Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-18Bitstream added on 2014-06-13T19:03:35Z : No. of bitstreams: 1 silva_jf_dr_arafcf.pdf: 9310413 bytes, checksum: fb67253daf71a3dc5fdaa805159dff93 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica causada pelos fungos dimórficos Paracoccidioides brasiliensis (espécies cripticas S1, PS2, PS3) e Paracoccidioides lutzii (Pb01-like espécies), endêmica na América Latina, principalmente no Brasil. A capacidade de causar micose com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até doença disseminada evoluindo para letalidade, depende da virulência do fungo e de sua habilidade em interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro e invadi-las, e a resposta imunológica deste último. P. brasiliensis tem a capacidade de aderir e invadir células epiteliais de linhagens humanas e animais e o processo de invasão do fungo afeta a estrutura do citoesqueleto, interferindo em aspectos morfológicos da actina, tubulina e citoqueratina, indicando a participação funcional dos microfilamentos e microtúbulos neste mecanismo. Em estudos prévios foi identificada adesina de P. brasiliensis de 30 kDa, ligante de laminina, caracterizada como uma proteína pertencente à família 14-3-3. O objetivo deste trabalho foi produzir a proteína recombinante, verificar o papel desta na interação do fungo com células epiteliais pulmonares de linhagem contínua. Para tanto, com o anticorpo anti-14-3-3 foi verificada a sua localização, tanto nas formas leveduriformes do fungo como no processo de interação. A clonagem foi realizada em vetor de clonagem pCR2.1-TOPO - pET32a, para permitir a expressão da proteína Pb14-3-3r com cauda de histidina no espaço periplasmático de E. coli. A fração periplasmática foi purificada por cromatografia de afinidade seguida de eletroeluição. Foi possível verificar alteração do padrão de distribuição de actina quando as células foram tratadas com a proteína recombinante e nativa. A proteína 14-3-3 apresenta distribuição ubíqua na... / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (cryptic species S1, PS2, PS3) and Paracoccidioides lutzii (Pb01-like species), endemic in Latin America, mainly Brazil. The ability to cause mycosis with a variety of clinical manifestations, from localized forms to disseminated disease progressing to lethality, possibly depends on the relationship between the virulence of these, the ability to interact with the surface structures of the host and invade them, and this immune response. P. brasiliensis has the ability to adhere and o invade human and animal epithelial cells lineage and the process of invasion of the fungus affects the structure of the cytoskeleton, morphological interfering with actin, tubulin and cytokeratin morphology, indicating the functional participation of microfilaments and microtubules in this mechanism. Previous study identified a 14-3-3 protein (30 kDa) that acts as a P. brasiliensis adhesin (laminin ligand) and this protein contributes to the virulence of this important fungal pathogen. The objective of this study was to produce recombinant protein, to verify the role of the interaction of the fungus with lung epithelial cells of continuous lineage. To do so, with the anti-14-3-3 was verified its location, both in the forms of the fungus and yeast in the process of interaction. The cloning was done in cloning vector pCR2.1-TOPO - pET32a to allow expression of protein Pb14-3-3r-tailed histidine periplasmic space of E. coli. The periplasmic fraction was purified by affinity chromatography followed by electroelution. It was possible to see change in the pattern of distribution of actin when cells were treated with recombinant and native protein. The 14-3-3 protein has ubiquitous distribution in yeast cells of P. brasiliensis (strain 18/S1) have a certain... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-17Bitstream added on 2015-03-03T12:06:58Z : No. of bitstreams: 1 000807238.pdf: 1014789 bytes, checksum: 130b475d54b3130a40fc2df43bd56a57 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo dimófico Paracoccidioides brasiliensis, que é endêmico na América Latina. As células fagocitárias desempenham um papel importante durante a resposta imune inata contra o Pb, e se tornaram alvo de estudos neste sentido. Em especial, os neutrófilos são capazes de destruir microrganismos através de três mecanismos: fagocitose, seguida pela morte em fagolisossoma, secreção de agentes microbicidas e através do mais recente mecanismo descoberto, a netose, que consiste na liberação de redes extracelulares a partir dos neutrófilos (NETs), constituídas por proteínas granulares associadas a cromatina. Neste estudo demonstramos pela primeira vez que leveduras de P. brasiliensis induzem NETs in vitro principalmente através da ligação pelo receptor dectina-1 presente nos neutrófilos. Estas estruturas foram demonstrados através de microscopia eletrônica de varredura, e os componentes específicos das NETs: histona, elastase e DNA foram evidenciados a partir da microscopia eletrônica de imunofluorescência confocal. As leveduras foram capturadas pelas NETs, o que revelou um importante papel destas esrtruturas: impedir a disseminação do fungo. Além disso, o tratamento das co-culturas com DNAse, que degradou as NETs evidenciou aumento da sobrevivência do fungo, o que denota sua capacidade microbicida / Paracoccidiodomycosis is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, which is endemic in Latin America. Since phagocytic cells play an important role during innate immune response against this fungus, we have studied the relationship between human neutrophils (PMNs) and P. brasiliensis, focusing on the effector mechanisms of these cells. Neutrophils can destroy microrganisms using at least 3 distint mechanisms: phagocytosis followed by destruction in a phagolysossome, secretion of antimicrobial molecules, and the more recently identified netosis, involving the release of neutrophil extracellular traps ( NETs) that are constituted by chromatin associated with different granule proteins with antimicrobial activities. Here, we showed for the first time, that yeast cells from P. brasiliensis strain 18 are able to induce the release of NETs in vitro, by binding to dectin-1 receptor on human neutrophils. These structures were evidenced by scanning electron microscopy, and specific NETs compounds such as histone and elastase were shown by confocal microscopy. Fungi were ensnared by NETs, denotting the role of these structures in confining infection, avoiding dissemination. In addition, disruption of NETs by treatment of cocultures with DNAse increased the fungi survival, evidencing their killing capacity / FAPESP: 2010/17405-5

Orientador: Eduardo Bagagli / Banca: Adriana Pardini Vicentini / Banca: Renata Castiglioni Pascon / Banca: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Banca: Marcelo Afonso Valim / Resumo: O fungo termodimórfico Paraccocidiodes brasiliensis, em sua fase leveduriforme, é o agente etiológico de uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina, a paracoccidioidomicose. A doença pode ser fatal em sua forma aguda, além de gerar, na forma crônica, lesões principalmente de ordem dermatológica e pulmonar. O fato de P. brasiliensis ser considerado uma única entidade biológica vem sendo questionado pelos recentes achados de filogenia molecular. Atualmente acredita-se que P. brasiliensis seja um complexo de quatro espécies crípticas, S1, PS2, PS3 e P. lutzii, sendo esta última a mais distante filogeneticamente. É possível que o fato esteja interferindo em aspectos relacionados à doença, como, por exemplo, a positividade do diagnóstico sorológico. Além disso, tal especiação pode significar diferenças na biologia do fungo, em aspectos como sua morfologia, fisiologia e ocupação de nichos ecológicos.A primeira frente deste trabalho visou produzir e caracterizar antígenos a partir de cepas pertencentes às diferentes espécies de P. brasiliensis, e avaliar o desempenho das mesmas em testes de imunodifusão (ID) contra pacientes das diferentes regiões do Brasil. Melhores resultados foram obtidos com o antígeno produzido por filtrado de cultura de um isolado pertencente ao grupo PS3, o qual apresentou altas taxas do antígeno imunodominante, a glicoproteína gp43, detectável por SDS-PAGE, e apresentou boa positividade nas IDs quando cruzados com soros de pacientes da região de Botucatu, reagindo inclusive com alguns soros falso-negativos para o antígeno considerado padrão, produzido pela cepa B-339. Entretanto, este antígeno, bem como outros aqui avaliados, não foi capaz de apresentar desempenho satisfatório frente a soros de pacientes da Região Centro-Oeste, justamente os que apresentam maiores taxas de negatividade, provavelmente por serem... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The thermo-dimorphic fungus Paraccocidiodes brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis, one of the most important systemic mycosis in Latin America. The disease can be fatal in its acute form, besides causing important lesions especially in lungs and skin when occurs in its chronic form. The fact that P. brasiliensis is considered a single biological entity has been challenged by the recent findings in molecular phylogenetics. Currently, it has been observed that P. brasiliensis is a complex of four cryptic species, S1, PS2, PS3 and Pb01-like, which is the most distantly related, being proposed as new formal species, P. lutzii. It is possible that these facts are interfering with the host/pathogen interactions, as well as with the results of serological diagnosis. Furthermore, this speciation could reflect differences in the biology of the fungus, especially on their morphology, physiology and occupation of ecological niches.The first approach of this work was to produce and characterize antigens from strains belonging to different species of P. brasiliensis, and evaluate their performance in immunodiffusion tests (ID) against sera of pacients from different regions of Brazil. The better results were obtained with the antigen produced by culture filtrate of an isolate belonging to the PS3, AgEpm83, which showed high positivity rates in IDs, against sera of patients from Botucatu. This antigen, in addition, presented high levels of the glycoprotein gp43, the immunodominant component, detectable by SDS-PAGE. However, this antigen, as well as other here evaluated, was unable to provide satisfactory performance against the sera of patients from the Brazilian Midwest Region, probably because they are infected with P. lutzii isolates. The in silico analysis of exon2 of the gene that encodes gp43 indicated that this gene is under purifying selection both... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, principalmente no Brasil, Argentina e Venezuela, e que promove um importante impacto na saúde pública. Seu agente etiológico é um fungo termodimórfico pertencente ao gênero Paracoccidioides que compreende o Paracocidioides brasiliensis (Pb) e suas espécies crípticas S1, PS2, PS3 e Paracoccidioides lutzii. As consequências da interação do fungo com as células da resposta imune inata, tais como as células dendríticas (DC), destacando a capacidade destas células para instruir a resposta imune adaptativa, não são totalmente compreendidas. Em estudo anterior, descobrimos que DCs não maturam em resposta ao desafio com Pb. Esta falha foi associada à inibição de PGE2 nas DCs pelo fungo, uma vez que este eicosanóide é um fator importante para a maturação dessas células. Na tentativa de melhor entender este processo e suas conseqüências para a instrução da resposta adaptativa CD4, nós buscamos analisar o perfil transcricional de DCs em resposta ao Pb assim como o de linfócitos CD4+ cocultivados com DCs sensibilizados com o fungo. Para estas análises, nós utilizamos a metodologia de RNA-seq, que permitiu o sequenciamento de alto rendimento e a quantificação sistemática de expressão gênica. Após as análises, os genes que foram regulados positivamente ou negativamente em ambas as células (DCs e CD4) foram listados e as funções das proteínas codificadas por eles, identificadas. A análise geral das proteínas co... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é uma micose sistêmica grave com formas aguda e crônica. As proteases ou peptidases são enzimas proteolíticas que ocorrem em todos os organismos e correspondem a 1-5% de seus conteúdos genéticos. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem durante a invasão metastática de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Um número reduzido de proteases do Pb já foram isoladas e caracterizadas, tampouco sua atividade durante o desenvolvimento da doença foi determinado, e até o momento, nenhuma atividade oligopeptidásica foi descrita nesse fungo. No presente trabalho foi demonstrada a presença de uma atividade metalo-peptidásica thimet oligopeptidase (TOP)-like no extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis, isolado 18 (Pb18). Nossos resultados mostraram a hidrólise do peptídeo com supressão intramolecular de fluorescência Abz-GFSPFRQ-EDDnp pelo extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis. Esse substrato é clivado preferencialmente pela TOP de mamíferos, e corroborando esse resultado, observou-se a inibição da hidrólise desse peptídeo por ο-fenantrolina e JA-2, inibidores seletivos de metalo-proteases e TOP, respectivamente. Utilizando-se peptídeos e inibidores seletivos para diferentes proteases, não se detectou a presença de atividade neurolisina-like ou neprilisina-like, e também se descartou a presença de serino-peptidases, cisteíno-peptidases e enzima conversora da angiotensina I. A maior atividade enzimática do extrato citosólico sobre os outros preparados (membrana/parede celular ou lisado total das leveduras) pode indicar uma localização citosólica dessa enzima. Não foi observada a secreção da peptidase no sobrenadante de cultura in vitro, mesmo após adição de soro fetal bovino. Todavia, a peptidase com atividade TOP-like de Pb parece ser secretada in vivo, ou liberada após lise do fungo por componentes efetores da resposta imune, uma vez que anticorpos capazes de inibir a atividade peptidásica são encontrados em soros de pacientes com paracoccidioidomicose, e soros com maior título em imunodifusão contém maiores concentrações de anticorpos enzima-específicos. Várias enzimas da família M3 clivam bradicinina, importante mediador inflamatório in vivo. A hidrólise da bradicinina e do substrato Abz-GFSPFRQEDDnp pelo extrato citosólico de P. brasiliensis, gera os mesmos fragmentos observados após clivagem pela TOP de mamíferos, que são diferentes dos gerados pela clivagem com MIP de mamíferos e OpdA bacteriana, sendo mais um indicador da presença majoritária de uma peptidase com atividade TOP-like em P. brasiliensis. A clivagem da bradicinina pela metalooligopeptidase com atividade TOP-like de Pb, poderia ocorrer no sítio inflamatório e poderia estar envolvida na inibição da indução de uma resposta imune protetora contra o fungo, favorecendo a permanência do mesmo no hospedeiro. Observamos ainda que o gene homólogo de TOP em P. brasiliensis é quase duas vezes mais expresso no virulento em comparação ao não virulento. O aumento da hidrólise do substrato Abz-GFSPFRQ-EDDnp também foi observado no isolado de maior virulência quando comparado ao de menor virulência. A possível relação entre a expressão da metalooligopeptidase com a virulência do fungo sugere que essa peptidase possa ser classificada como um fator de virulência fúngica, no entanto experimentos complementares são necessários para sua confirmação. A expressão da gp43 também foi analisada no isolado virulento e não virulento e observou-se uma expressão aumentada em até treze vezes no primeiro. Para melhor caracterização dessas metalo-oligopeptidases é necessária a obtenção da proteína recombinante, ou da proteína purificada nativa, isolada do lisado fúngico. Não obtivemos sucesso na expressão das proteínas recombinantes, tampouco no isolamento da peptidase nativa por métodos cromatográficos. Nossos resultados sugerem a presença de uma atividade metalooligopeptidásica TOP-like na fração citosólica de leveduras de P. brasiliensis. Liberação in vivo dessa enzima após a lise de fungos ou secreção estimulada por fatores do hospedeiro, pode ter um papel na inflamação e desenvolvimento da micose. / Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a systemic mycosis with severe acute and chronic forms. Proteases or peptidases are proteolytic enzymes that occur in all organisms and constitute 1-5% of their genetic contents. These enzymes are involved in biological processes such as blood clotting, cell death and tissue differentiation. Several important proteolytic steps occur during the invasion of metastatic tumors, as well as in the infection of a large number of viruses and pathogens. To date, a small number of Pb proteases were isolated and characterized, also, their activities during the development of the disease was not determined, and an oligopeptidase activity was not detected in this fungus. In the present work, we demonstrated a metallopeptidase thimet oligopeptidase (TOP)-like activity in the cytosolic extract of Pb18 yeasts. Our results shown a major hydrolysis of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide Abz-GFSPFRQ-EDDnp, preferentially cleaved by TOP from mammals, and the inhibition of the hydrolysis of this peptide by orthophenantrolin and JA-2, selective inhibitors of metalloproteases and TOP, respectively. The presence of neurolysin- like and neprilysin-like, serinepeptidases, cysteine-peptidases and angiotensin converting enzyme I was discarded by analyzing selective FRET peptides and inhibitors. The higher peptidase activity of cytosolic extracts over the membrane/cell wall and total yeast lysate preparations may indicate that this enzyme is localized in the yeast cytosol. The metallo-oligopeptidase activity was not detected on in vitro culture supernatants, even after addition of fetal calf serum. However, the peptidase with TOP-like activity of P. brasiliensis seems to be secreted in vivo, or released after fungal lysis by immune factors, since antibodies that can inhibit this enzymatic activity were found in sera from paracoccidioidomycosis patients, and serum with highest titer in immunodiffusion contains higher concentrations of enzymespecific antibodies. Bradykinin, an important inflammatory mediator in vivo, is cleaved by several enzymes from the M3 family. The same fragments observed after hydrolysis by TOP were observed after cytosolic extract hydrolysis of bradykinin and the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp. MIP and bacterial OpdA hydrolysis of these peptides generate different fragments, and this is an additional indicator of a major TOP-like activity in P. brasiliensis yeast cells Bradykinin hydrolysis by the TOP-like metallopeptidase of P. brasiliensis may occur in inflammatory processes and this suggests that the enzyme may be involved in the inhibition of a protective anti-fungal response induction, limiting fungal elimination. We also observed that the expression of the TOP homologous gene in P. brasiliensis has almost a two-fold increased in the virulent isolate 18 compared to the non-virulent isolate. Increased hydrolysis of the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp was also observed in the most virulent isolate compared to the non-virulent. The possible correlation between TOP-like peptidase expression and fungal virulence suggests that this peptidase could be classified as a fungal virulence factor, however, additional experiments are needed to confirm this hypothesis. Gp43 expression was also analyzed in both isolates, and it was observed a thirteen-fold increase in the expression on the virulent isolate. In order to better characterize the P. brasiliensis TOP-like activity, we attempted to obtain the purified recombinant or the native protein, isolated from fungal lysate. However, we were not successful in the expression of recombinant proteins and neither on the isolation of the native protein using chromatographic methods. Our results suggest the presence of a TOP-like activity in the cytosolic fraction of P. brasiliensis yeasts. In vivo release of this enzyme after fungal lysis, or host factors-stimulated secretion, may have a role in inflammation and development of the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:44Z : No. of bitstreams: 1 000851710_20160722.pdf: 735546 bytes, checksum: 011c591d928a97fba211a8ca067ba722 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-25T13:17:40Z: 000851710_20160722.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-25T13:18:47Z : No. of bitstreams: 1 000851710.pdf: 5518013 bytes, checksum: 8a378cf5a8a0a17841f43b423f397e01 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP (PADC) / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células do hospedeiro são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, estes utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. O sucesso de colonização dos tecidos do hospedeiro pelo fungo é um evento complexo, geralmente envolvendo um ligante codificado pelo patógeno (adesinas) e um receptor da célula (freqüentemente um componente da matriz extracelular). A identificação de mecanismos de adesão, invasão ou evasão imune por Paracoccidioides é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Neste intuito o estudo dos passos envolvidos desde o contato inicial de P. brasiliensis até os que culminam com a sua entrada na célula através da caracterização funcional de proteínas de membrana de P. brasiliensis, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de elongação Tu, pertence ao grupo de proteínas denominadas moonlighting, tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. Previamente esta proteína foi identificada em P. brasiliensis por análise proteômica, sendo diferencialmente expressa quanto o fungo foi cultivado na presença de sangue de carneiro, porém esta ainda não foi caracterizada sendo interessante então a elucidação do seu papel na interação deste fungo às células epiteliais. O objetivo deste estudo foi produzir a proteína EF-Tu recombinante e seu respectivo anticorpo policlonal, verificar... / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. The adhesion and host cell invasion are critical events involved in the infection and dissemination of the pathogen. Furthermore, they use their surface molecules to bind to extracellular matrix components to establish infection. The successful colonization of host tissues by the fungus is a complex event, usually involving a linker encoded by the pathogen (adhesins) and a cell receptor (often an extracellular matrix component). The identification of adhesion mechanisms, invasion or immune evasion by P. brasiliensis is extremely important and has been investigated in recent studies developed by several groups. In order to study the steps involved from the initial contact of P.brasiliensis until the culminating in its entry into the host cell through the functional characterization of P. brasiliensis membrane proteins, the main targets of interaction with host molecules, is of great importance. The elongation factor Tu (EF-Tu) belongs to the group of proteins called moonlighting such molecules have the ability to perform more than one function, and typically are located in different compartments of the cell. There are reports that EF-Tu of pathogens can act as a virulence factor. This protein has been previously identified in P. brasiliensis by proteomic analysis, but this has not yet been characterized as being interesting then the elucidation of its role in interacting of the fungus with epithelial cells. For this purpose the aim of this study was to produce the recombinant protein and its respective polyclonal antibody, verify your role in the fungus interaction with pneumocytes, extracellular matrix and plasminogen. Also in order to characterize the EF-Tu protein the present study aimed to obtain isolated with low expression of the gene encoding EF-Tu and with this verifies the role of EF-...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-22Bitstream added on 2014-06-13T18:26:25Z : No. of bitstreams: 1 silva_acap_me_arafcf.pdf: 700931 bytes, checksum: 859de3c2d6bc2ff9e78faf746b707164 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii são fungos dimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, que é uma micose humana sistêmica geograficamente confinada na América Latina. Vários antifúngicos podem ser utilizados para o tratamento dessa doença, tais como anfotericina B, sulfamídicos e azólicos (itraconazol) e de maneira geral seu uso é prolongado. As limitações frequentes dos antifúngicos e o aumento na incidência das infecções fúngicas sistêmicas têm ressaltado a necessidade da descoberta e do desenvolvimento de novos fármacos. O objetivo deste estudo foi comparar a atividade antifúngica de anfotericina B, itraconazol e galatos de alquila anti-complexo de Paracoccidioides por métodos fenotípicos e proteômicos. Para tanto foi padronizado o teste de sensibilidade para selecionar o galato de maior potência, utilizando o documento M27-A2 (2002), modificado pela adição de Alamar Blue. Adicionalmente, análises proteômicas foram realizadas antes e após tratamento com o antifúngico selecionado para verificar o perfil das possíveis proteínas-alvo. A atividade antifúngica foi estudada contra isolados de P. brasiliensis (S1, S2 e PS3) e P. lutzii, (Pb01-like), e depois o teste foi estendido para mais seis isolados. O valor da CIM do ácido gálico variou de 31,25 a 0,250 mg/L para todos os isolados. Os galatos mostraram valores de CIM entre 16 a 0,004 mg/L. O menor valor de CIM foi observado para seis galatos que possuem uma substituição por uma cadeia relativamente longa de carbonos. O perfil proteico dos isolados Pl01 e Pb18 foi estudado por eletroforese 2D após contato com anfotericina B , itraconazol e o galato de decila (todos a uma concentração de 0,125 mg/L. Mais de 130 spots para ambos os fungos foram observados e a maioria destas proteínas... / Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii are dimorphic fungi, etiological agents of paracoccidioidomycosis, which is a systemic human mycosis geographically restricted to Latin America. Various antifungal agents may be used to treat this disease, such as amphotericin B, sulfamidic agents and itraconazole, and these drugs are used in long-term therapies. The limitations of antifungals and increased incidence of systemic fungal infections has underscored the need for discovery and development of new drugs. The objective of this study was to compare the antifungal activity of amphotericin B, itraconazole and alkyl gallates anti-Paracoccidioides complex by phenotypic and proteomic methods. Thus, the susceptibility test was applied to select the most potent gallate, using the document M27-A2 (2002), modified by the addition of Alamar Blue. Finally, proteomic analyses was developed before and after the treatment with the antifungal agent selected, to study the protein profile after this treatment. The antifungal activity was evaluated against isolates of P. brasiliensis (S1, S2 and PS3) and P. lutzii (PB01-like), and after, the test has been extended to six isolates. The MIC values of gallic acid varied from 31.25 to 0.250 mg/L for all isolates. The gallates showed MIC values ranging from 16 to 0,004 mg/L. The lowest MIC value was observed for six gallates bearing a substitution for a long side chain. The protein profile of isolates Pb18 and Pl01 was studied by 2D electrophoresis after contact with amphotericin B, itraconazole and decyl gallate, all in the concentration of (0.125 mg/L ). More than 130 spots for both species were observed, and the most of these proteins... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:53:57Z : No. of bitstreams: 1 angella_af_me_botib.pdf: 1771008 bytes, checksum: 49bffe6b87df00a6ffab3e65cd19bdaa (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de virulência. / The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast (M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis, (including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence and expression of hsp70 gene. It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition. The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70 gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups. Conclusions: Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:13:53Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_rk_me_botfm.pdf: 1449236 bytes, checksum: 7642944fe5ad7bf06d645c01bd3ea971 (MD5) / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica, endêmica na América Latina. As células dendríticas (DCs) desempenham papel crucial na detecção de patógenos, desencadeamento de uma resposta inicial do hospedeiro, assim como na instrução da resposta imune adaptativa. Mediadores liberados pelas DCs, de uma forma autócrina, modulam as suas funções. Entre esses, destacamos as prostaglandinas e leucotrienos. Assim, avaliamos se DCs humanas produzem PGE2 e LTB4 em resposta ao fungo, a participação de receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRRS) nessa produção, assim como o papel modulador desses eicosanóides sobre a maturação fenotipica dessas células e a produção das citocinas IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 e TNF-α. DCs humanas imaturas (CD14- / CD1ahigh / CD83 low) obtidas a partir da diferenciação de monócitos cultivados com GM-CSF e IL-4 (7 dias) liberaram substanciais concentrações de PGE2 e LTB4 que aumentaram significativamente, no caso da PGE2, com incubação com LPS durante 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h ou 48h. No entanto, os níveis de PGE2 e LTB4 foram significativamente inibidos após o desafio com as duas cepas do fungo. Ensaios de bloqueio dos PRRS mostraram que o processo de inibição de PGE2 envolveu o receptor de manose. Adicionalmente, ensaios de fenotipagem mostraram que após o desafio com o fungo, as DCs não alteraram o seu fenótipo de imaturas para o de células maduras. Assim, detectamos uma clara associação entre inibição da produção de PGE2 e LTB4 e a incapacidade do fungo em induzir a maturação de DCs. Ensaios utilizando PGE2 ou LTB4 exógenos confirmaram essa associação. Estas células ainda produzem altos níveis de IL-6... / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis, endemic in Latin America. Dendritic cells (DCs) play a crucial role in the detection of pathogens, triggering an initial response from the host as well as the instruction of the adaptive immune response. Mediators released by DCs, by an autocrine way, modulate their functions. Among these, we highlight the prostaglandins and leukotrienes. We therefore assessed whether human DCs produce PGE2 and LTB4 in response to fungus, the participation of recognition receptors of molecular patterns (PRRS) in this production, as well as the modulating role of these eicosanoids on phenotypic maturation of these cells and the production of the cytokines IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 e TNF-α. Human immature DCs (CD14-/ CD1ahigh/CD83low) derived from the differentiation of monocytes cultured with GMCSF and IL-4 (7 days) released substantial concentrations of PGE2 and LTB4 which increased significantly in the case of PGE2, with incubation with LPS for 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h or 48h. However, the levels of PGE2 and LTB4 were significantly inhibited after challenge with two different strains of the fungus. Trials have shown that blockade of PRRS process involved the inhibition of PGE2 mannose receptor. Additionally, phenotyping assays showed that after challenge with the fungus, DCs did not change their phenotype of immature cells to mature ones. Accordingly, we detected a clear association between inhibition of the production of PGE2 and LTB4 fungus and inability to induce maturation of DCs. Assays using exogenous PGE2 and LTB4 confirmed this association. These cells also produce high levels of IL-6 in response to fungus, which, however, were not associated with inhibition of the production of eisosanóides. Rather than that, these DCs do not produce... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:23Z : No. of bitstreams: 1 000832029.pdf: 1345027 bytes, checksum: 6207079d0ab94cde1a6d3a7db40846f6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Paracoccidiodomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, de alta prevalência no Brasil, que tem como agente etiológico os fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides, P. brasiliensis e P. lutzii. No processo de infecção as adesinas, substâncias sintetizadas por estes fungos que se ligam a matriz extracelular, são importantes fatores de virulência para o estabelecimento da infecção. A proteína de 30kDa, pertencente a família de proteínas 14-3-3, se destaca no processo adesivo deste fungo. As proteínas 14-3-3 são uma família de proteínas presentes em todas as células eucariotas e possuem múltiplas funções. Em P. brasiliensis, a proteína 14-3-3Pb, liga-se a laminina, principal componente da matriz extracelular das células hospedeiras, e durante a infecção sua expressão é aumentada. Com o intuito de compreender melhor a função desta proteína o objetivo deste estudo foi realizar a análise funcional da 14-3-3Pb através da obtenção de um homólogo funcional em S. cerevisiae e análise do anticorpo monoclonal anti-14-3-3Pb. S. cerevisiae foi escolhida como modelo de estudo por ser uma levedura amplamente utilizada na pesquisa genética, ao contrário de P. brasiliensis, e por possuir duas isoformas de 14-3-3, Bmh1p e Bmh2p, com alta identidade com 14-3-3Pb Para obtenção do homólogo funcional, foi realizada a transformação do vetor pYES-14-3-3Pb em S. cerevisiae. A partir da obtenção dos transformantes a avaliação da complementação foi realizada e foi observado uma complementação parcial das proteínas Bmh1p e Bmh2p por 14-3-3Pb. Ainda foram realizados teste de sensibilidade aos antifúngicos e a derivados semissintéticos do ácido gálico, onde foi possível observar um aumento da sensibilidade das linhagens com nocaute para os genes BMH1 e BMH2, S. cerevisiae Δbmh1 e Δbmh2, quando comparado à linhagem selvagem. A análise do anticorpo monoclonal foi realizada através de ensaio... / Paracoccidioidomycosis (PCM) a systemic mycosis endemic in Latin America, with high prevalence in Brazil, has as etiological agent dimorphic fungi Paracoccidioides spp., P. brasiliensis e P. lutzii. During the infection process the adhesins, substances synthetized by fungi that interacts with host's extracellular matrix (ECM), are important virulence factors for the establishment of infection. A 30kDa protein that belongs to 14-3-3 proteins family stands out in the adhesion process of this fungus. The 14-3-3 proteins are present in all eukaryotic cells and play multiple functions. In P. brasiliensis, the 14-3-3Pb protein binds to lamin, the major component of ECM from host cells, and during the infection the expression is increased. In order to have a better understanding of 14-3-3Pb functions the aim of this study is to perform a functional analysis of this protein through achieving a functional homologous in S. cerevisiae and to analyze the monoclonal antibody anti-14-3-3Pb during infection. S. cerevisiae was chosen as model because it's widely use in genetic research, unlike P. brasiliensis, and has two isoforms of 14-3-3 proteins, Bmh1p and Bmh2p, with high identity with 14-3-3Pb. The functional homologous were obtained by yeast transformation of pYES-14-3-3Pb vector. Complementation assay was performed with obtained transformants, and it was observed that 14-3-3Pb partially complements Bmh1p and Bmh2p, with higher complementation of Bmh2p. Also susceptibility assays were performed with antifungal drugs and semi-synthetic compounds derived from gallic acid where it was observed that S. cerevisiae wild type was less sensitive to antifungals than the knockout strains, S. cerevisiae Δbmh1 and Δbmh2. Monoclonal antibody anti14-3-3Pb was evaluated alone and in association with substances with antifungal activities through inhibition adhesion assay, where it was observed that the anti-14-3-3Pb alone is able to inhibit P. brasiliensis ...