Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Flavia Maria de Souza Carvalho / Banca: Fabrício José Jaciani / Resumo: A produção de laranja e de suco concentrado é uma atividade agrícola que tem uma grande importância para o Brasil, em especial para o estado de São Paulo. Entretanto, o cancro cítrico é uma doença que causa grandes prejuízos à citricultura brasileira e mundial, sendo que até o momento não há nenhum método curativo para esta doença e o principal controle é a erradicação das plantas contaminadas. O cancro cítrico é originário da Ásia e tem como agente causal a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), a qual ataca todas as espécies comerciais de citros. Em um estudo de expressão gênica em dois mutantes de Xac que apresentavam diminuição ou ausência total de sintomas de cancro cítrico, a proteína XAC1008 se mostrou altamente expressa, pelo que o objetivo deste trabalho foi a caracterização funcional da ORF XAC1008 de Xac. A estratégia utilizada foi a produção de um mutante desta ORF e avaliação da sua patogenicidade quando comparada com a do isolado 306 de Xac selvagem em plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbek) e laranja Pêra (Citrus sinensis (L.) Osbeck). A técnica utilizada para a obtenção do mutante foi a da mutagênese sítio-dirigida por PCR utilizando o vetor suicida pOK1, seguida de recombinação homóloga. Os ensaios de patogenicidade do mutante ΔXAC1008 mostraram que a mutação alterou a coloração e o formato das colônias e impediu a multiplicação da bactéria in planta, embora ela ainda seja capaz de crescer em meio de cultura. O mutante diminuiu de maneira significativa a formação de biofilme e não foi capaz de causar doença em laranja 'Pêra Rio' (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e em limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbek), dois de seus hospedeiros citros, enquanto que a Xac 306 selvagem apresentou os sintomas característicos do cancro cítrico nos dois hospedeiros. Os resultados indicam que a proteína XAC1008 não está diretamente relacionada... / Abstract: The production of frozen concentrated juice from sweet orange is an agricultural activity that is of great importance to Brazil, especially for the state of São Paulo. However, citrus canker is a disease that causes bigger losses to the Brazilian and global citrus industry, and to date there is no curative method for this disease and the main control is the eradication of infected plants. The citrus canker originated in Asia and its causal agent is the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), which attacks all commercial species of citrus. In a study of gene expression in two Xac mutants with impaired or total absence of symptoms of citrus canker, the ORF XAC1008 was highly expressed, so the aim of this study was the functional characterization of the protein encoded by ORF XAC1008 from Xac. The strategy used was the construction of a mutant of the ORF XAC XAC1008 and evaluation of its pathogenicity in plants of Rangpur lime (Citrus limonia Osbek) and sweet orange 'Pêra Rio' (Citrus sinensis (L.) Osbeck) compared with the wild isolate strain Xac 306. The technique used for obtaining the mutant was PCR-based site-directed mutagenesis using the suicide vector POK1, followed by homologous recombination. Pathogenicity tests of the mutant ΔXAC1008 showed that the mutation affected the color and shape of colonies, and prevent multiplication of bacteria in the plant, though it is still able to grow in the culture medium. The mutant decreased significantly biofilm formation and was not able to cause disease in sweet orange 'Pêra Rio' orange and Rangpur lime, two of its citrus hosts, while the wild isolate strain Xac 306 showed the characteristic symptoms of citrus canker in both hosts. The results indicate that the protein XAC1008 is not directly related to the virulence or pathogenicity of Xac in citrus but is essential for the proliferation and survival of the bacteria in the host. Although the presence of the ... / Mestre

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Terezinha Knöbl / Banca: Marita Vedovelli Cardozo / Resumo: RESUMO - Salmonella Gallinarum (SG) é um patógeno hospedeiro-específico que causa o tifo aviário, doença sistêmica severa que é considerada uma das principais preocupações da indústria avícola mundial. Quando infecta a ave, SG utiliza mecanismos de evasão para sobreviver e replicar no interior de macrófagos. Nesse contexto, os genes phoPQ codificam o sistema regulatório de dois componentes (PhoPQ) que regula genes de virulência responsáveis pela adaptação de Salmonella spp. a fatores antimicrobianos como baixo pH, peptídeos antimicrobianos e baixas concentrações de cátions bivalentes. No presente estudo, objetivou-se investigar a função desses genes para SG. Assim, uma estirpe de SG com genes phoPQ defectivos (SG ∆phoPQ) foi construída e sua patogenicidade avaliada em aves poedeiras de 20 dias de vida susceptíveis ao tifo aviário. SG ∆phoPQ não causou sinais clínicos nem mortalidade em aves desafiadas oralmente, sendo não-patogênica. Ademais, essa estirpe não foi recuperada de fígados e baços. Por outro lado, aves desafiadas subcutaneamente com a estirpe mutante tiveram alterações patológicas discretas a moderadas e baixas contagens bacterianas em tecidos de fígado e baço. A partir dos dados, observa-se que SG ∆phoPQ é atenuado para aves o que sugere que ambos os genes são importantes durante a infecção sistêmica em aves por SG. / Abstract: ABSTRACT - Salmonella Gallinarum (SG) is a host-restrict pathogen that causes fowl typhoid, a severe systemic disease that is one of the major concerns to the poultry industry worldwide. When infecting the bird, SG makes use of evasion mechanisms to survive and to replicate within macrophages. In this context, phoPQ genes encode a two-component regulatory system (PhoPQ) that regulates virulence genes responsible for adaptation of Salmonella spp. to antimicrobial factors such as low pH, antimicrobial peptides and deprivation of bivalent cations. Herein, we aimed to investigate the role of the mentioned genes to SG. Thus, a phoPQ-depleted SG strain (SG ∆phoPQ) was constructed and its virulence assessed in twenty-day-old laying hens susceptible to fowl typhoid. SG ∆phoPQ did cause neither clinical signs nor mortality in birds orally challenged, being non-pathogenic. Furthermore, this strain was not recovered from livers or spleens. On the other hand, chickens challenged subcutaneously with the mutant strain had discreet to moderate pathological changes and also low bacterial counts in liver and spleen tissues. These findings show that SG ∆phoPQ is attenuated to susceptible chickens and suggest that both genes are important during chicken systemic infection by SG. / Mestre

Submitted by TAMIRIS KEMPNER (tamireskempner@yahoo.com.br) on 2018-08-08T19:23:03Z No. of bitstreams: 1 Tese - Tamiris Kempner.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-08-08T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kempner_t_dr_jabo.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kempner_t_dr_jabo.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diante da importância do cancro cítrico para a citricultura mundial, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, o agente causal da doença, tem sido amplamente estudada. Pesquisadores brasileiros realizaram o sequenciamento completo do genoma da X. citri subsp. citri isolado 306 (Xac306), com o intuito de elucidar os genes e mecanismos envolvidos na patogenicidade e/ou virulência da bactéria. As ORFs XAC2361 e XAC3898 possuem tamanhos e locais diferentes no genoma da Xac306, mas têm em comum o domínio Peptidase_M23, cujo processo biológico predito é de hidrolase de parede celular, mas a real função destas proteínas em Xac ainda é desconhecida. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio da mutação sítio-dirigida, se as ORFs XAC2361 e XAC3898 estão relacionadas com a virulência e/ou patogenicidade de X. citri subsp. citri 306 e com o desenvolvimento do cancro cítrico. Para isso, foram realizados testes in vitro e in planta dos mutantes obtidos, visando observar alterações fenotípicas. Devido a presença de peptídeo sinal, a ORF XAC2361 foi fundida à proteína fluorescente mCherry (XAC2361-mCherry) para expressão in vivo e avaliação por microscopia de fluorescência. As análises fenotípicas demonstraram que o mutante ΔXAC2361 não apresentou alterações nos sintomas quando avaliado em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), porém apresentou menor capacidade de crescimento in vitro, menor motilidade swimming e swarming e menor capacidade de sobrevivência em SDS. Por outro lado, o mutante ΔXAC3898 apresentou uma significativa redução na virulência, menor capacidade de crescimento in planta, maior capacidade de crescimento in vitro, menor capacidade de agregação, maior produção de goma e biofilme e a avaliação por microscopia eletrônica de varredura mostrou que houve uma redução no comprimento das células da bactéria. A análise por microscopia de florescência da proteína de fusão XAC2361-mCherry mostrou, predominantemente, uma fluorescência dispersa, o que é um indício de que a mesma pode estar sendo direcionada para o citoplasma. Apesar disso, não foi possível confirmar a expressão da proteína de fusão XAC2361-mCherry por meio de Western-blot. Diante dos resultados obtidos, sugere-se que o domínio Peptidase_M23 está de alguma forma envolvido com a virulência e/ou patogenicidade de Xac, atuando na formação da parede celular. / In view of the importance of citrus canker in citrus culture worlwide, the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, the causal agent of this disease, has been extensively studied. Brazilian researchers performed the complete sequencing of the genome of X. citri subsp. citri isolate 306 (Xac306), in order to elucidate the genes and mechanisms involved in the pathogenicity and/or virulence of Xac. The ORFs XAC2361 and XAC3898 have different sizes and location in the genome, but have in common the M23 Peptidase domain, whose biological process is predicted to act as cell wall hydrolase, but the actual function of these proteins in Xac is still unknown. This work aimed to evaluate, through site-directed mutagenesis, whether XAC2361 and XAC3898 ORFs are related to the virulence and / or pathogenicity of Xac306 and the development of citrus canker. In order to observe phenotypic changes, in vitro and in planta tests of the mutants were carried out. Due to the presence of signal peptide, the ORF XAC2361 was fused to the mCherry fluorescent protein (XAC2361-mCherry) for in vivo expression and fluorescence microscopy evaluation. Phenotypic analyzes demonstrated that the ΔXAC2361 mutant showed no change in symptoms when evaluated in Mexican lime (Citrus limonia Osbeck), but presented lower in vitro growth capacity, lower swimming and swarming motility, and lower survival capacity in SDS. On the other hand, the ΔXAC3898 mutant showed a significant reduction in virulence, lower in plant growth capacity, higher in vitro growth capacity, lower aggregation capacity, higher gum production and biofilm, and scanning electron microscopy evaluation showed that there was a reduction in cell length. Microscopy analysis of the XAC2361-mCherry fusion protein showed predominantly dispersed fluorescence, which is an indication that it may be being directed to the cytoplasm. Despite this, the expression of XAC2361-mCherry fusion protein could not be confirmed by Western blotting. In view of the obtained results, it is suggested that the Peptidase_M23 domain is in some way involved with the virulence and/or pathogenicity of Xac, acting in the formation of the cellular wall.

As aves foram separadas em quatro grupos, dois vacinados e dois não vacinados no 1º dia de vida. As aves foram desafiadas no 1º,4º,7º,10º,13º,16º,19º e 22º dias de vida. A cada dia de desafio eram coletados e medidos, antes e depois, os seguintes itens do grupo: peso relativo da bolsa de Fabrício, diâmetro da bolsa, bolsa de Fabrício para exame histológico e soro para medir os anticorpos contra a DIB, através de Elisa e avaliação clínica da DIB. Os resultados mostraram uma queda de anticorpos sem diferença significativa entre aves vacinadas e não vacinadas. Analisando os diferentes resultados, foi estabelecido que um título de Elisa (log10) de 3,4, foi o ponto de corte entre aves saudáveis e aves doentes. Foram construídas equações de regressão, para o estabelecimento do melhor dia para a vacinação ou do título de Elisa (log10), que as aves podem ter numa determinada idade. Assim sendo, os pintos da Empresa A deveriam receber vacina contra a DIB a partir do 6º - 7º dia, e os da Empresa B deveriam receber a vacina entre o 11º-12º dia de idade. Com os resultados obtidos neste experimento fica claro que as aves não devem ser vacinadas no 1º dia de vida, que o esquema de vacinação das reprodutoras ocasiona diferenças na proteção da progênie e que não se deve aplicar o mesmo esquema de vacinação indiscriminadamente para todos os lotes de frangos.

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Francisco André Ossamu Tanaka / Banca: Roberto Hirochi Herai / Banca: Helen Alves Penha / Banca: Henrique Ferreira / Resumo: Os citros são um grupo de espécies vegetais, com alto potencial produtivo, porém, acometido por várias doenças. Do gênero de bactérias Xanthomonas, três espécies são patogênicas a citros: Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, uma das doenças de maior preocupação da citricultura; X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C, que causam a cancrose; e X. alfalfae subsp. citrumelonis, responsável por causar a mancha bacteriana dos citros. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi a análise e descrição, em nível anatômico e ultraestrutural, dos processos de infecção de bactérias do gênero Xanthomonas, causadoras de doenças em citros, a correlação do fenótipo da interação XfaC-citros com o transcriptoma e a análise dos fatores de virulência das estirpes estudadas. O processo de infecção das estirpes Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 e XfaC1630 em lima ácida 'Galego' e/ou laranja doce 'Hamlin', foi avaliado em diferentes períodos de infecção, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônicas de varredura e transmissão. As seguintes características relacionadas a virulência das estirpes foram avaliadas: formação in vitro de biofilme, produção de goma, motilidade "swimming" e auto agregação celular. Os resultados mostraram que Xac306 é a estirpe mais agressiva dentre as demais, visto pelos sintomas e pela intensidade das alterações anatômicas no tecido de 'Hamlin' e 'Galego'. O processo de infecção em lima ácida 'Galego' foi semelhante em todas as ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Citrus are a diverse group of plant species, with high yield potential, but affected by several diseases. The bacteria genus Xanthomonas has three species pathogenic to citrus: Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, one of the most important diseases of citrus crop; X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C, causing citrus cancrosis; and X. alfalfae subsp. citrumelonis, which causes citrus bacterial spot. Therefore, the goal of this work was to analyze and describe, at the anatomical and ultrastructural level the infectious processes of Xanthomonas causing diseases in citrus, the correlation of the XfaC-citrus interaction phenotype with the transcriptome and the comparative analysis of virulence related factors, in order to elucidate morphophysiological traits of host-pathogen interaction. The infection process of Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 and XfaC1630 strains in 'Galego' Mexican lime and 'Hamlin' sweet orange were evaluated at different points of infection by light microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The following virulence related characteristics of the strains were evaluated: in vitro biofilm formation, gum production, swimming motility and cellular auto aggregation. The results showed that Xac306 is the most aggressive strain among the others, due to the intensity of the symptoms and anatomical alterations in 'Hamlin' and 'Galego' tissue. The infection process in the susceptible host ('Galego' Mexican l... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Trezentos pacientes portadores de colonização intracavitária pulmonar (pelos exames soro lógico e/ou tecidual) foram investigados num período de 10 anos. Os casos foram classificados como: Aspergillus fumigatus (246 casos); Ao niger (21 casos); A. flavus (7 casos); Pseudallescheria boydii (1 caso); colonização fúngica não especificada (21 casos) e colonização actinomicética (4 casos). os grupos A. niger (çasos)e A. fumigatus (controles) foram comparados a respeito de variáveis clínicas e laboratoriais, por serem os mais freqUentes e pela pobreza da literatura sobre A. niger. Esta análise mostrou associações estatisticamente significativas com o A. niger para;sexo masculino (Razão de Chances = 3,28; p <0,05); infecção nosocomial, ocorrendo em hospitais de conservação precária (RC = 150,8; p< 0,001); tuberculose ativa (RC = 8,03; P <0,001); diabete mélito tipo 11 (RC = 10,67; p<O,OOl); e êxito letal (RC = 3,1; p<0,02). Por outro lado, cristais de oxalato de cálcio no escarro e oxalose sitêmica só ocorreram no grupo A.niger. As implicações etiológicas e diagnósticas destes achados sao discutidas, enfatizando o papel do ambiente externo, da oxalose, do acúmulo de ácidos e da tuberculose ativa na etiopatogenia do A. niger. / Three hundred patients with intracavitary pulmonary colonization (by serologic and/or tissue examinations) were analysed during a ten years period. The cases were classified as: Aspergillus fumigatus (246 cases); A. niger (21 cases); A. flavus (7cases); Pseudallescheria boydii (1 case); fungal colonization not especified (21 cases) and actinomycetic colonization (4 cases). Due to their frequency and the scarcity of literature about A. niger, the groups A. niger (cases) and A. fumigatus (controls) were compared with respect to clinical and laboratorial variables. This analysis showed statistically significant associations with A. niger for: male sex (Odds Ratio = 3,28; p< 0,05); nosocomial infection, which occurred.in hospitaIs in poor state of repair (aR = 150.8; p<O,ooU; active tuberculosis (aR = 8,03; p<O,OOl); type 11 diabete mellitus (aR = 10,67; p<O,ooU; and lethal outcome (aR = 3, 1; p < o, 02). On the other hand, calcium oxalate crystals in the sputum and sistemic oxalosis occured only in A. niger group. The etiologic and diagnostic implications of these findings are discussed, with emphasis on the role of the externa 1 environernent, oxalosis, acid acurnulation and ative tuberculosis in the etiopathogenesis of A. niger.

A Escherichia coli foi considerada, por muito tempo, um microrganismo nãopatogênico, no entanto com o passar do tempo, alguns sorogrupos começaram a ser associados a diversas patologias no homem e em animais. E. coli é encontrada na microflora normal do trato intestinal das aves e também amplamente distribuída na natureza, necessitando por isso, fazer-se a diferenciação de amostras patogênicas de não-patogênicas e que venha desenvolver doenças. Em aves, amostras de E.coli com a presença de alguns fatores de virulência são denominadas APEC (E.coli patogênica para aves). APEC está associada com infecções extra-intestinais principalmente do trato respiratório ou infecções sistêmicas. Lesões por ela causadas, como agente primário e principalmente secundário, geram prejuízos econômicos decorrentes de menor desenvolvimento corpóreo, pior conversão alimentar, mortalidade embrionária, aumento da mortalidade e custos com medicamentos e condenação de carcaças. É um dos principais problemas da avicultura industrial moderna, devido a grandes prejuízos econômicos causados no mundo inteiro. A celulite aviária é uma forma de infecção também causada pela E.coli e tem extrema importância em função da condenação de aves nos abatedouros devido a lesões cutâneas. A patogenicidade das cepas de E.coli está relacionada com a cumulatividade dos mecanismos de virulência e que podem ser multifatoriais. Seguindo a linha de pesquisa no Programa de Isolamento e Identificação de cepas Patogênicas de Escherichia coli desenvolvida pelo CDPA, este trabalho tem como objetivo otimizar a detecção de genes associados à patogenicidade de amostras de E. coli a partir de isolamento bacteriano através da técnica de Multiplex-PCR (m-PCR), baseado em adaptações do protocolo de PCR para estabelecer o perfil genético de E. coli, associados à classificação de patogenicidade, isoladas de frangos de corte com a utilização de Inteligência Artificial (Redes Neurais Artificiais) desenvolvido por (ROCHA, 2006). As amostras de E.coli oriundas de empresas avícolas do Rio Grande do Sul foram isoladas de quadros respiratórios, camas aviárias e de lesões de celulite. Os fatores de virulência e os genes responsáveis, identificados nesse trabalho foram: capacidade de adesão pela fímbria P (pap C) e fímbria F11 (fel A), a produção de colicinas (cva C), a presença de aerobactina (iut A), presença dos antígenos capsulares K1 e K5 (kpsll), a resistência sérica (iss), hemaglutinina sensível à temperatura (tsh). A detecção de fatores de virulência de amostras de E.coli através do m-PCR produziu a amplificação simultânea dos fragmentos de DNA dos genes propostos em tamanho de pares de base esperado para cada multiplex, através de adequações dos protocolos em 100% dos testes. Os iniciadores foram específicos para amostras que continham os genes elencados já que não houve amplificação nas amostras que serviram como controles negativos. Os resultados obtidos pelo m-PCR desenvolvido nesse experimento, reproduziram os resultados gerados pelos protocolos de PCR de Rocha em 2006, com avantagem de obter o mesmo resultado em menor tempo e com a utilização de menor volume de reagentes determinando uma economia nos insumos do ensaio. Os acréscimos obtidos tornam o método disponível para a avaliação dos atributos de virulência que determinam o potencial de patogenicidade de isolados de E. coli. / The Escherichia coli, was considerate for a long time a non pathogenic microorganism however. As time went by some serogroup started to be associated with several pathologies in humans and animals. E.coli, it is found in the normal bacterial flora of the avian intestinal tract and it is also widely spread in the environment, therefore it is necessary to differentiate the nonpathogenic samples from the pathogenic ones and the ones that can cause diseases. In fowls, E.coli samples with the presence of some virulence factors are called APEC (avian pathogenic Escherichia coli). APEC is associated with extra intestinal infections, mainly in the respiratory tract or systemic infections. Lesions it causes, either as primary or secondary agent, result in economic losses which occur as a consequence of the bird’s poorer growth rate and feed conversion, as well as increased mortality, medication costs and condemnation at the processing plant. It is one of the major problems in the modern aviculture industry, due to the big economic losses in the whole world. The avian cellulitis is a kind of infection also caused by E. coli and has extreme importance in terms of the avian condemnations in the slaughter houses due to the cutaneous lesions. The pathogenicity of the strains of E. coli is related to the cumulativity of the virulence mechanisms and that can be multifactorials. Following the line of research in Isolation Program and Identification of the Pathogenics Strains of the Escherichia coli developed by the CDPA, this work had as aim achieve faster the detection of genes associated with the pathogenicity of the samples of E. coli from on bacterial isolation through the technique of Multiplex – PCR ( m – PCR ), based on the adaptations of the protocol of PCR to restore the genetic profile of the E. coli associated with the classification of the isolated pathogenicity of the chicken flocks with the utilization of Artificial Inteligence (Artificial Neural Nets ) developed by Rocha, (2006). The samples derived from the avian enterprise from the state of RGS were isolated from the respiratory cases, avian beds and from the cellulitis lesions, and the virulence factors and the responsible genes identificated in isolated E. coli samples of the fowls in this work were: adhesion capacity by the fimbriae P (pap C) and fimbriae F 11 (fel A), the colicin production (cva C), the aerobactin presence ( iut A) capsular antigens presence K1 and K5 (kpsll ), the serum resistence (iss), temperature-sensitive hemmaglutin ( tsh ). The detection of the virulence factors of the E. coli samples through the m–PCR produced the simultaneous amplification of the DNA fragments of the genes proposed in the size of the based pairs expected for each multiplex, through protocols adaptations by 100%. The initiators were specified for the samples that contained the chosen genes whereas there was not amplification in the samples that served as negative controllers. The results obtained by the m-PCR developed in that experiment, reproduced the results generated by the PCR protocols developed by Rocha 2006, with the advantage to obtain the same result in less time and with the utilization of lower volume of the reagents determining a saving in the costs of the test. The increases obtained become the method available for the assessment of the virulence attributes that determined the potential of the pathogenecity of the E. coli isolated.

No controle da infecção por Salmonella, a correção de fatores de risco tem sido associada a medidas alternativas como a adição de prebióticos às dietas. O mananoligossacarídeo (MOS) é um carboidrato capaz de adsorver bactérias Gram-negativas que possuem fímbria tipo 1, essencial para a colonização do intestino. O presente estudo teve como objetivo: i. avaliar isolados de Salmonella enterica quanto à presença e expressão de fímbria tipo 1 e adsorção ao MOS; ii. avaliar em suínos o efeito do MOS no índice de infecção e excreção de Salmonella; na microbiota entérica e no título de IgA. Um total de 108 isolados de Salmonella, foi avaliado quanto à amplificação dos genes fimA e fimH, hemaglutinação manose-sensível e adsorção ao MOS. Em todos os isolados ambos os genes foram amplificados, 31 expressaram fímbria tipo 1 e, desses, 74,2% adsorveram fortemente ao MOS. Após, 23 suínos desmamados, alocados em grupo tratamento (com MOS) e controle, foram inoculados, com um isolado de S. Typhimurium capaz de adsorver ao MOS, e acompanhados por 28 dias. A quantidade de Salmonella excretada pelos suínos foi baixa, apresentando tendência de menores medianas no grupo tratamento. Não houve diferença significativa no número de infectados nem nas densidades óticas do ELISA IgG e IgA. As amostras de tonsila apresentaram o maior número de isolamentos. Contagens similares de lactobacilos, enterococos e coliformes foram encontradas nos dois grupos. Concluiu-se que a adição de MOS não impediu a infecção dos suínos por Salmonella, porém houve uma tendência de menor excreção no grupo tratado. / In the control of Salmonella infection, correction of risk factors has been associated with alternative measures such as the addition of prebiotics to diets. Mannanoligosaccharide (MOS) is a complex carbohydrate, able to adsorb Gram-negative bacteria that possess type-1 fimbriae, essential for colonization of the intestine. This study aimed to: i, evaluate isolates of Salmonella enterica, the presence and expression of type-1 fimbriae, and agglutination with MOS; and ii, evaluate in pigs the effect of MOS on the rate of infection and excretion of Salmonella, and enteric microbiota and Salmonella IgA titers. A total of 108 strains of Salmonella sp. isolated from carrier pigs were evaluated for the amplification of fimA and fimH genes, agglutination with MOS and hemagglutination. In all strains tested, amplicons of the expected size were detected, 31 expressing type-1 fimbriae; and of these, 74.2% showed a strong agglutination to MOS. A total of 23 weaned pigs were allotted to a treatment group (with MOS) and a control group, were inoculated with a strain of S. Typhimurium able to adsorb to the MOS, and were evaluated for 28 days. The amount of Salmonella excreted by the pigs was low, showing a trend toward a lower median in the treated group. The ELISA IgG and IgA optical density of both groups showed no significant difference. In our study, the tonsils contributed to the highest rate of Salmonella isolation. The medians of coliforms, enterococci and lactobacilli were similar throughout the experiment in both groups. It was concluded that the addition of MOS did not affect the infection of pigs by Salmonella, although the excretion rate was lower in the treated group.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-06-03T12:32:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertação padronizada_Felipe Dutra Rêgo 2013 versao final.pdf: 3338152 bytes, checksum: 4b1ea54844c41caffe2e3dd7db69355e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-03T12:32:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação padronizada_Felipe Dutra Rêgo 2013 versao final.pdf: 3338152 bytes, checksum: 4b1ea54844c41caffe2e3dd7db69355e (MD5) Previous issue date: 2013 / As leishmanioses são protozooses de alta prevalência em regiões tropicais como o Brasil e são transmitidas por vetores flebotomíneos, cujos hospedeiros são compostos por diferentes espécies animais vertebrados. O objetivo deste trabalho foi estudar os aspectos entomológicos relacionados à epidemiologia das leishmanioses na aldeia Imbaúbas da Terra Indígena Xakriabá, Município de São João das Missões, Minas Gerais. Durante o período de julho de 2008 a julho de 2009 foram realizadas seis coletas de flebotomíneos sendo dispostas 40 armadilhas luminosas no peridomicílio de 20 casas sorteadas aleatoriamente. Entre outubro de 2011 a agosto de 2012 foram realizadas seis campanhas de captura de flebotomíneos e 20 armadilhas luminosas foram distribuídas em 4 trilhas (cinco armadilhas por trilha) previamente demarcadas para estudo de hospedeiros silvestres e sinantrópicos de Leishmania. Foram utilizados testes estatísticos para avaliar diferenças no padrão de distribuição de espécies, riqueza e abundância de flebotomíneos nos diferentes ecótopos. Um total de 8.046 flebotomíneos pertencentes a 28 espécies e 11 gêneros foram coletados e identificados. As spécies Lutzomyia longipalpise Nyssomyia intermediaforam as mais abundantes no peridomicílio enquanto Martinsmyia minasensise Lutzomyia cavernicolaas mais abundantes nas trilhas de coleta. As fêmeas foram dispostas em "pools" contendo no máximo dez espécimes da mesma localidade, espécie e data de coleta para pesquisa de DNA de Leishmania spp. por métodos moleculares. A identificação da espécie de Leishmaniafoi feita a partir da técnica de ITS1PCR-RFLP utilizando a enzima HaeIIIe o sequenciamento genético para um alvo do gene SSUrRNA. Foi possível detectar a presença de DNA de Leishmaniaem 11 amostras provenientes do peridomicílio: Lu. longipalpis (2), Ny. intermedia(4); Lu. renei(2); Lu. ischnacantha; Micropygomyia goiana e Evandromyia lenti. Com relação às trilhas, foi possível verificar a presença de DNA de Leishmania em 12 amostras: Mt. minasensis (5); Ny. intermedia(3); Mi. peresi(2); Mi. capixabae Ev. lenti. Os resultados obtidos reforçam a importância epidemiológica das espécies Lu. longipalpise Ny. intermediana transmissão da leishmaniose visceral e tegumentar respectivamente, além do encontro de outras espécies com DNA de Leishmania como Mt. minasensise Ev. lenti que podem participar de um ciclo silvestre e/ou sinantrópico de Leishmania na área de estudos / Leishmaniases are protozooses highly prevalent in tropical regions such as Brazil and are transmitted by sand flies vectors, whose hosts are different vertebrate species. The objective of this study was to survey the entomological aspects related to the epidemiology of this disease in Imbaúbas village of the Xacriabá Indian Reserve, São João das Missões municipality, Minas Gerais state. Between July 2008and July 2009, six sand fly collections were carried out using 40 light traps placed in theperidomicile of 20 randomly selected houses. Between October 2011 and August 2012, another six collections to capture sand flies were carried out with 20 light traps distributed in 4 tracks (five traps per track) selected for a previous study of wild and synanthropic hostsof Leishmania. Statistical tests were used to evaluate differences in the distribution patterns, richness and abundance of sand flies in different ecotopes. A total of 8.046 sand flies belonging to 28 species and 11 genera were collected and identified. The species Lutzomyia longipalpisand Nyssomyia intermediawere the most abundant in peridomicile, while Martinsmyia minasensisand Lutzomyia cavernicola were the most abundant on the tracks. Females were organized in poolswith a maximum of ten specimens from the same locality, species and date for detection of Leishmaniaspp. by molecular methods. Leishmaniaspecies identification was made with ITS1PCR-RFLP using the enzyme HaeIIIand genetic sequencing was used for SSUrRNA target. The presence of LeishmaniaDNA was detected in 11 samples from peridomicile: Lu. longipalpis (2), Ny. intermedia(4), Lu. renei(2), Lu. ischnacantha, Micropygomyia goiana and Evandromyia lenti. On the tracks, it was possible to verify the presence of LeishmaniaDNA in 12 samples: Mt. minasensis (5), Ny. intermedia(3), Mi. peresi(2), Mi. capixabaand Ev. lenti. The results support the epidemiological importance of Lu. longipalpisand Ny. intermedia in the transmission of visceral and cutaneous leishmaniases respectively, in addition to the finding of other species associated with Leishmania DNA, such as Mt. minasensisand Ev. lenti which may participate in a wild and/or synanthropiccycle of Leishmaniain the tudied area.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T14:09:58Z No. of bitstreams: 1 Tese_RafaelleCGomesFaresGusmão.pdf: 2582678 bytes, checksum: c69c8890c0878586f273089f5214d41f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T14:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_RafaelleCGomesFaresGusmão.pdf: 2582678 bytes, checksum: c69c8890c0878586f273089f5214d41f (MD5) Previous issue date: 2013 / A cardiomiopatia dilatada crônica decorrente da infecção pelo T. cruzi está associada com o remodelamento do miocárdio e com a fibrose intersticial, o que resulta em mudanças significativas da matriz extracelular (MEC). O remodelamento da MEC é regulado por enzimas proteolíticas como as metaloproteinases de matriz (MMPs). Nesse estudo, avaliamos pela primeira vez o envolvimento das MMPs 2 e 9 e seus inibidores (TIMPs) em pacientes portadores das formas clínicas indeterminada (IND) e cardíaca (CARD) da doença de Chagas. Nossos resultados mostraram que os níveis séricos da MMP-9 estão associados com a gravidade do acometimento cardíaco e que a MMP-9 possui maior potencial de atividade proteolítica no soro de pacientes CARD. Os níveis séricos de TIMP-1 não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos estudados. Por outro lado, os níveis séricos de TIMP-2 foram maiores no grupo CARD. A partir da análise de correlação, foi possível observar uma possível especificidade do TIMP-1 pela MMP-9. A análise da produção de MMPs por linfócitos T e monócitos mostrou que essas células do sistema imune são capazes de produzir MMP-2 e MMP-9 e, ainda que linfócitos T CD8+ são as principais células mononucleares produtoras de MMP-2 e MMP-9. A partir da cultura tridimensional de cardiomiócitos de camundongos, observamos que existem componentes no soro dos pacientes com doença de Chagas capazes de induzir a expressão de componentes da matriz extracelular no microtecido cardíaco. Além disso, MMP-2 apresentou correlação negativa com proteínas de matriz (laminina e fibronectina) e com citocinas inflamatórias (TNF-IL-6 e IL-1), enquanto que a MMP-9 apresentou correlação positiva com proteínas de matriz (laminina e fibronectina) e com a citocina inflamatória IL-1. A partir da análise da ocorrência de polimorfismos de nucleotídeo único, não foi possível observar influência da genética do hospedeiro sobre os níveis séricos das MMPs 2 e 9 e seus inibidores, bem como sobre a morbidade da doença de Chagas. Nossos resultados sugerem que MMP-2 e MMP-9 participam de maneira diferente na patogênese da doença de Chagas, sendo que a MMP-9 parece estar mais envolvida no processo inflamatório e no remodelamento cardíaco. Em resumo, nossos resultados mostram, pela primeira vez, o envolvimento da MMP-9, mas não da MMP-2, na cardiomiopatia chagásica. Esses dados são inovadores e representam um avanço no conhecimento dos mecanismos envolvidos no estabelecimento e manutenção da patologia do acometimento cardíaco na doença de Chagas. / Dilated chronic cardiomyopathy (DCC) in Chagas disease is associated with myocardial remodeling and interstitial fibrosis, resulting in significant extracellular matrix (ECM) modifications. ECM remodeling is regulatedby proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinases (MMPs). In this study, we evaluated, for the first time, the serum MMPs 2 and 9 levels, as well as their main cell sources in the peripheral blood from patients presenting the indeterminate (IND) or cardiac (CARD) clinical forms of Chagas disease. Our results showed that MMP-9 serum levels are associated with the severity of Chagas disease. The serum levels of TIMP-1 were not different between the studied groups; however the serum levels of TIMP-2 were higher in CARD group.The correlation analysis showed a possible specificity of TIMP-1 for MMP-9. The analysis of MMPs production by T lymphocytes showed that CD8+ T cells are the main source of both MMP-2 and MMP-9 molecules. Using a new 3-dimensional model of fibrosis we also observed that serum from patients with Chagas disease induced an increase in the extracellular matrix components in cardiac spheroids obtained from mice cardiomyocytes. Furthermore, MMP-2 and MMP-9 have showed different profile of correlation with matrixproteins (laminin and fibronectin) and inflammatory cytokines (TNF-and IL-1) in patients with Chagas disease. Our results suggest that MMP-2 and MMP-9 show distinct activities in Chagas disease pathogenesis. While MMP-9 seems to be involved with the inflammation and cardiac remodeling of Chagas disease, MMP-2 does not show any correlation with inflammatory molecules. There are many factors involved in the determination of the severity and progression of Chagas disease, and host genetics is certainly a contributing factor for the development of the disease. Therefore, we evaluated whether there were significant polymorphisms in MMPs and TIMPs genes. Our results did not show any association between polymorphisms occurrence and morbidity of the disease. In conclusion, our datastress the involvement of MMP-9, and not of MMP-2, in heart disease and, for the first time, its participation in chagasic cardiomyopathy. These data are innovative and represent an advance in the knowledge of the mechanisms involved in the establishment/maintenance of the Chagas heart disease pathology.