Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hypothyroidism is a pathology that can cause manifestations in several systems and tissues, including, changes in markers of endothelial functions, contribute to increase in incidence of cardiovascular disease. Furthermore, hypothyroidism has relation with the formation of reactive oxygen species (ROS), which has the ability to generate damage to the body. The extracellular adenine nucleotides ATP, ADP and the nucleoside adenosine regulating many physiological processes in the vascular system, including platelet aggregation, vascular tone and cardiac function. The flavonoids compounds such as quercetin exert multiple functions therapeutic highlighting its antioxidant, antiplatelet and anti-inflammatory capacity. In this context, the objective of this study was to investigate the effect of quercetin on the activity of enzymes that hydrolyze adenine nucleotides and nucleosides, on platelet aggregation and oxidative profile in platelet of adult male rats with hypothyroidism induced by methimazole 0.02 mg/mL. The animals received only methimazole 0.02 mg/ml for 30 days, and then began to receive also quercetin 10 and 25mg/kg for 60 days. The results showed that the activity of NTPDase with ATP as substrate was increased in hypothyroid group and treatment with quercetin 25mg/kg reversed this increase. No significant changes were observed in the hydrolysis of ADP. The activity of 5'-nucleotidase was reduced in the group of animals with hypothyroidism. No difference was observed in ADA activity in the group with hypothyroidism, but treatment with quercetin 25 mg/kg significantly reduced its activity. The results also indicated an increase in platelet aggregation in the hypothyroid group. The administration of quercetin 25 mg/kg reversed this increase. Furthermore, there was an increase in the levels of lipid peroxidation in hypothyroid rats and the treatment with quercetin reversed the increase. The activity of catalase (CAT) was decreased in rats with hypothyroidism, but treatment with quercetin reversed this decrease. These results suggested that quercetin is able of modulate the activity of ectoenzymes and decrease platelet aggregation in rats with hypothyroidism, which can contribute to the prevention of platelet changes, and consequently, vascular complications as well as providing protection against oxidative stress presented in hypothyroid state. / O hipotireoidismo é uma patologia que pode causar manifestações em diversos sistemas e tecidos, entre eles, alterações nos marcadores de funções endoteliais, contribuindo para uma maior incidência de doenças cardiovasculares. Além disso, o hipotireoidismo tem relação com a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais tem a capacidade de gerar danos ao organismo. Os nucleotídeos extracelulares ATP, ADP e o nucleosídeo adenosina regulam processos fisiológicos no sistema vascular, entre eles, a agregação plaquetária, o tônus vascular e as funções cardíacas. Os compostos flavonoides como a quercetina exercem várias funções terapêuticas destacando-se a sua capacidade antioxidante, antiagregante e anti-inflamatória. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi verificar o efeito da quercetina na atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos de adenina, na agregação plaquetária e no perfil oxidativo em plaquetas de ratos machos adultos com hipotireoidismo induzido por metimazol 0,02mg/mL. Os animais receberam somente metimazol 0,02 mg/mL durante 30 dias e em seguida passaram a receber também quercetina 10 e 25 mg/kg durante 60 dias. Os resultados obtidos demonstraram que a atividade da NTPDase com ATP como substrato foi aumentada no grupo hipotireoideo e o tratamento com quercetina 25 mg/kg reverteu esse aumento. Não foram observadas alterações significativas na hidrólise do ADP. Já a atividade da 5'-nucleotidase foi reduzida no grupo de animais com hipotireoidismo. Não foram observadas diferenças na atividade ADA no grupo com hipotireoidismo, mas o tratamento com quercetina 25 mg/kg reduziu significativamente sua atividade. Os resultados obtidos indicaram também um aumento na agregação plaquetária no grupo hipotireóideo. A administração de quercetina 25 mg/kg reverteu esse aumento. Além disso, houve um aumento nos níveis de peroxidação lipídica em ratos hipotireóideos e o tratamento com quercetina reverteu este aumento. A atividade da catalase (CAT) encontrou-se diminuída nos animais com hipotireoidismo, mas o tratamento com quercetina reverteu esse decréscimo. Estes resultados sugerem que a quercetina é capaz de modular a atividade das ectoenzimas e diminuir a agregação plaquetária em ratos com hipotireoidismo, o que pode contribuir para a prevenção de alterações plaquetárias, e consequentemente complicações vasculares, bem como proporcionar proteção contra o estresse oxidativo apresentado no estado hipotireoideo.

Hashimoto Thyroiditis (HT) or chronic lymphocytic thyroiditis is an autoimmune disease that causes the destruction of the thyroid gland by inflammatory infiltrates and consequently loss of function. This disease is spread worldwide and predominantly affects females. The consequences of alterations in its activity range from cretinism to the vascular changes. It is known that the enzymes ectonucleoside diphosphohydrolase triphosphate (E-NTPDase, EC 3.6.1.5, CD39), ecto-5'nucleotidase (EC 3.1.3.5, CD73) and adenosine deaminase (ADA, EC 3.5.4.4) are involved in regulating the immune response and thrombotic events, since they regulate extracellular levels of adenine nucleotides and nucleoside. Since HT patients have an autoimmune response and present microvascular changes, the objective of this study was to evaluate the influence of purinergic signaling in the regulation of microvascular dysfunction triggered by the disease determining the activity of the ectoenzymes involved in the metabolism of ATP in platelets from patients with HT in treatment with levothyroxine. Samples were collected from patients with HT treated with levothyroxine and from a control group. In this study we determined the activity of the enzymes E-NTPDase, ecto-5'-nucleotidase and E-ADA; detected the expression of the enzyme in platelets and E-NTPDase; and measured hormone levels of TSH and fT4 in patients with HT treated with levothyroxine and control group. Results obtained in the enzyme activity showed that patients with HT in hormone replacement with levothyroxine presented no significant changes when compared with the control group. In conclusion, levothyroxine used in patients with HT may reverse the effects of hypothyroidism when used regularly in these patients, while maintaining the enzyme activity in basal levels. / A Tireoidite de Hashimoto (TH) ou tireoidite linfocítica crônica é uma doença autoimune que causa a destruição da glândula tireóide por meio de infiltrados inflamatórios e consequente perda da função. Esta patologia encontra-se difundida mundialmente e acomete prevalentemente o sexo feminino. As consequências das alterações de sua atividade vão desde cretinismo à alterações vasculares. Sabe-se que as enzimas ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase (E-NTPDase; E.C. 3.6.1.5; CD39), ecto-5 nucleotidase (E.C.3.1.3.5; CD73) e adenosina desaminase (ADA; E.C.3.5.4.4) participam tanto da regulação da resposta imune quanto de eventos trombóticos, uma vez que regulam os níveis extracelulares dos nucleotídeos e nucleosídeo da adenina. Visto que, pacientes portadores da TH possuem uma resposta autoimune e também apresentam alterações microvasculares, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência da sinalização purinérgica na regulação das disfunções microvasculares desencadeadas pela doença, através da determinação da atividade de ectoenzimas envolvidas no metabolismo do ATP em plaquetas de pacientes com TH em tratamento com levotiroxina. Foram coletadas amostras de pacientes com TH em tratamento com levotiroxina e um grupo controle. Neste estudo determinamos a atividade das enzimas E-NTPDase, ecto-5 -nucleotidase e E-ADA, verificamos a expressão da enzima E-NTPDase em plaquetas e dosamos os níveis hormonais de TSH e fT4 em pacientes com TH em tratamento com levotiroxina, bem como do grupo controle. Os resultados obtidos na atividade das enzimas e na concentração dos nucleotídeos e nucleosídeo da adenina, não demonstraram alterações significativas quando comparamos os pacientes com TH em reposição hormonal com levotiroxina, com o grupo controle. Em conclusão, sugere-se que a levotiroxina usada em pacientes com TH pode reverter os efeitos do hipotireoidismo quando usada regularmente por estes pacientes, mantendo as atividades das enzimas em níveis basais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os transtornos psiquiátricos são um problema de saúde pública, ocupando cinco das dez principais causas de incapacitação no mundo. O transtorno bipolar (TB) é um transtorno de humor, segundo o DSM-IV (manual diagnóstico e estatístico de doenças mentais), o qual afeta cerca de 1% da população mundial. O TB do tipo I (TBI) é o mais frequente entre os TBs e é caracterizado pela presença de episódios maníacos ou mistos acompanhados por episódios depressivos. Assim como outros transtornos psiquiátricos, como a depressão, ansiedade e esquizofrenia, o TB representa um importante fator de risco cardiovascular, e pacientes com este transtorno apresentam mortalidade cardiovascular duas vezes maior que a população em geral. No entanto, os exatos mecanismos envolvidos nesta relação permanecem desconhecidos. Estudos sugerem o envolvimento da via L-arginina-óxido nitrico (NO) na patofisiologia do TB. O NO é responsável por diversas funções fisiológicas, incluindo a inibição da função plaquetária. A L-arginina, sua precursora, é transportada em plaquetas pelo carreador y+L, ativando a enzima NO sintase (NOS), a qual produz NO e e L-citrulina. Uma vez produzido, o NO ativa a enzima guanilato ciclase (GC), levando ao aumento dos níveis de guanosina monofosfato cíclica (GMPc). Adicionalmente, a L-arginina não é exclusivamente utilizada pela NOS, ela também pode ser metabolizada pela arginase e produzir L-ornitina e uréia. A biodisponibilidade do NO depende tanto de sua síntese como de sua degradação pelo estresse oxidativo ou pela inflamação. O objetivo deste estudo foi investigar detalhadamente a via L-arginina-NO-GMPc em plaquetas de pacientes com TBI, a expressão da arginase e outros marcadores de estresse oxidativo e inflamação. Vinte e oito pacientes com TB e dez indivíduos saudáveis foram incluídos no estudo. Nossos estudos mostraram uma redução da atividade da NOS em todos os grupos de pacientes bipolares (fases de eutimia, depressão e mania), quando comparados aos controles. Isto ocorreu na presença de concentrações normais do substrato e de seu transporte, e da expressão inalterada das isoformas eNOS e iNOS. A expressão da arginase II não diferiu entre os grupos estudados, indicando que a disponibilidade da L-arginina não está sendo desviada para o ciclo de uréia em plaquetas. A produção reduzida de GMPc foi observada mesmo com a expressão inalterada da GC. A atividade e marcadores de estresse oxidativo, avaliada através da quantificação da oxidação de proteínas e atividade da catalase, não foram modificadas em plaquetas de pacientes com TB, enquanto que a atividade da SOD estava aumentada em todas as fases. Os níveis séricos da proteína C-reativa (PCR), um marcador inflamatório, estão aumentados em pacientes maníacos, comparados aos controles. A reduzida produção de NO observada em plaquetas de pacientes bipolares pode ser um elo entre esta complexa associação entre TB e a doença cardiovascular. / Psychiatric disorders are public health problems, ocuppying five of ten major causes of incapacitation in the world. Bipolar disorder (BD) is a mood disorder, according to DMS-IV (Diagnostic and Statistic Manual of Mental Disease), which affects about 1% of world population. Bipolar I disorder (BDI) is the most frequent among the BDs and is characterized by the presence of manic or mixed episodes accompanied by depressive episodes. Similarly to other psychiatric disorders, such as depression, anxiety and schizophrenia, BD represents an important cardiovascular risk factor, and patients with this disorder have twice the cardiovascular mortality expected from general population. However, the exact mechanisms underlying this relationship remain unknown. Studies suggest the involvement of L-arginine-nitric oxide (NO) pathway on the pathogenesis of BD. NO is responsible for several physiological functions, including platelet function inhibition. L-arginine, its precursor, is transported into platelets by y+L carrier, and activates the enzyme NO synthase (NOS), which produces NO and L-citrulline. Once produced, NO activates the enzyme guanilyl cyclase (GC), increasing cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels. Additionally, L-arginine is not exclusively used by NOS, it can also be metabolized by arginase and produce L-ornithine and urea. NO bioavailability depends on both its synthesis and its degradation by oxidative stress and inflammation. The aim of this study was to investigate in detail L-arginine-NO-cGMP pathway in platelets of BDI patients, arginase expression and other markers that can affect NO bioavailability, such as oxidative stress and inflammation. Twenty eight patients with BD and ten healthy volunteers were included in this study. Our results showed decreased NOS activity in all groups of BDI patients (euthymic, depressive and manic episodes), when compared with controls. This occurred in the presence of normal substrate concentrations and unchanged expressions of eNOS and iNOS isoforms. Arginase II expression was not different between studied groups, indicating that L-arginine availability is not shifted to urea cycle in platelets. Decreased GMPc production was observed even in inalthered expression of GC. Activity and oxidative stress markers, evaluated through protein oxidation quantification and SOD and catalase activity, were not modified in platelets of BD patients while SOD activity was increased in all groups. Serum C-reactive protein (CRP) levels, an inflammatory marker, were higher in manic patients, compared with controls. The reduced production of NO observed in platelets of bipolar patients can be a link in this complex association between BD and cardiovascular disease.

Os antígenos plaquetários humanos são estruturas imunogênicas resultantes de alterações pontuais (SNP) que levam a substituição de um aminoácido a nível proteico. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência alélica e genotípica do sistema HPA-1 a -5 e -15 em doadores de plaquetas do Estado do RS e comparar as frequências alélicas encontradas com as observadas em outras populações. A genotipagem HPA foi realizada através do método de PCR-SSP. Um total de 201 doadores de plaquetas foram incluídos no estudo sendo 167 caucasoides e 34 não caucasoides. O alelo “a” foi o mais frequente nos sistemas HPA-1 a -5 em ambos grupos. O genótipo HPA-15AB foi predominante sobre os genótipos homozigotos para este sistema. O teste exato de Fisher revelou diferença estatisticamente significativa para o sistema HPA-5. Houve maior prevalência do alelo HPA-5B no grupo não caucasoide. Para o grupo caucasoide, o método de neighbor-joining e a PCA revelaram proximidade genética entre este grupo e as populações europeias. De um modo geral, concluímos que as frequências alélicas para os sistemas HPA-1 a -5 e -15 encontradas em nosso grupo caucasoide são similares às descritas em populações europeias. Estes dados corroboram a formação étnica da população do RS. A maior frequência do alelo HPA-5b encontrada no grupo não caucasoide de nosso estudo indica a possibilidade de alosensibilização para pacientes que recebem transfusões de plaquetas não compatibilizadas geneticamente. / Human platelet antigens are immunogenic structures that result from single nucleotide polymorphisms (SNPs) leading to single amino acid substitutions. The present study sought to determine the allele and genotype frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 in platelet donors from the state of Rio Grande do Sul, Brazil, and compare their allele frequencies to those observed in other populations. HPA genotyping was performed via the single specific primer-polymerase chain reaction (PCR-SSP) method. The study sample comprised 201 platelet donors (167 Caucasians and 34 non-Caucasians). Allele “a” was that most commonly found for HPA-1 through 5 in both groups. The HPA-15AB genotype predominated over homozygous genotypes of this system. Fisher’s exact test revealed statistically significant differences for the HPA-5 system, with a greater prevalence of the HPA- 5B allele in non-Caucasians. The neighbor-joining method and principal components analysis (PCA) revealed genetic proximity between the Caucasian group and European populations. We conclude that the allele frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 found in our Caucasian sample are similar to those reported for European populations. These findings corroborate the ethnic makeup of the population of Rio Grande do Sul. The higher frequency of the HPA-5b allele found in the non-Caucasian group of our sample suggests the possibility of allosensitization in patients who receive platelet transfusions from genetically incompatible donors.

Embora pacientes em terapia dupla antiplaquetária, composta de aspirina e um antagonista do receptor purinérgico P2Y12, tenham melhor prognóstico, eles ainda sofrem eventos trombóticos. Frequentemente, relaciona-se o nível de inibição plaquetária destes pacientes à ineficácia do tratamento. A reatividade plaquetária destes pacientes é uma função do nível do bloqueio do receptor P2Y12 e dos níveis de óxido nítrico e prostaciclina, importantes mediadores endoteliais, os quais agem em sinergia tripla aumentando o nível dos nucleotídeos cíclicos intraplaquetários mantendo a plaqueta em estado quiescente. Pacientes com disfunção endotelial têm menor disponibilidade destes mediadores e, consequentemente, menor inibição plaquetária in vivo. Propõe-se uma nova estratégia terapêutica composta de um inibidor do receptor purinérgico P2Y12, um ativador da enzima guanilato ciclase e um inibidor da fosfodiesterase, visando aumento dos nucleotídeos cíclicos, resultando em um forte efeito antiplaquetário localizado e tendo aplicação direta à pacientes com disfunção endotelial. / Disorders on the cardiovascular (CV) system are responsible for 31% of deaths worldwide. When inappropriately activated, platelets can cause myocardial infarction and stroke. Dual anti-platelet therapy (DAPT), composed of acetylsalicylic acid and a P2Y12 receptor blocker (clopidogrel, prasugrel, etc) is recommended for the prevention of recurrent CV events. Whilst DAPT is associated with an improvement in patient outcomes, thrombotic events do still occur. Platelet reactivity of patients under DAPT is a function of the level of P2Y12 receptor blockade and the levels of nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2), two important endothelium-derived autacoids. Therefore, a new antithrombotic therapy is proposed using soluble guanylate cyclase (sGC) allosteric modulators independent of NO and phosphodiesterase (PDE) inhibitors. Based on the results observed, the combination of a sGC activator and a PDE inhibitor given at low doses, in the presence of P2Y12 receptor blocker, could produce enhanced and localized platelet inhibition.

O período gestacional é bastante complexo e do ponto de vista vascular, ocorrem inúmeras alterações e adaptações no sistema circulatório, na funcionalidade plaquetária e no sistema endotelial com o objetivo de prevenir futuras complicações na mãe ou no concepto no momento do parto e após o nascimento. Além das alterações na circulação, nos processos vasculares e no sistema imune que são inerentes a este período, existem trabalhos demonstrando a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) as quais poderão desencadear um desequilíbrio do balanço redox. Os nucleotídeos de purina ATP, ADP, AMP, além do nucleosídeo adenosina participam da regulação vascular endotelial, de processos inflamatórios e do controle imunológico entre outras funções. O controle da produção e dos níveis intracelulares e extracelulares destes nucleotídeos e nucleosídeos são regulados por uma cascata enzimática, na qual, participam as enzimas E-NTPDases (Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfoidrolase), ENPPs (Ecto-Nucleotídeo Pirofosfatase Fosfodiesterase), 5`-Nucleotidase e adenosina desaminase. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade de enzimas envolvidas no processo hemostático de gestantes normais e com complicações, como a diabetes melito gestacional, a pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV, além de alguns parâmetros de estresse oxidativo e a agregação plaquetária durante o terceiro trimestre gestacional. Os resultados obtidos demonstram um aumento na atividade das enzimas NTPDase e 5`-nucleotidase em plaquetas de gestantes normais e com diabetes melito gestacional e pré-eclampsia comparadas com mulheres não grávidas. Ocorreu um aumento na atividade da enzima adenosina desaminase no soro de gestantes normais e com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV. Foi verificado, também, um aumento na atividade plaquetária, através da medida da agregação plaquetária, nas gestantes normais e com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV. Por outro lado, foi verificado um aumento na atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase, butirilcolinesterase e acetilcolinesterase juntamente com um aumento da peroxidação lipídica e uma redução dos níveis de ácido ascórbico e conteúdo sulfidrílico total. Além disso, não foi encontrada alteração significativa na análise de carbonilação protéica. Os resultados apresentados aqui sugerem que estas ectonucleotidases atuam na modulação de respostas vasculares, inflamatórias, imunes e circulatórias. Finalmente, foi detectado um aumento na atividade de enzimas antioxidantes e uma redução no conteúdo de moléculas antioxidantes, acompanhadas de um aumento no dano oxidativo aos lipídios de membrana o que remete à uma produção aumentada de espécies reativas e a uma tentativa do organismo em combater este desequilíbrio. / The pregnancy stage is very complex in the vascular point of view, occurring many changes and adjusts in the circulatory system, in the platelets functionality and in the endothelial system with the function of prevent future complications to the pregnant or to the newborn at the delivery and in the afterbirth. Besides the circulation changes, in the vascular processes and in the immune system that are inherent to this stage, there are studies that report the generation of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS), which could trigger an imbalance in the redox status. The purine nucleotides ATP, ADP, AMP and the nucleoside adenosine participate in the endothelial vascular regulation, inflammatory events, immune regulation, among other functions. The control of the production, the intracellular and extracellular levels of these nucleotides and nucleosides are regulated by an enzymatic cascade, in which, participate the enzymes E-NTPDases (ectonucleotise triphosphate diphosphohydrolases), E-NPPs (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases), 5’-nucleotidase and adenosine deaminase. The purpose of this study was to investigate the activity of enzymes involved in the hemostatic dynamics from normal pregnant and those with complications, such as the gestational diabetes mellitus, the pre-eclampsia and infected with the HIV. We also investigated some oxidative stress parameters and the platelets aggregation during the third gestational trimester. The results demonstrated an increase in the enzymes NTPDase and 5’-nucleotidase in platelets from normal pregnant and those with gestational diabetes mellitus and pre-eclampsia compared with not-pregnant women. It was also observed an increase in the enzyme adenosine deaminase activity in the serum from normal pregnant and those with gestational diabetes mellitus, pre-eclampsia and infected with the HIV. It was also verified an increase in the platelets activity through the measure of platelets aggregation in the normal pregnant, those with gestational diabetes mellitus, pre-eclampsia and infected with the HIV. Otherwise, it was verified an increase in the activity of the enzymes superoxide dismutase, catalase, butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase together with an increase in the lipid peroxidation and a decrease in the ascorbic acid and total sulphydryl groups content. Moreover, it was not observed any significant alteration in the protein carbonilation. The results showed here suggest that these ectonucleotidases participate in the modulation of vascular, inflammatory, immune and circulatory responses. Finally, it was detected an increase in the activity of antioxidant enzymes and a decrease in the antioxidant molecules content, together with an increase in the membrane lipids oxidative damage, which brings about an increased production of reactive species and a struggle of the body to combat this unbalance.

A uremia é uma desordem sistêmica que pode estar associada à disfunção plaquetária adquirida, levando a alterações na hemostasia primária. Vários modelos de interferência entre a uremia e a falha na hemostasia já foram propostos, porém o mecanismo exato é desconhecido, e a tendência ao sangramento parece ser de origem multifatorial. O teste do tempo de sangramento da mucosa oral (TSMO) pode ser utilizado na avaliação da hemostasia primária em animais. O fator de von Willebrand (FvW:Ag) normal ou aumentado, observado na maioria dos cães urêmicos, contribui para o diagnóstico de uma alteração plaquetária adquirida. A contagem de plaquetas e os testes de coagulação normais associados a um aumento no TSMO dão suporte à suspeita de um defeito qualitativo. O objetivo deste trabalho foi investigar possíveis anormalidades na hemostasia, buscando estabelecer uma relação entre os resultados de exames laboratoriais e alterações no tempo de sangramento. A hemostasia foi avaliada em quarenta cães azotêmicos, urêmicos ou não. O aumento no TSMO foi observado em 35% dos cães azotêmicos. O teste de Spearman demonstrou haver correlação entre o TSMO e os valores de creatinina, uréia e hematócrito, porém, o ajuste pela Regressão Linear Múltipla evidenciou o hematócrito como única variável associada com o TSMO. Valores de hematócrito abaixo do intervalo de referência para a espécie foram observados em 92,86% dos pacientes que apresentaram aumento no TSMO. Esses valores reduzidos parecem contribuir para a tendência ao sangramento, embora não possam ser considerados como fator determinante preditivo, uma vez que sua ocorrência nem sempre se associou com interferências no TSMO. / Uremia is a systemic disorder that may be associated with acquired platelet dysfunction, leading to changes in primary hemostasis. Several interference models between uremia and hemostasis failure have been proposed, but the exact mechanism is unknown, and bleeding tendencies seem to have a multifactorial origin. The buccal mucosal bleeding time (BMBT) test can be used in the assessment of primary hemostasis in animals. Normal or increased von Willebrand factor (vWF:Ag), observed in most uremic dogs, contributes to the diagnosis of an acquired platelet alteration. Normal platelet counts and coagulation tests associated with BMBT raises support the suspicion of a qualitative defect. The aim of this study was to investigate possible hemostasis abnormalities, trying to establish a relation between the results of laboratory tests and changes in bleeding times. Hemostasis was evaluated in forty azotemic dogs, uremic or not. Increase in BMBTs was observed in 35% of the azotemic dogs. Spearman’s test showed a correlation between BMBT and the values of creatinine, urea and hematocrit; however, adjusting for Multiple Linear Regression showed hematocrit as the only variable associated with BMBT. Hematocrit values below reference range for the species was observed in 92,86% of the patients showed an increase in BMBT. These low values appear to contribute to the tendency to bleed, although they cannot be considered as a preditive determining factor, since their occurrence is not always associated with interference in BMBT.

Os antígenos plaquetários humanos são estruturas imunogênicas resultantes de alterações pontuais (SNP) que levam a substituição de um aminoácido a nível proteico. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência alélica e genotípica do sistema HPA-1 a -5 e -15 em doadores de plaquetas do Estado do RS e comparar as frequências alélicas encontradas com as observadas em outras populações. A genotipagem HPA foi realizada através do método de PCR-SSP. Um total de 201 doadores de plaquetas foram incluídos no estudo sendo 167 caucasoides e 34 não caucasoides. O alelo “a” foi o mais frequente nos sistemas HPA-1 a -5 em ambos grupos. O genótipo HPA-15AB foi predominante sobre os genótipos homozigotos para este sistema. O teste exato de Fisher revelou diferença estatisticamente significativa para o sistema HPA-5. Houve maior prevalência do alelo HPA-5B no grupo não caucasoide. Para o grupo caucasoide, o método de neighbor-joining e a PCA revelaram proximidade genética entre este grupo e as populações europeias. De um modo geral, concluímos que as frequências alélicas para os sistemas HPA-1 a -5 e -15 encontradas em nosso grupo caucasoide são similares às descritas em populações europeias. Estes dados corroboram a formação étnica da população do RS. A maior frequência do alelo HPA-5b encontrada no grupo não caucasoide de nosso estudo indica a possibilidade de alosensibilização para pacientes que recebem transfusões de plaquetas não compatibilizadas geneticamente. / Human platelet antigens are immunogenic structures that result from single nucleotide polymorphisms (SNPs) leading to single amino acid substitutions. The present study sought to determine the allele and genotype frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 in platelet donors from the state of Rio Grande do Sul, Brazil, and compare their allele frequencies to those observed in other populations. HPA genotyping was performed via the single specific primer-polymerase chain reaction (PCR-SSP) method. The study sample comprised 201 platelet donors (167 Caucasians and 34 non-Caucasians). Allele “a” was that most commonly found for HPA-1 through 5 in both groups. The HPA-15AB genotype predominated over homozygous genotypes of this system. Fisher’s exact test revealed statistically significant differences for the HPA-5 system, with a greater prevalence of the HPA- 5B allele in non-Caucasians. The neighbor-joining method and principal components analysis (PCA) revealed genetic proximity between the Caucasian group and European populations. We conclude that the allele frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 found in our Caucasian sample are similar to those reported for European populations. These findings corroborate the ethnic makeup of the population of Rio Grande do Sul. The higher frequency of the HPA-5b allele found in the non-Caucasian group of our sample suggests the possibility of allosensitization in patients who receive platelet transfusions from genetically incompatible donors.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-05-30T13:47:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Colacao - GLEYDESZ.pdf: 1328379 bytes, checksum: bdbc54c225ef4bd1d59a4bd0b6bd2391 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T13:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Colacao - GLEYDESZ.pdf: 1328379 bytes, checksum: bdbc54c225ef4bd1d59a4bd0b6bd2391 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / A razão contagem de plaquetas/diâmetro longitudinal do baço (CP/DB) é um teste não invasivo desenvolvido para identificar varizes esofágicas em cirróticos. Hipertensão portal ocorre na forma hepatoesplênica da esquistossomose (EHE). Estes pacientes apresentam varizes esofágicas com risco de sangramento. Este estudo, de validação fase III, teve como objetivos: validar (artigo 1) a razão CP/DB e (artigo 2) um sistema de pontos como testes não invasivos para predição de varizes esofágicas na EHE. Oitenta e um pacientes com EHE realizaram endoscopia digestiva (EDA) para verificar a presença de varizes. Também realizaram ultrassonografia abdominal para aferição do diâmetro do baço, além de hemograma e testes hepáticos. Calculou-se a razão CP/DB para todos os pacientes. Foram observadas varizes em 63 pacientes (77,8%). Idade e sexo não foram significativamente diferentes entre pacientes com e sem varizes. Naqueles com varizes, a mediana da contagem de plaquetas (64.000/µL versus 129.500/µL, p=0,002) e a razão CP/DB (414,46 versus 878,16, p=0,003) foram significativamente menores, enquanto o diâmetro do baço (153,9 versus 147,1, p=0,026) foi significativamente maior. Utilizou-se uma curva ROC para avaliar o valor do ponto de corte da razão CP/DB. A razão CP/DB abaixo de 683,9 teve sensibilidade igual a 75,8% (IC 95%: 64,8 – 86,8), especificidade igual a 76,5% (IC 95%: 56,3 – 96,6), VPP igual a 92,2% (IC 95%: 84,8 – 99,5) e VPN igual a 46,5% (28 – 64,9). A acurácia da razão CP/DB, avaliada pela área sob a curva, foi igual a 0,74 (IC 95%: 0,622 – 0,827). O estudo revelou uma boa acurácia, porém o baixo VPN encontrado limita seu uso na prática clínica. O segundo artigo estudou 81 indivíduos suspeitos de apresentarem varizes esofágicas. Destes, 63 apresentaram varizes pelo padrão-ouro (endoscopia digestiva). As variáveis (categorizadas em “acima” e “abaixo” do normal) que apresentaram uma associação significante com o diagnóstico de varizes na análise univariada foram: contagem de plaquetas, diâmetro da veia esplênica, razão CP/DB, AST, APRI e INR. Em seguida, construiu-se um modelo de regressão logística multivariada. Permaneceram no modelo: AST, diâmetro da veia esplênica, contagem de plaquetas e INR. Criou-se um sistema de pontos, baseado nas variáveis que mostraram associação mais forte com varizes, para verificar em caráter exploratório o poder de discriminação. Para isso utilizou-se o coeficiente de regressão β (logaritmo do OR da variável) obtido das variáveis constantes no modelo multivariado final. O coeficiente β foi multiplicado por dez para obter-se uma pontuação de maior valor. Após o cálculo do escore total para cada paciente, aplicou-se a curva ROC. Foram encontrados sensibilidade de 83,02%, especificidade de 50,00%, VPP de 84,61% e VPN de 47,06%. O sistema mostrou boa sensibilidade, porém um baixo VPN. Isso torna o teste não adequado para o diagnóstico não invasivo das varizes, uma vez que mais da metade dos indivíduos com pontuação ˂ 12 poderia ter varizes que não seriam identificadas. Concluindo, ambos os testes mostraram-se promissores, no entanto a amostra foi pequena. Consideramos que se faz necessário realizar novos estudos com maior amostra para posterior validação a fim de estabelecer a eficácia dos testes na EHE. / The platelet count/spleen longitudinal diameter (PC/SD) ratio is a noninvasive test designed to identify esophageal varices in cirrhotic patients. Portal hypertension occurs in the hepatosplenic form of schistosomiasis (HSS). These patients present esophageal varices, with the risk of bleeding. The objectives of this phase III validation study were: to validate (Article 1) the PC/SD ratio, and (Article 2) a point system, as noninvasive tests to identify esophageal varices in HSS. A total of 81 patients with HSS underwent gastrointestinal endoscopy (GIE) to verify the presence of varicose veins. They also performed abdominal ultrasound in order to measure the diameter of the spleen, as well as a blood count and liver tests. The PC/SD ratio was calculated for all patients. Varices were observed in 63 patients (77.8%). Age and sex were not significantly different between patients with and without varices. Of those with varices, the median platelet count (64,000 / uL vs. 129,500 / uL, p = 0.002) and the PC/SD ratio (414.46 vs. 878.16, p = 0.003) were significantly lower, while the diameter of the spleen (153.9 versus 147.1, p = 0.026) was significantly higher. The ROC curve was used to evaluate the value of the cutoff point of the PC/SD ratio. A PC/SD ratio under 683.9 presented a sensitivity of 75.8% (95% CI: 64.8 to 86.8), a specificity of 76.5% (95% CI: 56.3 to 96, 6) a PPV of 92.2% (95% CI: 84.8 to 99.5) and an NPV of 46.5% (28 to 64.9). The accuracy of the PC/SD ratio, measured by the area under the curve, was 0.74 (95% CI: 0.622 to 0.827). While the study presented a high level of accuracy, the low NPV encountered would be a limiting factor for its use in clinical practice. The second article studied 81 individuals with suspected esophageal varices. Of these, 63 presented with varices using the gold standard method (gastrointestinal endoscopy). The variables (categorized as "above" and "below" normal) that demonstrated a significant association with the diagnosis of varices in the univariate analysis were: platelet count, splenic vein diameter, PC/SD ratio, AST, APRI and INR. A multivariate logistic regression model was then constructed, and the following items remained in the model: AST, splenic vein diameter, platelet count and INR. A point system was created, based on the variables that demonstrated the strongest association with varices, so as to verify an exploratory measure of the power of discrimination. For this we used the regression coefficient β (OR logarithm of the variable) obtained from the variables in the final multivariate model. The coefficient β is multiplied by ten to obtaina higher point score value. After calculating the total score for each patient, the ROC curve was applied. We encountered a sensitivity of 83.02%, a specificity of 50.00%, a PPV of 84.61% and an NPV of 47.06%. The system demonstrated good sensitivity, but a low NPV, which makes the test unsuitable for a noninvasive diagnosis of varices, since over half of the individuals with a score ˂12 could have varices, which were not identified. In conclusion, both tests have shown to be promising. However, the sample size was small. We believe that it is necessary to undertake further studies with a larger sample for further validation, in order to establish the efficacy of the tests in HSS.

Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes-Pires_MariaElisa_M.pdf: 587163 bytes, checksum: da754de9ce10b146c6cb1043d6b01555 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O LPS é capaz de ativar diferentes células, incluindo plaquetas, causando a liberação de mediadores inflamatórios como o óxido nítrico, interleucinas e espécies reativas de oxigênio (ROS). Vários trabalhos têm sido publicados sobre os efeitos do LPS sobre a reatividade plaquetária, mas os resultados ainda são conflitantes e os mecanismos envolvidos nas cascatas de sinalização desencadeada pelo LPS permanecem indefinidos. Portanto, utilizamos plaquetas isoladas de ratos tratados com LPS para investigar o papel das ROS na modulação da agregação plaquetária. Os ratos foram injetados com LPS (1 mg / kg, i.p.) e após, 2 a 72 h depois, a agregação plaquetária foi avaliada. As espécies reativas de oxigênio foram determinadas através da sonda 2', 7'-dichlorofluorescein diacetato (DCFH-DA). A agregação plaquetária induzida por ADP foi, tempo-dependente, reduzida 4 a 72 h após a injeção LPS, e este efeito inibitório foi aumentado quando plaquetas foram incubadas com PEG-SOD, PEG-catalase ou N-acetilcisteína (NAC). O tratamento de ratos com NAC (150 mg / kg i.p., 30 minutos após a injeção LPS) impediu a inibição da agregação plaquetária. A incubação de plaquetas de animais controle com LPS (100 e 300 µg/ml, 2 h) in vitro não afetou a produção de ROS. Nas plaquetas de ratos tratados com LPS, ativadas com ADP, a produção de ROS foi significativamente maior comparado com os ratos controle. Este aumento da produção de ROS foi significativamente reduzido quando as plaquetas foram incubadas in vitro com o inibidor da NADPH-oxidase (DPI). O tratamento de ratos com NAC impediu o aumento da produção de ROS pelo LPS. Como conclusão, a produção sistêmica de ROS em resposta ao tratamento in vivo de LPS desempenha um importante papel modulatório na agregação plaquetária. / Abstract: LPS activates different cells, including platelets, causing the release of inflammatory mediators like nitric oxide, interleukins and reactive oxygen species (ROS). It has been published several reports about the effects of LPS on platelet reactivity but the results are still conflicting and the mechanisms underlying the LPS signaling pathway remains unclear. Therefore, we have used platelets isolated from LPS-treated rats to investigate the role of ROS in modulating the platelet aggregation. Rats were injected with LPS (1 mg/kg, i.p.), and at 2 to 72 h thereafter, platelet aggregation was evaluated. Reactive-oxygen species was determined 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA). ADP-induced platelet aggregation was time-dependently reduced at 4 to 72 h after LPS injection, and this inhibitory effect was augmented when platelets were incubated with PEG-SOD, PEG-catalase or N-acetylcysteine (NAC). Treatment of rats with NAC (150 mg/kg i.p., 30 min after LPS injection) prevented the inhibition of platelet aggregation. Incubation of control platelets with LPS (100 and 300 µg/ml, 2 h) in vitro did not affect the ROS production. In ADP-activated platelets of LPS-treated rats, ROS production was significantly higher compared with control rats. This increased ROS production was significantly reduced when platelets were incubated in vitro with the NADPH-oxidase inhibitor (DPI). Treatment of rats with NAC prevented the increased ROS production by LPS. In conclusion, systemic or in situ ROS production in response to in vivo LPS treatment plays an important modulatory role on platelet aggregation. / Mestrado / Mestre em Farmacologia