Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-10-24T17:23:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_PedroAugustoCarvalhoCosta.pdf: 2613947 bytes, checksum: 08fad24a8075a76fe3f727816f49fdb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-24T17:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_PedroAugustoCarvalhoCosta.pdf: 2613947 bytes, checksum: 08fad24a8075a76fe3f727816f49fdb0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / No Brasil a malária ainda é considerada um grande problema de saúde pública. Embora o número de casos de malária esteja diminuindo, a incidência foi maior que 300.000 casos nos últimos dois anos. Destes casos, o Plasmodium vivaxfoi considerado o principal agente causador, com 90% de incidência. A resposta imune adaptativa, com o auxílio da imunidade inata, tem a função de superar as estratégias impostas pelos agentes infecciosos, levando ao controle da infecção. A ativação de células T envolve além da sinalização através do receptor de célula T (TCR), sinalização secundária desencadeada por moléculas reguladoras. A combinação das interações mediadas por estes regula a extensão, qualidade e duração da ativação de células T e, portanto, influenciam significativamente no curso das respostas imunes em questão. O objetivo desse trabalho é avaliar o fenótipo de células T de pacientes infectados pelo P. vivax com o foco na expressão de moléculas reguladoras como morte programada-1 (PD-1), co-estimulador induzível de células T (ICOS), antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), domínios de mucina e imunoglobulina de célula T (TIM-3) e gene 3 de ativação linfocitária (LAG-3). Células mononucleares do sangue periférico foram coletadas de pacientes infectados pelo P. vivax em Porto Velho, RO. Os linfócitos foram analisados por citometria de fluxo. Os resultados demonstram um aumento de citocinas inflamatórias e uma diminuição no número de linfócitos em pacientes infectados pelo P. vivax. Na literatura, a expressão desses receptores inibidores e moléculas co-estimulatórias é associada com a diminuição de função de células T. Nossos resultados demonstram um aumento da expressão das moléculas citadas acima em pacientes infectados pelo P. vivax. O aumento da expressão de algumas dessas moléculas correlacionam com o dano hepático e com plaquetopenia em pacientes infectados pelo P. vivax. Além disso, foi observado um aumento da expressão de um marcador específico da proliferação celular, o Ki67, em pacientes infectados pelo P. vivax. A caracterização fenotípica aqui realizada sugere disfuncionalidade das células T. Estudos adicionais devem ser realizados para avaliar a função destas moléculas durante a malária. / In Brazil, malaria is still considereda major public healthproblem. Although the number of malaria cases is declining, the incidence was greater than 300,000 cases in the past two years. Of these cases, Plasmodium vivax was considered the main causative agent, with 90% incidence. The adaptive immune response, along with innate immunity, has the function to overcome the strategy imposed by infectious agents, leading to infection control. The activation of T cells involves signaling through the T cell receptor (TCR) and regulatory receptors. The combination of these interactions regulates the extent and quality of the T cell activation and therefore influences significantly the course of immune responses in question. The aim of this study is to evaluate the phenotype of T cells from patients infected with P. vivaxfocusing on the expression of regulatory receptors such as programmed death-1 (PD-1), inducibleT cell stimulator (ICOS), cytotoxic T lymphocyte attenuator (CTLA-4), T-cell immunoglobulin and mucin domain domain 3 (TIM-3) and lymphocyte activation gene-3 (LAG-3). Peripheral blood mononuclear cells were collected from patients infected with P. vivax in Porto Velho, RO. Lymphocytes were analyzed by flow cytometry. Our data demonstrate an increase in inflammatory cytokines levels and a decrease in the number of lymphocytes during malaria. It has been described that the expression of these inhibitory receptors and costimulatory molecules is associated with decreased T cell function. Our results demonstrate that P. vivax infection triggers an increase in the expression of all molecules mentioned above. Increased expression of someof these molecules correlates with liver damage and thrombocytopenia. Moreover, we observed increased expression of a proliferation marker, the Ki67, in the same patients. The phenotype observed suggests a T cell dysfunction. Further studies have to be performed to evaluate the role of these molecules during malaria.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:09:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 226777.pdf: 1423317 bytes, checksum: 06344de2ef2baa141fe34897c24c9755 (MD5) / Com o estabelecimento de 39 isolados em cultivo in vitro foi realizada a caracterização morfológica pela qual foram observadas duas espécies, Colletotrichum acutatum e C. gloeosporioides. C. acutatum apresentou crescimento mais lento em meio BDA, insensibilidade ao fungicida benomyl, massa de conídios de coloração salmão, conídios de formato fusiforme, com uma ou ambas as extremidades afuniladas, e tamanho variando entre 4,3 - 4,8 x 11,4 - 13,9 µm. Isolados de C. gloeosporioides apresentaram crescimento mais rápido em meio BDA, sensibilidade ao fungicida benomyl, formação de peritécios e conídios retos com ápices obtusos e bases às vezes truncadas com tamanho variando entre 4,7 - 5,5 x 13,4 - 18,0 µm. Dentre os isolados classificados como C. gloeosporioides foi observado um grupo resistente ao fungicida benomyl, composto pelos isolados 17, 18, 19, 20 e 21, todos provenientes do município de Palmeira, PR. Teste de patogenicidade foi realizado nas cultivares Gala (suscetível) e Fuji (resistente). Somente os isolados provenientes de C. gloeosporioides causaram sintomas típicos de Mancha da Gala (MG) tanto em folhas como nos frutos da cv. Gala. Os isolados de C. acutatum não causaram sintomas de MG em folhas, e em frutos ocasionaram sintomas típicos de Podridão Amarga (PA). Nenhum dos isolados de ambas as espécies mostrou-se patogênico para a cv. Fuji. No estudo de geração de heterocariontes, foi observada a formação destes nos pareamentos dos isolados 17 x 18, 26 x 27, 27 x 28 e 32 x 33. Os heterocariontes não apresentaram diferenças significativas nas características morfológicas e culturais quando comparados aos isolados que lhes deram origem. Entretanto, no teste de patogenicidade os isolados H10, H11 e H12 não foram patogênicos quando inoculados em folhas de ambas as cultivares. A caracterização molecular de 39 isolados e 15 heterocariontes foi realizada com 10 iniciadores RAPD, que revelaram 165 bandas polimórficas, com peso molecular variando entre 0,35-2,5 kb. Pela análise de similaridade genética calculada pelo coeficiente de Jaccard, se agrupou os isolados em 7 grupos. O primeiro grupo apresentou 100% de similaridade genética e foi representado pelos isolados 1 e 2, provenientes de Caçador; o segundo grupo foi formado pelos isolados 31, 32, 33, 34, de Fraiburgo e 35, 36 e 37, de Palmas, apresentando similaridade variando entre 80 - 100%. O terceiro grupo foi formado pelos heterocariontes H10, H11 e H12, com similaridade variando entre 83 - 86,5%. O quarto grupo foi formado por 25 isolados, os quais causaram sintomas de MG em folhas da cv. Gala, com similaridade genética variando de 91,0 - 100%, oriundos de diversas localidades. O quinto grupo foi formado pelos heterocariontes H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H13, H14 e H15 com coeficiente de similaridade entre 58 - 97%. Os isolados 7 e 8 formaram o sexto grupo, de Frei Rogério, apresentando similaridade de 98%. O sétimo grupo formado pelos isolados 38, 39 e 40, apresentaram 100% de similaridade genética, procedentes de São Joaquim. Não houve relação direta entre os grupos formados pelo teste de patogenicidade e pela análise molecular, sendo que este último tipo de analise detectou um maior polimorfismo entre os isolados trabalhados.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-09T18:17:46Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 93744 bytes, checksum: 9c82a9017db2449c670fde86f0fec24e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-09T18:17:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 93744 bytes, checksum: 9c82a9017db2449c670fde86f0fec24e (MD5) Previous issue date: 2000-09-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A atividade in vitro das citolisinas, listeriolisina O (LLO) e fosfatidilcolina- fosfolipase C (PC-PLC), uma lecitinase e a virulência in vivo, de isolados de Listeria monocytogenes proveniente de ambientes de laticínios, de alimentos e de humanos foram determinados. A susceptibilidade a agentes antimicrobianos também foi avaliada e foi feita uma comparação entre dois meios de cultura, para determinar a atividade de PC-PLC. Os isolados de alimentos e de humanos pertenciam aos sorotipos 1/2a, 1/2b e 4b; e 60% dos isolados procedentes de ambientes de laticínios pertenciam ao sorogrupo 4. A atividade hemolítica em hemácias de carneiro foi constatada em todos os isolados analisados, com exceção do isolado 506/82, proveniente de líquido cefalorraquidiano. A atividade de PC-PLC em ágar BHI, contendo 2% de NaCl e 5% de emulsão de gema de ovo, foi detectada em 91,9% dos isolados de L. monocytogenes após 96 h de incubação sob anaerobiose. Nas espécies L. innocua, L. grayi, L. welshimeri e L. seeligeri, não foi observada atividade hemolítica nem de PC-PLC. A virulência, avaliada em embriões de galinha de viii14 dias, foi constatada em 88,4% dos isolados de L. monocytogenes. Dois isolados de alimentos que apresentaram atividade hemolítica e o isolado 506/82, não-hemolítico, proveniente de humanos, foram avirulentos. Não foi possível relacionar os sorotipos e a presença de fatores de patogenicidade in vitro com a virulência in vivo. Os isolados de outras espécies de Listeria não foram considerados patogênicos por promoverem a morte de 40% ou menos dos embriões inoculados. A resistência a antibióticos foi constatada em 25 (71,4%) dos 35 isolados de L. monocytogenes avaliados. A resistência a cefoxitina foi verificada em 54,3% dos isolados, enquanto 48,6% foram resistentes à kanamicina, 8,6% à cefotaxima e 2,9% à amicacina. Entre os isolados resistentes, 11 (44%) apresentaram resistência a um antibiótico e 14 (56%) foram resistentes a dois ou três agentes antimicrobianos. A comparação do ágar BHI com o ágar Vogel-Johnson para detecção da atividade de PC-PLC revelou que resultados positivos podem ser observados a partir de 24 h de incubação em ágar Vogel-Johnson, em anaerobiose, enquanto, no ágar BHI, a maioria dos resultados positivos ficam evidentes após 72 h de incubação, sob as mesmas condições. Dos 71 isolados de L. monocytogenes avaliados, 55 (77,5%) apresentaram atividade de PC-PLC mas apenas em condições de anaerobiose. Os 34 isolados das outras espécies de Listeria não demonstraram atividade dessa enzima em nenhum dos dois meios de cultura avaliados. Estes resultados permitem sugerir a adoção do teste de PC-PLC em meio Vogel- Johnson entre os testes bioquímicos de diferenciação da espécie L. monocytogenes das demais espécies do gênero. / The in vitro activity of the citolysins, listeriolysin O (LLO) and phosphatidylcholine phospholipase C (PC-PLC), a lecithinase, and the in vivo virulence of some L. monocytogenes strains isolated from dairy industries, foods, and humans were evaluated. The susceptibility to antimicrobial agents and PC-PLC activity in two different culture media were also evaluated. Isolates obtained from foods and humans corresponded to serotypes 1/2a, 1/2b, and 4b, and 60% of those from the dairies belonged to serogroup 4. A hemolytic activity of sheep hematocytes was observed for all isolates but 506/82, obtained from cephalo-rachidian liquid. PC-PLC activity in BHI containing 2% NaCl and 5% yolk emulsion was detected for 91.9% of the isolates of L. monocytogenes after 96h of incubation under anaerobiosis. For L. innocua, L. grayi, L. welshimeri, and L. seeligeri, no hemolytic or PC-PLC activity was observed. Virulence, evaluated in 14-day-old chicken embryos, was observed for 88.4% of the isolates of L. monocytogenes. Two food isolates presenting hemolytic activity and the non-hemolytic isolate 506/82, isolated from humans, were avirulent. No correlation could be established between the serotypes, the in vitro presence of xpathogenicity factors, and in vivo virulence. The isolates of other species of Listeria that caused the death of 40% or less of the inoculated embryos were not considered pathogenic. Resistance to antibiotics was detected for 25 (71.4%) of the 35 L. monocytogenes isolates. Resistance to cefoxitin was observed for 54.3% of the isolates, while 48.6% were resistant to kanamycin, 8.6% to cefotaxime, and 2.9% to amikacin. Among the resistant isolates, 11 (44%) were resistant to one antibiotic and 14 (56%) were resistant to two or three. Comparisons between BHI and Vogel-Johnson agar for the detection of PC-PLC activity demonstrated that positive results could be obtained after 24h of incubation on Vogel-Johnson agar under anaerobiosis, while in BHI, most of the positive results were evident after 72h of incubation under the same conditions. Among the 71 isolates of L. monocytogenes evaluated, 55 (77,5%) presented PC-PLC activity only under anaerobiosis. The 34 isolates of other species of Listeria did not produce lecithinase in none of the tested media. These results suggest that the PC-PLC test on Vogel-Johnson agar can be used with other biochemical tests to distinguish L. monocytogenes from the other species of the genus.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-12T12:15:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1816313 bytes, checksum: c4290f186027bed900c1adff1f3a742c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T12:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1816313 bytes, checksum: c4290f186027bed900c1adff1f3a742c (MD5) Previous issue date: 2001-12-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A identificação morfo-tintorial e bioquímica de 21 isolados de Klebsiella provenientes de amostras de dietas enterais artesanais revelou que 15 deles pertenciam a espécie K. pneumoniae e seis a K. oxytoca. A sorotipagem de K. pneumoniae identificou cinco isolados do sorotipo K5, um do sorotipo K4 e os demais não foram sorotipados pelos antissoros dos grupos K1 a K6. Os resultados das análises por RAPD e da região espaçadora 16S-23S do rDNA mostraram um polimorfismo acentuado entre os isolados de K. pneumoniae e um polimorfismo menor entre os isolados de K. oxytoca. O fragmento de DNA, de 1420 pb, gerado pela amplificação da região 16S do rDNA foi digerido por oito endonucleases de restrição e resultou padrões de RFLP idênticos para todos os isolados. As análises por RAPD e por PCR da região espaçadora do rDNA mostraram-se apropriadas para avaliar a diversidade genética entre estes isolados. A resistência a pelo menos dois antibióticos foi verificada em todos os isolados de Klebsiella e maior prevalência de resistência foi verificada aos antibióticos amoxacilina e ampicilina. Os isolados que apresentaram resistência a um maior número de antibióticos pertenciam a espécie K. pneumoniae provenientes, principalmente, do hospital B. A produção de β-lactamase de espectro ampliado não foi verificada em nenhum dos isolados avaliados. Observou-se que a freqüência de colônias mucóides entre as estirpes foi baixa (23,8%) e que a produção de cápsula foi verificada, microscopicamente, somente nas estirpes, cujas colônias apresentaram aspecto mucóide. K. pneumoniae apresentou maior adesão em células Caco-2 e HEp-2 enquanto K. oxytoca apresentou adesão expressiva apenas em células Caco-2. Porém, a invasão de K. pneumoniae foi constatada nas três linhagens de células eucarióticas, apesar dos índices terem sido baixos em relação aos de adesão. Somente os isolados da espécie K. pneumoniae apresentaram adesão e invasão nas células HEp-2. De uma forma geral, os índices de adesão e invasão foram maiores entre os isolados do hospital A. Nas condições usadas neste estudo, os isolados de Klebsiella não apresentaram atividade hemolítica, de fosfolipase e produção de enterotoxina termoestável, assim como do sideróforo aerobactina. A inoculação intraperitoneal em camundongos sadios e imunodeprimidos com estirpes selecionadas de Klebsiella para a determinação da DL 50 não promoveu a morte dos animais, até uma concentração de 10 7 células por inoculação. Quando camundongos foram alimentados com dietas enterais ou ração não se observou a presença de colônias típicas de Klebsiella na análise de amostras do fígado, baço, coração, rim e pulmão dos animais. Entretanto, em amostras de fígado e pulmão dos camundongos dos grupos que receberam drogas imunodepressoras e, ou antimicrobiana, alimentados ou não com dieta enteral contaminada com 6 x 10 9 UFC/animal de Klebsiella, a presença de colônias típicas foi constatada. Em animais que receberam somente a dieta contaminada, a translocação de Klebsiella também foi observada. A análise do perfil genético, por RAPD, de isolados recuperados desses órgãos revelou similaridades com os padrões de bandas de DNA das estirpes de Klebsiella administradas aos animais, via oral. A presença de Klebsiella no fígado de camundongos que não receberam fonte exógena de Klebsiella, mas que receberam a combinação de medicamentos, sugere que estirpes da microbiota intestinal autóctone foram capazes de translocar quando houve uma depressão do sistema imunológico e uma descontaminação seletiva, promovidas pelo corticóide e antibiótico, respectivamente. A colonização por Klebsiella, proveniente das dietas enterais, no intestino também foi facilitada quando medicamentos imunodepressores e antimicrobianos foram utilizados. / Biochemical testing and microscopic observations of stained cells were used to identify 21 Klebsiella isolates from hospital enteral formulae. Fifteen of the isolates were identified as K. pneumoniae and six as K. oxytoca. Serotyping of K. pneumoniae identified five isolates belonging to serological group K5 and one to serological group K4 while the rest could not be identified using the antisera in serological groups K1 through K6. Results of RAPD analysis and of the 16S-23S rDNA intergenic spacer revealed accentuated polymorphism among the K. pneumoniae isolates and a lesser polymorphism among the K. oxytoca isolates. The 1420 bp DNA fragment generated by amplification of the 16S rDNA region digested with eight restriction endonucleases resulted in identical RFLP patterns for all isolates. RAPD and PCR analyses of the rDNA intergenic spacer were shown to be appropriate tools for evaluating genetic diversity among the isolates. Resistance to at least two antibiotics was observed in all Klebsiella isolates, with greater prevalence of resistance to amoxacillin and ampicillin. K. pneumoniae isolates presented resistance to the greatest number of antibiotics, xiiespecially those isolated from Hospital B. Broad-spectrum β-lactamase production was not observed in any isolate. Presence of mucous was infrequent (6.7%) and capsule production was only observed among the isolates that presented moderate to intense mucous production. Adhesion and invasion were observed in Caco-2 and HEp-2 cells, but not in VERO cells. Only K. pneumoniae isolates adhered to and invaded HEp-2 cells. No hemolysin activity, phospholipase activity, thermostable enterotoxin production or aerobactin siderophore production were observed under the conditions used in this study. Selected Klebsiella isolates were inoculated intraperitoneally in healthy and immunodepressed mice to determine LD 50 but did not prove lethal, demonstrating the avirulence of the isolates. When mice were given enteral formula or animal feed, no typical Klebsiella colonies were observed in liver, spleen, heart, and kidney or lung samples. However, typical colonies were observed in liver and lung samples from animals that received immunodepressant and/or antimicrobial drugs, regardless of whether or not the animals received enteral formula contaminated with 6 x 10 9 CFU Klebsiella per animal. In animals that only received the contaminated formula, translocation was also observed. Genetic profile analysis of isolates retrieved from these organs by RAPD revealed similarities to the DNA band patterns of the Klebsiella strains administered orally to the animals, confirming pathogen translocation. Presence of Klebsiella in livers of mice that did not receive an external source of Klebsiella but that received a combination of medications suggests that autochthonous intestinal microbial strains are able to translocate when the immunological system is depressed as well as a selective decontamination promoted by corticoids and antibiotics, respectively. Intestinal colonization by Klebsiella isolated from enteral formula was also immunodepressant and antimicrobial medications were used.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é uma micose sistêmica grave com formas aguda e crônica. As proteases ou peptidases são enzimas proteolíticas que ocorrem em todos os organismos e correspondem a 1-5% de seus conteúdos genéticos. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem durante a invasão metastática de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Um número reduzido de proteases do Pb já foram isoladas e caracterizadas, tampouco sua atividade durante o desenvolvimento da doença foi determinado, e até o momento, nenhuma atividade oligopeptidásica foi descrita nesse fungo. No presente trabalho foi demonstrada a presença de uma atividade metalo-peptidásica thimet oligopeptidase (TOP)-like no extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis, isolado 18 (Pb18). Nossos resultados mostraram a hidrólise do peptídeo com supressão intramolecular de fluorescência Abz-GFSPFRQ-EDDnp pelo extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis. Esse substrato é clivado preferencialmente pela TOP de mamíferos, e corroborando esse resultado, observou-se a inibição da hidrólise desse peptídeo por ο-fenantrolina e JA-2, inibidores seletivos de metalo-proteases e TOP, respectivamente. Utilizando-se peptídeos e inibidores seletivos para diferentes proteases, não se detectou a presença de atividade neurolisina-like ou neprilisina-like, e também se descartou a presença de serino-peptidases, cisteíno-peptidases e enzima conversora da angiotensina I. A maior atividade enzimática do extrato citosólico sobre os outros preparados (membrana/parede celular ou lisado total das leveduras) pode indicar uma localização citosólica dessa enzima. Não foi observada a secreção da peptidase no sobrenadante de cultura in vitro, mesmo após adição de soro fetal bovino. Todavia, a peptidase com atividade TOP-like de Pb parece ser secretada in vivo, ou liberada após lise do fungo por componentes efetores da resposta imune, uma vez que anticorpos capazes de inibir a atividade peptidásica são encontrados em soros de pacientes com paracoccidioidomicose, e soros com maior título em imunodifusão contém maiores concentrações de anticorpos enzima-específicos. Várias enzimas da família M3 clivam bradicinina, importante mediador inflamatório in vivo. A hidrólise da bradicinina e do substrato Abz-GFSPFRQEDDnp pelo extrato citosólico de P. brasiliensis, gera os mesmos fragmentos observados após clivagem pela TOP de mamíferos, que são diferentes dos gerados pela clivagem com MIP de mamíferos e OpdA bacteriana, sendo mais um indicador da presença majoritária de uma peptidase com atividade TOP-like em P. brasiliensis. A clivagem da bradicinina pela metalooligopeptidase com atividade TOP-like de Pb, poderia ocorrer no sítio inflamatório e poderia estar envolvida na inibição da indução de uma resposta imune protetora contra o fungo, favorecendo a permanência do mesmo no hospedeiro. Observamos ainda que o gene homólogo de TOP em P. brasiliensis é quase duas vezes mais expresso no virulento em comparação ao não virulento. O aumento da hidrólise do substrato Abz-GFSPFRQ-EDDnp também foi observado no isolado de maior virulência quando comparado ao de menor virulência. A possível relação entre a expressão da metalooligopeptidase com a virulência do fungo sugere que essa peptidase possa ser classificada como um fator de virulência fúngica, no entanto experimentos complementares são necessários para sua confirmação. A expressão da gp43 também foi analisada no isolado virulento e não virulento e observou-se uma expressão aumentada em até treze vezes no primeiro. Para melhor caracterização dessas metalo-oligopeptidases é necessária a obtenção da proteína recombinante, ou da proteína purificada nativa, isolada do lisado fúngico. Não obtivemos sucesso na expressão das proteínas recombinantes, tampouco no isolamento da peptidase nativa por métodos cromatográficos. Nossos resultados sugerem a presença de uma atividade metalooligopeptidásica TOP-like na fração citosólica de leveduras de P. brasiliensis. Liberação in vivo dessa enzima após a lise de fungos ou secreção estimulada por fatores do hospedeiro, pode ter um papel na inflamação e desenvolvimento da micose. / Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a systemic mycosis with severe acute and chronic forms. Proteases or peptidases are proteolytic enzymes that occur in all organisms and constitute 1-5% of their genetic contents. These enzymes are involved in biological processes such as blood clotting, cell death and tissue differentiation. Several important proteolytic steps occur during the invasion of metastatic tumors, as well as in the infection of a large number of viruses and pathogens. To date, a small number of Pb proteases were isolated and characterized, also, their activities during the development of the disease was not determined, and an oligopeptidase activity was not detected in this fungus. In the present work, we demonstrated a metallopeptidase thimet oligopeptidase (TOP)-like activity in the cytosolic extract of Pb18 yeasts. Our results shown a major hydrolysis of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide Abz-GFSPFRQ-EDDnp, preferentially cleaved by TOP from mammals, and the inhibition of the hydrolysis of this peptide by orthophenantrolin and JA-2, selective inhibitors of metalloproteases and TOP, respectively. The presence of neurolysin- like and neprilysin-like, serinepeptidases, cysteine-peptidases and angiotensin converting enzyme I was discarded by analyzing selective FRET peptides and inhibitors. The higher peptidase activity of cytosolic extracts over the membrane/cell wall and total yeast lysate preparations may indicate that this enzyme is localized in the yeast cytosol. The metallo-oligopeptidase activity was not detected on in vitro culture supernatants, even after addition of fetal calf serum. However, the peptidase with TOP-like activity of P. brasiliensis seems to be secreted in vivo, or released after fungal lysis by immune factors, since antibodies that can inhibit this enzymatic activity were found in sera from paracoccidioidomycosis patients, and serum with highest titer in immunodiffusion contains higher concentrations of enzymespecific antibodies. Bradykinin, an important inflammatory mediator in vivo, is cleaved by several enzymes from the M3 family. The same fragments observed after hydrolysis by TOP were observed after cytosolic extract hydrolysis of bradykinin and the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp. MIP and bacterial OpdA hydrolysis of these peptides generate different fragments, and this is an additional indicator of a major TOP-like activity in P. brasiliensis yeast cells Bradykinin hydrolysis by the TOP-like metallopeptidase of P. brasiliensis may occur in inflammatory processes and this suggests that the enzyme may be involved in the inhibition of a protective anti-fungal response induction, limiting fungal elimination. We also observed that the expression of the TOP homologous gene in P. brasiliensis has almost a two-fold increased in the virulent isolate 18 compared to the non-virulent isolate. Increased hydrolysis of the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp was also observed in the most virulent isolate compared to the non-virulent. The possible correlation between TOP-like peptidase expression and fungal virulence suggests that this peptidase could be classified as a fungal virulence factor, however, additional experiments are needed to confirm this hypothesis. Gp43 expression was also analyzed in both isolates, and it was observed a thirteen-fold increase in the expression on the virulent isolate. In order to better characterize the P. brasiliensis TOP-like activity, we attempted to obtain the purified recombinant or the native protein, isolated from fungal lysate. However, we were not successful in the expression of recombinant proteins and neither on the isolation of the native protein using chromatographic methods. Our results suggest the presence of a TOP-like activity in the cytosolic fraction of P. brasiliensis yeasts. In vivo release of this enzyme after fungal lysis, or host factors-stimulated secretion, may have a role in inflammation and development of the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-03-16T14:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 50.pdf: 1867882 bytes, checksum: af8a86de2d01897e472d78c908f1e225 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Este estudo avaliou a colonização por Staphylococcus spp em superfícies de artigos médicos (estetoscópio, esfigmomanômetro e Sonar Doppler) e das fossas nasais e mãos dos profissionais do serviço de atendimento ao pré-natal de duas Unidades Básicas de Saúde no Município do Rio de Janeiro, no período de 2009-2010. Foram coletadas 79 amostras que resultaram em 49 isolados, submetidos à caracterização fenotípica (bioquímica e suscetibilidade aos antimicrobianos) e molecular (PCR dos genes coa, femA e mecA). Trinta e cinco (71,4%) foram coagulase positivas e 41 (83,6%) apresentaram a enzima DNase. A susceptibilidade aos antimicrobianos resultou em 19 perfis de resistência, 34,6% apresentaram susceptibilidade aos nove antimicrobianos analisados, 53,6% foram resistentes à eritromicina, 34,6% à cefoxitina, 30,6% a oxacilina, 16,3 % a clindamicina e 2% a vancomicina. A PCR dos genes coa, femA e mecA resultou na amplificação de um único fragmento variável de 650 a 900 pb, 900 pb e 500 bp respectivamente em 75,5%, 71,4% e 30,6% dos isolados, respectivamente. Dos 49 isolados, 20,4% foram coagulase positiva e resistente à oxacilina e, portanto considerados Meticillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) e 10,20% Meticillin Resistant coagulase negativa Staphylococci (MR-CoNS) após a confirmação pela amplificação do gene mecA. A resistência concomitante à eritromicina e a clindamicina foi observada em 10 cepas (20,4%) que apresentaram o fenótipo Macrolide-Lincosamide-Streptogramin type B (MLSB) constitutivo. Oito isolados (16,3%), apresentaram perfis multirresistentes (cinco ou mais antimicrobianos) e foram identificados como MRSA. Dentre essas oito cepas multirresistentes, uma cepa isolada da mão de um profissional, apresentou também resistência à vancomicina. A evidência de Staphylococcus patogênicos em equipamentos e profissionais de saúde traduz a preocupação com a proteção da saúde de pacientes, profissionais e da comunidade... / Este estudo avaliou a colonização por Staphylococcus spp em superfícies de artigos médicos (estetoscópio, esfigmomanômetro e Sonar Doppler) e das fossas nasais e mãos dos profissionais do serviço de atendimento ao pré-natal de duas Unidades Básicas de Saúde no Município do Rio de Janeiro, no período de 2009-2010. Foram coletadas 79 amostras que resultaram em 49 isolados, submetidos à caracterização fenotípica (bioquímica e suscetibilidade aos antimicrobianos) e molecular (PCR dos genes coa, femA e mecA). Trinta e cinco (71,4%) foram coagulase positivas e 41 (83,6%) apresentaram a enzima DNase. A susceptibilidade aos antimicrobianos resultou em 19 perfis de resistência, 34,6% apresentaram susceptibilidade aos nove antimicrobianos analisados, 53,6% foram resistentes à eritromicina, 34,6% à cefoxitina, 30,6% a oxacilina, 16,3 % a clindamicina e 2% a vancomicina. A PCR dos genes coa, femA e mecA resultou na amplificação de um único fragmento variável de 650 a 900 pb, 900 pb e 500 bp respectivamente em 75,5%, 71,4% e 30,6% dos isolados, respectivamente. Dos 49 isolados, 20,4% foram coagulase positiva e resistente à oxacilina e, portanto considerados “Meticillin Resistant Staphylococcus aureus” (MRSA) e 10,20% “Meticillin Resistant coagulase negativa Staphylococci” (MR-CoNS) após a confirmação pela amplificação do gene mecA. A resistência concomitante à eritromicina e a clindamicina foi observada em 10 cepas (20,4%) que apresentaram o fenótipo “Macrolide-Lincosamide-Streptogramin type B” (MLSB) constitutivo. Oito isolados (16,3%), apresentaram perfis multirresistentes (cinco ou mais antimicrobianos) e foram identificados como MRSA. Dentre essas oito cepas multirresistentes, uma cepa isolada da mão de um profissional, apresentou também resistência à vancomicina. A evidência de Staphylococcus patogênicos em equipamentos e profissionais de saúde traduz a preocupação com a proteção da saúde de pacientes, profissionais e da comunidade. Uma das atribuições da Vigilância Sanitária é a conscientização da importância dos procedimentos de limpeza e desinfecção das mãos e dos artigos médicos utilizados nos ambientes de saúde.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T15:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel) foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente) e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco. Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados. Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo. / Wolbachia pipientis is an intracellular bacterium that infects about 40% of arthropods and some nematodes, causing reproductive alterations in their hosts. Recently, two strains of Wolbachia (wMelPop and wMel) were individually introduced into Aedes aegypti (naturally uninfected) and the adult mosquitoes containing Wolbachia were less susceptible to different arboviruses (Dengue and Chikungunya) and Plasmodium sp. Currently, A. aegypti mosquitoes containing Wolbachia (wMel) are being released in the field in many countries, through the Eliminate Dengue Program, as a possible biological control agent for Dengue. During the invasion of mosquitoes containing Wolbachia in the field there is the need to weekly screen large numbers of mosquitoes to detect Wolbachia via quantitative PCR, a technique still quite costly. Due to this fact, it is essential to develop a rapid, specific and inexpensive method to detect mosquitoes infected with this bacterium, to survey and monitor the spread of Wolbachia in the field. In the present study we successfully developed a rapid detection method through LAMP (loop-mediated isothermal amplification) using 3 pairs of primers that bind to 8 distinct regions of the target DNA, increasing the specificity of the reaction. In our case, we designed primers based on the sequence of the Wolbachia 16S rRNA gene. During the optimization process we used colony mosquitoes reared at the Insectary of the Malaria Laboratory (CPqRR), either infected or uninfected with Wolbachia. We also used field insect samples (mosquitoes and insects belonging to different orders). The incubation time allowing amplification was set to 90 minutes at 63oC, being possible to perform the reaction either in a thermocycler or on a heat block. For sensitivity analysis, we performed serial dilutions of plasmid DNA (109 to 100 copies) containing the target sequence and the amplification was still possible by using only one copy of the plasmid DNA. To verify the specificity, samples of different bacterial species were used and in none of them the amplification occurred, confirming that the LAMP is very specific. To reduce the reaction cost we were able to reduce the amount of the Bst DNA polymerase down to 1 unit and we can see clearly a great amplification. To visualize the results, two dyes were used, the Hydroxy Naphtol Blue (HNB) and SYBR Green I. In both cases it was possible to differentiate positive from negative samples without the need to run agarose gels. An advantage of using the HNB is that there is no need to manipulate amplified products as this dye is added before the reaction, avoiding possible contamination, and it is also possible to see the difference in color by naked eye without the need of UV light. When comparing the costs, in Brazilian Reais, to perform PCR or LAMP, the latter had a cost 53.92% lower than the PCR, and it does not require sophisticated equipment or electrophoresis agarose gel to analyze the results. In the present study, we develop a technique for Wolbachia detection which is very specific, rapid, sensitive and with low cost enabling its use in large-scale monitoring of Wolbachia infection status of several insect species.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 401.pdf: 9920494 bytes, checksum: 8583b102e7c583547584adc8d2fe879e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O tratamento utilizado para a leishmaniose apresenta efeitos colaterais graves, exige acompanhamento médico e prolongado tempo de terapia. Assim, a prospecção de novos compostos contra esta doença ainda se faz necessária. As macroalgas possuem grande variedade de moléculas bioativas. No presente trabalho foi avaliada a atividade leishmanicida, a citotoxicidade, a produção de óxido nítrico (NO) e os possíveis alvos dos extratos de macroalgas. Foi avaliado o efeito de 10 extratos sobre o crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis. A citotoxicidade em células de mamíferos foi avaliada através do método do MTT e o índice de seletividade foi determinado. A produção de NO por macrófagos foi avaliada pelo reagente de Griess. A análise ultraestrutural foi realizada por microscopia eletrônica. Para análise dos efeitos dos extratos sobre a membrana e o potencial de membrana mitocondrial células tratadas e controles foram submetidas à marcação com iodeto de propídio (IP) e rodamina 123. Os dados mostraram que todos os extratos inibiram o crescimento de formas promastigotas e apresentaram baixa toxidade para células de mamífero. Canistrocarpus cervicornis (CC), Dictyota mertensii (DM) e Laurencia dendroidea (LD) foram as mais efetivas e mais seletivas contra formas promastigotas entre todas as algas testadas. Estes extratos também inibiram a infecção e índice de sobrevivência de formas amastigotas no interior de macrófagos. Esses extratos aumentaram a produção de NO em relação às células controles. Alterações compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular foram observadas por microscopia eletrônica. Células tratadas apresentaram discreto aumento no número de células IP+. Os extratos induziram alterações significativas no potencial de membrana mitocondrial. A baixa toxicidade às células de mamíferos e a atividade leishmanicida apresentadas apontam para a utilização dos extratos de CC, DM e LD como agentes promissores para o tratamento da leishmaniose cutânea

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-20T17:45:33Z No. of bitstreams: 1 IsabelaGomesRibeiro.pdf: 30073116 bytes, checksum: 9aac4c6cb4b86a1ee88a09e7d840ddde (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-20T17:45:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 IsabelaGomesRibeiro.pdf: 30073116 bytes, checksum: 9aac4c6cb4b86a1ee88a09e7d840ddde (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T17:45:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IsabelaGomesRibeiro.pdf: 30073116 bytes, checksum: 9aac4c6cb4b86a1ee88a09e7d840ddde (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Diante de constantes avanços no entendimento da infecção pelo VHC e mudanças no esquema terapêutico, torna-se necessário uma melhor compreensão da cinética de biomarcadores imunológicos ao longo do tratamento triplo e a sua importância na monitoração terapêutica e no alcance da resposta virológica sustentada (RVS) pelos pacientes ao término do tratamento. Neste estudo foi realizada uma caracterização cinética dos aspectos clínico-laboratoriais, perfil de quimiocinas e micropartículas circulantes em pacientes com infecção crônica pelo VHC, antes e durante a terapia tripla com interferon peguilado, ribavirina e inibidor de protease (telaprevir ou boceprevir). Foram avaliados 20 pacientes infectados com o vírus VHC com genótipo 1 em tratamento com terapia tripla e 20 indivíduos saudáveis, doadores de sangue, que compuseram o grupo controle para o estabelecimento dos valores de referência para análise de quimiocinas e micropartículas (MPs) circulantes. As quimiocinas CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG e CXCL10/IP10 e MPs derivadas de eritrócitos, células endoteliais, plaquetas, leucócitos e suas subpopulações foram quantificadas em soro e plasma, respectivamente,empregando citometria de fluxo,comparando os dados antes do tratamento (AT) e durante o tratamento (DT) nassemanas 2, 4, 8, 12, 24 e 48. Nossos resultados demonstraram que 70,0% dos pacientes eram do sexo masculino e 35,0% do sexo feminino, com idade média de 58,5 anos. Dos vinte pacientes avaliados 75,0% apresentavam o genótipo 1b e 30,0% o genótipo 1a do VHC. Quatorze pacientes completaram o tratamento triplo com 86,7% de RVS. Na análise de quimiocinas, houve um aumento de CCL2 na semana 12 em comparação com AT. CXCL8 aumentou na semana 12 em comparação com AT. CXCL9 e CXCL10 diminuíram na semana 24 em relação à semana 12 DT.Na análise da frequência de MPs, aquelas originadas de neutrófilos diminuíram nas semanas 2 e 24, em comparação com a AT, diminuíram na semana 24 em comparação com a semana 8 DT e aumentaram na semana 8 em relação à semana 2 DT. As micropartículas derivadas de monócitos diminuíram nas semanas 2, 12 e 24 em comparação com AT e aumentaram na semana 48 em relação à semana 24. As MPs derivadas de linfócitos TCD3+ diminuíram nas semanas 12, 24 e 48 em comparação com AT e nas semanas 24 e 48 em relação à semana 4 DT. Já aquelasoriginadas de linfócitos TCD4+ diminuíram nas semanas 12 e 24 em comparação com AT e diminuíram na semana 12 em comparação com a semana 4 DT. Avaliações adicionais que utilizaram ferramentas de análise de sistemas biológicos revelaram que antes do tratamento houve uma elevação de enzimas hepáticas e frequências das MPs nos pacientes, e a freqüência de altos produtores de quimiocinas foi baixa. Após o tratamento, houve uma diminuição progressiva das enzimas hepáticas e micropartículas, que foi acompanhado por aumento de quimiocinas com um pico na semana 12 do tratamento. Na semana 24 do tratamento, houve uma redução na maioria dos biomarcadores em comparação com a frequência mostrada antes do tratamento, exceto para CCL2 e CCL5 que ainda estavam sendo secretadas ao final do tratamento. Em suma, as análises do presente estudo mostraram que houve um declínio dos marcadores de agressão hepática, dos níveis de quimiocinas e da frequência de micropartículas no decorrer do tratamento, sugerindo, em síntese, que o tratamento e a redução ou eliminação do VHC promove um ambiente imunomodulador com retorno da resposta imunológica dentro dos padrões esperados na ausência da infecção viral. Para grande maioria dos pacientes que terminaram o tratamento, esse panorama está associado ao alcance de resposta virológica sustentada e, consequentemente, ao sucesso do tratamento triplo. / Faced with constant advances in the understanding of HCV infection and changes in the therapeutic regimen, it becomes necessary a better understanding of the kinetics of immune biomarkers along the triple treatment, and its importance in therapeutic monitoring and scope of sustained virologic response (SVR) by patients after treatment. In this study it was performed a kinetic characterization of clinical and laboratory aspects, chemokines profile and circulating microparticles in patients with chronic HCV infection before and during triple therapy with pegylated interferon, ribavirin and protease inhibitor (telaprevir or boceprevir). 20 patients infected with genotype 1 HCV virus treated with triple therapy and 20 healthy blood donors, who comprised the control group for the establishment of benchmarks for analysis of circulating chemokines and microparticles (MPs), were assessed. The CCL2 / MCP-1, CCL5 / RANTES, CXCL8 / IL-8, CXCL9 / MIG and CXCL10 / IP10 chemokines and MPs derived from erythrocyte, endothelial cells, platelets, leukocytes and their subpopulations were quantified in serum and plasma, respectively, using flow cytometry, comparing the data before treatment (BT) and during treatment (DT) at weeks 2, 4, 8, 12, 24 and 48. Our results showed that 70.0% of patients were male and 35.0% female, mean age of 58.5 years. Of the twenty patients evaluated, 75.0% had genotype 1b and 30.0% had genotype 1a of HCV. Fourteen patients completed triple therapy with 86.7% of RVS. In the analysis of chemokines, there was an increase of CCL2 at week 12 compared to BT. CXCL8 increased at week 12 compared to BT. CXCL9 and CXCL10 decreased at week 24 compared to week 12 DT. In MPs frequency analysis, those originating from neutrophils decreased at weeks 2 and 24, compared with BT, decreased at week 24 compared to week 8 DT and increased at week 8 compared to week 2 DT. The microparticles derived from monocytes decreased at weeks 2, 12 and 24 compared with BT and increased at week 48 compared to week 24. The MPs derived TCD3 + lymphocytes decreased on days 12, 24 and 48 compared to BT and at weeks 24 and 48 compared to week 4 DT. The ones originating from CD4 + T lymphocytes, decreased at weeks 12 and 24 compared to BT and decreased at week 12 compared to week 4 DT. Additional assessments that used biological systems analysis tools revealed that before treatment there was an elevation of liver enzymes and frequencies of MPs in patients, and the frequency of high producers of chemokines was low. After treatment, there was a progressive decrease in liver enzymes and microparticles, which was accompanied by increase of chemokines with a peak at week 12 of treatment. At week 24 of treatment there was a reduction in most of the biomarkers compared with the frequency shown before treatment, except for CCL2 and CCL5 which were still secreted the end of treatment. In short, the analysis of this study showed that there was a decline of liver injury markers and of the levels of chemokines and microparticles frequency during treatment, suggesting, in essence, that the treatment and the reduction or elimination of HCV promotes immunomodulator environment with return of immune response within the standards expected in the absence of viral infection. For the vast majority of patients who completed treatment, this situation is associated with sustained virologic response range and, consequently, the success of triple therapy.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-04-11T16:10:17Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_LaraSaraiva.pdf: 5064404 bytes, checksum: 0de0a8fd07fbd0e6a577f8be885ebb1b (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-04-11T16:10:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_LaraSaraiva.pdf: 5064404 bytes, checksum: 0de0a8fd07fbd0e6a577f8be885ebb1b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T16:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_LaraSaraiva.pdf: 5064404 bytes, checksum: 0de0a8fd07fbd0e6a577f8be885ebb1b (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / O município de Belo Horizonte e sua região metropolitana ilustram o mais sério exemplo de expansão da leishmaniose visceral no sudest e do Brasil. O município e o parque Estadual do Sumidouro localizam-se no bioma cerrado, segundo ma ior bioma terrestre da América do Sul. Os objetivos deste projeto foram: estudar a variação sazonal da fauna flebotomínica no DS Venda Nova (Belo Horizonte) e no PES; descrever os padrões de riqueza e diversidade fauna flebotomínica nas formações vegetais do PES e no DS Venda Nova; de terminar a taxa de infecção natural de fêmeas capturadas; est udar a variação morfológica das populações de Lu. longipalpis coletadas nos diferentes ambientes; aval iar os impactos das ações de controle realizadas no DS Venda Nova nas taxas de oc orrência sazonal e dens idade das populações de flebotomíneos. Foram realizadas coletadas mensais no pe ríodo de agosto de 2011 a agosto de 2013. Os insetos foram identificados de acordo com Galati 2003. As fêmeas coletadas não ingurgitadas foram submetidas à extração de DNA e reações de PCR e de PCR-RFLP para a averiguação da infecção natural por espécies de Leishmania. Para comparação das localidades de estudo foi utilizada análise descritiva e índices ecológicos. Para a comparação morfológica trinta casais (quinze proveni ente do DS Venda Nova e quinze do PES) da espécie Lu. longipalpis foram medidos, e foram comparados tantos as médias como as variâncias dos caracteres entre os grupos. As ações de contro le da LV no DS Venda Nova realizadas nos período de janeiro de 2011 a dezembro de 2013 foram analisadas descritivamente e relacionadas à curva sazonal de Lu. longipalpis . A riqueza, a diversidade e a equitabilidade da fauna de flebotomíneos foram marcadamente dife rentes entre o DS Venda Nova e o PES. Na área urbana foram coletados 2.247 espécimes pertencentes a cinco gênero s e oito espécies, a curva de acumulação de espécies atingiu a satu ração na 19º amostragem. No DS Venda Nova a curva de variação sazonal foi delineada principalmente por Lu. longipalpis e 95,3% dos espécimes pertenciam a esta espécie. Lu. longipalpis apresentou taxas de infecção natural de 1,01% para Leishmania infantum e 1,77% para Leishmania braziliensis . No PES foram coletados 4.675 espécimes pertencentes a ci nco gêneros e 25 esp écies e a curva de acumulação atingiu a saturação na 16º amostragem. No PES não houve uma única espécie que apresentasse padrão tão pronunciado de dominância. Lu. longipalpis correspondeu a 5,35% dos espécimes. Diversas espécies com envolvi mento (suspeito ou comprovado) nos ciclos de LTA foram registradas. Uma fêmea do comple xo cortellezzi apresent ou detecção positiva para Le. braziliensis. A comparação morfométrica e de co mposição de feromônios indicou grande similaridade entre as duas populações de Lu. longipalpis avaliadas. A análise realizada para co rrelação das ações de controle com a variação sazonal de Lu. longipalpis indicam a necessidade de estudos pormenorizados para inferências mais robustas. Os resultados evidenciam a dominância da espécie Lu. longipalpis no ambiente urbano, e indicam que as mudanças antrópicas no cerrado podem a lterar a composição das populações de flebotomineos e os ciclos de tran smissão de patógenos aos humanos. / The municipality of Belo Horizonte and its me tropolitan region illustrate the most serious example of the expansion of leishmaniasis in southeast Brazil. The m unicipality of Belo Horizonte, its metropolitan region, and th e Sumidouro State Park, are in the Brazilian Savannah biome (Cerrado). This is the second la rgest terrestrial biome in South America. The aims of this project were: to study the seasona l variation of sand flies in SD Venda Nova (Belo Horizonte) and in the PES; to describe the ric hness and diversity pa tterns of sand flies in the vegetable formations of PES and SD Venda Nova; to determine the natural infection rate of females captured; to study the morphological variation of Lu. longipalpis populations from different environments; to evaluate the im pacts of LV control actio ns carried out in DS Venda Nova in seasonal occurr ence of sandflies. Sampling was performed every month over three consecutive days using HP light trap s form August 2011 to August 2013. The insects were identified according to Galati 2003. Th e non-engorged females were subjected to DNA extraction and PCR reactions and the PCR-RFLP for the investigation of natural infection with Leishmania species. To compare the study sites was used descriptive analysis and ecological indexes. In the morphological comp arison thirty couples (fifteen from the DS Venda Nova and fifteen PES) of Lu. longipalpis species were measured and the means and variances were compared. The LV control actions in DS Venda Nova conducted in the period from January 2011 to December 2013 were analyzed descriptively and related to seasonal curve Lu. longipalpis. Richness, diversity and evenness in the study areas, urban and park protected area, were distinct. In Venda Nova SD 2.427 sand flies specimen s belonging to five genera and eight species were collected and the species accumulation curve reached saturation in the 19º sampling. In Sumidouro State Park a total of 4,675 sand flie s specimens belonging to nine genera and 25 species were collected and the species accumulation curve reached the saturation in the 16º sampling. In Venda Nova SD the species seasonal variation curve is predominantly determined by Lu. longipalpis . In Venda Nova 95.3% of the collected specimens belonged to the species Lu. longipalpis and this species exhibited a natural infection rate of 1.01% for Le. infantum and 1.77% for Le. braziliensis . In the Sumidouro State Park a total of 4,675 sand fly specimens of 25 species bel onging to nine genera were collected. The seasonal curve is not delineated by a unique species. In the park area, Lu. longipalpis accounted for only 5.35% of the collect ed specimens. The main vector of Le. infantum , Lu. longipalpis, accounted for only 5.35% of the specimens collected. Proven or suspected vectors of Le. braziliensis were recorded, and one female of the cortellezzii complex tested positive for Le. braziliensis DNA. The results make evident the Lu. longipalpis dominance in the urban environment. Our d ata demonstrate that anthropic modifications in the savannah studied area sign ificantly altered the sandflies populations and the Leishmania transmission cycles.