A redução do número de doses inseminantes por fêmea coberta utilizando protocolos de uma única inseminação em tempo fixo (IATF) permitem reduzir o número de células espermáticas por fêmea coberta e otimizar os programas de inseminação artificial (IA). Considerando a grande variabilidade no intervalo entre o início do estro e a ovulação, os protocolos de IATF exigem hormonios para a sincronização da ovulação. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a utilização de diferentes dosagens de hormônio luteinizante suíno (pLH) aplicado no início do estro em leitoas e porcas, através de diferentes vias de aplicação, para sincronização da ovulação e definição de um protocolo de IATF. O primeiro estudo avaliou o efeito de diferentes dosagens de pLH aplicado em leitoas no início do estro por via intramuscular (i.m.), sobre o intervalo início estro e a ovulação. Desta forma foram realizados três tratamentos: controle - sem aplicação de pLH no início do estro; pLH2,5 - uso de 2,5 mg de pLH no início do estro via i.m.; pLH5 - uso de 5 mg de pLH no início do estro via i.m. Não foram observadas diferenças no intervalo início do estro e a ovulação (IOEO) entre os diferentes tratamentos (P>0,05). De forma semelhante a distribuição de frequência do IOEO não diferiu entre os tratamentos (P>0,05). Em um segundo estudo, foi avaliado uma rota alternativa de aplicação de pLH e a performance reprodutiva de leitoas submetidas a uma única IATF. Assim, os seguintes tratamentos foram realizados: Controle - sem aplicação de hormônio no inicio do estro e realização de protocolos de múltiplas IAs; VS2.5FTAI - uso de 2,5 mg de pLH aplicado no início do estro via submucosa vulvar (v.s.) e realização de uma única IATF 16 h após; IM5FTAI - uso de 5 mg de pLH aplicado no inicio do estro via i.m. e realização de uma única IATF 16 h após. Em média foram observadas diferenças no IOEO entre os tratamentos (P<0,05) e maior frequência de leitoas ovuladas até 24 h após o inicio do estro no grupo VS2.5FTAI em relação ao grupo controle (P<0,05). A taxa de parto ajustada (AFR) não diferiu entre tratamentos (P>0,05), porém o total de leitões nascidos (TPB) foi menor no grupo VS2.5FTAI em relação ao grupo controle (P<0,05). Com objetivo de ajustar o protocolo de IATF em leitoas para uma melhor aplicabilidade prática na rotina das granjas e avaliar o uso do pLH via v.s. em porcas desmamadas, o terceiro estudo foi conduzido através de dois experimentos. Nas leitoas foram realizados dois tratamentos: controle-G - sem uso de pLH no início do estro e realização de múltiplas inseminações ao longo do estro; FTAI-G - aplicação de 2,5 mg de pLH via v.s. no início do estro e realização de uma única IATF 12 h após. O IOEO foi menor nas leitoas do grupo FTAI-G comparado ao controle-G (P<0,05), no entanto a distribuição de frequência do IOEO não foi diferente entre os tratamentos (P>0,05). A AFR foi menor para o grupo FTAI-G quando comprado ao controle-G (P<0,05). Diferenças no TPB não foram observadas entre tratamentos (P>0,05). Nas porcas desmamadas, foram realizados três tratamentos: Controle-S - sem aplicação de pLH no início do estro e realização de múltiplas inseminações; FTAI-NH - sem aplicação de pLH no início do estro e realização de uma única inseminação 24 h após; FTAI-pLH - uso de 2,5 mg de pLH no início do estro via v.s. e realização de uma única inseminação 24 h após. Os resultados deste estudo não asseguraram diferença quanto a AFR e TPB entre os distintos tratamentos (P>0,05). / The reduction in the number of semen doses used per sow served through of a single fixed-time insemination (FTAI) allows sperm cell reduction per sow served, optimising the artificial insemination (AI) programs. Considering the large variability in the interval between oestrus onset and ovulation the ovulation time, the FTAI protocols require hormones to synchronise ovulation. Thus, the aim of this study was to evaluate the use of different dosages of porcine luteinising hormone (pLH) given at oestrous onset in gilts and sows through different routes of application to synchronise the ovulation and to define a protocol of FTAI. The first study evaluated the effect of different dosages of pLH applied at oestrous onset by intramuscular route (i.m.) in gilts on interval between oestrus onset to ovulation. In this way three treatments were performed: control - without pLH application at oestrous onset; pLH2.5 - use of 2.5 mg of pLH given at oestrous onset by i.m. route; pLH5 - use of 5 mg of pLH given at oestrus onset by i.m. route. Differences in the interval onset of oestrus to ovulation (IOEO) among treatments (P>0.05) were not observed. Similarly the frequency distribution of IOEO did not differ among treatments (P>0.05). In a second study, was evaluated an alternative route of pLH application and the reproductive performance of gilts submitted to a single FTAI. Thus, the following treatments were performed: control – without pLH application at oestrous onset and use of multiple AI; VS2.5FTAI – use of 2.5 mg of pLH injected at oestrus onset by vulvar submucosal route (v.s) and use of a single FTAI 16 h later; IM5FTAI – use of 5 mg of pLH injected at oestrous onset by i.m. and use of a single FTAI 16 h later. On average differences in the IOEO among treatments (P<0.05) were observed and more VS2.5FTAI gilts ovulated up to 24 h after oestrous onset in relation to control (P<0.05). Adjusted farrowing rate (AFR) did not differ among treatments (P>0.05), however the total piglets born (TPB) was lower in the group VS2.5FTAI compared to control (P<0.05). In order to adjust the FTAI protocol in gilts for a practical use in the routine of the farm and to evaluate the use of pLH by v.s. route in weaned sows, the third study was conducted through two experiments. In gilts two treatments were performed: control-G - without pLH injection at oestrous onset and use of multiple AI during the oestrous; FTAI-G – 2.5 mg pLH applied by v.s. route at oestrous onset and use of a single FTAI 12 h later. The IOEO was shorter in the FTAI-G gilts compared to control-G (P<0.05), but the frequency distribution of IOEO did not differ between treatment (P>0.05). The AFR was lower to FTAI-G group compared to control-G (P<0.05). Differences on TPB between treatments were not observed (P>0.05). In the weaned sows three treatments were performed: control-S - without pLH application at oestrous onset and use of multiple inseminations; FTAI-NH - no hormone application and a single FTAI 24h after the onset of oestrus detection; FTAI-pLH - use of 2.5 mg pLH at oestrous onset by v.s. route and use of a single FTAI 24 h later. The results of this study did not insure difference on the AFR and TPB among treatments (P>0.05).

of The aim of this study was to develop and evaluate two protocols for estrus synchronization and/or induction in 12-14 months old beef heifers, which would allow the use of timed artificial insemination (TAI) after a short period of estrus detection (48h). The first experiment consisted of evaluating whether eCG was a necessary component in the BioRep system to be used in heifers. To address this question 64 heifers (Bos taurus x Bos indicus) were randomly divided into 2 groups: eCG (treatment n=32) and no eCG (controle n=32). A second experiment was performed with the objective of increasing the number of animals in the eCG group to evaluate the consistency of the results obtained in the first experiment (n=92). On day 0 animals from group treatment received a vaginal pessary containing 250mg of medroxyprogesterone acetate (MPA) for 7 days, along with an intramuscular (IM) injection containing 2.5mg of estradiol benzoate (EB). On day 6 animals were treated with 250IU of eCG (IM) and i~g of cloprostenol sodium in the vulvar submucosa (VSM). After MPA withdrawal heifers were checked for estrus manifestation for 48h and were inseminated 12 hours after estrus detection. Heifers which did not manifest estrus during the 48h observation received i~g of GnRH (IM) and were inseminated 16 to 24h later by TAI. Heifers in the control group received a similar treatment except for the eCG injection which was not used. Because results from treatment group on first and second experiments were not different, pooled conception (55.2%) and pregnancy (46.2%) rates were compared to control rates (23.07% and 25.0% respectively) showing a significant improvement of those rates. We conclude that the use of eCG associated with MPA improves pregnancy rates of 12-14 months old beef heifers. Our second objective was to evaluate the use of progestogens in a system of estrus induction/synchronization using eCG-GnRH-MPA-PGGnRH (eMGPG) in 12-14 months old beef heifers. Bos taurus heifers, mostly Red Angus, were randomly divided into 2 groups: eMGPG (n=85) and eGPG (n=85). Heifers on group eMGPG received 400IU of eCG (IM; day -3) with the objective of inducing an increase in follicular growth, leading to higher responsiveness of follicles to GnRH. Seventy-two hours after eCG injection animals were given GnRH (100g; IM; day 0) and a vaginal pessary containing 250mg of MPA for 7 days. At MPA withdrawal (day 7) 5mg of Dinoprost was injected into the VSM. Fourty-eight hours after pessary withdrawal estrus detection followed by AI was performed. Heifers which did not manifest estrus received 100g of GnRH (IM) and were inseminated 16 to 24h later by TAI. Females from group eGPG received a protocol similar to group eMGPG, except for MPA which was not used. Percentage of estrus manifestation on groups eMGPG and eGPG after prostaglandin injection were 23.5% (20/85) and 22.3% (19/85) respectivelly (p>0.05). Similarly, conception and pregnancy rates on groups eMGPG (65.0%; 13/20 and 37.6%; 32/85%) and eGPG (68.4%; 13/19 and 28.2%; 24/85) were not statistically different. To evaluate the response of follicles with different sizes after eCG administration, 12-14 months old heifers were randomly divided into groups of animals containing follicles of 5.0 (small), 8.5 (medium) and >10.0mm (large) to receive 400IU of eCG (IM) during diestrus. Follicular diameters on day 3 of the control of follicular growth by ultrasound were 13mm, 10mm and 8mm on groups of large, medium and small follicles, respectively. We conclude that the use of eCG prior to the regular hormonal protocol, with the objective of increasing the follicular responsiveness to GnRH does not replace a source of progestagen during the synchronization/induction of estrus in 12-14 months old beef heifers.Furthermore, some females despite the prior administration of eCG depending upon their stage of follicular development do not reach a diameter compatible with GnRH responsiveness / O objetivo do presente estudo, foi o de desenvolver e avaliar dois protocolos de sincronização e ou indução de estro em novilhas de corte com 12 a 14 meses de idade, que possibilite o emprego da inseminação em tempo fixo (IATF) após um curto controle de estro (48h). O primeiro trabalho experimental consistiu na avaliação da necessidade de eCG no sistema BioRep quando utilizado em novilhas. Para tanto, foram empregadas 64 novilhas (Bos taurus x Bos indicus) divididas ao acaso em dois grupos: eCG (tratamento- n =32) e s/eCG (controle -n=32). Em uma segunda etapa o grupo tratamento foi implantado em um número maior de fêmeas (n=92), avaliando a consistência dos resultados obtidos no pré-experimento. No dia 0, as novilhas do grupo tratamento receberam um pessário vaginal com 250mg de MAP por sete dias, e uma injeção intra-muscular (IM) de 2,5mg de BE. No sexto dia, foram aplicados 250UI IM de eCG e 104μg Cloprostenol sódico na sub-mucosa vulvar (smv). Após a retirada do MAP, as novilhas tiveram seu estro controlado por um período de 48h, sendo inseminadas 12h após a manifestação do mesmo. As novilhas que não manifestaram o estro no período de controle, receberam 100μg IM de GnRH e, após 16 a 24h, foram inseminadas por IATF. As novilhas do grupo controle receberam o mesmo tratamento anterior, sem a aplicação do eCG. Os índices de concepção e prenhez nos grupos tratamento (55,2% e 46,2%), mostrarem-se similares e ao serem agrupados foram significativamente superiores aos do grupo controle (23,07% e 25,0%) respectivamente (P<0,05). Conclui-se que o emprego de eCG, associado ao MAP, permite melhorar os índices de prenhez em novilhas de 12 a 14 meses de idade. Por sua vez, o segundo experimento teve por objetivo avaliar o emprego de progestágeno em um sistema de indução/sincronização de estro, utilizando eCG-GnRH-MAP-PG-GnRH (eMGPG) para novilhas de corte de 12 a 14 meses. Novilhas Bos taurus, predominante Red Angus, foram divididas aleatoriamente em dois grupos: eMGPG (n=85) e eGPG (n=85). As novilhas do grupo eMGPG receberam 400UI de eCG (IM; dia -3) com a finalidade de provocar um aumento de crescimento folicular, tornando-os mais responsivos ao GnRH. Após 72h, os animais receberam uma injeção de GnRH (100μg; IM; dia 0) e um pessário vaginal contendo 250mg de acetato de medroxi-progesterona (MAP) por sete dias. Na retirada do MAP (dia 7), foi aplicada uma dose de 5mg de Dinoprost, via submucosa vulvar. Nas 48h seguintes à retirada dos pessários, foi realizado o controle da manifestação de estro e inseminação artificial (IA). As novilhas que não manifestaram estro nesse período, receberam uma dose de 100μg de GnRH por via IM e IATF nas 16 a 24h seguintes. As fêmeas do grupo eGPG receberam o protocolo similar ao anterior porém, sem o MAP. A percentagem de estro dos grupos eMGPG e eGPG após a aplicação da prostaglandina foram de 23,5% (20/85) e 22,3% (19/85) respectivamente (p>0,05). Igualmente, os índices de concepção e prenhez nos grupos eMGPG (65,0%; 13/20 e 37,6%; 32/85) e eGPG (68,4%; 13/19 e 28,2%; 24/85) não diferiram estatisticamente. Com intuito de avaliar a resposta de folículos de diferentes tamanhos após administração de eCG, novilhas de 12-14 meses foram aleatoriamente distribuídas para receber 400UI de eCG (IM) na presença de folículos de 5,0, 8,5 e >10,0mm, durante o diestro. Os diâmetros médios dos folículos no dia 3 da dinâmica foram, de 13mm, de 10mm e de 8mm nos grupos de folículos grandes, de folículos médios e de folículos pequenos respectivamente. Conclui-se que a aplicação prévia de eCG para aumentar o índice de folículos responsivos ao GnRH não substitui uma fonte de gestágeno na sincronização/indução de estro em novilhas de corte com 12 a 14 meses de idade. Pode-se concluir também que algumas fêmeas, apesar da aplicação prévia de eCG, dependendo do momento do crescimento folicular em que se encontram, não atingem um diâmetro folicular compatível com resposta ao GnRH

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The kallikrein-kinin system (KKS) has been described as an important mediator of physiologic processes. Kallikreins use kininogen (KNG) as substrate to generate bradykinin, the principal active peptide of the KKS which acts through two types of receptors, the B1R and B2R. The objective of this study was to characterize some components of KKS in different compartments of ovary during the ovulation process in bovine. mRNA expression pattern of KNG, B1R and B2R was assessed in theca and granulosa cells and bradykinin concentration and kallikrein-like activity in follicular fluid of bovine peri-ovulatory follicles. In order to obtain a peri-ovulatory follicle (≥ 12mm), twenty-seven cows were submitted to estrus synchronization protocol and ovariectomized by colpotomy at 0, 3, 6, 12 or 24 hours after a GnRH-analog injection (gonadorelin; 100 μg, IM). Follicular fluid was aspirated for enzymatic assays and granulosa and theca cells were harvested for mRNA analysis. The mRNA expressions in follicular cells were evaluated by real-time RT-PCR and data represented as relative to housekeeping gene cyclophilin. Bradykinin concentration and Kallikrein-like activity was measured in follicular fluid by enzymatic immunoassay and selective substrate cleavage, respectively, and the absorbance measured using a plate reader. KNG mRNA expression was similar for both follicular cell types (P>0.05), while B2R expression in theca cells and B1R expression in theca and granulosa cells showed different profiles during peri-ovulatory period (P<0.05). Bradykinin concentration and kallikrein-like activity in follicular fluid were different (P<0.05) according the time during ovulation process. The results provide an important characterization of the presence and possible regulation of KKS during ovulation in bovine. / O sistema calicreína-cinina (KKS) tem sido descrito como um importante mediador de processos fisiológicos. Calicreínas utilizam o cininogênio (KNG) como substrato para formar a bradicinina, que é o principal peptídeo ativo do KKS o qual atua através de dois tipos de receptores, o B1R e B2R. O objetivo deste estudo foi caracterizar os principais componentes do KKS em diferentes compartimentos ovarianos durante o processo ovulatório de bovinos. A expressão de RNAm de KNG, B1R e B2R foi mensurada em células da teca e granulosa, e concentração de bradicinina e atividade de calicreína no fluido folicular de folículos peri-ovulatórios bovinos. Para obter um folículo peri-ovulatório (≥ 12mm), vinte e sete vacas foram submetidas a um protocolo de sincronização de cios e ovariectomizadas por colpotomia 0, 3, 6, 12 ou 24 horas após uma injeção de um análogo ao GnRH (gonadorelina; 100 μg, IM). O fluido folicular foi aspirado para os ensaios enzimáticos e as células da teca e granulosa dissecadas para análise do RNAm. A expressão do RNAm em células foliculares foi avaliada por PCR em tempo real e os dados representados em relação ao gene constitutivo ciclofilina. A concentração de bradicinina e atividade de calicreína foram mensuradas no fluido follicular por imunoensaio enzimático e clivagem de substrato seletivo, respectivamente, e sua absorbância mensurada por leitor de placas. A expressão de RNAm para o KNG não variou em ambos os tipos celulares nos diferentes tempos (P>0,05), enquanto que para B2R a expressão em células da teca e expressão para B1R nas células da teca e granulosa apresentaram diferentes padrões durante o período peri-ovulatório (P<0,05). A concentração de bradicinina e a atividade de calicreína no fluido follicular foram diferentes (P<0,05) de acordo com o tempo durante o processo ovulatório. Estes resultados demonstram que o KKS está presente e há indicativos de sua regulação durante a ovulação em bovinos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the first study, we characterized an in vitro culture system able to delaying meiosis resumption of bovine oocytes. Firstly, we demonstrated that the use of an EGFR inhibitor (AG1478; 5μM) in a culture system with follicular hemisections (FHS) was effective to maintain 89.3% of the oocytes in germinal vesicle stage (GV) during 15 h. This blocking effect was dependent on the FHS, since in its absence only 40% of the oocytes remain in GV stage. The meiosis blockage was totally reversible, since the oocytes reached matured stages after an additional 18 and 20 h maturation period and were able to support the embryonic development after in vitro fertilization. Regarding the molecular profile of the cells involved in the blocking system, we did not observe treatment effect on mRNA expression of the genes evaluated in oocyte. However, in cumulus cells, whereas the expression of EGR-1, TNFAIP6 and HAS2 was inhibited by AG1478 treatment, the expression of CX43 and IMPDH1 was decreased by FHS influence. Moreover, in the granulosa cells we observed a downregulation in the expression levels of PGR and ADAMTS1 by AG1478 treatment. The Western blot data revealed that the treatment with AG1478 plus FHS induces a downregulation in p-ERK1/2 protein abundance. In the next experiment, we verified that the AngII or PGE2 and PGF2α did not reverse the inhibitory effect of AG1478 plus FHS on meiosis resumption. In conclusion, findings from this study revealed an effective and reversible system to prevent meiosis resumption of bovine oocytes. In the second study, we investigate the role of mTOR system and its relation with LH regulated genes during preovulatory period in cattle. Using an in vivo model, we demonstrated mTOR kinase activity in granulosa cells 3 and 6 h after induction of ovulation with GnRH. In the similar moments (3 h after GnRH), we observed an increase in p-ERK1/2, STAR and EGR1 protein abundance. The inhibition of mTOR kinase activity by intrafollicular injection of rapamycin did not alter the ovulation rate. However, the treatment of granulosa cells in vitro with rapamycin interrupted the LH-induced increase in EREG mRNA levels. Moreover, the effect of rapamycin in culture was proved by inhibiting the p-P70S6K protein levels. In the same Western blot analysis, we verified that rapamycin may be inducing AKT activity and did not alter Phospho-ERK1/2 status and EGR1 protein abundance. These results provided the first evidence in cattle that mTOR system is upregulated by LH at time points similar to p-ERK1/2, STAR and EGR1. In addition, the mTOR inhibition data contribute to suggest an AKT dependent pathway during ovulation process, in which occurs ERK1/2 activation in a pathway independent of EREG, AREG and PTGS2 mRNA levels. / O primeiro estudo caracterizou um modelo in vitro de bloqueio do reinício da meiose de oócitos bovinos. Em um primeiro momento, demonstramos que o uso de um inibidor dos EGFR (AG1478; 5μM) em um sistema de cultivo com metades foliculares (FHS) foi eficiente para manter 89,3% dos oócitos em vesícula germinativa durante 15 h. Esse efeito de bloqueio foi dependente das FHS uma vez que na sua ausência apenas 40% dos oócitos permanecem em vesícula germinativa. O sistema de bloqueio foi totalmente reversível, tendo em vista que os oócitos completaram a maturação após um período adicional de 18 e 20 h, e suportaram o desenvolvimento embrionário subsequente após fertilização in vitro. Quanto ao perfil molecular das células envolvidas no bloqueio, no oócito não foi verificado efeito do tratamento na expressão dos genes avaliados. Entretanto, nas células do cumulus, enquanto a expressão de EGR1, TNFAIP6 e HAS2 foi diminuída pelo tratamento com AG1478, a expressão de CX43 e IMPDH1 foi diminuída pela influência das FHS. Além disso, nas células da granulosa observamos uma diminuição nos níveis de expressão de PGR e ADAMTS1 pelo tratamento com AG1478. Os dados de Western blot nos mostraram que a abundância de p-ERK1/2 diminui em decorrência do tratamento com AG1478 associado as FHS. Posteriormente, verificamos que o efeito inibitório do AG1478 juntamente com as FHS não foi revertido pelo tratamento com AngII ou PGs. Em conclusão, este estudo propõem um modelo efetivo e reversível para o bloqueio do reinício da meiose de oócitos bovinos. Em um segundo estudo, investigamos o papel do sistema mTOR e sua relação com genes regulados pelo LH durante o período pré-ovulatório em bovinos. Utilizando um modelo in vivo, demonstramos que ocorre um aumento na atividade do mTOR em células da granulosa 3 e 6 h após indução da ovulação com GnRH. Em momentos similares (3 h após GnRH) ocorreu maior abundância proteica para p-ERK1/2, STAR e EGR1. Ao injetar rapamicina no ambiente intrafolicular in vivo, não foram observadas alterações nas taxas de ovulação. Entretanto, o uso da rapamicina em cultivo in vitro de células da granulosa inibiu a expressão de RNAm para EREG induzida pelo LH. Além disso, os dados de cultivo comprovaram o efeito da rapamicina em bloquear a atividade do mTOR, caracterizada pela abundância proteica de p-P70S6K, induzir um provável aumento na abundância de p-AKT e não alterar os níveis de p-ERK1/2 e EGR1. Esses resultados fornecem a primeira evidência em bovinos que o sistema mTOR é regulado positivamente pelo LH em momentos similares a p-ERK1/2, STAR e EGR1. Além disso, os dados de inibição do mTOR contribuem para sugerir uma outra rota para a ovulação controlada pela p-AKT, na qual ocorre ativação de ERK1/2 em uma via independente dos níveis de expressão de EREG, AREG e PTGS2.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this study the effect of exogenous 500μg cloprostenol sódico (PGF2α Ciosin®) with or without previous intravaginal progesterone (P4) releasing insert (CIDR) treatment on the ovulation rate of prepubertal heifers was evaluate. Forty crossbred Angus prepubertal heifers 250 kg in average were randomly assigned into three experimental groups: Progesterone + PGF2α Group (PPG Group, n = 12) plus an im. injection of PGF2α at the CIDR s remove, PGF2α Group (PG Group, n = 14) heifers were treated im with PGF2α five days after follicular wave emergence and the Control Group (n = 14) were not treated. Immediately after CIDR insert, the PPG heifers received im 50 mg of progesterone and 2 mg of estradiol benzoate. The CIDRs were removed on the fifth day after the emergence of a new follicular wave. The rate of ovulation was higher in PPG (10/12; 83.33%) and PG Groups (11/14; 78.50%) than in the Control Group (1 / 14; 7.14%) (P < 0.0001). Our study indicates that PGF2α induces ovulation in prepubertal heifers in spite of its use with or without exogenous progesterone. / Neste estudo avaliou-se o efeito de 500μg de cloprostenol sódico (PGF2α, Ciosin®) associado ou não ao tratamento prévio com um dispositivo intravaginal liberador de progesterona (P4, CIDR®) sobre a taxa de ovulação de novilhas pré-púberes. Quarenta novilhas da raça Red Angus, com média de 250 kg de peso-vivo foram distribuídas aleatoriamente em três grupos experimentais: O grupo de fêmeas PPG (n=12) foi tratado com P4 e PGF2α via i.m no momento da retirada do CIDR. As fêmeas do grupo PG (n=14) receberam PGF2α 5 dias após a emergência da onda folicular (n=14). As fêmeas do Grupo Controle (n=14) não receberam tratamento. Imediatamente após a colocação do CIDR®, as novilhas do grupo PPG receberam 50 mg de P4 i.m. e 2 mg de benzoato de estradiol. Os dispositivos de CIDR® foram retirados no quinto dia após a emergência da nova onda folicular. A percentagem de ovulação foi maior nos Grupos PPG (10/12, 83,33%) e PG (11/14, 78,5%) comparados ao GC (1/14; 7,14%) (P< 0.0001). A PGF2α induz a ovulação em novilhas pré-púberes, independente se associada ou não a progesterona exógena.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:52:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-02Bitstream added on 2015-05-14T16:59:38Z : No. of bitstreams: 1 000829200.pdf: 325615 bytes, checksum: 4a9a2d1fb847b75b354083bd4e3c20af (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A indução da ovulação após o tratamento com hCG e análogos de GnRH, como a deslorelina, ocorrem por mecanismos distintos. Por sua vez, é possível que estes tratamentos acarretem alterações na perfusão vascular folicular durante o período pré-ovulatório. Desta forma, a ultrassonografia colorida Doppler apresenta potencial para ser utilizada como ferramenta na avaliação em tempo real do potencial ovulatório de folículos em éguas. Os objetivos principais deste trabalho foram avaliar as alterações na perfusão vascular folicular (PVF) após o uso de hormônios indutores da ovulação e sua relação temporal com o perfil plasmático de LH. Além de avaliar se a PVF pode ser utilizada para indicar a proximidade da ovulação. Ciclos estrais de éguas foram aleatoriamente divididos em três grupos experimentais: grupo GnRH, grupo hCG e grupo controle (n=10 éguas/grupo). Tratamentos foram realizados na presença de folículo com diâmetro ≥35mm associado à edema uterino. O momento imediatamente antes do tratamento foi considerado H0. Colheita de sangue e exame ultrassonográfico Doppler função power-flow do folículo dominante foram realizados para avaliar, respectivamente, a concentração plasmática de LH e a perfusão vascular folicular (PVF). Os parâmetros foram avaliados de hora em hora entre os intervalos H0-H12 e a cada seis horas da H12 até H30. Adicionalmente, os grupos GnRH e hCG foram acompanhados a cada hora a partir da H30 até a detecção da ovulação ou até H48. Já no grupo controle, foi realizada ultrassonografia modo-B a cada seis horas após H30 e ao se detectar características indicativas da proximidade de ovulação a US Doppler foi realizada de hora em hora até detecção da ovulação. O grupo controle apresentou um intervalo mais longo até à ovulação (P < 0,0001). Efeito de grupo (P < 0.05) foi detectado para PVF. Animais do grupo GnRH apresentaram maior PVF (P < 0.05) média quando ... / Ovulation induction after treatment with hCG and GnRH analogs, such as deslorelin, occur through distinct mechanism. Meanwhile, it is possible that these treatments entail changes in follicular vascular perfusion during the pre-ovulatory period. Thus, color Doppler ultrasound presents a potential to be used as a tool for real-time assessment of follicles ovulatory potential in mares. The main purposes of this paper were to evaluate follicular vascular perfusion (FVP) after the use of ovulation induction hormones and the relationship with the plasmatic profile of LH. Additionally, evaluate if FVP can be used to indicate proximity to ovulation. Estrous cycles of mares were randomly divided in three experimental groups: GnRH group, hCG group and control group (n=10 mares/group). Treatments were done in the presence of a follicle with ≥35mm diameter associated with uterine edema. The moment immediately before treatment was considered H0. Blood collection and Doppler ultrasound exam with power-flow mode of the dominant follicle were done to evaluate, respectively, plasmatic concentration of LH and FVP. Parameters were evaluated every hour between H0-H12 and every six hours from H12 until H30. Additionally, GnRH and hCG groups were evaluated every hour from H30 until ovulation detection or until H48. In the control group, B-mode ultrasonography was completed every six hours after H30 and when detection of characteristics indicative of imminent ovulation Doppler ultrasonography was done every hour until ovulation detection. Control group presented a longer interval until ovulation (P < 0,0001). Group effect (P < 0.05) was detected for FVP. Animals from the GnRH group presented higher mean FVP (P < 0.05) when compared to the hCG and control groups since H0 until the moment of ovulation. No moment effect and interaction group:moment was found between experimental groups. Mean LH concentration between H1 and ... / FAPESP: 2012/11117-3

Este trabalho teve por objetivo avaliar a dinâmica folicular de vacas de corte tratadas com protocolos para a sincronização da ovulação onde se utilizou implantes vaginais impregnados com progesterona ou com acetato de medroxi-progesterona e um implante auricular impregnado com norgestomet, além da utilização de ésteres de estradiol em diferentes doses. Foram utilizadas nove vacas Braford, multíparas, não-lactantes, cíclicas e com CC>=3. Os animais foram mantidos confinados e alimentados com feno e ração. Os animais foram divididos em três tratamentos, sendo que todos os animais passaram pelos três tratamentos em quatro repetições. Em cada repetição os animais foram divididos entre os três grupos de forma homogênea. No grupo 1 (n = 14), os animais receberam no dia 0, uma esponja vaginal impregnada com 250 mg de acetato de medroxi-progesterona (MAP) e uma aplicação intramuscular (i.m.) de 2 mg de benzoato de estradiol (BE); no dia 8, a esponja vaginal foi retirada e aplicado i.m. 0,5 mg de Cloprostenol e 24 horas após foi aplicado i.m. 1 mg de BE. No grupo 2 (n = 7), os animais receberam no dia 0, um implante vaginal de silicone impregnado com 1 g de progesterona e uma aplicação i.m. de 2 mg de BE; no dia 8, o implante foi retirado e aplicado i.m. 0,5 mg de Cloprostenol e 24 horas após foi aplicado i.m. 1 mg de BE. No grupo 3 (n = 8), os animais receberam no dia 0, um implante auricular de silicone impregnado com 3 mg de Norgestomet e uma aplicação i.m. de 3 mg de Norgestomet e 5 mg de Valerato de Estradiol (VE); no dia 9 o implante auricular foi retirado. Os animais foram examinados diariamente por via trans-retal com um ultra-som equipado com um transdutor linear de 8 MHz para monitorar a dinâmica folicular e luteal nos ovários. Após a retirada do implante auricular no grupo 3 e após a aplicação de 1 mg de BE nos grupos 1 e 2, os animais foram avaliados por ultra-sonografia duas vezes por dia até que a ovulação fosse detectada. No grupo 1, sete animais perderam a esponja vaginal impregnada com MAP e os dados foram retirados das análises. Os três tratamentos foram eficientes em promover uma nova onda de crescimento folicular sincronizada em 3,7 ± 1,1, 3,7 ± 0,7 e 4,9 ± 1,1 dias (P = 0,059) nos grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Além de promover a ovulação de um folículo dominante com poucos dias de dominância e com diâmetro satisfatório em 66 ± 12, 66 ± 0 e 70,5 ± 12,7 horas após a retirada do implante (P = 0,62) nos grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Portanto, os três protocolos foram eficientes em promover a sincronização da ovulação e são indicados para utilização em programas de inseminação artificial a tempo fixo em vacas de corte. / This experiment was done to evaluate the ovarian follicular dynamics in beef cows treated with protocols of synchronization of ovulation where were used vaginal implants impregnated with progesterone or with medroxi-progesterone acetate and an ear implant impregnated with norgestomet, than the use of estradiol esters in different doses. Nine Braford cows, multiparous non-lactating, cyclic and BCS>=3 where used in these trial. The animals were kept confined and fed with hay and concentrated. The animals were divided into three treatments, which all animals went for three treatments in four replicates. In each replicate the animals were divided among groups homogeneously. Group 1 (n = 14), animals received on day 0, a vaginal sponge impregnated with 250 mg medroxi-progesterone acetate (MPA) and an intramuscular (i.m.) application of 2 mg of estradiol benzoate (EB); on day 8, the vaginal sponge was removed and applied i.m. 0.5 mg cloprostenol and 24 hours latter was applied i.m. 1 mg of EB. Group 2 (n = 7), the animals received on day 0, a silicone vaginal implant with 1 g of progesterone and an application i.m. of 2 mg of EB; on day 8, the implant was removed and applied i.m. 0.5 mg cloprostenol and 24 hours latter was applied i.m. 1 mg of EB. Group 3 (n = 8), the animals received on day 0, a silicone ear implant impregnated with 3 mg norgestomet and an application i.m. of 3 mg norgestomet and 5 mg of estradiol valerate; on the 9th day the implant was removed. From day 0, animals were examined daily by trans-rectal ultrasound with an 8 MHz linear transducer to monitor follicular and luteal dynamics. After removal of the implant in group 3 and after application of 1 mg EB in the other groups, the animals were evaluated by ultrasound two times per day until ovulation was detected. In group 1, seven animals lost a vaginal sponge impregnated with MPA and the data were removed from analysis. The three treatments groups were effective in promoting a new follicular wave emergence synchronously in 3,7 ± 1,1, 3,7 ± 0,7 and 4,9 ± 1,1 days (P = 0,059) in the groups 1, 2 and 3, respectively. Besides promoting ovulation a dominant follicle with few days of dominance and with satisfactory diameter in 66 ± 12, 66 ± 0 and 70,5 ± 12,7 hours after implant removal (P = 0,62) in the groups 1, 2 and 3, respectively. Therefore, the three protocols were effective in promoting the synchronization of ovulation and are indicated for use in fixed-time artificial insemination programs in beef cows.

O análogo de GnRH, Lecirelina (Gestran Plus®; ARSA S.R.L., Buenos Aires, Argentina), foi testado para habilidade de induzir e sincronizar a ovulação de porcas. As fêmeas foram uniformemente distribuídas após o desmame, em dois grupos de 56 fêmeas de acordo com a ordem de parto (OP) (2-6), intervalo desmame-estro (IDE) e escore corporal visual (ECV). O análogo de GnRH (25μg, 1mL) e a solução fisiológica (grupo controle) foram administrados no início do estro (quando detectado o primeiro reflexo de tolerância ao macho). A detecção do estro, assim como a ultrasonografia transcutânea foram realizados em intervalos de 8 horas. A duração do estro, no grupo controle e tratado, foram de 66,3 ± 1,3 h e de 61,3 ± 1,3 h (P=0,007), respectivamente. O intervalo entre o início do estro e a ovulação (IEO) foi de 44,3 ± 1,2 h e 39,9 ± 1,2 h (P=0,012) para o grupo controle e tratado, respectivamente. Até 40 h após o tratamento, 70,9% das fêmeas que receberam a Lecirelina ovularam enquanto somente 48,2% das fêmeas controle ovularam no mesmo período (P=0,01). Uma maior proporção das fêmeas hormonalmente tratadas tendeu (P=0,09) a ovular até 48 h após o tratamento (92,7%) comparado com as fêmeas do grupo controle (82,4%). O desempenho reprodutivo (taxa de parto, número de leitões nascidos totais, leitões nascidos vivos, natimortos e fetos mumificados) não foi afetado (P>0,05) pela indução da ovulação com Lecirelina. / The GnRH analog, Lecirelin (Gestran Plus®; ARSA S.R.L., Buenos Aires, Argentina), was tested for the ability to induce and synchronize ovulation in sows. Sows were uniformly allocated, after weaning, in two groups (n=56, each) according to parity (2-6), wean to estrus interval (WEI) and body condition score (BCS). GnRH analog (25μg, 1mL) and saline solution (control group) were injected at estrus onset (at first standing reflex). Estrus detection and transcutaneous real-time ultrasonography were performed each 8 h. Duration of estrus for control and treated groups was of 66.3 ± 1.3 h and 61.3 ± 1.3 h (P=0,007), respectively. Interval from estrus onset to ovulation (IEO) was of 44.3 ± 1.2 h and 39.9 ± 1.2 h (P=0,012) for the control and treated groups, respectively. Up to 40 h after treatment administration, 70.9% of Lecirelin sows had ovulated whereas 48.2% of control sows ovulated in the same period (P= 0.01). A large proportion of Lecirelin sows tended (P= 0.09) to ovulate up to 48 h after treatment (92.7%) compared to control sows (82.4%). Reproductive performance (farrowing rate, number of total piglets born, piglets born alive, stillborn piglets and mummified fetuses) was not affected (P>0.05) by induction of the ovulation with Lecirelin.

This thesis aims to contribute to the knowledge of the regulation and function of the natriuretic peptide (NP) system during follicular dominance, ovulation, oocyte meiosis resumption and cumulus cells expansion in cattle. In the first study, the NP system was characterized in bovine COC. Moreover, NPPA and NPPC increased cGMP levels in cumulus cells and oocyte after 3 hours of culture, preventing the increase of cAMP in oocyte in the presence of forskolin. In the second study, using in vivo experimental models, none of the three NPs were detected in the granulosa cells during follicular deviation in cattle. However, NPR-3 is highly expressed at the expected time of follicular deviation, and all three NP receptors are expressed in granulosa cells of the dominant follicle. FSH injection maintained the expression of the three NP receptors after follicular deviation in the largest and second largest follicles. However, only NPR-1 mRNA decreased after inhibition of estradiol receptors by intrafollicular injection of fulvestrant. In the granulosa cells of pre ovulatory follicles, only NPPB mRNA was not detected. Nevertheless, after the administration of a GnRH analog, NPPC mRNA expression increased within 3 and 6 hours and NPR-3 mRNA gradually decreased after 3 hours. NPPA and NPR-2 mRNA was not regulated by GnRH, but NPR-1 mRNA increased at 24 hours after GnRH. In the third study, abundance of mRNA for NPR-1, NPR-2 and NPR-3 was not altered by LH and/or AG1478 (EGFr inhibitor) after 6 hours of culture in vitro. Also, LH stimulated NPPC mRNA expression and AG1478 prevented this increase in granulosa cultured in vitro. To confirm the in vitro results, was used an in vivo model and observed that the NPPC mRNA expression increased and NPR-3 mRNA decreased in granulosa cells after 6 hours of GnRH challenge. However, intrafollicular injection of AG1478 prevented the effect of GnRH on NPPC and NPR-3 mRNA expression. In addition, it we obseved that ANP in association with LH stimulated COX2 expression in comparison with LH alone or absence of this gonadotropin. It was observed that the EGFr blockade in vivo did not prevent ovulation in cattle. In the fourth study, it was observed that NPR-3 mRNA expression decreases in bovine cumulus cells after treatment of COCs with FSH or FSH+LH via EGFr. Forskolin, an adenylate cyclase stimulator, also decreased NPR-3 mRNA expression in cumulus cells. Expression of NPR-1 mRNA was very low in bovine cumulus cells and NPR-2 mRNA was not regulated in the proposed treatments. In addition, it was observed that the activation of NPR-3 by a specific agonist (cANP4-23) did not interfere in bovine oocyte nuclear maturation, but it inhibited the complete expansion of cumulus cells FSH+LH-stimulated. Additionally, the association of cANP4-23 with CNP further decreased cumulus cell expansion. / Esta tese tem como objetivo contribuir para o conhecimento da regulação e função do sistema dos peptídeos natriuréticos (NP) durante a dominância folicular, ovulação, retomada da meiose oocitária e expansão das células do cumulus em bovinos. No primeiro estudo, caracterizou-se o sistema NP no CCO de bovino e foi demonstrado que o NPPA e o NPPC aumentam os níveis de cGMP no cumulus e no oócito após 3 horas de cultivo, impedindo o aumento de cAMP no oócito na presença de forskolin. No segundo estudo, utilizando modelos experimentais in vivo, os três NPs não foram detectados nas células da granulosa durante a divergência folicular em bovinos. Contudo, demonstrou-se que o NPR-3 apresenta maior expressão no momento esperado da divergência folicular, sendo que após este momento os três receptores NPs apresentavam alta expressão nas células da granulosa do folículo dominante. A administração de FSH manteve a expressão dos três receptores NPs após a divergência folicular no maior e segundo maior folículo. Porém, somente a expressão do NPR-1 diminui após a inibição dos receptores de estradiol pela injeção intrafolicular de fulvestrant. Nas células da granulosa de folículos pré ovulatórios, somente o NPPB não foi detectado. De modo que, após a administração de um análogo de GnRH, a expressão de NPPC aumentou em 3 e 6 horas e a de NPR-3 gradualmente diminuiu após 3 horas. NPPA e NPR-2 não foram regulados pelo GnRH, e o NPR-1 teve a expressão aumentada somente 24 horas após o GnRH. No terceiro estudo, a abundância de mRNA para NPR-1, NPR-2 e NPR- 3 nas células da granulosa não foi alterada por LH e/ou por AG1478 (inibidor do EGFr) após 6 horas de cultivo in vitro. Também em cultivo in vitro de células da granulosa, o LH estimulou a expressão de NPPC, sendo que o AG1478 impediu este aumento. Como forma de comprovar esses resultados in vitro, utilizamos um modelo in vivo e observamos que a expressão do NPPC aumentou e a do NPR-3 diminuiu após 6 horas do desafio com GnRH, nas células da granulosa. De maneira que, a injeção intrafolicular de AG1478 preveniu o efeito do GnRH sobre a expressão do NPPC e NPR-3. Além disso, foi demonstrado que o ANP em associação com o LH estimulou a expressão de COX2 em comparação com LH isoladamente ou ausência desta gonadotrofina. Também foi demonstrado que o bloqueio do EGFr in vivo não foi suficiente para bloquear a ovulação em bovinos. No quarto estudo, foi observado que a expressão do NPR-3 diminui nas células do cumulus pelo tratamento dos CCOs com FSH ou FSH+LH via EGFr em bovinos. Forskolin (estimulador adenilato ciclase) também induziu a diminuição da expressão do NPR-3. A expressão do NPR-1 foi muito baixa no cumulus de bovino e o NPR-2 não apresentou regulação nos tratamentos propostos. Além disso, foi observado que a ativação do NPR-3 por um agonista específico (cANP4-23) não interferiu na maturação nuclear oocitária em bovinos, porém, inibiu a completa expansão das células do cumulus estimulada por FSH+LH. De maneira que, a associação do cANP4-23 com CNP potencializou a inibição da expansão das células do cumulus.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of present study was to investigate (Pro)renin receptor function in the theca and granulosa cells during the preovulatory period and luteinization in cattle. During the initial preovulatory period, prorenin induced the resumption of oocyte meiosis even in the presence of follicular hemisections or forskolin. In granulosa cells, pró-renina did not increase LHinduced epiregulin (EREG) mRNA after 6 h of culture. Treatment with prorenin plus LH increased amphiregulin (AREG) and prostaglandin synthase 2 (PTGS2) mRNA in granulosa cells. The absence of prorenin effect to stimulate EREG, AREG, and PTGS2 in granulosa cells was established using different combinations of treatments with prorenin and/or aliskiren ([P]RR inhibitor) and/or LH. Treatment of granulosa cells with LH plus EGFR antagonist (AG1478) did not regulate prorenin and (P)RR after 6 h of culture. This result was confirmed in vivo using a model of intrafollicular treatment with AG1478 and intramuscular treatment with GnRH. Finally, (P)RR protein and transcripts for prorenin and pro-fibrotic genes increased in the granulosa cells from 12 h post-GnRH. In the theca cells, (P)RR mRNA and protein increased 6 h after treatment of cows with GnRH. The LH effect to stimulate (P)RR transcript was confirmed in vitro. Intrafollicular treatment with aliskiren did not reduce the ovulation rate. In cultured theca cells, AREG and EREG mRNA were not significantly expressed and ADAM17 was not stimulated by prorenin. Intrafollicular injection of AG1478 did not regulate LH-induced (P)RR, although increased CYP17A1 protein. Prorenin did not induce androstenedione and testosterone synthesis in cultured theca cells. In the corpus luteum, prorenin and (P)RR mRNA were increased at day 10 of estrous cycle compared to day 5, but were not regulated by prostaglandin in vivo, as observed for profibrotic genes. Intrafollicular treatment with aliskiren reduces serum progesterone levels in cows that ovulated. Prorenin role in progesterone synthesis through (P)RR was also evidenced in vitro. Moreover, prorenin induced ERK1/2 phosphorylation in luteal cells, although ERK1/2 inhibition (PD0325901) did not completely inhibit prorenin-induced progesterone synthesis, as evidenced using AG1478. In summary, these results demonstrate that prorenin and (P)RR are stimulated by LH at the end of the preovulatory period and, therefore, they are not related to genes regulated by LH at the initial ovulatory process in granulosa cells; (P)RR is stimulated by LH in the theca cells independently of EGFR; and prorenin stimulate progesterone synthesis through (P)RR, which involves ERK1/2 and EGFR participation. In conclusion, (P)RR is upregulated in granulosa and theca cells after gonadotropins peak and prorenin/(P)RR play an important role in the resumption of oocyte meiosis and on progesterone synthesis in the corpus luteum in cattle. / O objetivo do presente trabalho foi investigar a função do receptor de (pro)renina [(P)RR] nas células da teca e da granulosa durante o período pré-ovulatório e luteinização em bovinos. No início do período pré-ovulatório, pró-renina reiniciou a meiose oocitária bloqueada tanto pelas metades foliculares, quanto por forscolina. Nas células da granulosa, pró-renina não aumentou a expressão de RNAm para epirregulina (EREG) que foi induzido por LH após 6 horas de cultivo. Pró-renina mais LH aumentaram a expressão de RNAm para anfirregulina (AREG) e prostaglandina endoperoxidase sintetase-2 (PTGS2). Contudo, a ausência do efeito de prórenina para estimular o RNAm para EREG, AREG e PTGS2 nas células da granulosa foi evidenciada utilizando as diferentes combinações de tratamento com pró-renina e/ou alisquireno [inibidor do (P)RR] e/ou LH. O tratamento das células da granulosa com LH e antagonista de EGFR (AG1478) não regularam o RNAm para pró-renina e (P)RR após 6 horas de cultivo. Esse resultado foi confirmado in vivo, utilizando um modelo de tratamento intrafolicular com AG1478 e GnRH intramuscular em vacas. Por fim, (P)RR e o RNAm para pró-renina e genes prófibróticos aumentaram nas células da granulosa a partir das 12 horas após tratamento de vacas com GnRH. Nas células da teca, a expressão de (P)RR aumentaram 6 horas após tratamento de vacas com GnRH. O estimulo de LH sobre o transcrito de (P)RR foi confirmado in vitro. O tratamento intrafolicular com alisquireno não reduziu a taxa de ovulação. No nosso cultivo de células da teca, a expressão de RNAm para AREG e EREG não foi significativa e ADAM17 não foi estimulado por pró-renina. Injeção intrafolicular com AG1478 não regulou (P)RR estimulado por LH, mas aumentou a proteína para CYP17A1. Pró-renina não induziu a síntese de androstenediona e testosterona no nosso sistema de cultivo. No corpo lúteo, RNAm para pró-renina e (P)RR foi aumentado no dia 10 do ciclo estral comparado ao dia 5 e não foram regulados por prostaglandina in vivo, como observado para os genes pró-fibróticos. O tratamento intrafolicular com alisquireno diminuiu os níveis de progesterona plasmática em vacas que ovularam. O papel de pró-renina na síntese de progesterona através de (P)RR também foi evidenciado in vitro. Ainda, pró-renina induziu a phosphorilação de ERK1/2 nas células luteais, embora o bloqueio de ERK1/2 (PD0325901) não inibiu completamente a síntese de progesterona induzida por pró-renina, como evidenciado pelo uso de AG1478. Em resumo, esses resultados demonstram que pró-renina e (P)RR são estimulados por LH no final do período pré-ovulatório e, portanto, não estão relacionados com os genes regulados por LH no início do processo ovulatório nas células da granulosa; (P)RR é estimulado por LH nas células da teca de forma independente de EGFR; e a pró-renina estimula a síntese de progesterona via (P)RR envolvendo a participação de ERK1/2 e EGFR neste processo. Em conclusão, (P)RR é regulado positivamente nas células da granulosa e da teca após o pico de LH e a pró-renina/(P)RR possui um importante papel no reinicio da meiose oocitária e na síntese de progesterona pelo corpo lúteo em bovinos.