Prominin-1 is a lipid raft–associated, cholesterol-binding membrane glycoprotein selectively associated with plasma membrane protrusions and extracellular vesicles derived therefrom. Despite its worldwide use for stem cell isolation and its clinical importance in cancer-initiating cells and photoreceptor morphogenesis the function of prominin-1 remains elusive. This prompted me to investigate its role in the architecture and dynamics of microvilli and primary cilia at the apical plasma membrane of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Therefore, stably transfected cell lines were established expressing human prominin-1 splice variant 1 or 2. Upon the overexpression of prominin-1 the number of individual microvilli and clusters of them increased significantly. I also noticed alterations in their architecture, i.e. branching microvilli. Fascinatingly, two point mutations (Pro37→Ala and Tyr41→Ser) in the ganglioside GM1-binding motif of prominin-1 increased the number of branched microvilli and generated irregular ones with knob-like structures at their tip. Additionally, the release of prominin-1+ vesicles was impaired. Interestingly, both phenotypes were suppressed by the inhibition of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) or the Arp2/3 complex. Impaired interaction of prominin-1 with the PI3K through the introduction of an additional mutation (Tyr828→Phe) in its PI3K-binding site also reduced the amount of structurally altered microvilli. Thus, the interaction of prominin-1 with the PI3K may drive the conversion of the docking phospholipid phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate into phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate resulting in the uncoupling of the microvillar membrane from the underlying actin filaments thereby creating irregular/knob-like microvilli. Simultaneously, the phospholipid conversion might modulate the activity of regulators and/or activators of the Arp2/3 complex leading to the branching of microvilli. The overexpression of human prominin-1 also increased the length of primary cilia. Remarkably, a mutation in the histone deacetylase 6-binding site that mimics acetylation produces shorter cilia in cells expressing human prominin-1.s2. Additionally, it stimulates membrane vesicle release and dome formation. Above these striking observations, I observed branching cilia and cilia with a pearling shape. Collectively, the data suggest that a complex interplay of prominin-1 with its lipid and protein interaction partners regulates the architecture and dynamics of cellular protrusions. Finally, a growing number of studies use canine prominin-1 as an antigenic marker despite the absence of specific antibodies. Studies investigating its expression in dog tissues or cells derived therefrom rely on antibodies directed against its human and murine orthologs. To determine its cross-species immunoreactivity I cloned canine prominin-1 and overexpressed it as a green fluorescent protein fusion protein in MDCK cells. Here, I show that the genomic structure of the canine prom1 gene is similar to that of human and mouse. Canine prominin-1 shows the common characteristics of the prominin-1 family but the primary structure is poorly conserved. Like human and mouse protein, it is targeted to the apical membrane of MDCK cells and specifically enriched in microvilli and primary cilia. Immunocytochemistry, flow cytometry and immunoblotting techniques revealed that none of the applied antibodies against human or mouse prominin-1 recognizes the canine protein.

Orientadores: José Andrés Yunes, Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:00:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_AndreBortolini_D.pdf: 16883235 bytes, checksum: e0759c48520d471791a5272349e1a837 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A via PI3K está frequentemente hiperativada em células primárias de leucemia linfoide aguda T (LLA-T) pediátrica, característica previamente associada à resistência a glucocorticoides. Pacientes cujas células leucêmicas apresentam mutações em PTEN, o principal regulador negativo de PI3K, podem apresentar maior risco de falha na terapia de indução e recaída. Neste estudo, uma assinatura baseada em expressão gênica foi utilizada para acessar o nível de ativação da via PI3K em amostras diagnósticas de LLA-T. Nós identificamos Myc como um importante integrador da atividade de sinalização por PI3K e observamos que maior atividade da via está associada à resistência a glucocorticoides e pior prognóstico. O inibidor de PI3K AS605240 mostrou atividade antileucêmica e forte sinergismo com glucocorticoides tanto in vitro como em um modelo xenográfico de LLA-T em camundongos NOD/SCID. Em contraste, a inibição de PI3K resultou em antagonismo com metotrexato e daunorrubicina, drogas que atuam preferencialmente em células em divisão. Esta interação antagonística, no entanto, pôde ser revertida pelo uso de um esquema temporal específico de administração das drogas. Nossos dados indicam os potenciais benefícios e limitações para a incorporação de inibidores de PI3K na terapia da LLA-T / Abstract: The PI3K pathway is frequently hyperactivated in primary T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cells. Activation of the PI3K pathway has been suggested as one mechanism of glucocorticoid resistance in T-ALL, and patients harboring mutations in the PI3K negative regulator PTEN may be at increased risk of induction failure and relapse. In this study, a PI3K gene expression signature was used as readout of PI3K activity in diagnostic T-ALL samples. We identified Myc as an important downstream integrator of PI3K pathway activity in T-ALL and found that higher PI3K activity is associated with glucocorticoid resistance and worse clinical outcome. The PI3K inhibitor AS605240 showed anti-leukemic activity and strong synergism with glucocorticoids both in vitro and in a NOD/SCID xenograft model of T-ALL. In contrast, PI3K inhibition showed antagonism with methotrexate and daunorubicin, drugs that preferentially target dividing cells. This antagonistic interaction, however, could be circumvented by the use of correct drug scheduling schemes. Our data indicate the potential benefits and difficulties for the incorporation of PI3K inhibitors in T-ALL therapy. OBSERVAÇÃOArquivo pdf com capa, página de rosto, folha de assinatura da banca examinadora, resumo e abstract foi editado segundo informação CCPG/002/2013 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

La voie PI3Kinase/AKT/mTOR, est une cible thérapeutique du temsirolimus, un inhibiteur de mTORC1. Dans le but d'obtenir une inhibition plus importante de cette voie j’utilise dans ce projet deux nouvelles molécules :- le NVP-BEZ 235 (BEZ) qui inhibe à la fois mTORC1 et la PI3kinase- l'AZD8055 (AZD), un inhibiteur des complexes mTORC1 et mTORC2. En utilisant différentes lignées de LCM, j’ai démontré que l'effet de ces nouveaux inhibiteurs sur la survie cellulaire est plus important que celui du temsirolimus. Cela est probablement dû à l'inhibition de la phosphorylation de l'AKT et la 4EBP. La deuxième partie de ce projet étudie la synergie entre les inhibiteurs de m-TOR kinase et l'aracytine. Un effet additif important a été démontré. J’ai trouvé en western blot que l’aracytine inhibe la phosphorylation des substrats de la voie Akt –mTOR notamment le 4EBP. L’ibrutinib (un inhibiteur de la voie Btk) a un effet modeste mais j’ai pu démontrer qu'il est capable à induire une inhibition plus importante de la survie cellulaire lorsqu'il est associé à l’aracytine. Cependant il s'est révélé antagoniste aux inhibiteurs de la voie PI3K-AKT-mTOR, cela reste difficile à décortiquer. Enfin, j’ai trouvé un effet additif de l’ibrutinib en combinaison avec la doxorubicine. Cependant les inhibiteurs de m-TOR n'ont pas le même effet. Afin d’expliquer ces résultats, j’ai étudié l’effet de ces molécules sur l’expression de GSTPi, enzyme de détoxification connue pour avoir un rôle important dans la résistance de LCM à l’anthracycline. J’ai mis en évidence une diminution de l’expression de cet enzyme par l’Ibrutinib. En revanche, les inhibiteurs de mTOR n’ont pas un effet sur l’expression de GSTPi. L’ibrutinib pourrait donc sensibiliser le LCM à l’anthracycline en diminuant l’expression de GSTPi. / The PI3K / AKT / mTOR pathway is the target of Temsirolimus. However, important resistance is observed. We tried to obtain a more important inhibition of PI3K / AKT pathway using two new molecules :- NVP-BEZ 235 (BEZ) which inhibits both mTORC1 and PI3K- AZD8055 (AZD) an inhibitor of mTORC1 and mTORC2 complexes. Using different cell lines of MCL, we have shown that the effect of these new inhibitors on cell survival was more important than that of Temsirolimus. This is probably because contrary to Temsirolimus, the two new molecules can inhibit AKT and 4EBP phosphorylation. In the second part of this project we studied the synergy between the m-TOR kinase inhibitors and aracytine (conventional treatment of MCL). We revealed a significant additive effect in MCL cell lines. We demonstrated by Western blot analysis that aracytine inhibits S6 and 4EBP phosphorylation. This may explain the results obtained from this drug association. We then showed that Ibrutinib (an inhibitor of Btk pathway) can induce a significant inhibition of cell survival when combined with aracytine. In this study, Ibrutinib proved antagonist effect to PI3K-AKT-mTOR inhibitors. The mechanisms of these results remain unclear. Finally, we demonstrated an additive effect of Ibrutinib in combination with doxorubicin. We did not obtain the same results when we combined m-TOR inhibitors with doxorubicin. To explain these data, we studied the effect of these drugs on the expression of GSTPi by western blot. This enzyme is known to have an important role in MCL resistance to anthracycline. Importantly, Ibrutinib induced a decrease in the expression of GSTPi but AZD8055, Temsirolimus and NVP-BEZ235 had no effect.

Hintergrund und Fragestellung/Hypothese Trotz verbesserter Diagnose und Therapiestrategien in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) in den letzten Jahrzehnten liegt das 5-Jahres-Überleben der Patienten bei nur etwa 60 %. Die hohe Mortalität ist zurückzuführen auf eine hohe Rezidivrate nach Radio- und Radiochemotherapie. Experimentelle und klinische Daten zeigen in dieser Tumorentität eine häufige Dysregulation des PI3K/AKT-Signalweges, der an verschiedenen Resistenzmechanismen beteiligt ist. Die Zielmoleküle des Signalweges sind involviert in DNA-Reparatur, Reoxygenierung und Repopulierung. Aufgrund der bekannten Beteiligung des PI3K/AKT-Signalweges an diesen wichtigen radiobiologischen Resistenzmechanismen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit folgenden Fragestellungen: 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Material und Methode/Ergebnisse 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren Für die vorliegende Untersuchung wurde auf Tumormaterial von sechs verschiedenen Plattenepithelkarzinomzelllinien (FaDu, SAS, XF354, UT-SCC-5, UT-SCC-14, UT-SCC-15) aus einer Biobank zurückgegriffen. Analysiert wurden Xenografttumoren, die mit 0, 3, 5 oder 10 Fraktionen bestrahlt worden waren. Die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges wurde mittels Western Blot-Analyse untersucht. Die publizierten Daten der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen, der Pimonidazol hypoxischen Fraktion und der HIF-1α-Proteinexpression wurden mit der pAKT-Expression korreliert. In allen unbehandelten Tumoren konnte pAKT nachgewiesen werden, wobei sich eine intratumorale Heterogenität in der Expression zeigte. Unter fraktionierter Strahlentherapie konnte in dem Panel von sechs Tumorlinien keine einheitliche Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges nachgewiesen werden. Die Expression des endogenen Hypoxiemarkers HIF 1α korrelierte in unbehandelten Tumoren mit der pAKT-Proteinexpression. Kein Zusammenhang wurde zwischen dem Gehalt von pAKT und der Pimonidazol hypoxischen Fraktion sowie der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen gefunden. 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro Die Experimente wurden an den humanen Plattenepithelkarzinomzelllinien Cal33, FaDu, UT-SCC-5 und UT-SCC-14 durchgeführt. In Proliferationsassays und weiteren Zellkultur-experimenten wurde der Effekt des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 auf die Proliferation, die Phosphorylierung von AKT sowie die Dauer des inhibitorischen Effektes untersucht. Das klonogene Zellüberleben wurde bestimmt, indem die Tumorzellen mit 0, 2, 4, 6 oder 8 Gy bestrahlt, 24 Stunden mit dem Inhibitor inkubiert und die entstandenen Kolonien nach 14 Tagen ausgezählt wurden. Eine deutliche Hemmung der Proliferation konnte an den Plattenepithelkarzinomzelllinien schon bei geringen Konzentrationen von Bay 80-6946 gezeigt werden. Die Zelllinie Cal33, welche eine bekannte PI3K Mutation besitzt, reagierte am empfindlichsten auf die Inhibition von PI3K, gefolgt von UT-SCC-14 und FaDu. Nach Inkubation mit 1 µM Bay 80 6946 konnte in keiner der drei Tumorlinien phosphoryliertes AKT nachgewiesen werden. Die Dauer der Inhibition hielt allerdings nur für die Dauer der Inkubation mit Bay 80-6946 an. Das klonogene Zellüberleben nach Bestrahlung wurde durch die Behandlung mit dem Inhibitor nicht signifikant verändert. 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Die Wirksamkeit von Bay 80-6946 wurde in einer Gruppe von neun verschiedenen Kopf-Hals-Tumorlinien sowie zwei NSCLC-Tumorlinien untersucht (A549, Cal33, FaDu, GLF, H460, SAS, SAT, UT-SCC-5, UT-SCC-8, UT-SCC-14 und XF354). Experimenteller Endpunkt war die Tumorwachstumsverzögerung. Bay 80-6946 wurde insgesamt fünfmal im Abstand von 48 Stunden in einer Konzentration von 20 mg/kg KG intravenös injiziert. Die Behandlung begann bei einem Tumordurchmesser von 7 mm. In den drei Tumorlinien Cal33, FaDu und UT-SCC-5 wurde Bay 80-6946 zusätzlich zur Monotherapie auch in Kombination mit fraktionierter Bestrahlung untersucht. Diese Tumormodelle wurden ausgewählt, da sie die intertumorale Heterogenität im Ansprechen auf die alleinige PI3K-Inhibition widerspiegeln. Die Tiere wurden mit 5 x 2 Gy täglich (Gesamtdosis 10 Gy) bestrahlt. Bay 80-6946 wurde einmal wöchentlich in einer Konzentration von 20 mg/kg KG über einen Zeitraum von 29 Tagen verabreicht. Die Behandlung begann eine Woche vor der ersten Bestrahlungsfraktion. Aufgrund des verlängerten Gesamtbehandlungs-zeitraums begann die Behandlung bereits bei einem Tumordurchmesser von 4 mm. In allen Experimentalarmen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Tumoren entnommen und immunhistochemisch auf die radiobiologischen Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion untersucht. Hinsichtlich der Wirksamkeit von Bay 80-6946 auf unbehandelte Plattenepithelkarzinome lassen sich drei Gruppen abgrenzen: starkes Ansprechen bei Cal33, intermediäres Ansprechen (SAS, UT-SCC-8, SAT, FaDu) und fehlendes Ansprechen (XF354, GLF, UT SCC-5, UT-SCC-14). Die NSCLC-Modelle A549 und H460 sprachen moderat auf Bay 80 6946 an. Bei der Kombinationstherapie von Bay 80-6946 mit fraktionierter Bestrahlung deutet sich bei Cal33 ein additiver und bei FaDu ein supraadditiver Effekt an. Bei UT-SCC-5 war in der Kombinationstherapie kein signifikanter Effekt auf das Tumorwachstum nachweisbar. Die immunhistochemischen Analysen zeigten in allen drei Tumorlinien weder bei der Mono- noch bei der Kombinationstherapie einen Einfluss des Inhibitors auf die Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion im Vergleich zur Kontrolle. Schlussfolgerung Die in einem Panel von Experimentaltumoren gewonnen Daten unterstützen derzeit nicht den Einsatz von pAKT als Biomarker, um das Ansprechen auf eine fraktionierte Strahlentherapie vorherzusagen. Vielmehr scheinen die gewonnenen Ergebnisse im Einklang zu den kontroversen und teilweise inkonsistenten Daten anderer Arbeitsgruppen zu stehen. Somit sind trotz klarer radiobiologischer Rationale weitere methodische und translationale Untersuchungen zum potenziellen Stellenwert des AKT-Signalweges als prognostischer Biomarker für die Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren notwendig. Durch die Kombination einer fraktionierten Strahlentherapie mit einem selektiven PI3K-Inhibitior konnte in der vorliegenden experimentellen Arbeit ein deutlicher Effekt auf die Tumorwachstumsverzögerung von Kopf-Hals-Tumoren gezeigt werden. Das Ausmaß des Ansprechens unterschied sich jedoch zwischen den drei untersuchten Tumorlinien und wirft die Frage nach der Ursache dieser Variabilität auf. Vor dem Einsatz eines PI3K-Inhibitors unter fraktionierter Strahlentherapie sollte in weiteren Experimenten der zugrundeliegende Mechanismus der Strahlensensibilisierung geklärt werden. Als zentrale Mechanismen sollten dabei vertiefend der Einfluss der selektiven PI3K-Inhibition auf das Tumormikromilieu sowie die Beteiligung des PI3K-Inhibitors an der Reparatur strahleninduzierter Schäden untersucht werden.

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Au sein d’une tumeur des régions hypoxiques se forment ce qui conduit à l’activation du facteur de transcription HIF1. HIF1, composé des deux protéines HIF1a et HIF1b, permet l’adaptation des cellules à des faibles concentrations d’oxygène en activant la transcription de gène cible. Un de ces gènes est celui codant pour la lysyl oxydase (LOX). Cette enzyme structure la matrice extracellulaire et est impliquée dans la tumorigénèse. Pour comprendre les liens entre LOX et HIF1a, nous avons modulé leurs expressions dans des lignées humaines de carcinome du côlon. En condition hypoxique, HIF1a contrôle l’expression de LOX et réciproquement, LOX régule la synthèse protéique d’HIF1a via l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT. Nous avons donc mis en évidence l’existence d’une boucle de régulation positive entre LOX et HIF1 en conditions hypoxique. Sachant que ces deux protéines sont des acteurs majeurs de la progression tumorale, nous avons cherché à comprendre le rôle de cette régulation mutuelle dans ce processus. Nos résultats démontrent que l’activité enzymatique de LOX promeut la croissance tumorale in vitro et in vivo et que son action est potentialisée par la présence de son partenaire HIF1a. De plus, LOX et HIF1a agissent en synergie afin d’augmenter la potentiel métastatiques des cellules tumorale de côlon in vitro. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence l’existence d’une boucle de régulation entre HIF1a et LOX qui est critique dans la progression tumorale et semble également être impliquée dans le processus métastatiques / The microenvironment of solid tumors is exposed to hypoxic conditions which lead to the activation of Hypoxia‐Inducible Factor 1 (HIF1). HIF1, composed by a heterodimer of HIF1a and HIF1b protein, is a key transcription factor involved in cellular adaptation to changes in oxygen level, inducing the expression of several transcriptional targets such as Lysyl Oxidase (LOX). LOX is an amine oxidase that catalyzes crosslinking of fibrillar collagens and elastin in the extracellular matrix. Furthermore, LOX is implied in tumor progression. To clarify, the link between LOX and HIF1a, their expression were modulated in human colorectal carcinoma cell lines. We pointed out that besides HIF1‐dependant regulation of LOX, LOX can also act on the HIF1 pathway under hypoxic conditions. Indeed, LOX enzymatic activity upregulates HIF1a protein synthesis, and this action is mediated by the PI3K/AKT pathway. Thus, these results emphasize the existence of a regulation loop between HIF‐1a and LOX, which represent two main actors of tumoral progression. Thus, we wanted to determine the implication of this amplification loop in tumor progression. Our results show that LOX enzymatic activity increase tumor growth in vitro and in vivo, and this role is partially dependant of its partner HIF1a. Furthermore, we established that that LOX and HIF1a act in synergy to foster metastatic potential in colorectal carcinoma cell lines. Taken together, our results demonstrate a regulation loop between LOX and HIF1a with is critical for tumor progression and metastasis formation

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass die Serumkonzentration des insulinähnlichen Wachstumsfaktorbindungsproteins-2 (IGFBP-2) bei Krebserkrankungen, die mit dem Verlust des Tumorsuppressorgens PTEN einhergehen, erhöht ist und daher möglicherweise einen Marker für den PTEN-Status und die Aktivität des PI3K/AKT/mTOR-Signalweges darstellt. Schmid et al. haben 2014 einen Patienten mit PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom (PHTS) mit einer heterozygoten PTEN-Keimbahndeletion und massiver Lipomatose beschrieben, bei dem erhöhte IGFBP-2 Serumspiegel gemessen wurden. Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren, ob PTEN-defiziente Lipomzellen des Patienten im Vergleich zu Kontrollfettzellen mehr IGFBP-2 produzieren, sowie den Einfluss verschiedener pharmakologischer Inhibitoren des AKT/PI3K/mTOR - und des MAPK- Signalwegs auf die IGFBP-2 Produktion zu untersuchen. In der PTEN-defizienten Lipomzellkultur, gewonnen aus reseziertem Lipomgewebe des Patienten, wurden vergleichbare Mengen an IGFBP-2 wie in den nicht PTEN-defizienten Kontrollzellen gefunden. Die pharmakologische Hemmung der PI3K und AKT bewirkten eine signifikante Senkung der IGFBP-2 Expression und Sekretion, wohingegen sich bei Hemmung der MEK und des mTORC1 keine Effekte zeigten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine heterozygote PTEN-Deletion in Lipomzellen nicht zu einer erhöhten IGFBP-2 Produktion führt und daher die erhöhten Serumspiegel des Patienten nicht darauf zurückzuführen sind. Des Weiteren bestätigen die in vitro Ergebnisse die klinische Beobachtung, dass unter der Therapie mit dem mTORC1-Inhibitor Rapamycin die IGFBP-2 Serumspiegel des Patienten nicht zurückgingen. Möglicherweise stellt IGFBP-2 jedoch einen geeigneten Verlaufsmarker für eine Therapie mit PI3K- oder AKT-Inhibitoren dar.

Le comportement et le devenir des lymphocytes T (LT) est conditionné par l’intégration de nombreux signaux solubles et cellulaires. Lorsque les LT ne sont pas stimulés, les facteurs de transcription FoxO orchestrent un réseau moléculaire important participant au maintien de la quiescence et à la capacité migratoire des LT. Longtemps considéré comme un état par défaut, le maintien des LT dans cet état quiescent est hautement régulé par un ensemble de signaux parmi lesquels la signalisation via le récepteur à l’interleukine 7 (IL7) et le récepteur à l’antigène (TCR) activé par des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) chargées avec des peptides du soi. Etonnamment, ces mêmes signaux sont nécessaires pour induire l’entrée des cellules dans le cycle cellulaire. L’inhibition de la prolifération des LT est donc un mécanisme actif qui peut être levé par des signaux externes. Le mécanisme moléculaire permettant le maintien de cet état quiescent reste très peu décrit. Mon projet de thèse a consisté à étudier les conséquences fonctionnelles de l’expression de Fam65b, une nouvelle cible transcriptionnelle de FoxO, sur la prolifération. Au cours de mon travail, j’ai montré que dans des cellules transformées, ayant donc perdu la capacité de réguler leur prolifération, l’expression forcée de Fam65b perturbe la mise en place du fuseau mitotique, induisant un arrêt en phase G 2 /M et la mort des cellules. Au cours de ce processus, Fam65b agit avec deux partenaires connus pour leur implication dans le cycle cellulaire, l’histone déacétylase 6 (HDAC6) et la protéine d’échafaudage 14-3-3. J’ai également pu établir que, dans les LT primaires humains, Fam65b est un facteur de quiescence. En effet, l’engagement du TCR induit une diminution d’expression de Fam65b et le maintien de son expression bloque la prolifération des LT, suggérant que l’inhibition de son expression est un pré-requis à la prolifération. Inversement, l’inhibition de l’expression de Fam65b dans des LT naïfs diminue leur seuil d’activation. L’ensemble de ces résultats désigne donc Fam65b comme une nouvelle cible pour le contrôle de la prolifération des cellules primaires et transformées. Nous avons également développé au laboratoire un modèle murin invalidé pour Fam65b dans le lignage T afin d’étudier son rôle dans un modèle plus intégré. J’ai pu initier l’analyse du phénotype de ces souris en l’absence de toute stimulation. L’ensemble de ces travaux, en complément de ceux précédemment obtenus au laboratoire, laissent apparaître Fam65b comme un nouvel effecteur de FoxO capable d’interagir avec divers partenaires afin de contrôler conjointement des fonctions cellulaires majeures. / T cell fate is conditioned by the integration of many soluble and cellular signals. When T cells are not stimulated, FoxO transcription factors orchestrate an important molecular network involved in maintaining the quiescent state and migratory ability of the cells. Considered as a "default" state, it is now known that maintenance of T cell quiescence is a process highly regulated by a set of signals including IL7 signaling and sustained contact with MHC molecules presenting self-peptides. Surprisingly, these same signals are required to induce entry of cells into the cell cycle. Inhibition of T cell proliferation is an active mechanism that can be lifted by external signals. The molecular mechanism maintaining this quiescent state is poorly described. My thesis project was studying the functional consequences of Fam65b expression, a new transcriptional target of FoxO, on proliferation. I showed that, in transformed cells, that have lost the ability to regulate their proliferation, forced expression of Fam65b disrupts the establishment of the mitotic spindle, inducing an arrest in G 2 /M phase and cell death. During this process, Fam65b acts with two partners, known to be involved in the cell cycle process, the histone deacetylase HDAC6 and the 14-3-3 protein scaffold. I have also been able to establish that in human primary T cell, Fam65b is a quiescence factor. Indeed, the TCR stimulation induces a reduction of Fam65b expression and maintaining its expression blocks the proliferation of T cells, suggesting that inhibition of Fam65b expression is a prerequisite for proliferation. Conversely, inhibition of Fam65b expression in naive T cells reduces their activation threshold. Altogether these results show that Fam65b is a new target for the control of the proliferation of primary and transformed cells. We have also developed, in the laboratory, a mouse model invalidated for Fam65b in T cell lineage. I initiated the phenotype analysis of these mice in the absence of any stimulation. This work, in addition to the previous results obtained in the laboratory, reveal that Fam65b is a new effector of FoxO factors, able to interact with various partners to jointly control major cellular functions.

La plupart des cellules du système immunitaire sont des cellules sécrétrices capables de libérer des molécules immuno-modulatrices en réponse à des stimuli variés. Cette sécrétion régulée qui permet l’orchestration de la réponse immunitaire et inflammatoire est assurée grâce aux organites apparentés aux lysosomes (LRO) qui vont contenir les molécules nécessaires à la fonctionnalité des cellules immunes. On retrouve par exemple les granules lytiques des lymphocytes T cytotoxiques qui permettent à ces cellules d’effectuer leurs fonctions lytiques ou encore les granules de sécrétion des mastocytes qui contiennent les médiateurs de l’inflammation. Le transport et l’exocytose des LRO impliquent une machinerie commune et conservée. C’est notamment le cas de la petite GTPase Rab27 qui joue un rôle central dans le transport et la sécrétion de ces LRO. De précédentes études réalisées au sein de notre laboratoire ont pu mettre en évidence l’implication du complexe moléculaire Rab27a/Slp3/kinésine-1 dans le transport terminal des granules lytiques des lymphocytes T cytotoxiques chez l’homme. De plus, un modèle murin dont la chaîne lourde de la kinésine-1 est spécifiquement invalidée dans les cellules immunitaires a pu être généré. L’objectif de ma thèse a été dans un premier temps de caractériser le phénotype de ce modèle murin déficient pour la kinésine-1 puis d’analyser plus précisément l’impact de l’absence de la kinésine-1 sur la fonctionnalité des lymphocytes T cytotoxiques et mastocytes murins. Dans un premier temps nous avons pu montrer que les souris déficientes pour la kinésine-1 ont un phénotype comparable à celui des souris contrôles à l’état basal. Nous avons ensuite montré que l’absence de la kinésine-1 au sein des lymphocytes T cytotoxiques murins n’induit pas de défauts d’activation et de sécrétion des granules lytiques in vitro. Cependant les comportements des granules lytiques à la synapse immunologique semblent anormaux. Néanmoins après un test d’infection au LCMV, qui ne révèle aucunes différences entre les souris contrôles et déficientes en kinésine-1, nous en venons à la conclusion que des mécanismes compensateurs pourraient compenser l’absence de la kinésine-1 dans les lymphocytes T cytotoxiques chez la souris. Pour finir des études fonctionnelles réalisées au niveau des mastocytes murins nous ont permis de mettre en évidence l’implication de la kinésine-1 dans le mécanisme de transport des granules de sécrétion. En effet, l’absence de kinésine-1 conduit à des défauts de dégranulation des mastocytes in vitro mais aussi in vivo (souris moins sensibles aux chocs anaphylactiques). En revanche l’absence de kinésine-1 n’affecte pas les capacités d’activation et de sécrétion des cytokines des mastocytes. Enfin, nous avons pu caractériser le complexe moléculaire Rab27b/Slp3/kinésine-1 impliqué dans le transport des granules mastocytaires et avons pu constater que la formation de ce complexe était dépendante de la voie d’activation liée à la PI3K (Phospatidylinositol 3-kinase). Ce travail permet d’apporter de nouveaux éléments quant aux mécanismes gouvernant la sécrétion des granules mastocytaires et ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement des hypersensibilités de type 1 (dépendantes des IgE). / Most of immune cells are secretory cells capable of releasing immunomodulatory molecules in response to various stimuli. This regulated secretion, which allows the orchestration of the immune and inflammatory responses, is ensured by the lysosome-related organelles (LRO) which will contain the molecules necessary for the functionality of the immune cells. For example we found the lytic granules of cytotoxic T lymphocytes, which allow their lytic functions or the secretory granules of mast cells which contain the inflammatory mediators. The transport and exocytosis of LRO involves a common and conserved machinery. This is particularly the case of the small GTPase Rab27 which plays a central role in the transport and secretion of these LRO. Previous studies carried out in our laboratory have highlighted the involvement of the molecular complex Rab27a / Slp3 / kinesin-1 in the terminal transport of lytic granules of cytotoxic T lymphocytes in humans. In addition, a murine model in which the heavy chain of kinesin-1 is specifically invalidated in immune cells has been generated. The objective of my thesis was first to characterize the phenotype of this murine model deficient for kinesin-1, then to analyze more precisely the impact of kinesin-1 absence on the cytotoxic T lymphocyte and mast cell functionality. In a first step, we have been able to demonstrate that mice deficient for kinesin-1 have a phenotype comparable to the control mice in a basal state. We have then shown that the absence of kinesin-1 in murine cytotoxic T lymphocytes does not induce defects in activation and in lytic granules’ secretion in vitro. However, the behavior of the lytic granules at the immunological synapse seems abnormal. Nevertheless, after an infection essay with LCMV, which revealed no differences between control and kinesine-1-deficient mice, we conclude that compensatory mechanisms may complement the absence of kinesin-1 in mice. Finally, functional studies carried out on murine mast cells have enabled us to demonstrate the involvement of kinesin-1 in the mechanism of granules’ transport. Indeed, the absence of kinesin-1 leads to degranulation defects in vitro and also in vivo (mice were less sensitive to anaphylactic shocks). On the other hand, the absence of kinesin-1 does not affect the activation and cytokines secretion capacities of mast cells. Finally, we were able to characterize the molecular complex Rab27b / Slp3 / kinesin-1 involved in mastocytic granules’ transport and found that this complex formation was dependent on the PI3K-related activation pathway (Phospatidylinositol 3-kinase). This work allows us to introduce new elements for the mechanisms governing the secretion of mast cell granules and thus opens new therapeutic perspectives for the treatment of type I hypersensitivity (IgE dependent).

Le VHC infecte les hépatocytes, cellules polarisées du foie. Le cycle de réplication du VHC est dépendant du métabolisme lipidique de la cellule hôte. Mais la relation entre VHC, polarité cellulaire et métabolisme lipidique est mal connue. Nous avons démontré que SHIP2 joue un rȏle important dans l’établissement de la polarité apicobasale des cellules épithéliales. La protéine core du HCV induit la perte de polarité cellulaire et diminue l’expression de la phosphatase SHIP2. La réintroduction de SHIP2 dans les cellules exprimant core restitue la polarité cellulaire et diminue l’expression de core. SHIP2 agit aussi sur l’accumulation et l’organisation des gouttelettes lipidiques qui sont des éléments cellulaires nécessaires à la réplication du VHC. Ces résultats montrent le rôle de SHIP2 dans la polarité cellulaire et le désigne comme une cible intéressante pour des recherches dans la lutte contre les infections du VHC. / HCV infects hepatocytes, polarized cells of the liver. HCV replication cycle is dependent on lipid metabolism of the host cell. But the relationship between HCV cell polarity and lipid metabolism is unknown. We demonstrated that SHIP2 plays an important role in establishment of the apicobasal epithelial cell polarity. The HCV core protein induces loss of cell polarity and decreases the expression of the phosphatase SHIP2. The reintroduction of SHIP2 in cells expressing core restores cell polarity and decreases the expression of core protein. SHIP2 also negatively affect lipid droplets, which are important for HCV replication. These results show the role of SHIP2 in cell polarity and designate it as an attractive target for research in the fight against HCV infection.