Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Érika Rayanne Carvalho (carvalho.erika@ymail.com) on 2009-09-30T03:40:23Z No. of bitstreams: 1 2006_Carine Ribeiro Pessoa.pdf: 968782 bytes, checksum: 645626ff01f51ee15826cfb0d9a84107 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-05T00:15:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Carine Ribeiro Pessoa.pdf: 968782 bytes, checksum: 645626ff01f51ee15826cfb0d9a84107 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-05T00:15:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Carine Ribeiro Pessoa.pdf: 968782 bytes, checksum: 645626ff01f51ee15826cfb0d9a84107 (MD5) Previous issue date: 2006-07 / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é dimórfico e patogênico ao homem. Ele é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica de maior incidência da América Latina. O estabelecimento da infecção é dependente da transição de micélio para levedura e este processo in vitro é reversível e regulado pela mudança de temperatura de 22 °C para 36 °C. O projeto ¿Genoma funcional e diferencial do fungo Paracoccidioides brasiliensis¿ identificou 6.022 PbAEST, que correspondem a genes expressos no fungo, representando aproximadamente 80% do genoma do fungo. Na interação patógeno-hospedeiro, a resposta eficiente do patógeno contra o ataque oxidativo imposto pelas células fagocitárias do hospedeiro facilita a sua sobrevivência no hospedeiro. Os genes potencialmente envolvidos na resposta ao estresse oxidativo em P. brasiliensis, identificados no projeto transcriptoma, foram categorizados em 4 classes: enzimas antioxidantes (12 PbAESTs), biossíntese e metabolismo da glutationa e regeneração de NADPH (11 PbAESTs), homeostase de íons metálicos (3 PbAEST) e fatores transcricionais (7 PbAESTs). Entre as seqüências anotadas no transcriptoma, foram estudadas neste trabalho aquelas que codificam para a CuZn superóxido dismutase GPI-ancorada (PbSOD3) e a citocromo c peroxidase (PbCCP). A superóxido dismutase retira do ambiente radical superóxido produzindo peróxido de hidrogênio e por sua vez, a citocromo c peroxidase, uma das peroxidases existentes nas células, reduz o peróxido de hidrogênio a água. A seqüência de cDNA que codifica para a enzima CuZnSOD GPI-ancorada (PbSOD3) de P. brasiliensis foi completamente seqüenciada. Esta enzima possui massa molecular deduzida de 24,3 kDa e a assinatura característica da família CuZnSOD e da região de ancoragem a GPI na região carboxi-terminal. A análise comparativa das seqüências protéicas PbSOD3 e Sod5 de C. albicans indicou cerca de 40% de similaridade em toda a extensão da proteína, sendo mais conservadas as regiões da assinatura do sítio catalítico e de ancoragem a GPI. A análise no programa PSORT II indicou que a PbSOD3 deve estar localizada na parede celular (34,8% de probabilidade) ou com a mesma probabilidade, na membrana celular. A seqüência de cDNA que codifica para a citocromo c peroxidase (PbCCP) está parcial e a seqüência da proteína deduzida mostra a presença do sítio ativo da peroxidase, sendo bastante conservada quando comparada com CCPs de outros fungos. A análise de Southern blot indicou que os genes que codificam para as enzimas PbSOD3 e CCP estão presentes no genoma do fungo em cópia única. A análise da expressão dos genes que codificam para a PbSOD3 e PbCCP durante a transição dimórfica in vitro, mostrou que ocorreu uma oscilação; entretanto, não ocorreu uma alteração do padrão de expressão significativamente diferente entre as formas de micélio e levedura. Também não foi observada variação significativa da expressão para ambos os genes, em nível transcricional, durante o choque térmico a 42 °C. Os ensaios de medida de atividade enzimática extracelular para a enzima SOD de P. brasiliensis, utilizando o meio de cultura das células de levedura, não detectaram atividade desta enzima, sugerindo que a mesma deve estar associada à parede celular e/ou membrana celular. A atividade enzimática da CCP de P. brasiliensis durante o choque térmico a 42 °C diminuiu em função do tempo de incubação das células de levedura, entretanto os valores ainda eram altos no fim do choque térmico, indicando que provavelmente este patógeno é capaz de responder ao estresse oxidativo durante esta condição de drástica alteração fisiológica. Os dados sugerem fortemente que o P. brasiliensis está apto, desde a forma de micélio, a responder contra as injúrias provocadas pelo estresse oxidativo, uma vez que este patógeno apresenta níveis similares de expressão dos genes sod3 e ccp nas duas formas, micélio e levedura. Experimentos de RNAi ou nocaute dos genes sod3 e ccp de P. brasiliensis devem ser realizados para efetivamente demonstrar a função destas enzimas na proteção contra o estresse oxidativo. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic and human pathogenic fungus. It is the causative agent of paracoccidiodoμycoses (PCM), an endemic disease widespread in Latin América. The establishment of infection depends on the transition from mycelium to yeast form and this process in vitro is reversible and dependent on temperature shifts from 22 C to 36 C. The transcriptome project identified 6.022 PbAEST that corresponds to expressed genes in fungus, representing approximately 80% of fungus genome. This data has allowed the identification of genes related in different biological processes of the fungus such as dimorphism, virulence and pathogenicity. In pathogen−host interaction, an efficient pathogen.s response against oxidative attack imposed from host phagocytic cells facilitates the pathogen survival in host. The genes potentially related in oxidative stress response in P. brasiliensis identified in transcriptoma project were categorized in 4 groups: antioxidant enzymes (12 PbAESTs); biosynthesis and metabolism of glutathione and NADPH regeneration (11 PbAESTs); ions homeostasis (3 PbAESTs) and transcription factors (7 PbAESTs). Among the annoted sequences in transcriptome, that ones coding for enzymes superoxide dismutase GPI−anchored (PbSOD3) and cytochrome c peroxidase (PbCCP) were analyzed in this study. The enzyme superoxide dismutase removes superoxide radical producing hydrogen peroxide and cytochroμe c peroxidase, one of peroxidases existing in cells, reduces hydrogen peroxide to water. The cDNA sequence coding for CuZnSOD GPI−anchored enzyμe from P. brasiliensis was completely sequenced. The deduced amino acid sequence of PbSOD3 has the molecular mass predicted of 24,3 kDa and pI of 6,05; furthermore, it has the protein signature of CuZnSOD family and a region for GPI anchoring in carboxyl−terminus. The comparative analysis of protein sequences of PbSOD3 and Sod5 of C. albicans indicated approximately 40% of similarity for the entire protein, where the most conserved regions are catalytic site of enzyme and GPI anchoring. The PSORTII program analysis revealed that PbSOD3 may be located in cell wall (34,8% of probability) or membrane plasmatic with the same probability. The cDNA sequence coding for cytochroμe c peroxidase is parcial and the protein deduced sequence has the active site of peroxidases and this region is very conserved when compared with CCPs of other fungi. The Southern blot analysis revealed that the genes coding for enzymes PbSOD3 and PbCCP are present as single copies in the fungus genome. The expression analysis of the same genes demonstrated an oscillation during dimorphic transition in vitro, however, do not occur any significantly difference in the gene expression pattern between mycelium and yeast forms. Also, it has not shown any significant difference in gene expression pattern during heat shock at 42 C, at transcriptional level, for both genes. The extracellular enzymatic activity assay, using yeast culture medium (or supernatant), was done to verify P. brasiliensis SOD activity with no activity detected. This result suggests that this enzyme may be associated to cell wall and/or plasmatic membrane. The enzymatic activity of P. brasiliensis CCP during heat shock at 42 C decreases in function of incubation time of yeast cells, but the values remained high at the end of heat shock, indicating that probably this pathogen is able to respond to oxidative stress during this drastic physiological change. These data strongly suggest that P. brasiliensis is capable, since mycelium form, to counteract injuries from oxidative stress, because this pathogen presents siμilar levels of gene expression for sod3 and ccp in mycelium and yeast forms. Experiments in vitro and in vivo through gene silencing (RNAi) or nocaute may be designed utilizing P. brasiliensis sod3 e ccp genes to efficiently determine if these enzimes are important to protect against oxidative stress.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-12T16:32:11Z No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo patogênico e dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul. O fungo ocorre na natureza na forma de micélio, na temperatura de 26ºC, e na forma de levedura, na temperatura de 37ºC in vitro, sendo esta a forma encontrada nos tecidos de hospedeiros. A transição dimórfica da forma miceliana para a de levedura parece ser essencial para a patogênese, como também observado para outros fungos patogênicos e dimórficos. O projeto "Genoma Funcional e Diferencial do Fungo P. brasiliensis", realizado sob coordenação de nosso laboratório, foi empreendido a partir do seqüenciamento de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura cultivadas in vitro. No contexto desse trabalho, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir do RNA total de P. brasiliensis obtido após seis horas de co-cultivo com células de macrófagos peritoneais murinos, sem qualquer cultivo adicional do fungo in vitro. A análise do perfil transcricional desse fungo a partir dessa biblioteca de cDNA, denominada PbY-MF, visa melhor compreender o padrão de expressão de genes potencialmente importantes para a adaptação e sobrevivência de P. brasiliensis no modelo de infecção. Nesse sentido, esse trabalho iniciou a caracterização do transcriptoma de P. brasiliensis recuperado de macrófagos, pelo seqüenciamento de cDNAs da biblioteca PbY-MF. A partir da submissão das seqüências ao pipeline de análise, um total de 474 ESTs de qualidade (PHRED ³ 20 e tamanho ³ 100 nt), foram geradas e analisadas. Após agrupamento pelo CAP3, essas ESTs foram agrupadas em 16 contigs e 99 singlets. Análises de similaridades empregando os bancos de dados do projeto transcriptoma de P. brasiliensis, GeneBank nr e dbEST, utilizando as ferramentas Blastn e Blastx, foram realizadas. Os resultados dessa análise revelam que 355 ESTs, agrupadas em 4 contigs e 16 singlets, apresentaram similaridades com seqüências já descritas para o fungo P. brasiliensis, sendo a maioria relacionada com genes da maquinaria traducional mitocondrial. Cinco contigs e sete singlets, ainda não descritos em P. brasiliensis, apresentaram similaridades com seqüências de outros organismos, sendo que a maioria também mostrava similaridade com genes mitocondriais que codificam proteínas da cadeia de transporte de elétrons. Das 474 ESTs analisadas no contexto desse trabalho, seis contigs e 63 singlets não apresentaram similaridades com nenhuma seqüência descrita nos bancos de dados empregados nessa análise, correspondendo a genes novos potencialmente específicos de P. brasiliensis. Em adição, nesse trabalho também foi realizada a análise de quatro contigs que apresentam similaridades com o gene de isocitrato liase (icl), o qual codifica uma proteína chave do ciclo do glioxilato, que mostra-se ativado em diferentes modelos de células de mamíferos infectadas por patógenos intracelulares facultativos. Essas contigs foram identificadas no transcriptoma de P. brasiliensis cultivado in vitro. Nesse sentido, foram realizados o seqüenciamento adicional de clones de cDNAs relacionados a essas contigs, análises de similaridade dessas seqüências e experimentos de Southern blot. Os resultados sugerem que três contigs, apresentando similaridade com uma mesma seqüência de isocitrato liase do fungo Coccidioides immitis, representam provavelmente um mesmo transcrito de P. brasiliensis, enquanto a quarta contig apresenta maior similaridade com o gene metilisocitrato liase do fungo Emericella nidulans. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracocidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Dimorphic transition is triggered by a temperature shift from the environmental 26 ºC, in which the fungus is found as a free-living mycelium, to the 37 ºC of the human host, when it changes to the pathogenic yeast form. The dimorphic transition is believed to play an essential role in pathogenesis, as described for other dimorphic pathogenic fungi. The project "Functional and Differential Genomics of the P. brasiliensis fungus", coordinated by our laboratory, has performed the sequencing of cDNA libraries from in vitro grown yeast and mycelium cells, resulting in 19,718 expressed sequence tags (ESTs) from in vitro cultivated yeast (9,941 ESTs) and mycelium (9,777 ESTs). The CAP3 clusterization software has assembled these raw sequence data into 2,655 contigs and 3,367 singlets. In order to better understand the expression of genes potentially involved in P. brasiliensis adaptation and survival in an infection model, in this work we describe the construction of a cDNA library using as template mRNA extracted from a six-hour co-culture of P. brasiliensis yeast cells and murine peritoneal macrophages, named PbY-MΦ. The sequencing of the PbY-MΦ library generated 474 ESTs that suited inclusion criteria of PHRED ≥ 20 and size greater than 100 nucleotides, which were clustered into 16 contigs and 99 singlets. BLAST-analysis against the P. brasiliensis transcritpome project, nr and dbEST databases, grouped 355 ESTs into four contigs and 16 singlets similar to previously described P. brasiliensis sequences, most of them corresponding to components of the mitochondrial translation apparatus. Five contigs and seven singlets, which were not described in P. brasiliensis, were found to be similar to sequences described in other organisms, with most of them implicated in the mitochondrial electron transport chain. Six contigs and 63 singlets were unique in that they had no homology to known sequences. In addition, we have performed a better characterization of four contigs described in the in vitro transcriptome, which were similar to the isocitrate lyase gene (icl), an enzyme of the glyoxylate cycle. Sequencing, similarity analysis and southern blotting experiments of these contigs suggest that three of them correspond to the isocitrate lyase from Coccidioides immitis, while the fourth is related to a methyl-isocitrate lyase gene from Emericella nidulans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-20T15:12:33Z No. of bitstreams: 1 2014_MirelleGarciaSilva.pdf: 8419912 bytes, checksum: e5ccd631407cc5bd54f8bdefba044458 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-20T15:39:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MirelleGarciaSilva.pdf: 8419912 bytes, checksum: e5ccd631407cc5bd54f8bdefba044458 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-20T15:39:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MirelleGarciaSilva.pdf: 8419912 bytes, checksum: e5ccd631407cc5bd54f8bdefba044458 (MD5) / O gênero Paracoccidioides inclui espécies fúngicas termodimórficas, causadoras da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica endêmica da América Latina. A infecção ocorre quando propágulos micelianos ou conídios são inalados pelo hospedeiro. Após conversão para levedura nos alvéolos pulmonares o fungo pode disseminar-se para outros órgãos e tecidos. O ferro é um micronutriente essencial para todos os eucariotos, pois participa de vários processos biológicos essenciais. Entretanto, a biodisponibilidade deste metal dentro do hospedeiro é baixa. Como consequência, micro-organismos patogênicos desenvolveram mecanismos de aquisição de alta afinidade como forma de obter ferro durante a infecção. O presente trabalho descreve a aquisição de ferro mediada por sideróforos neste fungo. Análises in silico demonstraram que as espécies do gênero Paracoccidioides possuem todos os genes necessários para síntese e captação de sideróforos, os quais são produzidos em condições de depleção de ferro. Análises de cromatografia líquida de fase reversa e espectrometria de massas revelaram que Paracoccidioides spp. produz sideróforos do tipo hidroxamato. O fungo sintetiza e secreta coprogeno B, o qual gera ácido dimerúmico como produto de degradação, e também produz ferricrocina e ferricromo C como sideróforos intracelulares. Adicionalmente, Paracoccidioides spp. é capaz de crescer na presença de sideróforos como única fonte de ferro, demonstrando que além de produzir, o fungo também utiliza siderofóros para o crescimento, incluindo o xenosideróforo ferrioxamina. A exposição prévia a ferrioxamina aumentou a sobrevivência de Paracoccidioides spp. após fagocitose por macrófagos ativados. Além disso, o fungo provavelmente induz a síntese de sideróforos quando no interior destas células, demonstrando que estas moléculas provavelmente desempenham papel importante durante a interação patógeno-hospedeiro. Ademais, sideróforos produzidos por Paracoccidioides spp. podem ser utilizados como fontes de ferro por Aspergillus nidulans. Em conjunto, estes dados demonstraram que a síntese e a utilização de sideróforos são mecanismos empregados por Paracoccidioides spp. para superar a limitação de ferro. Como a escassez deste micronutriente é encontrada no hospedeiro, a produção de sideróforos está provavelmente relacionada à patogenicidade e virulência do fungo e representa um possível alvo para terapia com antifúngicos levando-se em consideração a ausência de tal via em humanos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genus Paracoccidioides includes termodimorphic fungal species which causes paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis endemic in Latin America. The infection occurs when mycelium propagules or conidia are inhaled by the host. After conversion to yeast in the alveoli the fungus may disseminate to other organs and tissues. Iron is an essential micronutrient for all eukaryotes, since it participates in a variety of essential biological processes. However, the bioavailability of this metal is low inside the host. As a consequence, pathogenic microorganisms evolved high affinity acquisition mechanisms to obtain iron during infection. Here we describe the siderophore mediated iron acquisition in this fungus. In silico analysis demonstrated that species from Paracoccidioides genus possess all the necessary genes for synthesis and uptake of siderophores, which are produced under iron limiting conditions. Reversed phase liquid chromatography and mass spectrometry analysis revealed that Paracoccidioides spp. produce siderophores of hydroxamate type. The fungus synthesizes and secretes coprogen B, which generates dimerumic acid as a breakdown product, and also produces ferricrocin and ferrichrome C as intracellular siderophores. Moreover, Paracoccidioides spp. is able to grow in presence of siderophores as the only iron sources, demonstrating that beyond producing, the fungus also utilizes siderophores for growth, including the xenosiderophore ferrioxamine. Previous exposure to ferrioxamine increased Paracoccidioides spp. survival following phagocytosis by activated macrophages. Moreover, the fungus probably induces siderophore synthesis inside these cells, demonstrating that these iron chelators play an important role during host-pathogen interaction. Additionally, siderophores produced by Paracoccidioides spp. can be utilized as iron sources by Aspergillus nidulans. Altogether, these data demonstrated that synthesis and utilization of siderophores are mechanisms employed by Paracoccidioides spp. to surpass iron limitation. As iron paucity is found within the host, siderophore production may be related to fungus pathogenicity and virulence and represents a possible target for antifungal therapy since these pathway is absent in humans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:29:13Z No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo patogênico humano, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). P. brasiliensis apresenta dimorfismo térmico, apresentando-se sob a forma miceliana a temperaturas inferiores a 28 ºC e sob a forma leveduriforme no hospedeiro humano e em temperaturas superiores à 28 ºC. Proteases são enzimas que clivam proteínas e desempenham funções como o processamento intracelular e a clivagem de proteínas do meio extracelular para obtenção de nitrogênio. Em microrganismos patogênicos proteases podem atuar como fatores de virulência, clivando proteínas do hospedeiro para facilitar a penetração pelos tecidos. No presente trabalho, foi realizado o rastreamento e identificação de proteases em banco de dados de ESTs oriundas de células leveduriformes de P. brasiliensis. Foram detectadas 53 ORFs codificantes para proteases. As seqüências preditas de aminoácidos foram obtidas e classificadas por homologia em banco de dados de proteases, sendo agrupadas em 3 aspartil, 8 cisteíno proteases, 10 metalo-, 10 serino proteases e 22 proteínas relacionadas às subunidades proteassomais. O presente trabalho inclui também o rastreamento e a identificação de ESTs codificantes de proteínas relacionadas à síntese e ao processamento de proteínas em banco de dados de ESTs oriundas de células de P. brasiliensis durante a transição dimórfica de micélio para levedura por 22 horas. Foram identificadas 200 ORFs apresentando homologia com seqüências codificantes a proteínas relacionadas aos processos de síntese e processamento de proteínas. Destas, 16 ORFs codificam para genes não descritos anteriormente em P. brasiliensis. Foi possível identificar ESTs que compõem subunidades ribossomais, assim como fatores de iniciação transcricional induzidos durante a transição dimórfica, sugerindo um aumento no nível de proteínas sintetizadas durante este processo. Também foram identificadas ESTs codificantes para chaperonas, para glicosiltransferases e para proteínas relacionadas com a aceleração do enovelamento de proteínas, sugerindo aumento da produção e do controle de qualidade durante a transição dimórfica de micélio para células leveduriformes. Alguns genes codificantes para proteases são induzidos após a indução da transição termodimórfica: uma aspartil protease A01, uma lon protease S16 e uma metaloprotease M28, o que sugere aumento dos processos de controle de qualidade das proteínas produzidas e da aquisição de aminoácidos do meio extracelular. Uma serino protease S08 foi caracterizada. As seqüências de nucleotídeos (Pbsp) e aminoácidos (PbSP) foram obtidas e analisadas. O cDNA codificante para Pbsp foi clonado em vetor de expressão para sistema bacteriano e a proteína recombinante foi utilizada para obtenção de anticorpo policlonal em camundongos. O anticorpo policlonal reconheceu especificamente uma espécie protéica de 66 kDa em extrato protéico e em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP seja uma molécula secretada. Ensaios de deglicosilação in vitro com endoglicosidase H demonstraram que PbSP é uma molécula N-glicosilada. PbSP tem seu nível de expressão induzido durante a privação de nitrogênio tanto em extrato protéico quanto em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP tenha importância na captação de nitrogênio. A expressão de Pbsp é aumentada durante a internalização de células leveduriformes por macrófagos murinos, sugerindo a importância do produto deste gene na resposta adaptativa de P. brasiliensis à internalização por macrófagos. A interação de PbSP com moléculas de P. brasiliensis foi avaliada utilizando o sistema de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisiae. Proteínas relacionadas com enovelamento protéico, controle de qualidade e destinação de proteínas, além de uma proteína de parede celular de P. brasiliensis foram identificadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a human pathogenic fungus, the causative agent of paracoccidioidomycose (PCM). P. brasiliensis is a thermodimorphic fungus presents as mycelium form in temperatures below 28º C and as yeast form in the human host and in temperatures above 28ºC. Proteases are enzymes that cleave proteins and are related to the intracellular protein processing and cleavage of extracellular proteins to nitrogen acquisition. In pathogenic microorganisms proteases could act as virulence factors by cleaving host proteins facilitating the invasion process in the host tissues. The present work identified proteases in ESTs database constructed with cDNAs sequences of P. brasiliensis yeast form. It was detected 53 ORFs encoding proteases. The predicted amino acids sequences were obtained and classified by homology in protease database: 3 sequences were classified as aspartil, 8 as cysteine, 10 as metallo-, 10 as serino and 22 proteins related to proteasomal subunits. The present work also includes the identification of ESTs encoding proteins related to protein synthesis and processing in ESTs database of P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast cells. It was identified 200 ORFs presenting homology to sequences encoding proteins related to protein synthesis and processing. Sixteen ORFs were described as novel genes of P. brasiliensis. It was identified ESTs related to ribosomal subunits and initiation transcription factors, suggesting intense synthesis of new ribosome particles, affecting the rate of protein synthesis. It was identified ESTs encoding chaperones, glycosiltransferases and proteins related to acceleration of protein folding, suggesting high protein production and high quality control in the protein production during transition from mycelium to yeast cells in P. brasiliensis. Transcripts encoding proteases were induced in P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast: an aspartil protease A01, a lon protease S16 and a metaloprotease M28. The higher expression of these genes during transition in P. brasiliensis suggests high control quality of proteins and nitrogen acquisition. A serine protease S08 was characterized. The cDNA (Pbsp) and deduced amino acids (PbSP) sequences were obtained and analyzed. Pbsp was cloned into expression vector in bacterial system and used to generate polyclonal antibody in mice. The polyclonal antibody recognized specifically a 66 kDa protein species in protein extracts and culture supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is a secreted molecule. In vitro deglycosylation assays with endoglycosidase H demonstrated that PbSP is a N-glycosylated molecule. PbSP is increased during nitrogen starvation both in protein extracts and cultures supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is important in nitrogen acquisition. Pbsp expression was induced during internalization of P. brasiliensis yeast cells by murine macrophages, suggesting the Pbsp product is important in the P. brasiliensis adaptative response to macrophage internalization. PbSP interaction with P. brasiliensis proteins was evaluated by two-hybrid assay in Saccharomyces cerevisiae. Proteins related to protein folding, quality control of translation, protein destination and a cell wall protein of P. brasiliensis were identified.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), que acomete preferencialmente o pulmão, sendo este um dos poucos órgãos que está em continua e intensa interação com o meio ambiente e o sistema imune. O grande desafio para o sistema imune pulmonar é discriminar o que é nocivo e reagir de acordo. As células dendríticas (DCs) são apresentadoras de antígenos \"profissionais\" capazes de fazer o processamento do antígeno e a apresentação de peptídeos a linfócitos T e são ideais para manter este equilíbrio delicado entre a tolerância e uma resposta imune efetora. Sabendo da importância dessas células no sistema imune e que a infecção por P. brasiliensis ataca preferencialmente o pulmão, células de lavado broncoalveolar (BAL), após infecção experimental com leveduras de P. Brasiliensis, foram analisadas. Nós observamos um significante aumento de DCs no BAL após 24hrs da infecção intratraqueal com 104 leveduras de P. brasiliensis. A caracterização das DCs mostraram que essas células expressaram CD11c, MHC-II e DEC205. A fim de verificar a capacidade de migração das DCs, as mesmas foram diferenciadas a partir de células de medula óssea e pulsadas com leveduras de P. brasiliensis, marcadas com CFSE e injetadas intratraquealmente em camundongos. Como controle negativo, utilizamos PBS e DCs não pulsadas com o fungo. Os resultados mostraram, que após 12 horas de infecção, as DCs (CFSE+CD11c+), migraram para os linfonodos torácicos. No entanto, a quantidade destas células diminui discretamente após 24 horas de infecção. Além disso, não observamos DCs nos linfonodos regionais, quando analisamos os grupos controle. Dessa forma, as células pulmonares também foram marcadas in vivo injetando-se intratraquealmente o corante CFSE juntamente com leveduras de P. brasiliensis. Verificamos que após 12 horas, as DCs pulmonares, dos animais infectados com o fungo, migraram para os linfonodos regionais. Esses resultados comprovam que o fungo P. brasiliensis foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para linfonodos regionais, e induziu nesse órgão uma resposta por células T evidenciada pela produção preferencial de IL-10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), which mainly affects the lungs. They are one of the few organs that are in constant and intense interaction with the environment and the immune system. The great challenge for the pulmonary immune system is to discriminate what is harmful and react accordingly. Dendritic cells (DCs) are \"professionals\" antigen-presenting cells and they can do the antigen processing. They can also do the presentation of peptides to T lymphocytes and are ideal for maintaining this delicate balance between tolerance and an effector immune response. Knowing the importance of these cells in the immune system and that the infection by P. brasiliensis preferentially attacks the lungs, cells from bronchoalveolar lavage (BAL), after experimental infection with yeasts of P. Brasiliensis, were analyzed. We observed a significant increase of DCs in BAL after 24 hours of intratracheal infection with 104 of yeast cells of P. brasiliensis. The characterization of these cells showed that DCs expressed CD11c, MHC-II and DEC205. In order to verify the ability of migration of DCs, they were differentiated from bone marrow cells and pulsed with yeasts of P. brasiliensis, they were also labeled with CFSE and injected intratracheally into mice. As a negative control, we used PBS and DCs that were not pulsed with the fungus. The results showed that after 12 hours of infection, the DCs (CFSE + CD11c +), migrated to the thoracic lymph nodes. However, the quantity of these cells decreases slightly after 24 hours of infection. Furthermore, we observed no DCs in regional lymph nodes when we analyzed the control groups. Thus, the lung cells were also labeled in vivo by injecting the CFSE dye intratracheally with yeasts of P. brasiliensis. We found that after 12 hours, pulmonary DCs of the animals infected with the fungus migrated to regional lymph nodes. These results indicate that the fungus P. brasiliensis was able to activate DCs, inducing their migration to regional lymph nodes, and inducing a response in that organ by T cells as evidenced by preferential production of IL-10.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica de natureza profunda e granulomatosa, que afeta preferencialmente o tecido pulmonar causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, um fungo que exibe dimorfismo térmico. O P. brasiliensis interage com células apresentadoras de antígenos (APCs), alterando suas principais funções biológicas. Entre as APCs, os macrófagos são células que desempenham um papel importante na indução e regulação da resposta imune e/ou inflamatória. São células do sistema fagocítico mononuclear que podem discriminar entre o que é próprio do organismo e os patógenos, através da expressão de receptores de reconhecimento padrão (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs), sendo células importantes no processo de fagocitose controlando o crescimento destes patógenos. Recentemente tem sido demonstrada a importância dos receptores Notch na regulação da atividade de macrófagos e do sistema imune. Os ligantes de Notch estão envolvidos nas locais inflamatórios de infecção devido ao aumento da expressão dos mesmos na superfície de células envolvidas neste processo. Considerando que a sinalização Notch pode estar envolvida na modulação da função de macrófagos, nós avaliamos se P. brasiliensis tem a capacidade de modular a ativação desta via e interferir na produção de citocinas pró-inflamatórias. Para isso, macrófagos J774, pré-estimulados com LPS ou não, foram interagidos com leveduras do fungo, seguido por análise de PCR em tempo real e citometria de fluxo, dosagem de citocinas e índice de fagocitose. Nossos dados revelaram que na presença do fungo existe aumento dos níveis de transcrição do receptor Notch 1 e diminuição da transcrição do ligante Delta 4 em macrófagos pré-estimulados com LPS. Entretanto, verificamos que o fungo sozinho não é capaz de induzir a transcrição de NF-κB, nem na presença do LPS, mas quando os macrófagos são estimulados com LPS e sofrem inibição da via de Notch existe aumento dos níveis de transcritos após interação com o fungo, sugerindo que esse fator é ativado na ausência de Notch. Nesse contexto de inibição de Notch, evidenciamos que a fagocitose de leveduras do fungo por macrófagos tornou-se mais eficiente, visto que houve aumento do índice de fagocitose na ausência de Notch. Foi possível verificar que o fungo tem a capacidade de promover a produção de IL-6 via TLR-Notch, fazendo-nos supor que essa citocina seja importante para o estabelecimento da doença ao ser benéfica para o fungo e prejudicar o hospedeiro. E concomitantemente ao aumento de IL-6 existe diminuição da produção de TNF-α. Com base nesses resultados, podemos sugerir que o P. brasiliensis utiliza a via de sinalização Notch como um mecanismo de escape. A interação entre as leveduras do fungo e os macrófagos promove a ativação dessa via, através do receptor Notch 1, induzindo maior produção de IL-6, citocina importante para o crescimento do fungo no hospedeiro, conjuntamente com a diminuição de TNF-α prejudicando a atividade fungicida dos macrófagos. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis and deep granulomatous in nature, which affects mainly the lung tissue caused by Paracoccidioides brasiliensis, a fungus that exhibits thermal dimorphism. The P. brasiliensis interacts with antigen presenting cells (APCs), changing its main biological functions. Among the APCs, macrophages are cells that play an important role in the induction and regulation of the immune response and/or inflammatory response. They are cells of the mononuclear phagocytic system that can discriminate between what is characteristic of the organisms and pathogens, by expression of pattern recognition receptors (PRR) that recognizes the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs), and are considered cells important in phagocytosis for controlling the growth of these pathogens. It has been recently demonstrated the importance of the Notch receptor in regulating the activity of macrophages and of the immune system. The ligands of Notch are involved in inflammatory sites of infection because there are increased expression of these ligands on cell surface involved in this process. Whereas the Notch signaling may be involved in modulating macrophage function, we evaluated whether P. brasiliensis has the ability to modulate the activation of this pathway and interfere with the production of pro-inflammatory cytokines. For this, J774 macrophages, pre-stimulated with LPS or not, are interacted with yeast fungus, followed by Real Time PCR analysis and flow cytometry, cytokine and phagocytosis index. Our data showed that the presence of the fungus exists increased levels of transcription of the Notch 1 receptor, and a decrease in ligand Delta 4 transcription on macrophages pre-stimulated with LPS. However, we found that the fungus itself is not able to induce transcription NF-κB, even in the presence of LPS, but when macrophages are stimulated with LPS and suffer inhibition of the Notch signaling, exists increased levels of transcripts after interaction with the fungus, suggesting that this factor is activated in the absence of Notch. Within the context of inhibition of Notch, we found that phagocytosis of yeasts by macrophages become more efficient, since the increased rate of phagocytosis in the absence of Notch. It was verified that the fungus has the ability to promote the production of IL-6 via TLR-Notch, making us suppose that this cytokine is important for the establishment of the disease to be beneficial for the fungus and damage the host. And concurrently with increased IL-6 there is decreased production of TNF-α. Based on these results, we suggest that P. brasiliensis uses the Notch signaling pathway as an escape mechanism. The interaction between the yeasts with macrophages promotes the activation of this pathway, by means of a Notch 1 receptor, inducing increased production of IL-6 cytokine important for the growth of fungus on host, together with a reduction of TNF-α, contributing with a damaging fungicidal activity of macrophages.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-13Bitstream added on 2014-06-13T20:12:17Z : No. of bitstreams: 1 balderramas_ha_me_botfm.pdf: 358097 bytes, checksum: c417b922a0a5cb167dc7ed65911f38d6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Leucotrienos são mediadores clássicos da resposta inflamatória, descritos como agentes quimiotáticos e reguladores da atividade microbicida de células do sistema imune inato, tendo papel protetor contra diferentes agentes infecciosos. Neste estudo, nós investigamos o envolvimento de leucotrienos no curso da paracoccidioidomicose murina a partir dos seguintes parâmetros imunológicos: influxo celular, atividade da mieloperoxidase, produção de NO, produção de citocinas e recuperação fúngica em pulmões de camundongos selecionados de acordo com a intensidade da sua resposta inflamatória aguda máxima (AIRmax) e mínima (AIRmin). Observamos que a infecção por P. brasiliensis induz considerável produção de citocinas IL-6, IL-10, IFN- e TNF-, promove o recrutamento celular e produção de NO nos pulmões em diferentes períodos de estudo. Nos animais tratados com um inibidor as síntese de leucotrienos (MK886) observamos uma menor produção das citocinas IFN-, IL-6 e TNF- concomitante com a queda do influxo de neutrófilos, e também diminuição na produção de NO, esses resultados podem explicar uma maior carga fungica nos pulmões de animais que tiveram a síntese de leucotrienos inibida, sugerindo aos leucotrienos um possível papel protetor na paracoccidioidomicose experimental. Animais da linhagem AIRmax apresentaram menor carga fungica quando comparado com animais AIRmin, este resultado pode ser relacionado ao fenótipo da AIR quanto à migração de neutrófilos, além de uma menor produção de NO e citocinas pró-inflamatórias, conferindo aos camundongos com background AIRmax maior resistência a infecção por P.brasiliensis. / Leukotrienes are classic inflammatory response mediators considered chemotactic agents and microbicide activity regulators in cells of the innate immune system, playing a protective role against different infectious agents. In this study, we investigated the involvement of leukotrienes in the course of murine paracoccidioidomycosis based on the following immunologic parameters: cell influx, mieloperoxydase activity, NO production, cytokine production, and fungal recovery in lungs of mice selected according to the intensity of their low (AIRmin) and high (AIRmax) acute inflammatory response. Infection by P. brasiliensis induced considerable production of the cytokines IL-6, IL-10, IFN-, and TNF-, and led to cell recruitment, as well as NO production, in lungs at different study periods. In animals treated with MK886, a leukotriene biosynthesis inhibitor, IFN-, IL-6 and TNF- production was lower, while neutrophil influx and NO production decreased. These results may explain the higher fungal load in lungs of animals in which leukotriene synthesis was inhibited, suggesting that leukotrienes have a possible protective role in experimental paracoccidioidomycosis. AIRmax animals had lower fungal load relative to AIRmin ones, which can be related to the AIR phenotype regarding neutrophil migration, besides lower production of NO and pro-inflammatory cytokines; thus, mice presenting AIRmax background are more resistant to infection by P.brasiliensis.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica de natureza profunda e granulomatosa, que afeta preferencialmente o tecido pulmonar causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, um fungo que exibe dimorfismo térmico. O P. brasiliensis interage com células apresentadoras de antígenos (APCs), alterando suas principais funções biológicas. Entre as APCs, os macrófagos são células que desempenham um papel importante na indução e regulação da resposta imune e/ou inflamatória. São células do sistema fagocítico mononuclear que podem discriminar entre o que é próprio do organismo e os patógenos, através da expressão de receptores de reconhecimento padrão (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs), sendo células importantes no processo de fagocitose controlando o crescimento destes patógenos. Recentemente tem sido demonstrada a importância dos receptores Notch na regulação da atividade de macrófagos e do sistema imune. Os ligantes de Notch estão envolvidos nas locais inflamatórios de infecção devido ao aumento da expressão dos mesmos na superfície de células envolvidas neste processo. Considerando que a sinalização Notch pode estar envolvida na modulação da função de macrófagos, nós avaliamos se P. brasiliensis tem a capacidade de modular a ativação desta via e interferir na produção de citocinas pró-inflamatórias. Para isso, macrófagos J774, pré-estimulados com LPS ou não, foram interagidos com leveduras do fungo, seguido por análise de PCR em tempo real e citometria de fluxo, dosagem de citocinas e índice de fagocitose. Nossos dados revelaram que na presença do fungo existe aumento dos níveis de transcrição do receptor Notch 1 e diminuição da transcrição do ligante Delta 4 em macrófagos pré-estimulados com LPS. Entretanto, verificamos que o fungo sozinho não é capaz de induzir a transcrição de NF-κB, nem na presença do LPS, mas quando os macrófagos são estimulados com LPS e sofrem inibição da via de Notch existe aumento dos níveis de transcritos após interação com o fungo, sugerindo que esse fator é ativado na ausência de Notch. Nesse contexto de inibição de Notch, evidenciamos que a fagocitose de leveduras do fungo por macrófagos tornou-se mais eficiente, visto que houve aumento do índice de fagocitose na ausência de Notch. Foi possível verificar que o fungo tem a capacidade de promover a produção de IL-6 via TLR-Notch, fazendo-nos supor que essa citocina seja importante para o estabelecimento da doença ao ser benéfica para o fungo e prejudicar o hospedeiro. E concomitantemente ao aumento de IL-6 existe diminuição da produção de TNF-α. Com base nesses resultados, podemos sugerir que o P. brasiliensis utiliza a via de sinalização Notch como um mecanismo de escape. A interação entre as leveduras do fungo e os macrófagos promove a ativação dessa via, através do receptor Notch 1, induzindo maior produção de IL-6, citocina importante para o crescimento do fungo no hospedeiro, conjuntamente com a diminuição de TNF-α prejudicando a atividade fungicida dos macrófagos. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis and deep granulomatous in nature, which affects mainly the lung tissue caused by Paracoccidioides brasiliensis, a fungus that exhibits thermal dimorphism. The P. brasiliensis interacts with antigen presenting cells (APCs), changing its main biological functions. Among the APCs, macrophages are cells that play an important role in the induction and regulation of the immune response and/or inflammatory response. They are cells of the mononuclear phagocytic system that can discriminate between what is characteristic of the organisms and pathogens, by expression of pattern recognition receptors (PRR) that recognizes the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs), and are considered cells important in phagocytosis for controlling the growth of these pathogens. It has been recently demonstrated the importance of the Notch receptor in regulating the activity of macrophages and of the immune system. The ligands of Notch are involved in inflammatory sites of infection because there are increased expression of these ligands on cell surface involved in this process. Whereas the Notch signaling may be involved in modulating macrophage function, we evaluated whether P. brasiliensis has the ability to modulate the activation of this pathway and interfere with the production of pro-inflammatory cytokines. For this, J774 macrophages, pre-stimulated with LPS or not, are interacted with yeast fungus, followed by Real Time PCR analysis and flow cytometry, cytokine and phagocytosis index. Our data showed that the presence of the fungus exists increased levels of transcription of the Notch 1 receptor, and a decrease in ligand Delta 4 transcription on macrophages pre-stimulated with LPS. However, we found that the fungus itself is not able to induce transcription NF-κB, even in the presence of LPS, but when macrophages are stimulated with LPS and suffer inhibition of the Notch signaling, exists increased levels of transcripts after interaction with the fungus, suggesting that this factor is activated in the absence of Notch. Within the context of inhibition of Notch, we found that phagocytosis of yeasts by macrophages become more efficient, since the increased rate of phagocytosis in the absence of Notch. It was verified that the fungus has the ability to promote the production of IL-6 via TLR-Notch, making us suppose that this cytokine is important for the establishment of the disease to be beneficial for the fungus and damage the host. And concurrently with increased IL-6 there is decreased production of TNF-α. Based on these results, we suggest that P. brasiliensis uses the Notch signaling pathway as an escape mechanism. The interaction between the yeasts with macrophages promotes the activation of this pathway, by means of a Notch 1 receptor, inducing increased production of IL-6 cytokine important for the growth of fungus on host, together with a reduction of TNF-α, contributing with a damaging fungicidal activity of macrophages.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), que acomete preferencialmente o pulmão, sendo este um dos poucos órgãos que está em continua e intensa interação com o meio ambiente e o sistema imune. O grande desafio para o sistema imune pulmonar é discriminar o que é nocivo e reagir de acordo. As células dendríticas (DCs) são apresentadoras de antígenos \"profissionais\" capazes de fazer o processamento do antígeno e a apresentação de peptídeos a linfócitos T e são ideais para manter este equilíbrio delicado entre a tolerância e uma resposta imune efetora. Sabendo da importância dessas células no sistema imune e que a infecção por P. brasiliensis ataca preferencialmente o pulmão, células de lavado broncoalveolar (BAL), após infecção experimental com leveduras de P. Brasiliensis, foram analisadas. Nós observamos um significante aumento de DCs no BAL após 24hrs da infecção intratraqueal com 104 leveduras de P. brasiliensis. A caracterização das DCs mostraram que essas células expressaram CD11c, MHC-II e DEC205. A fim de verificar a capacidade de migração das DCs, as mesmas foram diferenciadas a partir de células de medula óssea e pulsadas com leveduras de P. brasiliensis, marcadas com CFSE e injetadas intratraquealmente em camundongos. Como controle negativo, utilizamos PBS e DCs não pulsadas com o fungo. Os resultados mostraram, que após 12 horas de infecção, as DCs (CFSE+CD11c+), migraram para os linfonodos torácicos. No entanto, a quantidade destas células diminui discretamente após 24 horas de infecção. Além disso, não observamos DCs nos linfonodos regionais, quando analisamos os grupos controle. Dessa forma, as células pulmonares também foram marcadas in vivo injetando-se intratraquealmente o corante CFSE juntamente com leveduras de P. brasiliensis. Verificamos que após 12 horas, as DCs pulmonares, dos animais infectados com o fungo, migraram para os linfonodos regionais. Esses resultados comprovam que o fungo P. brasiliensis foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para linfonodos regionais, e induziu nesse órgão uma resposta por células T evidenciada pela produção preferencial de IL-10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), which mainly affects the lungs. They are one of the few organs that are in constant and intense interaction with the environment and the immune system. The great challenge for the pulmonary immune system is to discriminate what is harmful and react accordingly. Dendritic cells (DCs) are \"professionals\" antigen-presenting cells and they can do the antigen processing. They can also do the presentation of peptides to T lymphocytes and are ideal for maintaining this delicate balance between tolerance and an effector immune response. Knowing the importance of these cells in the immune system and that the infection by P. brasiliensis preferentially attacks the lungs, cells from bronchoalveolar lavage (BAL), after experimental infection with yeasts of P. Brasiliensis, were analyzed. We observed a significant increase of DCs in BAL after 24 hours of intratracheal infection with 104 of yeast cells of P. brasiliensis. The characterization of these cells showed that DCs expressed CD11c, MHC-II and DEC205. In order to verify the ability of migration of DCs, they were differentiated from bone marrow cells and pulsed with yeasts of P. brasiliensis, they were also labeled with CFSE and injected intratracheally into mice. As a negative control, we used PBS and DCs that were not pulsed with the fungus. The results showed that after 12 hours of infection, the DCs (CFSE + CD11c +), migrated to the thoracic lymph nodes. However, the quantity of these cells decreases slightly after 24 hours of infection. Furthermore, we observed no DCs in regional lymph nodes when we analyzed the control groups. Thus, the lung cells were also labeled in vivo by injecting the CFSE dye intratracheally with yeasts of P. brasiliensis. We found that after 12 hours, pulmonary DCs of the animals infected with the fungus migrated to regional lymph nodes. These results indicate that the fungus P. brasiliensis was able to activate DCs, inducing their migration to regional lymph nodes, and inducing a response in that organ by T cells as evidenced by preferential production of IL-10.

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Silvio Luis de Oliveira / Banca: José Maurício Sforcin / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Carlos Artério Sorgi / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Dentre os vários mecanismos da resposta inata contra esse fungo, os envolvendo as células fagocitárias desempenham papel central na contenção do processo infeccioso, com destaque para a participação na atividade fungicida e modulação da resposta inflamatória. As funções das células fagocitárias contra os diversos microrganismos, incluindo os fungos, são iniciadas a partir de mecanismos de ativação dessas células, gerados após o reconhecimento dos mesmos por receptores de reconhecimento de estruturas moleculares padrões (PRRs) que reconhecem estruturas moleculares compartilhadas por determinados grupos de microrganismos, os chamados padrões moleculares associados à patógenos (PAMPS). Nosso estudo objetivou estudar a participação dos receptores TLR2, TLR4, receptor de manose (MR) e dectina-1, na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias e dos eicosanóides PGE2 e LTB4, por monócitos e neutrófilos humanos em resposta a cepas de P. brasiliensis de alta (Pb18) e baixa virulência (Pb265). Verificamos que as duas cepas do fungo, mas principalmente a Pb265 são capazes de induzir a produção de TNF- por monócitos. TLR2 e TLR4 foram os receptores que se mostraram mais envolvidos nesse processo. Adicionalmente, mostramos a capacidade de essas células liberarem IL-12 em resposta ao fungo, sendo os maiores níveis detectados para a cepa Pb265 e ocorrendo um importante papel do TLR4 e MR. Altos níveis de IL-10 também foram detectados, principalmente em resposta à cepa Pb18 para a qual houve um envolvimento do TLR2 e do MR. Para a cepa 265, o receptor de maior envolvimento foi o TLR2. As duas cepas, de forma semelhante, foram capazes de induzir uma maior produção de PGE2 e LTB4 pelos monócitos. No entanto, nenhum dos PRRs mostrou-se envolvido na produção dos ... / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidiodomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. During the innate immune response of the host against this fungus, phagocytic cells play an essential role, highlighting their participation in fungicidal activity and modulation of the inflammatory response. The functions of phagocytic cells against various microorganisms, including fungi, are initiated by the recognition of patterns molecular structures, shared by a group of microorganisms, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), by pattern recognizing receptors (PRRs) expressed by these cells. In this study, we assessed the involvement of the PRRs : TLR2, TLR4, mannose receptor (MR) and dectin-1, in the production of pró and anti-inflammatory cytokines and the eicosanoid PGE2 and LTB4, by human monocytes and neutrophils in response to high- (Pb18) and a low- (Pb265) virulence strain of P. brasiliensis. We showed that monocytes produce TNF-alpha and IL-12 in response to both strains, but with higher levels to Pb 265. TLR2 and TLR4 were the main receptors involved in TNF-alpha production, while for IL-12, the participation of TLR4 and MR was detected. High levels of IL-10 were also observed, mainly in response to Pb18, with involvement of TLR2 and MR. For Pb265, the receptor responsible was TLR2. Boths strains were able to induce PGE2 and LTB4 by monocytes. However, none of the studied receptors was shown to be involved in this production. Neutrophils did not produce TNF-alpha in response to both strains. On the other hand, these cells produce IL-12, mainly in response to Pb265, with participation of TLR2, dectin-1 and TLR4. These cells also produce L-10, whose levels were higher for Pb18 with involvement of TLR2 and MR and only TLR2 for Pb265. The production of PGE2 and LTB4 was also detected for these cells, similarly for the two strains. For PGE2, it ... / Doutor