Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-09T13:39:32Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - André Luís Elias Moreira - 2014.pdf: 2397469 bytes, checksum: 4a631b1ca63986a489d7e4bec3dfe90c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-09T13:41:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - André Luís Elias Moreira - 2014.pdf: 2397469 bytes, checksum: 4a631b1ca63986a489d7e4bec3dfe90c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T13:41:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - André Luís Elias Moreira - 2014.pdf: 2397469 bytes, checksum: 4a631b1ca63986a489d7e4bec3dfe90c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by the thermo dimorphic fungus Paracoccidioides spp.. The route of infection of the PCM occurs by the inhalation of conidia or mycelia fragments. Until now, no proteomic studies were performed with conidia of Paracoccidioides sp. In this sense, characterize the proteome of the conidia, may contribute to the detailed knowledge of the proteins expressed during the propagation phase and their potential roles in virulence and pathogenicity, providing possible targets for antifungal strategies. For the conidia production, the mycelia of isolate Pb01 (ATCC MYA-826) were cultured in potato agar medium during 90 days at 18 ºC. After production, the conidias were collected and purified. The proteins were extracted and subjected to tryptic digestion with subsequent identification by NanoUPLC-MSE. We identified a total of 242 proteins of conidia of Paracoccidioides. The in silico analysis were used to characterize the proteins present in Paracoccidioides conidia. Proteins as GAPDH, enolase, triosephosphate isomerase, and some glycoproteins like ECM33 and β-1,3-glucanosyltransferase gel2 were identified during analysis. Some of these have been described as adhesins in Paracoccidioides and in other pathogenic fungi. Were also identified proteins related to signal transduction pathways, such as: Ras GTPase, RhoA GTPase and calmodulin, described in other fungi involved in morphologic changes. Proteins related to evasion, defense and virulence of the fungus, such as HSP90, catalase, mitochondrial peroxiredoxin Prx1, have been described with functions related to temperature shifts or oxidative stress provided by the host environment, were also identified. These results highlight that Paracoccidioides conidia contain proteins that can contribute to its maintenance in the environment and have molecules related to important processes necessary for the initial steps of infection in the host. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides spp.. A principal rota de infecção da PCM ocorre por inalação de conídios ou fragmentos de micélio. Até o momento, estudos proteômicos não foram realizados com conídios de Paracoccidoides sp. Neste sentido, caracterizar o proteoma do conídio poderá contribuir para o conhecimento detalhado das proteínas expressas durante a fase de propagação e seus potenciais papéis na virulência e patogenicidade, fornecendo prováveis alvos para estratégias antifúngicas. Para a produção de conídios, o micélio do isolado Pb01 (ATCC MYA-826) foi cultivado em meio ágar batata durante 90 dias a 18 ºC. Após a produção, os conídios foram coletados e purificados. As proteínas foram extraídas e submetidas a digestão tríptica com subsequente identificação por NanoUPLC-MSE. Foram identificados um total de 242 proteínas de conídios de Paracoccidioides. As análises in silico foram utilizadas para caracterizar as proteínas presentes em conídios de Paracoccidioides. Proteínas como a GAPDH, enolase, triosefosfato isomerase e algumas glicoproteínas como ECM33 e β-1,3-glicanosiltransferase Gel2 foram identificadas durante as análises. Algumas destas já foram descritas como adesinas em Paracoccidioides e em outros fungos patogênicos. Também foram identificadas proteínas relacionadas as vias de transdução de sinais, tais como: Ras GTPase, RhoA GTPase e calmodulina, descritas em outros fungos envolvidas em alterações morfológicas. Proteínas relacionadas à evasão, defesa e virulência do fungo, tais como HSP90, catalase B, peroxiredoxina mitocondrial Prx1, foram descritos com funções relacionadas a mudanças de temperatura ou estresse oxidativo proporcionado pelo ambiente hospedeiro, também foram identificados. Esses resultados demonstram que o conídio de Paracoccidioides contem proteínas que podem contribuir para sua manutenção no meio ambiente e possuem moléculas relacionadas a processos importantes necessários para os passos iniciais da infecção no hospedeiro.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, prevalente na América do Sul, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O fungo apresenta estrutura complexa de proteínas e glicoproteínas e dentre esses componentes, alguns estão envolvidos na patogenicidade da doença. A recuperação da virulência de isolados por meio de passagem in vivo foi realizada com sucesso em nosso laboratório. Os isolados Pb18 atenuado e virulento foram analisados sob diversos ângulos para confirmação dessa modificação. Os resultados de curva de sobrevida, recuperação de CFU de órgão e histologia, mostraram claramente as diferenças no padrão de patogenicidade desses dois isolados. Outras características também foram avaliadas como morfometria, padrão de crescimento e ultraestrutura celular. Análises de expressão gênica diferencial apontaram um perfil de regulação positiva para genes relacionados ao metabolismo de proteínas, de lipídeos e aminoácidos. Algumas moléculas anteriormente descritas como putativos fatores de virulência foram moduladas positivamante, entre as quais podemos citar a calmodulina, proteína kex-like e hsp70. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre estes fatores virulência para maioria dos fungos dimórficos, entre eles o P.brasiliensis. Várias técnicas têm sido utilizadas, sem sucesso, para caracterização destas moléculas. Utilizando a metodologia de Phage display, foram selecionados três fagos que se ligam preferencialmente ao isolado Pb18 virulento. Por meio de ensaio de ligação, o fago p04 foi capaz de distinguir graus de virulência de outros quatro isolados. As imagens obtidas por microscopia confocal mostraram que o pep04, acoplado a 6-FAM, foi internalizado somente por leveduras do isolado virulento. Imagens seriadas indicam marcação do meio intracelular, frequentemente associada ou co-localizada à marcação por DAPI. Estes resultados demonstraram que ambos, pep04 e p04, podem ser considerados biomarcadores de virulência na PCM. Para avaliar as consequências das interações destes biomarcadores com células fúngicas, foram realizados ensaios in vitro e in vivo. O fago p04 foi suficiente para impedir a implantação e disseminação do fungo. Além disso, foi capaz de reduzir o número de CFUs recuperadas de animais tratados com este fago, quando comparado ao controle (fago sem inserto). Experimentos in vitro utilizando o pep04 demostraram a atividade fungicida deste peptídeo contra, apenas, o isolado virulento. Desta foram, estes biomarcadores poderão ser utilizados tanto no diagnóstico, quanto na pratica clínica como adjuvante terapêutico. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a human systemic granulomatous disease, prevalent in South America, caused by a thermodimorphic fungus, Paracoccidioides brasiliensis. This fungus presents complex antigenic structure and some of these components have been related with its pathogenicity, of which little is known. The virulence recovery of isolates by passage in vivo was performed in our laboratory. Attenuated and virulent Pb18 isolates were analyzed from various angles to confirm this change. The results of the survival curve, the number of CFUs and histology, showed clear differences in pathogenicity pattern of these isolates. Other features were also evaluated as morphology, growth curve and cell ultrastructure. Analysis of differential gene expression profile showed positive regulation genes related to metabolisms of proteins, lipids and amino acids. Some molecules, previously described as putative virulence factors, were positive regulated, among which calmodulin, kex-like protein and Hsp70. However, the number of defined virulence factors for dimorphic fungal pathogens, up to now, is relatively small. Several techniques have unsuccessfully been employed to characterize these elusive antigenic structures. Using phage display methodology, three peptide-displaying phages that bound preferentially to virulent isolates of P. brasiliensis were selected. By binding assay, p04 phage distinguished predefined degrees of virulence of isolates. Using confocal microscopy, the homologue synthetic peptide (pep04), labeled with 6-FAM, was internalized by only virulent isolate yeast cells. Sequential optical section imaging indicated that the labeling was within the intracellular milieu and frequently close or overlapping DAPI staining. These results showed that both, phage p04 and pep04, can be considered as biomarkers of virulence in PCM since both bound to virulent P. brasiliensis. To evaluate the consequences of interactions between the biomarkers and fungal cells, in vitro and in vivo experiments were performed. The latter demonstrated that p04 phage was sufficient to prevent the implantation of the fungus in the lungs and its migration to spleen and liver. In addition, this phage reduced colony-forming units in the lungs of mice infected with P. brasiliensis as compared to controls. In vitro experiments showed that pep04 exhibited fungicidal activity only against virulent P. brasiliensis, leaving unaltered the growth of the attenuated isolate. Therefore, these biomarkers may be useful tools for prognosis in PCM and may be possibly used in the routine clinical practice as therapeutic drug adjuvants. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-12Bitstream added on 2014-06-13T19:01:46Z : No. of bitstreams: 1 graciani_apb_dr_botfm.pdf: 427562 bytes, checksum: b481f2e6f558c5bae2f08ca356c1ed60 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo dimórfico que sobrevive no interior de monócitos/macrófagos humanos não ativados. Estudos anteriores em nosso laboratório têm demonstrado que os monócitos humanos não ativados são incapazes de realizar atividade fungicida, e esse processo está associado com a capacidade do fungo induzir a produção de prostaglandinas (PGs), uma vez que, essas células são capazes de realizar atividade fungicida significativa após o tratamento com indometacina (INDO), um inibidor da produção de ciclooxigenase. No entanto, o processo de pré-ativação com IFN-γ, resulta em um parcial efeito compensatório sobre os efeitos inibidores das PGs, principalmente quando essas células são desafiadas com a cepa de baixa virulência do fungo. Assim, a proposta deste presente estudo foi avaliar se a ativação de monócitos humanos com outras citocinas como TNF-α e GM-CSF resulta em um efeito similar ao observado com IFN-γ. Uma outra questão a ser respondida é se esse processo poderia estar associado com alterações nos níveis de H2O2 e NO, que são moléculas efetoras envolvidas na atividade fungicida contra o P. brasiliensis, bem como nos níveis das citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6. Culturas de monócitos do sangue periférico, obtidos de 20 indivíduos normais foram tratadas somente com INDO ou ativados com IFN-γ, TNF-α ou GM-CSF na presença ou ausência de INDO por 18h, e posteriormente desafiados com cepas de alta (Pb18) ou baixa (Pb265) virulência do P. brasiliensis por 4h. Após esse período, as culturas foram avaliadas quanto à atividade fungicida, produção de H2O2 e NO e expressão de mRNA para enzima óxido nítrico sintase (iNOS) por RT-PCR em tempo real. As concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-10 nos sobrenadantes das coculturas foram avaliadas por ELISA. Nossos resultados... / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is a dimorphic fungus that survives within nonactivated human monocytes/macrophages. Previous studies have demonstrated that the lack of fungicidal activity by nonactivated human monocytes is associated to fungus capacity to inducing prostaglandins release, since a significative fungicidal activity was detected after monocytes treatment with indomethacin (INDO), a cyclooxigenase inhibitor. However, cells activation with IFN-γ seems to partially compensating this inhibitory effect, mainly when cells were challenged with low virulent strain of the fungus. Here, we extended our studies, addressing whether monocytes activation with other cytokines such as TNF-α and GM-CSF results in a similar effect to that observed with IFN-γ. Moreover, we asked if this process could be associated with alterations on H2O2 and NO levels, the molecules involved in Pb killing, as well as in the levels of the cytokines TNF-α, IL-10 and IL-6. Peripheral blood monocytes obtained from 18 healthy donors were treated only with INDO or activated with IFN-γ, TNF-α or GM-CSF in presence or absence of INDO for 18h, and further challenged with high (Pb18) or low (Pb265) virulent strain of Pb for 4h. After, cultures were evaluated for fungicidal activity, H2O2 and NO release and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA by real-time RT-PCR. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 on supernatants of cocultures were evaluated by ELISA. Our results provided evidence that human monocytes challenged with both strains of P. brasiliensis release prostaglandins that via induction of IL-10 and IL-6 inhibits TNF-α production. This process results in defective cell activation with consequent release of low H2O2 levels and lack of fungicidal activity by cells. However the inhibitory effect of PGs may be... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo dimórfico que sobrevive no interior de monócitos/macrófagos humanos não ativados. Estudos anteriores em nosso laboratório têm demonstrado que os monócitos humanos não ativados são incapazes de realizar atividade fungicida, e esse processo está associado com a capacidade do fungo induzir a produção de prostaglandinas (PGs), uma vez que, essas células são capazes de realizar atividade fungicida significativa após o tratamento com indometacina (INDO), um inibidor da produção de ciclooxigenase. No entanto, o processo de pré-ativação com IFN-γ, resulta em um parcial efeito compensatório sobre os efeitos inibidores das PGs, principalmente quando essas células são desafiadas com a cepa de baixa virulência do fungo. Assim, a proposta deste presente estudo foi avaliar se a ativação de monócitos humanos com outras citocinas como TNF-α e GM-CSF resulta em um efeito similar ao observado com IFN-γ. Uma outra questão a ser respondida é se esse processo poderia estar associado com alterações nos níveis de H2O2 e NO, que são moléculas efetoras envolvidas na atividade fungicida contra o P. brasiliensis, bem como nos níveis das citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6. Culturas de monócitos do sangue periférico, obtidos de 20 indivíduos normais foram tratadas somente com INDO ou ativados com IFN-γ, TNF-α ou GM-CSF na presença ou ausência de INDO por 18h, e posteriormente desafiados com cepas de alta (Pb18) ou baixa (Pb265) virulência do P. brasiliensis por 4h. Após esse período, as culturas foram avaliadas quanto à atividade fungicida, produção de H2O2 e NO e expressão de mRNA para enzima óxido nítrico sintase (iNOS) por RT-PCR em tempo real. As concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-10 nos sobrenadantes das coculturas foram avaliadas por ELISA. Nossos resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is a dimorphic fungus that survives within nonactivated human monocytes/macrophages. Previous studies have demonstrated that the lack of fungicidal activity by nonactivated human monocytes is associated to fungus capacity to inducing prostaglandins release, since a significative fungicidal activity was detected after monocytes treatment with indomethacin (INDO), a cyclooxigenase inhibitor. However, cells activation with IFN-γ seems to partially compensating this inhibitory effect, mainly when cells were challenged with low virulent strain of the fungus. Here, we extended our studies, addressing whether monocytes activation with other cytokines such as TNF-α and GM-CSF results in a similar effect to that observed with IFN-γ. Moreover, we asked if this process could be associated with alterations on H2O2 and NO levels, the molecules involved in Pb killing, as well as in the levels of the cytokines TNF-α, IL-10 and IL-6. Peripheral blood monocytes obtained from 18 healthy donors were treated only with INDO or activated with IFN-γ, TNF-α or GM-CSF in presence or absence of INDO for 18h, and further challenged with high (Pb18) or low (Pb265) virulent strain of Pb for 4h. After, cultures were evaluated for fungicidal activity, H2O2 and NO release and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA by real-time RT-PCR. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 on supernatants of cocultures were evaluated by ELISA. Our results provided evidence that human monocytes challenged with both strains of P. brasiliensis release prostaglandins that via induction of IL-10 and IL-6 inhibits TNF-α production. This process results in defective cell activation with consequent release of low H2O2 levels and lack of fungicidal activity by cells. However the inhibitory effect of PGs may be... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciene Alarcão Dias Melicio / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: João pessoa Araújo Junior / Banca: Heloisa Blotta / Banca: Gil Bernard / Doutor

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao parte 1 lidiane biologia.pdf: 35041 bytes, checksum: c58f88ce1be4655ee71c7b5ab0bef247 (MD5) Previous issue date: 2008-04-03 / Paracoccidoides brasiliensis is a human pathogenic dimorphic fungus. The recombinant chitinase from P. brasiliensis, Pbcts1r, was overexpressed in Escherichia coli using pET-32a (+) as vector. The enzyme was produced as inclusion bodies and became soluble by Sarkosyl being purified by a single step using a Ni-NTA resin. Pbcts1r showed activity against 4-MU-(GlcNAc)3 and 4-MU-(GlcNAc)2, presenting a endochitinase activity. Immunoblot reaction with anti-Pbcts1r identified two proteins in yeast crude extract. A partial purification of P. brasiliensis yeast crude extract by cationic-exchange chromatography on HPLC revealed two different chitinases, Pbcts1 and Pbcts2, with molecular mass of 45 kDa and 34 kDa, respectively. Pbcts2 has exochitinase activity and Pbcts1 has endochitinase activities. Reactions with anti- Pbcts1r showed the presence of Pbcts1 and Pbcts2 in crude extracts of yeast and transition from mycelium to yeast. On mycelium crude extracts was found only Pbcts1 and on yeast cell wall extract only Pbcts2. Both proteins were found to be secreted by yeast parasitic phase showing their probable importance in the permanence of the fungus in the human host. Phylogenetic relationships between the orthologs Pbcts1 and the putative Pbcts2 indicated the presence of a common ancestral. During evolution, P. brasiliensis could have acquired Pbcts2 and Pbcts1 playing distinct roles in order to growth and survive in diverse environment on saprophytic and parasitic phases / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico humano. A quitinase recombinante de P. brasiliensis, Pbcts1r, foi superexpressa em Escherichia coli utilizando pET-32(a)+ como vetor. A enzima foi produzida em corpos de inclusão e se tornou solúvel pela adição de sarkosyl, sendo purificada em um único passo com a utilização da resina Ni-NTA. Pbcts1r mostrou atividade diante de 4-MU-(GlcNAc)3 e 4- MU-(GlcNAc)2, apresentando atividade de endoquitinase. A reação de imunoblot com anti-Pbcts1r identificou duas proteínas no extrato bruto de levedura. A purificação parcial do extrato bruto de P. brasiliensis por cromatografia de troca-catiônica em HPLC revelou duas quitinases diferentes, Pbcts1 e Pbcts2, com massas moleculares de 45 e 34 kDa, respectivamente. Pbcts2 tem atividade de exoquitinase e Pbcts1 de endoquitinase. Reações com anti-Pbcts1r mostraram a presença de Pbcts1 e Pbcts2 no extrato bruto de levedura e transição de micélio para levedura. No extrato bruto de micélio foi encontrado somente Pbcts1 e no extrato de parede celular de levedura somente Pbcts2. Ambas as proteínas foram encontradas secretadas pela fase parasitária (levedura), mostrando a provável importância dessas proteínas na permanência do fungo no hospedeiro. Relações filogenéticas entre os ortólogos Pbcts1 e a provável Pbcts2 indicam a presença de um ancestral comum. Durante a evolução, P. brasiliensis poderia ter adquirido Pbcts2 e Pbcts1 desempenhando diferentes papéis para o crescimento e sobrevivência do fungo na fase saprofítica e parasitária

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-22Bitstream added on 2014-06-13T20:44:20Z : No. of bitstreams: 1 miranda_et_dr_arafcf.pdf: 641942 bytes, checksum: 8d27d1b81ac16fe68d939f32e284f53f (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Neste trabalho foi realizado um estudo comparativo entre isolados de Pb18 e Pb265, que têm capacidades distintas de adesão às células Hela e Vero, sob influência da temperatura e diversos fatores químicos. Foram também avaliados eventos em células de epitélio pulmonar expostas à gp 43 e células de Pb18, antes e após inoculação animal, representando, respectivamente, isolados menos e mais virulentos. Os resultados mostram que as adesinas fúngicas são termo-lábeis, sugerindo sua natureza protéica. Os açúcares aminados glucosamina e galactosamina foram os mais eficientes para inibir a adesão celular, em relação à manose, glicose e galactose, indicando que esta atividade envolve mecanismos específicos tipo lectina. O estudo com componente da matriz extracelular mostrou que a laminina, assim como seus derivados sintéticos, inibiu a adesão do isolado Pb18, fato não verificado com Pb265, tanto com células Hela, quanto com a linhagem Vero, mas variável sob influência de fatores químicos. As distintas vias de sinalização foram demonstradas pelos eventos Ras-Raf, Rho e AKT verificados, sendo que o isolado menos virulento causou menos estresse citotóxico, comprovado por menor sinal Ras- Raf e AKT de proliferação. Os sinais intensos de proliferação observados nos experimentos com o isolado mais virulento e exposição à gp 43 poderiam ser associados à maior sobrevida do fungo que se internaliza mais facilmente nas células do hospedeiro, dificultando o seu reconhecimento por células do sistema monocítico-fagocitário, antes de causar apoptose, evadir e disseminar-se. A ativação das vias de sobrevida, associada a sinais citosólicos quando o Pb entra na célula epitelial, foi demonstrada de modo inédito neste trabalho. / In this work it was accomplished a comparative study between isolates Pb18 and Pb265, which have distinct capacities of adhesion to the cells Hela and Vero under influence of temperature and several chemical factors. Events in pulmonary epithelial cells exposed to gp 43 and in Pb18 cells, before and after animal inoculation, representing, respectively, isolates less and more virulent were evaluated as well. The results show that the fungal adhesins are term-labels, suggesting its proteical nature. The aminated sugars glucosamine and galactosamine were the most efficient, in comparison with manose, glycose and galactose, in inhibiting the cellular adhesion, indicating that this activity involves specific mechanisms lectin-type. The study with extracellular matrix component indicated that the laminin, as well as its synthetic derivatives, inhibited the adhesion of the isolate Pb18 to the cells Vero and Hela, what did not occur with Pb265, but it was variable under influence of chemical factors. The distinct signaling pathways were demonstrated by the Ras-Raf, Rho and AKT events, considering that the less virulent isolate caused minor cytotoxic stress, proved by minor Ras-Raf and AKT proliferation signals. The intense proliferation signals observed in the experiments with more virulent isolate and exposition to gp 43 could be associated to larger time of survival of the fungus that more easily goes inside the host cells, making it difficult to the monocyte-macrophage system cells to recognize it before the apoptosis, the evasion and the dissemination. The Ras-Raf and AKT pathways acted synergetically with the effects of the cell survival. The decrease of the AKT event implied partial loss of the survival signal that intensified, following and in a opposite way, with Ras-Raf decrease. The activation of the survival pathways, associated to citosolic signals when Pb goes inside the epithelial cell, was for the first time demonstrated in this work.

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: Márcia de Souza Carvalho Melhem / Banca: Gil Bernard / Resumo: Neste trabalho foi realizado um estudo comparativo entre isolados de Pb18 e Pb265, que têm capacidades distintas de adesão às células Hela e Vero, sob influência da temperatura e diversos fatores químicos. Foram também avaliados eventos em células de epitélio pulmonar expostas à gp 43 e células de Pb18, antes e após inoculação animal, representando, respectivamente, isolados menos e mais virulentos. Os resultados mostram que as adesinas fúngicas são termo-lábeis, sugerindo sua natureza protéica. Os açúcares aminados glucosamina e galactosamina foram os mais eficientes para inibir a adesão celular, em relação à manose, glicose e galactose, indicando que esta atividade envolve mecanismos específicos tipo lectina. O estudo com componente da matriz extracelular mostrou que a laminina, assim como seus derivados sintéticos, inibiu a adesão do isolado Pb18, fato não verificado com Pb265, tanto com células Hela, quanto com a linhagem Vero, mas variável sob influência de fatores químicos. As distintas vias de sinalização foram demonstradas pelos eventos Ras-Raf, Rho e AKT verificados, sendo que o isolado menos virulento causou menos estresse citotóxico, comprovado por menor sinal Ras- Raf e AKT de proliferação. Os sinais intensos de proliferação observados nos experimentos com o isolado mais virulento e exposição à gp 43 poderiam ser associados à maior sobrevida do fungo que se internaliza mais facilmente nas células do hospedeiro, dificultando o seu reconhecimento por células do sistema monocítico-fagocitário, antes de causar apoptose, evadir e disseminar-se. A ativação das vias de sobrevida, associada a sinais citosólicos quando o Pb entra na célula epitelial, foi demonstrada de modo inédito neste trabalho. / Abstract: In this work it was accomplished a comparative study between isolates Pb18 and Pb265, which have distinct capacities of adhesion to the cells Hela and Vero under influence of temperature and several chemical factors. Events in pulmonary epithelial cells exposed to gp 43 and in Pb18 cells, before and after animal inoculation, representing, respectively, isolates less and more virulent were evaluated as well. The results show that the fungal adhesins are term-labels, suggesting its proteical nature. The aminated sugars glucosamine and galactosamine were the most efficient, in comparison with manose, glycose and galactose, in inhibiting the cellular adhesion, indicating that this activity involves specific mechanisms lectin-type. The study with extracellular matrix component indicated that the laminin, as well as its synthetic derivatives, inhibited the adhesion of the isolate Pb18 to the cells Vero and Hela, what did not occur with Pb265, but it was variable under influence of chemical factors. The distinct signaling pathways were demonstrated by the Ras-Raf, Rho and AKT events, considering that the less virulent isolate caused minor cytotoxic stress, proved by minor Ras-Raf and AKT proliferation signals. The intense proliferation signals observed in the experiments with more virulent isolate and exposition to gp 43 could be associated to larger time of survival of the fungus that more easily goes inside the host cells, making it difficult to the monocyte-macrophage system cells to recognize it before the apoptosis, the evasion and the dissemination. The Ras-Raf and AKT pathways acted synergetically with the effects of the cell survival. The decrease of the AKT event implied partial loss of the survival signal that intensified, following and in a opposite way, with Ras-Raf decrease. The activation of the survival pathways, associated to citosolic signals when Pb goes inside the epithelial cell, was for the first time demonstrated in this work. / Doutor