidase with retinol promotes superoxide generation in vitro, and investigated the potential factors involved in this effect. On the other hand, the principal retinol derivative, retinoic acid, induced neither reactive species production or proliferation nor MAPKs activation. In contrast to retinol, retinoic acid presented its well documented antiproliferative effects by decreasing DNA synthesis and increasing the level of the CDK inhibitor p21 leading to cell arrest. Data presented in this work, may contribute to elucidation of the mechanisms involved in pro-oxidants, proliferatives/antiproliferatives and cytotoxic actions of vitamin A and its derivatives in biologycal systems.

Orientador: Valdecir Farias Ximenes / Coorientador: Luiz Marcos da Fonseca / Banca: Maria Luiza Zeraik / Banca: Iêda Maria Marinez Paino / Banca: Daniel Rinaldo / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: Inúmeras patologias têm a sua gênese e/ou progressão relacionadas à produção desregulada de intermediários oxidantes. O complexo multienzimático NADPH oxidase é um dos componentes de maior relevância neste contexto, pois é uma das principais fontes de ânion superóxido no organismo animal. Sendo expresso em inúmeros tecidos, incluindo leucócitos e células do tecido endotelial, o desenvolvimento de inibidores eficientes deste complexo enzimático poderá significar uma nova terapêutica para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas. Com objetivo de explorar a relação entre a estrutura molecular, as propriedades químicas e atividades biológicas, utilizamos o éster fenetílico do ácido cafeico (CAPE) como inibidor do complexo enzimático NADPH oxidase e comparamos sua eficácia com o seu precursor ácido cafeico e os derivados, éster fenetílico do ácido cinâmico e o ácido clorogênico, correlacionando-os a respeito a sua hidrofobicidade, propriedades redox e inibição do complexo NADPH oxidase em leucócitos ativados. A hipótese seria de que um aumento da hidrofobicidade provocado pela esterificação do ácido cafeico poderia facilitar o seu acesso à membrana celular e assim alterar seu efeito como possível inibidor de NADPH Oxidase. Os resultados, em ensaios in vitro, mostraram que as alterações na hidrofobicidade não provocaram alterações significativas no potencial de oxidação e potencial antioxidantes dos compostos testados. Quando testados em leucócitos ativados (modelos ex vivo),... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Several diseases have their genesis and / or progression related to unregulated production of oxidants intermediates. The multienzymatic complex NADPH oxidase is one of the most important components in this context because it is a major source of superoxide anion in animal organisms. It is expressed in numerous tissues, including leukocytes and endothelial tissue cells. Developing effective inhibitors of this enzyme complex may indicate a new therapy for the treatment of chronic inflammatory diseases. Several studies have described numerous anti-inflammatory properties attributed to caffeic acid phenethyl ester (CAPE), an active component found in propolis. In order to explore the relationship between the molecular structure, chemical properties and biological activities, we used CAPE to inhibit the enzyme complex NADPH oxidase and compare its efficacy with the its precursor caffeic acid and derivatives, phenethyl ester of cinnamic acid and chlorogenic acid, correlating them with regard to hydrophobicity, redox properties and inhibition of NADPH oxidase complex on activated leukocytes. The hypothesis was that an increase of hydrophobicity caused by the esterification of caffeic acid could facilitate access to cell membranes and thereby alter its effect as a possible inhibitor of NADPH oxidase. The results (in vitro), showed that the changes in hydrophobicity did not provoke significant changes in the oxidation potential and antiradical potency of the tested compounds. But whe... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor