Carcinomas papilíferos (CP) estão relacionados à ativação da via de sinalização MAPK por diversos oncogenes. Estudos têm relacionado a incidência de CP com a disponibilidade de iodo, um dos mais importante reguladores da função tiroidiana. Recentemente, nosso grupo descreveu que a inibição da via de sinalização TGF<font face=\"symbol\">b pode estar vinculada ao desenvolvimento de CP. Nosso objetivo foi avaliar os efeitos do excesso de iodo na transformação de células tiroidianas. Utilizamos células PCCL3 com indução do oncogene RET/PTC3, tratadas com excesso de iodo. Observamos que o iodo reduziu a proliferação, sem alterar a morte das células e recuperou a expressão de genes específicos tiroidianos, evento geralmente vinculado à transformação maligna tiroidiana. O tratamento com excesso de iodo, ainda, reduziu a expressão de proteínas envolvidas na via MAPK e promoveu o restabelecimento da expressão da via TGF<font face=\"symbol\">b, uma importante via inibitória da proliferação de células tiroidianas. Concluímos que o excesso iodo tenha uma ação antioncogênica durante a transformação maligna tiroidiana. / Papillary Carcinomas (PC) are frequently related to MAPK signaling pathway, activation by several oncogenes. Recent studies had related PC incidence and iodine availability, one of the most important thyroid function regulators. Our group has recently showed that TGF<font face=\"symbol\">b pathway inhibition is directly related to PC development. Our aim was to evaluate iodine excess effects during thyroid cells transformation. We used the PCCL3 cells with RET/PTC3 oncogene induction, treated with iodine excess. We observed that iodine reduced the cell proliferation, not altering cell death and recovered thyroid specific genes expression, event frequently liked to thyroid cells malignant transformation. Iodine excess treatment also reduced MAPK proteins expression and reestablished TGF<font face=\"symbol\">b pathway components expression, an important inhibitory pathway of epithelial cells. We can conclude that iodine excess treatment plays an antioncogenic role during thyroid malignant transformation.

Muitos pacientes submetidos à tireoidectomia por Carcinoma Papilífero da Tireoide (CPT) têm doença linfonodal subclínica no momento da cirurgia. A mutação BRAF T17799A (V600E) é um evento comum no CPT e alguns estudos demonstram correlação entre a mutação e características de maior agressividade tumoral, incluindo a presença de metástases linfonodais. O esvaziamento eletivo do compartimento central ganha aceitação, uma vez que alguns estudos evidenciam que a presença de metástases linfonodais aumenta o risco de recidiva e mortalidade. Devido ao grande potencial de complicações do esvaziamento do compartimento central, o objetivo deste trabalho foi avaliar a associação entre a presença da mutação BRAF T17799A (V600E), a presença de metástases linfonodais e fatores clínicos e histopatológicos de pior prognóstico. Métodos: 51 casos consecutivos de pacientes com CPT foram submetidos à tireoidectomia total e ao esvaziamento eletivo ou terapêutico do compartimento central. Em todos os pacientes foi pesquisada a mutação BRAF T17799A (V600E) no tecido tireoidiano com Carcinoma Papilífero de Tireoide. Resultados: Cinquenta e quatro por cento (54,9%) dos pacientes apresentaram metástases linfonodais. Seis pacientes apresentaram metástases laterais confirmadas por punção aspirativa por agulha fina no pré-operatório e 22 pacientes (43%) apresentaram metástases não detectadas no pré ou no intra operatório A mutação BRAF T17799A (V600E) foi encontrada em 15 pacientes portadores de CPT (29,4%). A presença da mutação não teve associação estatisticamente significante para sexo, idade, tamanho do tumor, extensão extratireoidiana, multicentricidade, embolização angiolinfática e metástases linfonodais. As metástases linfonodais se associaram à multifocalidade (p = 0,005) e invasão angiolinfática (p = 0,003) na análise univariada. Conclusão: A presença da mutação BRAF T17799A (V600E) não se associou à metástases linfonodais em nosso estudo. A multifocalidade e a detecção de invasão angiolinfática no CPT foram os fatores mais importantes na predição de metástases linfonodais / Background: Many patients undergoing thyroidectomy for Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) have subclinical node disease at the time of surgery. The BRAF T17799A (V600E) mutation is a common event in PTC and some studies have demonstrated a correlation between the mutation and aggressive characteristics including lymph node metastasis. Prophylactic Central Node Dissection (CND) is gaining acceptance in the treatment of PTC as studies have shown nodal disease increases local recurrence and may alter mortality. Given the potential complications of CND, the aim of this study was to determine the correlation among BRAF mutation, lymph node metastasis and clinical and histopathological factors of worse prognosis. Methods: A total of 51 consecutive cases of patients with PTC underwent total thyroidectomy and routine prophylactic (CND) or therapeutic neck dissection when metastases were found. All patients were tested for the BRAF mutation. Results: Overall, positive lymph nodes were found in Fifty four per cent9% of patients. Six patients had lateral metastases confirmed by fine needle aspirative cytology and 22 patients (43%) had occult metastases. The BRAF mutation was found in 15 patients (29.4%). BRAF was not correlated with sex, age, size of tumor, multifocality, extrathyroid extension or lymph node metastases. Lymph node metastases were correlated with multifocality (p = 0.005) and angiolymphatic invasion (p = 0.003) in univariate. Conclusions: The BRAF mutation was not correlated with lymph node metastases in our study. Multifocality and angiolymphatic invasion were important factors for predicting lymph node metastases

Objetivo: Investigar a expressão imunoistoquímica de CD117 em um grupo de pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago Pacientes e Métodos: Vinte e sete pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital de Clínicas de Porto Alegre da Universidade Federal do Rio Grande do Sul foram avaliados para imunoreatividade do CD117. Como grupo controle, foram utilizadas biópsias de mucosa esofágica de dez indivíduos saudáveis. A avaliação imunoistoquímica dos tecidos foi realizada com anticorpo monoclonal anti-CD117 (DAKO). Resultados: Foram avaliados 21 (78%) homens e 6 (12%) mulheres com idade média de 58 anos (36 a 77). A maioria dos pacientes apresentava estadiamento TNM IIb ou III, e a sobrevida média foi de 21 meses (2 a 72). A reação imunoistoquímica em membrana produzida pelo anticorpo anti-CD117 foi considerada positiva em 4 dos 27 dos casos analisados (15%) . Conclusões: Esses achados sugerem que CD117 deve ser investigado como marcador para o carcinoma epidermóide de esôfago. Estudos adicionais são necessários em outras amostras populacionais, para melhor definir o papel do CD117 nesses tumores. / Aim: To investigate the CD117 expression in specimens of patients with squamous cell carcinoma of the esophagus (SCCE). Methods: A pilot study was performed for CD177 immunoreactivity, using a monoclonal antibody against CD117 (DAKO), on 27 esophageal squamous cell carcinoma specimens from patients who underwent surgical resection at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre University Hospital, Faculty of Medicine, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. As a control group, specimens of esophageal mucosa obtained from 10 healthy subjects were also studied. Results: Twenty-one (78%) males and six (12%) females with median (sd) age of 58 (8) years, ranging from 36 to 77 years. Most of the patients were of TNM stage IIb or III and mean overall survival was 21 (2 to 72) months. Cytoplasmic membrane CD117 immunoreactivity was demonstrated in only 4 (15%) out of 27 tumors and in none of the controls (0%). Conclusions: These results suggest that the decreased expression of CD117 may be due to lack of control of the cell cycle in SCCE. Additional studies are needed to better define the role of the CD117 in such tumors.

Objetivo: Investigar a expressão imunoistoquímica de CD117 em um grupo de pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago Pacientes e Métodos: Vinte e sete pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital de Clínicas de Porto Alegre da Universidade Federal do Rio Grande do Sul foram avaliados para imunoreatividade do CD117. Como grupo controle, foram utilizadas biópsias de mucosa esofágica de dez indivíduos saudáveis. A avaliação imunoistoquímica dos tecidos foi realizada com anticorpo monoclonal anti-CD117 (DAKO). Resultados: Foram avaliados 21 (78%) homens e 6 (12%) mulheres com idade média de 58 anos (36 a 77). A maioria dos pacientes apresentava estadiamento TNM IIb ou III, e a sobrevida média foi de 21 meses (2 a 72). A reação imunoistoquímica em membrana produzida pelo anticorpo anti-CD117 foi considerada positiva em 4 dos 27 dos casos analisados (15%) . Conclusões: Esses achados sugerem que CD117 deve ser investigado como marcador para o carcinoma epidermóide de esôfago. Estudos adicionais são necessários em outras amostras populacionais, para melhor definir o papel do CD117 nesses tumores. / Aim: To investigate the CD117 expression in specimens of patients with squamous cell carcinoma of the esophagus (SCCE). Methods: A pilot study was performed for CD177 immunoreactivity, using a monoclonal antibody against CD117 (DAKO), on 27 esophageal squamous cell carcinoma specimens from patients who underwent surgical resection at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre University Hospital, Faculty of Medicine, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. As a control group, specimens of esophageal mucosa obtained from 10 healthy subjects were also studied. Results: Twenty-one (78%) males and six (12%) females with median (sd) age of 58 (8) years, ranging from 36 to 77 years. Most of the patients were of TNM stage IIb or III and mean overall survival was 21 (2 to 72) months. Cytoplasmic membrane CD117 immunoreactivity was demonstrated in only 4 (15%) out of 27 tumors and in none of the controls (0%). Conclusions: These results suggest that the decreased expression of CD117 may be due to lack of control of the cell cycle in SCCE. Additional studies are needed to better define the role of the CD117 in such tumors.

Objetivo: Investigar a expressão imunoistoquímica de CD117 em um grupo de pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago Pacientes e Métodos: Vinte e sete pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital de Clínicas de Porto Alegre da Universidade Federal do Rio Grande do Sul foram avaliados para imunoreatividade do CD117. Como grupo controle, foram utilizadas biópsias de mucosa esofágica de dez indivíduos saudáveis. A avaliação imunoistoquímica dos tecidos foi realizada com anticorpo monoclonal anti-CD117 (DAKO). Resultados: Foram avaliados 21 (78%) homens e 6 (12%) mulheres com idade média de 58 anos (36 a 77). A maioria dos pacientes apresentava estadiamento TNM IIb ou III, e a sobrevida média foi de 21 meses (2 a 72). A reação imunoistoquímica em membrana produzida pelo anticorpo anti-CD117 foi considerada positiva em 4 dos 27 dos casos analisados (15%) . Conclusões: Esses achados sugerem que CD117 deve ser investigado como marcador para o carcinoma epidermóide de esôfago. Estudos adicionais são necessários em outras amostras populacionais, para melhor definir o papel do CD117 nesses tumores. / Aim: To investigate the CD117 expression in specimens of patients with squamous cell carcinoma of the esophagus (SCCE). Methods: A pilot study was performed for CD177 immunoreactivity, using a monoclonal antibody against CD117 (DAKO), on 27 esophageal squamous cell carcinoma specimens from patients who underwent surgical resection at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre University Hospital, Faculty of Medicine, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. As a control group, specimens of esophageal mucosa obtained from 10 healthy subjects were also studied. Results: Twenty-one (78%) males and six (12%) females with median (sd) age of 58 (8) years, ranging from 36 to 77 years. Most of the patients were of TNM stage IIb or III and mean overall survival was 21 (2 to 72) months. Cytoplasmic membrane CD117 immunoreactivity was demonstrated in only 4 (15%) out of 27 tumors and in none of the controls (0%). Conclusions: These results suggest that the decreased expression of CD117 may be due to lack of control of the cell cycle in SCCE. Additional studies are needed to better define the role of the CD117 in such tumors.

O Adenoma adrenocortical é frequente em adultos, já o carcinoma é raro e agressivo. Mesmo com critérios padronizados, ainda há dificuldade para diferenciar esses tumores, sendo necessário o estudo de marcadores eficientes na detecção e diferenciação. Por serem raros e com diversas manifestações clínicas, culturas in vitro pode ser uma ferramenta para o estudo de processos que envolvem a doença. Foi realizada a caracterização molecular e funcional de culturas de células de tumores de pacientes. Resultados de PCR Array não mostraram um padrão que diferenciasse as culturas em função dos diagnósticos. Desta análise, 7 oncogenes apresentaram maior expressão e 9 supressores de tumor apresentaram baixa expressão nas culturas. WWOX, FHIT e TP73 foram validados por qPCR e a sugestiva interação entre esses fatores nos tumores adrenocorticais merecem futuras investigações. O potencial funcional das culturas T83-ACC, T36-REC e T7-ACA(P) foram evidenciados, e mostraram que podem ser bons modelos para estudo da ação de hormônios e seus mecanismos. / The adrenocortical adenoma is common in adults, since carcinoma is rare and aggressive. Even with standardized scores, it is still difficult to differentiate these tumors, the study of efficient markers in the detection and differentiation is necessary. Because they are rare and diverse clinical manifestations in vitro cultures can be a tool for the study of disease processes that involve. Molecular and functional characterization of cultured tumor cells of patients was conducted. PCR Array results did not show a pattern that differentiates cultures on the basis of diagnoses. This analysis showed higher expression 7 oncogenes and tumor suppressors 9 showed low expression in cultures. WWOX, FHIT and TP73 were validated by qPCR and suggestive interaction between these factors in adrenocortical tumors deserve further investigation. The functional potential of T83-ACC, T36-REC and T7-ACA(P) cell cultures were found, and shown confirm that they can be good models for studying the action of hormones and their mechanisms.

Carcinomas papilíferos (CP) estão relacionados à ativação da via de sinalização MAPK por diversos oncogenes. Estudos têm relacionado a incidência de CP com a disponibilidade de iodo, um dos mais importante reguladores da função tiroidiana. Recentemente, nosso grupo descreveu que a inibição da via de sinalização TGF<font face=\"symbol\">b pode estar vinculada ao desenvolvimento de CP. Nosso objetivo foi avaliar os efeitos do excesso de iodo na transformação de células tiroidianas. Utilizamos células PCCL3 com indução do oncogene RET/PTC3, tratadas com excesso de iodo. Observamos que o iodo reduziu a proliferação, sem alterar a morte das células e recuperou a expressão de genes específicos tiroidianos, evento geralmente vinculado à transformação maligna tiroidiana. O tratamento com excesso de iodo, ainda, reduziu a expressão de proteínas envolvidas na via MAPK e promoveu o restabelecimento da expressão da via TGF<font face=\"symbol\">b, uma importante via inibitória da proliferação de células tiroidianas. Concluímos que o excesso iodo tenha uma ação antioncogênica durante a transformação maligna tiroidiana. / Papillary Carcinomas (PC) are frequently related to MAPK signaling pathway, activation by several oncogenes. Recent studies had related PC incidence and iodine availability, one of the most important thyroid function regulators. Our group has recently showed that TGF<font face=\"symbol\">b pathway inhibition is directly related to PC development. Our aim was to evaluate iodine excess effects during thyroid cells transformation. We used the PCCL3 cells with RET/PTC3 oncogene induction, treated with iodine excess. We observed that iodine reduced the cell proliferation, not altering cell death and recovered thyroid specific genes expression, event frequently liked to thyroid cells malignant transformation. Iodine excess treatment also reduced MAPK proteins expression and reestablished TGF<font face=\"symbol\">b pathway components expression, an important inhibitory pathway of epithelial cells. We can conclude that iodine excess treatment plays an antioncogenic role during thyroid malignant transformation.

MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Análises de expressão em larga escala identificaram aumento da expressão de miR-146b-5p no carcinoma papilífero (PTC), o subtipo mais prevalente do câncer de tiróide. Uma análise in silico apontou SMAD4, um membro da via de sinalização de TGFbeta, como potencial alvo de miR-146b-5p. A via de TGFbeta é uma via inibitória da proliferação da célula folicular, contudo o mecanismo de escape do sinal inibitório de TGFbeta pela célula tumoral tiroideana permanence não esclarecido. A expressão de miR-146b-5p em linhagem normal PCCL3 diminuiu os níveis de SMAD4, conferindo resistência ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta e aumentando a proliferação celular. A inibição de miR-146b-5p em linhagens de PTC aumentou os níveis de SMAD4, restaurou a resposta ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta, diminuindo a proliferação celular. Os dados obtidos neste trabalho revelam o papel oncogênico de miR-146b-5p como um regulador negativo da via de TGFbeta. / MicroRNAs are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional gene regulation. Large-scale analyses revealed that miR-146b-5p is overexpressed in papillary carcinomas (PTC), the most prevalent form of thyroid cancer. A computational analysis indicated SMAD4, an important member of the TGF-<font face=\"Symbol\">b signaling pathway, as a putative target of miR-146b-5p. The TGFbeta pathway is a negative regulator of thyroid follicular cell growth, and the mechanism by which thyroid cancer cells evade its inhibitory signal remains unclear. The overexpression of miR-146b-5p in normal follicular PCCL3 cells decreased SMAD4 levels, conferred resistance to TGFbeta anti-proliferative signal and increased cell proliferation. The specific inhibition of miR-146b-5p in papillary carcinoma cell lines significantly increased SMAD4 levels, restored the TGFbeta signal transduction and decreased cell growth. Altogether, our data confirm the oncogenic role of miR-146b-5p in thyroid follicular cells as a negative regulator of TGFbeta signaling pathway.

O vetor retroviral é uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada em ensaios de laboratório e em protocolos clínicos. Nosso laboratório desenvolveu um novo vetor, chamado pCLPG, com expressão viral sob comando de p53, um supressor de tumor e um ativador indutível de transcrição, com alvo de estabelecer um vetor com alta expressão. O sistema pCLPG demonstrou um nível de expressão superior ao vetor não modificado em ensaios em cultura de células. Neste projeto, nosso objetivo foi caracterizar a expressão do vetor pCLPG in vivo, utilizando um modelo animal de transdução de células da medula óssea (CMO) do camundongo C57BL/6 seguido por transplante em animais recipientes previamente irradiados para abolir o sistema hematopoiético. Visando observar a expressão sustentada do transgene in vivo, padronizamos o transplante de CMO seriado, transdução do vetor retroviral, realizamos análise do gene repórter eGFP por citometria de fluxo e análise por real time PCR, além da observação de outros tecidos como baço, timo, sangue periférico. Realizamos também analises hematológicas nos animais transplantados para observação de possíveis efeitos adversos relacioanados com a presença do retrovírus. Com estes ensaios não foi observado uma diferença significante entre o desempenho do vetor parental pCLeGFP e o pCLPGeGFP. Tanto o número de células eGFP positivas quanto a expressão do gene repórter diminuíram ao longo do processo de transplante seriado. Expressão foi observada em 3-4%, 2-3% ou 2-3% das celulas recuperadas da medula ossea dos recipientes primários, secundários ou terciários de CMO transduzida com o vetor pCLeGFP, mas não no sangue periférico, timo ou baço. Semelhantemente, células eGFP-positivas (6-7%, 4-4,5% ou 3-3,5%) foram observadas após transplante seriado somente na medula óssea de animais recipientes de CMO transduzida com o vetor pCLPGeGFP. Entretanto, sangue periférico foi recuperado dos recipientes e tratado com 5-asacitidina, proporcionando a indução de expressão de eGFP a partir de ambos os vetores em aproximadamente 4% das células, implicando que o silenciamento viral poderia estar relacionado com processos de metilação. Este estudo demonstrou que as modificações no promotor do vetor pCLPG não foram suficientes para evitar silenciamento de expressão viral no modelo utilizado. / The retroviral vector is a widely used gene transfer tool in both laboratory assays and clinical trials. Our laboratory developed a new vector, called pCLPG, with viral expression under the command of p53, a tumor suppressor and inducible activator of transcription, with the aim of establishing a vector with high level expression. The level of expression offered by the pCLPG system was superior to the non-modified vector in cell culture assays. In this project, our objective was to characterize the expression of the pCLPG vector in vivo utilizing an animal model where bone marrow cells (BMC) from C57BL/6 mice are transduced and then transplanted in recipient animals that have been previously irradiated in order to abolish the hematopoietic system. With the aim of observing sustained transgene expression in vivo, we standardized serial BMC transplantation, transduction with retroviral vectors and analyzed the eGFP reporter gene by flow cytometry and real time PCR, and also studied other tissues, such as spleen, thymus and peripheral blood. We also performed hematologic analyses in the transplanted animals in to observe possible adverse events related to the presence of the retrovirus.These assays did not reveal a significant difference between the performances of the parental pCLeGFP vector and pCLPGeGFP. Both the number of eGFP-positive cells and the intensity of reporter gene expression diminished during the serial transplant process. Expression was observed in 3-4%, 2-3% or 2-3% of cells recovered from bone marrow of the primary, secondary or terciary recipients of BMC transduced with the pCLeGFP vector, but not in peripheral blood, thymus or spleen. Similarly, eGFP-positive cells (6-7%, 4-4.5% or 3-3.5%) were observed after serial transplantation only in the bone marrow of animals that received BMC transduced with the pCLPGeGFP vector. However, peripheral blood was recovered from recipients and treated with 5-azacytidine, inducing the expression of eGFP from both vectors in approximately 4% of these cells, implying that viral silencing may have been related with methylation. This study demonstrated that the modifications in the promoter of the pCLPG vector were not sufficient to avoid silencing of viral expression in this model.

In the context of the somatic mutation theory of chemical carcinogenesis, mutations are thought to arise during the replication of DNA past carcinogen-DNA adducts. The work described in this thesis deals with the testing of a hypothetical mechanism whereby mammalian cells are able to replicate their DNA past polycyclic aromatic hydrocarbon DNA adducts. The second objective of this thesis work was to develop both in vivo and in vitro models to study the induction of mutations in a target human gene by chemical carcinogens from two different classes, polycyclic aromatic hydrocarbons and nitrosamines. To approach the hypothetical mechanism of bypass replication in mammalian cells, synchronized Chinese hamster ovary cells were treated with the ultimate carcinogenic form of benzo (a) pyrene, 7β, 8α-dihydroxy-9α, 10α-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo (a) pyrene (BPDE I). Using the pH step alkaline elution assay, it was found that the reduced rate of S phase progression was due to a delay in the appearance of multiple replicon size nascent DNA. It was determined using agarose gel electrophoresis that the ligation of Okazaki size replication intermediates was blocked in BPDE I-treated, synchronized CHO cells. The data obtained were, therefore, supportive of the 'block-gap' model of DNA bypass replication in carcinogen damaged mammalian cells. To study mutagenesis of a specific sequence induced by chemical carcinogens, the human c-Ha-ras proto-oncogene was transfected into the mouse fibroblast cell line, NIH 3T3. Transfected NIH 3T3 cell lines (HHRN 1-4) were isolated that had a low copy number of the human c-Ha-ras proto-oncogene and a non-transformed phenotype. It was determined that the integrated human c-Ha-ras gene was hypomethylated, and expressed at the messenger level. The human c-Ha-ras protein, p21, was also detected in these transfected cell lines. Treatment of the HHRN cell lines with the nitrosamine, N-methyl-N-nitroso-N'-nitroguanidine (MNNG) resulted in transformed NIH 3T3 foci. In vitro MNNG treatment of the plasmid, z-6, and transfection into NIH 3T3 cells led to the isolation of transformed cell lines. Screening of the in vitro and in vivo treated, transformed cell lines by RNA:RNA duplex mismatch analysis led to the detection of no mutations within the first exon of the human c-Ha-ras oncogene.