Made available in DSpace on 2015-04-14T13:36:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 390131.pdf: 5578218 bytes, checksum: c77a182ad83015eba8c6cebefee0f9f5 (MD5) Previous issue date: 2007-01-24 / Introdu??o: A prote?na oligom?rica da matriz da cartilagem (COMP) ? uma glicoprote?na n?o-col?gena, pentam?rica, pertencente ? fam?lia das trombospondinas (TSPs). Participa de processos da estrutura??o da matriz extracelular, mobilidade celular e organiza??o do citoesqueleto. A express?o da COMP foi evidenciada na cartilagem e humor v?treo, e tamb?m em c?lulas musculares lisas e mesenquimais, incluindo sinovi?citos e fibroblastos da derme. A COMP atua na estrutura??o da cartilagem ao interagir com fibrilas de col?genos I e II. O processo de cicatriza??o p?s-infarto agudo do mioc?rdio (IAM), por sua vez, inclui alto teor de col?geno tipo I e preserva??o da matriz extracelular, sendo poss?vel a participa??o da COMP nesta circunst?ncia. Objetivo: Verificar se n?veis s?ricos de COMP, quando alterados, associam-se ? presen?a de doen?as reum?ticas prevalentes (artrite reumat?ide, osteoartrite) e de infarto agudo do mioc?rdio (IAM). Pacientes e M?todos: Neste estudo de caso-controle, os casos consistiram de pacientes com artrite reumat?ide (AR), osteoartrite (OA) e IAM. Os pacientes com AR e OA foram selecionados a partir de base de dados e biobanco autorizado com diagn?stico confirmado segundo os crit?rios do Col?gio Americano de Reumatologia. Os pacientes com IAM foram selecionados a partir de base de dados e biobanco autorizado, sendo o diagn?stico previamente confirmado por cardiologistas de acordo com crit?rios tradicionais. O grupocontrole consistiu de doadores de sangue selecionados consecutivamente, sem queixas reum?ticas ou cardiovasculares na anamnese efetuada pelo hemoterapeuta. A COMP foi dosada quantitativamente por imunoensaio enzim?tico. Um n?vel de signific?ncia de 5% foi considerado para valores P. Para estimar o grau de associa??o entre n?veis de COMP e doen?a, raz?es de chances ( odds ratios , OR) foram calculadas. A compara??o entre os grupos foi realizada com an?lise de vari?ncia. O desempenho diagn?stico da COMP nos grupos estudados foi apresentado atrav?s da sensibilidade, especificidade e raz?o de verossimilhan?a ( likelihood ratio , LR). Resultados: Foram estudados 269 indiv?duos (100 controles, 63 com AR, 40 com OA e 66 com IAM). A m?dia de idade nos grupos foi: controle = 48?6 anos; AR = 54?14 anos, OA = 65?9 anos e IAM = 58?10 anos (P<0,05 para os grupos IAM e OA em rela??o ao grupo controle e P>0,05 para o grupo AR em rela??o ao grupo controle). O sexo feminino predominou nos grupos AR e OA, e o masculino nos grupos controle e IAM. A maioria dos indiv?duos com AR e OA tinham menos de 10 anos de doen?a. Os n?veis m?dios de COMP ajustados para idade e sexo nos grupos controle, AR, OA e IAM foram respectivamente 7,3?0,5, 12,9?0,7, 13,1?1,1 e 3,0+0,6, com diferen?a significativa de todos os grupos de casos em rela??o ao grupo-controle (P<0,01). O ponto de corte que melhor discriminou os grupos AR e OA foi 12 U/L. Para o grupo IAM, o ponto de corte mais discriminativo foi 4 U/L. O desempenho da COMP na AR evidenciou especificidade de 95% (IC95% 88,7-98,4) e sensibilidade de 47,6% (IC95% 34,9-60,6). Quanto ? probabilidade de desfecho AR, o LR positivo foi moderado (9,5, IC95% 3,9-23,3). N?veis de COMP acima de 12 U/L se associaram fortemente ? presen?a de AR (OR 17,3, IC95% 5,7-55,7). O desempenho da COMP na OA evidenciou especificidade de 95% (IC95% 88,7-98,4), e sensibilidade de 37,5% (IC95% 22,7-54,2). O LR positivo foi moderado (7,5, IC95% 2,9- 19,3). N?veis de COMP acima de 12U/L se associaram fortemente ? presen?a do desfecho OA (OR 11,4, IC95% 3,4-40,2). O desempenho da COMP no IAM evidenciou especificidade de 82% (IC95% 73-89,0) e sensibilidade de 66,7% (IC95% 54-77,8). O LR positivo foi baixo (3,7, IC95% 2,4-5,8). N?veis de COMP abaixo de 4 U/L se associaram fortemente ? ocorr?ncia de IAM (OR 9,1, IC95% 4,2-20,1). Conclus?es: N?veis de COMP superiores a 12 U/L se associaram fortemente ? AR e OA, e conferiram alta especificidade no diagn?stico dessas doen?as. N?veis de COMP inferiores a 4 U/L se associaram definidamente com IAM, e conferiram moderada especificidade. N?veis de COMP superiores a 12U/L cursaram com moderada probabilidade de desfecho AR e OA. Como um todo, altera??es nos n?veis s?ricos de COMP, usando-se os referidos pontos de corte, discriminaram pacientes com AR, OA e IAM de controles sadios

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AntonioMUA_DISSERT.pdf: 1696201 bytes, checksum: e2516f76e3d7b85984f386475f859b2b (MD5) Previous issue date: 2010-03-16 / Tendo em vista a grande biodiversidade existente no litoral brasileiro, onde muitas esp?cies ainda s?o pouco conhecidas, inclusive sob o aspecto nutricional, e considerando que os moluscos bivalves se constituem em um recurso natural de boa aceita??o pela popula??o mundial, escolheu-se o molusco bivalve Anadara notabilis, por n?o ter sido encontrado na literatura nenhuma informa??o nutricional ou toxicol?gica sobre ele e devido seu tamanho ser bem maior que outras esp?cies de moluscos mais popularmente encontrados nessa regi?o. Foram determinados neste trabalho teores de umidade, cinzas, prote?nas, macro e microminerais, al?m de ?ons met?licos de import?ncia toxicol?gica. Todas as determina??es seguiram as Normas Anal?ticas do Instituto Adolfo Lutz. A determina??o de prote?na foi realizada pelo m?todo de Kjeldahl. Todos os ?ons met?licos foram determinados por espectroscopia de emiss?o ?tica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) descrito pela metodologia USEPA 6010C. Os resultados mostraram que a Anadara notabilis pode ser introduzida na alimenta??o dos seres humanos, tendo em vista sua riqueza mineral. Merecem destaque entre os macronutrientes o magn?sio e o f?sforo que apresentaram os respectivos valores em mg/kg 918,7 e 586,7. Com rela??o aos micronutrientes destacam-se o ferro presente com 586,7 mg/kg e o Zinco com 12,31 mg/kg. N?o foi encontrado ?ndice elevado de metais contaminantes para este molusco, o que impediria seu consumo, apenas o cromo esta 0,7 mg/kg acima do valor estabelecido pela legisla??o brasileira. Os resultados obtidos certamente ser?o muito ?teis em futuras pesquisas nutricionais e para constru??o de uma tabela brasileira de composi??o qu?mica de alimentos

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Catia Marques da Costa.pdf: 899456 bytes, checksum: b8d00f84cefd48cf338e385b27121da0 (MD5) Previous issue date: 2007-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Anaplasma marginale (Ricktsialles: Anaplasmataceae) is a ricketsial hemoparasite responsible for causing great economic losses in cattle from tropical and subtropical regions. The objectives of this work were to produce the recombinant membrane proteins AM254, VirB9 and VirB10 and to evaluate its possible antigenicity. The genes am254, virB9 and virB10 were submitted to various experiments and were , linked to pET47 (b) plasmid. After the certification of the recombinant plasmid (pET-47-am254, pET-47-virB9 and pET-47- virB10), it was transformed into E. coli Rosetta cells for expression. The recombinant proteins produced, were analyzed by Western blot assay where the reaction of the anti-histidin monoclonal antibody against rAM254 (47kDa), rVirB9 (31kDa) and rVirB10 (60kDa) was observed. After the confirmation of the production of recombinant proteins the indirect Enzyme-Linked Immnunosorbent Assay (ELISA) was standardized with sera previously confirmed by PCR and ELISA (rMSP1 and rMSP5). The averages of the optic densities (OD) of the positive sera were of 1.339; 1.288 and 1.240 and of the negative sera of 0.470, 0.324 and 0.414 for AM254, VirB9 and VirB10 respectively with significant difference to the level of 5% between positives and negatives for each recombinant protein. The study demonstrated that the proteins rAM 254, rVirB9 and rVirB10 of A. marginale are recognized by sera of bovines immunized by different Brazilian isolates of the ricketsia (homologous and heterologous), showing the antigenicity potential of these proteins. / Anaplasma marginale (Ricktsialles: Anaplasmataceae) ? uma riquetsia intraeritroc?tica, respons?vel por ocasionar grandes perdas econ?micas na pecu?ria bovina das regi?es tropical e sub-tropical. O objetivo desse trabalho foi produzir as prote?nas de membrana recombinantes AM254, VirB9 e VirB10 e avaliar sua poss?vel antigenicidade. Os genes am254, virB9 e virB10 foram submetidos a v?rios procedimentos experimentais at? serem ligados ao plasm?deo pET-47b(+). Ap?s a certifica??o do plasm?deo recombinante (pET-47bam254, pET-47b-virB9 e pET-47bvirB10) este foi transformado em E. coli Rosetta para express?o. As prote?nas recombinantes produzidas foram analisadas pelo ensaio Western blot onde foi observada a rea??o do anticorpo monoclonal anti-histidina contra rVirB9 (31kDa), rVirB10 (60kDa) e rAM254 (47kDa). Ap?s a confirma??o da produ??o das prote?nas recombinantes realizou-se a padroniza??o do ensaio de imunoadsor??o enzim?tica (ELISA) indireto com soros oriundos de sangue total previamente confirmados por PCR; os mesmos soros tamb?m foram testados por ELISA (rMSP1 e rMSP5). As m?dias das densidades ?pticas (DO) dos soros positivos foram de 1,339; 1,288 e 1,240 e dos soros negativos de 0,470, 0,324 e 0,414 para AM254, VirB9 e VirB10 respectivamente com diferen?a significativa ao n?vel de 5% entre positivos e negativos para cada prote?na recombinante. O estudo demonstrou que as prote?nas rAM 254, rVirB9 e rVirB10 de A. marginale s?o reconhecidas por soros de bovinos imunizados com diferentes isolados brasileiros da riqu?tsia (hom?logo e heter?logos), revelando o potencial antig?nico dessas prote?nas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451784.pdf: 974193 bytes, checksum: b53f42e8acb1653e7c655d1d1345a38b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Annexin V is an endogenous human protein Ca+2 dependent, with a molecular weight of 35.8 kDa, widely distributed intracellularly, with very high concentrations in the placenta and lower concentrations in endothelial cells, kidneys, myocardium, skeletal muscle, skin, red cells, platelets and monocytes. Annexin V binds preferably to phosphatidylserine, a phospholipid commonly present on inner leaflet of lipid bilayer, which during cell apoptosis is translocated to outer leaflet of cell membrane. Despite of Annexin V is a relatively large protein, it was shown early on that the protein can be internalized at sites of ischemic injury both in the heart and in the brain and cross the intact blood-brain barrier, being increasingly used as a tool to detect apoptosis in several diseases such as Alzheimer and Ischemia and in drug. Therefore, production of recombinant human Annexin V using recombinant DNA technique along with High Cell Density Culture and protein purification becomes applicable to commercialize it in Brazil, increasing and facilitating the access of pharmaceutical industries and research laboratories in purchase product. We developed a protocol to produce recombinant human annexin V in large scale, in which approximately 20 mg of recombinant protein was yielded from 3 g of E. coliBL21(DE3) wet cells. N-terminal amino acid sequencing and massspectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of therecombinant protein, as well as an apoptosis/necrosis in vitro detectionkit produced performed similarities with an imported commercialized kit in Brazil. / A Anexina V ? uma prote?na humana end?gena dependente de Ca+2, com peso molecular de 35,8 kDa, amplamente distribu?da intracelularmente em altas concentra??es na placenta e em concentra??es mais baixas nas c?lulas endoteliais, renais, mioc?rdicas, epiteliais, esquel?ticas musculares, eritr?citos, plaquetas e mon?citos. Apresenta como principal caracter?stica a capacidade de se ligar ? fosfatidilserina, um fosfolip?deo presente na camada interna da bicamada lip?dica, que durante a apoptose celular ? translocada para a camada externa da membrana celular. Apesar de ser uma prote?na de tamanho relativamente grande, a Anexina V apresentou a capacidade de penetrar em s?tios de inj?ria isqu?mica tanto mioc?rdica quanto cerebral, atravessando a Barreira Hemato-Encef?lica, sendo cada vez mais utilizada para dete??o de apoptose em diversas doen?as como Alzheimer e Isquemia e em monitoramento de drogas antic?ncer. Por esses motivos, se torna relevante a produ??o da prote?na Anexina V humana atrav?s da t?cnica do DNA recombinante em larga escala para que possa ser comercializada no Brasil, aumentando e facilitando o acesso de laborat?rios de pesquisa e ind?strias farmac?uticas na aquisi??o deste produto. Desenvolvemos um protocolo para cultivoem biorreator de grandes quantidades de Anexina V recombinante, no qual aproximadamente 20 mg de prote?na recombinante podem ser obtidos a partir de 3 g de c?lula ?mida de E. coli BL21(DE3). As an?lises porsequenciamento N-terminal de amino?cidos e espectrometria de massas proveram evid?ncias para a identidade e pureza da prote?na recombinante, assim como um desenvolvimento de um kit para marca??o de apoptose in vitro apresentou muita semelhan?a com outro kit importado j? comercializado no Brasil.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451788.pdf: 1287455 bytes, checksum: d1990d71c198ca3db981a675db0e192b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a major hematopoietic cytokine involved in the immune defense against infectious agents, stimulating and regulating the proliferation, survival and differentiation of neutrophils precursor cells in the bone marrow. The G-CSF molecule has a 174 amino acids sequence, with a molecular weight of approximately 18.8 kDa. As a strategy for neutropenia prevention, G-CSF (or filgrastim) has been successfully used in cancer patients whose treatment requires high doses of chemotherapy, in both adults and children. Moreover, this biopharmaceutical may be used to strengthen the immune system in patients with HIV, pneumonia, infections resulting from diabetes, leukemia and febrile neutropenia. Currently, filgrastim is not produced in Brazil, which obligates the government to import this medicine. Due to its wide clinical application, the large scale production of G-CSF is required to supply the demand of national market. In this work, a protocol to obtain this protein was developed using overexpression and cultivation in a bioreactor, solubilization and purification of recombinant G-CSF. The protein was expressed in Escherichia coli host cells C41(DE3) cultures grown in bioreactor using a fed-batch strategy. The expression of the recombinant protein was induced by IPTG. A linear ascending feeding strategy permitted high plasmid stability, low accumulation of acetate in the culture medium, a biomass of approximately 31 g/ L and high expression levels of the protein in the form of inclusion bodies which were solubilized using 2 M urea and alkaline pH. The recombinant protein was purified and yielded approximately 1.22 mg of homogeneous recombinant protein per gram of wet cells, corresponding to a volumetric yield of 151.5 mg of rhG-CSF per liter of culture medium. A mass spectrometry analysis was performed, confirming the identity of the recombinant protein. Our work shows a simple and effective strategy to obtain recombinant hG-CSF, stimulating and encouraging a future production of a national biosimilar. / O fator estimulador de col?nias de granul?citos (G-CSF) ? uma das principais citocinas hematopoi?ticas envolvidas na defesa do sistema imune contra agentes infecciosos, estimulando e regulando a prolifera??o, sobreviv?ncia e diferencia??o das c?lulas precursoras de neutr?filos na medula ?ssea. ? uma mol?cula que possui uma sequ?ncia de 174 amino?cidos, com peso molecular de aproximadamente 18,8 kDa. Como estrat?gia de preven??o da neutropenia, o G-CSF (ou filgrastima) ? utilizado clinicamente com sucesso em pacientes com c?ncer, cujo tratamento requer altas doses de quimioterapia, tanto em adultos como em crian?as. Al?m disso, o G-CSF pode ser utilizado para refor?ar o sistema imunol?gico em pacientes com HIV, pneumonia, infec??es decorrentes da diabetes, leucemia e neutropenia febril. Atualmente, a filgrastima n?o ? produzida no Brasil, consequentemente, todo medicamento adquirido pelo governo ? importado. Tendo em vista sua ampla aplica??o cl?nica, a produ??o em larga escala do G-CSF se faz necess?ria para suprir a demanda do mercado nacional e diminuir os custos com importa??o desse biof?rmaco. Neste trabalho um protocolo para a produ??o desta prote?na foi desenvolvido, utilizando t?cnicas de DNA recombinante por meio de experimentos de superexpress?o e cultivo em biorreator, solubiliza??o e purifica??o da G-CSF recombinante. A prote?na foi expressa em c?lulas Escherichia coli C41(DE3) em cultivos de batelada alimentada em biorreactor, utilizando indu??o com IPTG e uma estrat?gia de alimenta??o linear ascendente, que nos permitiu obter um alto percentual de estabilidade plasmidial, baixo ac?mulo de acetato no meio de cultivo, uma biomassa de aproximadamente 31 g/ L e elevados n?veis de express?o da prote?na em forma de corpos de inclus?o, que foram solubilizados utilizando ureia 2 M e pH alcalino. A prote?na recombinante foi purificada obtendo-se aproximadamente 1,22 mg de prote?na recombinante homog?nea por grama de c?lulas ?mida, correspondendo a um rendimento volum?trico de 151,5 mg de rhG-CSF por litro de meio de cultura. Uma an?lise por espectrometria de massa tamb?m foi realizada, confirmando a identidade da prote?na recombinante. Nosso trabalho mostra uma estrat?gia simples e eficaz para obter hG-CSF recombinante, contribuindo e estimulando a futura produ??o de um biossimilar nacional.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 458474.pdf: 1757493 bytes, checksum: c5379d3dddf546f5888748177b083560 (MD5) Previous issue date: 2014-03-07 / Acute viral bronchiolitis is the most common respiratory illness in children in the first years of life and at least half of patients are diagnosed with respiratory tract infection by viruses such as Respiratory Syncytial Virus (RSV). Because RSV is extremely common disease it generates large number of hospitalizations and large costs to health systems. The RSV Fusion (F) Protein is essential for the infective cycle of the virus. Neutrophils and their products are present in the airways of RSV-infected patients who developed increased lung disease due to viral infection. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are formed by the release of the inner content of neutrophils (proteins from granules and DNA) in the extracellular space in response to different stimuli. They are essential to prevent the spread of microorganisms, which are killed by antimicrobial proteins that are anchored in networks of DNA, such as elastase and myeloperoxidase. The objective of this work is to characterize the effect of the RSV F protein on the generation of NETs. The F protein was capable of inducing the formation of NETs in vitro in a dose-dependent way with co-expression of neutrophil elastase and myeloperoxidase. The production of NETs in response to F protein was mediated by the TLR-4-receptor and was dependent on ROS production, p38 and ERK MAPK. Together, these data provide evidence that support the activation of specific signaling pathways by the F protein to induce the production of NETs. Excessive production of NETs can aggravate the inflammatory symptoms induced by infection with RSV. / A bronquiolite viral aguda ? a doen?a respirat?ria mais frequente em crian?as nos primeiros anos de vida, sendo que ao menos a metade dos pacientes ? diagnosticado com infec??o respirat?ria por v?rus como o V?rus Sincicial Respirat?rio (RSV). Por ser uma doen?a extremamente comum gera grande n?mero de interna??es e grandes custos aos sistemas de sa?de. A prote?na de fus?o (F) do RSV ? essencial para o ciclo infectivo do v?rus. Neutr?filos e seus produtos est?o presentes nas vias a?reas de pacientes infectados por RSV que desenvolveram doen?a pulmonar aumentada devido a infec??o viral. As Redes Extracelulares de Neutr?filos (NETs) s?o formadas pela libera??o do conte?do nuclear dos neutr?filos no espa?o extracelular em resposta a diferentes est?mulos, sejam patog?nicos ou n?o. Elas s?o fundamentais para impedir a dissemina??o de microrganismos, que s?o mortos pelas prote?nas antimicrobianas que ficam ancoradas nas redes de DNA, como elastase e mieloperoxidase. O objetivo desta disserta??o ? caracterizar o efeito da prote?na F do RSV sobre a gera??o de NETs. A prote?na F foi capaz de induzir a forma??o de NETs in vitro de forma dose-dependente e com a co-express?o de elastase neutrof?lica e mieloperoxidase. A produ??o de NETs pela prote?na F foi mediada pelo TLR-4, e dependente da produ??o de ROS e de ERK-p38 MAPK. Juntos, estes dados fornecem evid?ncias que suportam a ativa??o de vias de sinaliza??o espec?ficas pela prote?na F para induzir a produ??o de NETs. A produ??o excessiva de NETs pode agravar os sintomas inflamat?rios induzidos pela infec??o com RSV.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459170.pdf: 2176701 bytes, checksum: a35f9eb08768c0d90b70f0dca32cbe46 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / The mycobacterial DNA-binding protein 2 (MDP2) of Mycobacterium tuberculosis is a small, basic protein known to bind to DNA in a non-specific manner and to anchor the nucleoid to the plasma membrane, promoting its unpacking. Motivated by a prior intrinsic disorder pre-diction in silico, we have used a complementary set of techniques to characterize this pro-tein, such as heat and chemical stability, gel filtration, limited proteolysis and electrophoret-ic mobility. Our results suggest that the MDP2 is structurally disordered, since it (1) was pre-dicted to be an IDP, having 86 % of its structure disordered; (2) resisted to denaturation in-duced by boiling temperature and to the chemical thrichloroacetic acid (TCA); (3) migrated anomalously on SDS-PAGE, appearing to be 1.4-fold higher its calculated molecular weight; and (4) was highly sensitive to proteolysis performed by proteinase K in comparison to glob-ular proteins. We also accomplished two experiments to determine the quaternary structure of the MDP2, such as gel-filtration and glutaraldehyde crosslinking. These two experiments showed that the protein has a tendency of self-aggregation, forming large clusters of pro-tein. We also performed the site-directed mutagenesis by allelic exchange in the hns gene, in order to develop a M. tuberculosis strain lacking the protein MDP2. The result of this knock-out showed that the hns gene is not essential for the survival of the mycobacteria, confirm-ing previous results performed by transposon mutagenesis. Combined with previous results related to MDP2 from other works, we speculate that this protein uses its highly disorder N-terminal region to bind to DNA through its KAAK and PAKK sequences in a non-specific man-ner. Thereby the MDP2 may act as a promiscuous protein inside the cell, binding to different regions of nucleoid by forming large clusters of proteins, in order to perform the DNA un-packing and to regulate several genes of the mycobacteria. We hope this work may contrib-ute to a better understanding of the mycobacterial metabolism, since the M. tuberculosis still stands a major global threat. / A prote?na micobacteriana ligadora de DNA 2 (MDP2) de Mycobacterium tuberculosis ? uma prote?na pequena e de car?ter b?sico, conhecida por se ligar ao DNA de uma forma n?o es-pec?fica e de ancorar o nucle?ide ? membrana plasm?tica promovendo o seu desempacota-mento. Motivados por uma predi??o de desordem intr?nseca in silico pr?via, n?s usamos um conjunto de t?cnicas complementares para caracterizar esta prote?na, tais como determina-??o da estabilidade ao calor e a desnaturantes qu?micos, gel filtra??o, prote?lise limitada e mobilidade eletrofor?tica. Nossos resultados sugerem que a MDP2 ? estruturalmente de-sordenada, uma vez que ela (1) foi predita por ser uma prote?na intrinsecamente desorde-nada (IDP), possuindo 86 % da sua estrutura desordenada; resistiu ? desnatura??o induzida por temperatura de fervura e pela a??o qu?mica do ?cido tricloroac?tico (TCA); (3) migrou anomalamente em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), aparentando ser 1,4 vezes maior que o seu peso molecular calculado; e (4) foi altamente sens?vel ? prote?lise realizada pela protei-nase K, em compara??o ?s prote?nas globulares. N?s tamb?m realizamos dois experimentos para determinar a estrutura quatern?ria da prote?na, como a gel filtra??o e o crosslinking por glutaralde?do. Estes dois experimentos mostraram que a prote?na tem uma tend?ncia a auto agrega??o, formando grandes aglomerados em solu??o. Tamb?m foi realizada a muta-g?nese s?tio-dirigida por troca al?lica no gene hns, com o intuito de desenvolver uma cepa de M. tuberculosis sem a prote?na MDP2. O resultado deste nocaute mostrou que o gene hns n?o ? essencial para a sobreviv?ncia da micobact?ria. Combinado com resultados pr?vios de outros trabalhos relacionados ? MDP2, n?s especulamos que esta prote?na usa sua regi?o N-terminal altamente desordenada para se ligar ao DNA por meio das suas sequ?ncias repetiti-vas KAAK e PAKK de uma forma n?o espec?fica. Desta forma, a MDP2 deve atuar como uma prote?na prom?scua dentro da c?lula, ligando-se a diferentes regi?es do nucle?ide pela for-ma??o de grandes aglomerados de prote?na, com o objetivo de realizar o desempacotamen-to do DNA e de regular diversos genes micobacterianos. N?s esperamos que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento do metabolismo micobacteriano, uma vez que o M. tuberculosis ainda ? uma grande amea?a global.

Submitted by PPG Medicina e Ci?ncias da Sa?de (medicina-pg@pucrs.br) on 2018-09-17T18:15:32Z No. of bitstreams: 1 KARINE_KAPPAUN.pdf: 4206975 bytes, checksum: b450fa28646271e7dfac9389de975825 (MD5) / Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2018-09-18T12:20:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KARINE_KAPPAUN.pdf: 4206975 bytes, checksum: b450fa28646271e7dfac9389de975825 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-18T12:54:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KARINE_KAPPAUN.pdf: 4206975 bytes, checksum: b450fa28646271e7dfac9389de975825 (MD5) Previous issue date: 2018-07-06 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Ureases (urea amidohydrolases, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes, widely spread in bacteria, fungi and plants, which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. Jaburetox is a peptide derived from a urease isoform of the Canavalia ensiformis plant. Structurally, jaburetox is an intrinsically disordered peptide, demonstrated by bioinformatics tools, and experimentally, by circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR). Several biological properties of jaburetox have already been described, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effect, among others. Soyuretox is a peptide colinear to jaburetox derived from the soybean ubiquitous urease. One of the objectives of this thesis was to carry out structural studies of the soyuretox peptide by CD and NMR, which revealed its intrinsically disordered nature and that its secondary structure content is modified in the presence of SDS micelles. Biological properties of soyuretox were evaluated. The peptide has entomotoxic activity, inducing aggregation of hemocytes from Rhodnius prolixus, the vector of Chagas disease, both in vivo and in vitro. The fungitoxic effect of soyuretox on yeast Candida albicans involves the production of superoxide anions, and the peptide was immunolocalized on the surface of the yeast. Finally, the behavioral and morphological effects of soyuretox on zebrafish larvae (Danio rerio) were evaluated, aiming to deepen the understanding of the mechanism of toxic action and the toxicological profile of this molecule, which presents biotechnological potential as a biopesticide. / Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) s?o enzimas n?quel dependentes, amplamente distribu?das em bact?rias, fungos e plantas, que catalisam a hidr?lise da ureia ? am?nia e di?xido de carbono. O jaburetox ? um pept?deo derivado de uma isoforma de urease da planta Canavalia ensiformis. Estruturalmente, o jaburetox ? um pept?deo intrinsecamente desordenado, demonstrado por ferramentas in silico de bioinform?tica, e experimentalmente, por dicro?smo circular (CD) e resson?ncia magn?tica nuclear (RMN). Diversas propriedades biol?gicas do jaburetox j? foram descritas, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lip?dicas, efeito fungit?xico, dentre outras. O soyuretox ? um pept?deo colinear ao jaburetox, por?m derivado da urease ub?qua de soja. Um dos objetivos dessa tese foi realizar estudos estruturais do pept?deo soyuretox por CD e RMN, que revelaram sua natureza intrinsecamente desordenada e aumento no conte?do de estrutura secund?ria na presen?a de micelas de SDS. Propriedades biol?gicas do soyuretox foram avaliadas. O pept?deo tem atividade entomot?xica, induzindo agrega??o de hem?citos de Rhodnius prolixus, o vetor da doen?a de Chagas, tanto in vivo como in vitro. O efeito fungit?xico do soyuretox na levedura Candida albicans envolve a produ??o de ?nions super?xido, sendo o pept?deo imunolocalizado ligado na superf?cie da levedura. Por fim, foram avaliados os efeitos comportamentais e morfol?gicos do soyuretox em larvas de zebrafish (Danio rerio), visando aprofundar o entendimento do mecanismo de a??o t?xica e o perfil toxicol?gico dessa mol?cula, que apresenta potencial biotecnol?gico como biopesticida.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JacquesNGF_DISSERT.pdf: 4337651 bytes, checksum: bb514d062c89b130feed99ac3aa661e9 (MD5) Previous issue date: 2009-09-30 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Effects of a Cordia salicifolia (porangaba) extract on the labeling of blood cells (BCs) with technetium-99m ((99m)Tc) and on the morphology of red BCs were evaluated. Labeling of cellular and molecular structures with (99m)Tc depends on a reducing agent. Some physical characteristics, as visible absorbance spectrum, electric conductivity, and refractive index of this porangaba extract, were also determined. Blood samples from Wistar rats were incubated with porangaba extract or with 0.9% NaCl (control). Labeling of blood constituents with (99m)Tc was performed. Plasma (P) and BCs, both soluble (SF-P and SF-BC) and insoluble (IF-P and IF-BC) fractions, were separated. The radioactivity in each fraction was counted, and the percentage of radioactivity incorporated (%ATI) was calculated. Blood smears were prepared, fixed, and stained, and the morphology of the red BCs was evaluated. Data showed an absorbance peak at 480 nm and electric conductibility and refractive index concentration-dependent. Porangaba extract decreased significantly (P < .05) the BC, IF-P, and IF-BC %ATI, and no modifications were verified on the shape of red BCs. Analysis of the results reveals that some physical parameters could be useful to aid in characterizing the extract studied. Moreover, it is possible that chemical compounds of this extract could have chelating/redox actions or be capable of binding to plasma and/or cellular proteins / Extratos aquosos de Cordia salicifolia (porangaba) t?m sido utilizados popularmente para tratamento de diversas doen?as. O uso de radionucl?deos com finalidades diagn?sticas e terap?uticas tem contribu?do para avan?os em Ci?ncias da Sa?de. Radiof?rmacos marcados com tecn?cio-99m (99mTc) tem possibilitado a obten??o de imagens diagn?sticas em Medicina Nuclear. Tem sido descrito que f?rmacos sint?ticos e extratos de plantas medicinais podem interferir na marca??o de constituintes sangu?neos com 99mTc. Este estudo teve como objetivos a obten??o de um extrato aquoso de porangaba (ExPo) com a realiza??o de controles de reprodutibilidade de preparo do mesmo e avalia??o de seu efeito in vitro na marca??o de constituintes sangu?neos com 99mTc e na morfologia de hem?cias de ratos Wistar. Foram determinadas algumas caracter?sticas f?sicas, como o espectro de absorb?ncia, condutividade el?trica e ?ndice de refra??o do ExPo. Amostras de sangue de ratos Wistar foram incubadas com ExPo ou NaCl 0,9% (grupo controle) e a marca??o de constituintes sangu?neos com 99mTc foi realizada. Fra??es sol?vel (FS) e insol?vel (FI) de plasma (P) e c?lulas sangu?neas (CS) foram separadas. A radioatividade em cada fra??o foi contada e a porcentagem de radioatividade incorporada (%ATI) foi calculada. Distens?es sangu?neas foram preparadas, fixadas, coradas e a morfologia de c?lulas sangu?neas foi avaliada. Dados mostraram um m?ximo de absorb?ncia em 480nm e uma condutividade el?trica e ?ndice de refra??o dependente da concentra??o do extrato. O ExPo diminuiu significativamente (p<0,05) a %ATI em CS, FI-P e FI-CS e nenhuma modifica??o foi verificada na forma das c?lulas vermelhas do sangue. A an?lise dos resultados sugere que alguns par?metros f?sicos podem ser ?teis na caracteriza??o do extrato estudado. Al?m disso, compostos qu?micos presentes no extrato poderiam ter a??es quelante, redox ou serem capazes de se ligar a prote?nas plasm?ticas ou celulares. xi Esse estudo ? uma pesquisa experimental com car?ter multidisciplinar. Foi desenvolvido em colabora??o com diferentes Departamentos da Universidade do Estado do Rio de Janeiro e Servi?os da ?rea Biom?dica do Hospital Universit?rio Pedro Ernesto, UERJ, atestando o car?ter multidisciplinar da pesquisa

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-08-25T13:27:56Z No. of bitstreams: 1 TES_THIAGO_LIPINSKI_PAES_COMPLETO.pdf: 7285473 bytes, checksum: 4dab05982a53386f1d5dd2202a2f9b21 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-25T13:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_THIAGO_LIPINSKI_PAES_COMPLETO.pdf: 7285473 bytes, checksum: 4dab05982a53386f1d5dd2202a2f9b21 (MD5) Previous issue date: 2017-03-27 / Among the main computational techniques currently applied to study proteins, classical molecular dynamics plays a important hole, specially its variation called replica exchange molecular dynamics or REMD, which provides efficient conformational sampling. Regular secondary structures elements of proteins are formed and maintained via stabilization by hydrogen bonds within helices and between strands of a -sheet. Packing of these structural elements, allowed by flexible turns and loops connecting them, leads to the formation of a structure that, in the successful cases, represents the native, functional state of a protein. Ionic, dipole, van der Waals, hydrophobic interactions, and hydrogen bonding are fundamental to these events. Most of these forces are strong up to a distance of 4.0 ?. Hence, these are the distances involved in the formation of local structural nubs that can further propagate and form whole elements of secondary structure. The common practice while simulating is, however, to keep fixed the cutoff at values higher or equal to 8.0 ?. Here a novel replica exchange molecular dynamics approach based on running cutoffs (varying from 4.0 ? to 8.0 ?) to enhance protein structure prediction is presented. We first proved the method as a reproducible one, as well as following a Boltzmann distribution and sampling different structures of conventional REMD. The human villin headpiece protein (PDB ID: 1UNC) was used as case study. We tested 9 different simulation protocols, in triplicate, and proved the use of incremental cutoff as an effective approach to enhance the quality and speed of protein structure predictions via replica exchange molecular dynamics. Applying the method to the protein test set, although of limited size, CuT-REMD showed good performance against the ab initio methods, most of the time being either as the best prediction method or with close results to the best ones. This made it possible to also compare CuT-REMD with de novo methods. Despite the difficulties, CuT-REMD maintained a good performance even surpassing certain servers for all tested proteins. The results obtained are encouraging, with the emergence of new questions to be addressed in the future. / Dentre os principais m?todos computacionais aplicados atualmente ao estudo de prote?nas, a din?mica molecular cl?ssica realiza importante papel, especialmente sua varia??o intitulada Replica Exchange Molecular Dynamics ou REMD, a qual prov? amostragem conformacional eficiente. Elementos de Estruturas Secund?rias (EES) regulares de prote?nas s?o formados e mantidos atrav?s de estabiliza??o por liga??es de hidrog?nio dentro de h?lices e entre fitas de uma folha . O empacotamento desses elementos estruturais, permitido por voltas e la?os flex?veis conectando-os, leva ? forma??o de uma estrutura que, nos casos bem sucedidos, representa o estado nativo, funcional de uma prote?na. Intera??es i?nicas, dipolo-dipolo, de van der Waals e hidrof?bicas, al?m de liga??es de hidrog?nio, s?o fundamentais para esses eventos. A maioria dessas for?as ? mais forte at? uma dist?ncia de 4,0 ?. Assim, essas (de 0,0 ? a 4,0 ?) s?o as dist?ncias envolvidas na forma??o de estruturas locais, que podem ainda se propagar e formar elementos inteiros de estrutura secund?ria. A pr?tica comum ao se executar simula??es por DM ?, no entanto, manter um raio de corte fixo em valores maiores ou iguais a 8,0 ?. Esta tese apresenta o m?todo CuTREMD, uma nova abordagem de REMD com base em raio de corte incremental (variando de 4,0 ? a 8,0 ?) testando a hip?tese de que tal abordagem pode otimizar a predi??o de estruturas terci?rias de prote?nas. Primeiramente, foi utilizada a prote?na villin headpiece humana (c?digo PDB 1UNC), como estudo de caso, e nove diferentes protocolos de simula??o foram testados, todos em triplicata. Posteriormente, com base nos resultados obtidos, um protocolo-padr?o foi escolhido como protocolo CuT-REMD, e um conjunto de nove prote?nas adicionais foi testado, sendo os resultados comparados com o m?todo REMD convencional. A utiliza??o de raio de corte incremental provou-se uma abordagem eficaz para melhorar a qualidade e velocidade das predi??es de estruturas de prote?nas via REMD. Aplicando o m?todo ao conjunto teste de prote?nas, embora de tamanho limitado, CuT-REMD mostrou bom desempenho em rela??o aos m?todos ab initio, colocando-se na grande maioria das vezes ou como o melhor m?todo de predi??o ou com resultados pr?ximos aos melhores m?todos. Isso possibilitou compar?-lo tamb?m com m?todos de novo e, embora com mais dificuldade, CuT-REMD manteve bom desempenho, inclusive superando certos servidores em todas as ocasi?es. Os resultados obtidos, em suma, mostram-se encorajadores, com o surgimento de novos questionamentos a serem abordados futuramente.