A investigação dos mecanismos de interação dos vírus com as células do hospedeiro trazem informações relevantes para a identificação de alvos no desenvolvimento de drogas para impedir a penetração e/ou desenvolvimento dos vírus. Peptídeos desenhados a partir de proteínas virais foram desenvolvidos e testados quanto as suas capacidades de inibir o processo de fusão do vírus com a célula do hospedeiro. Alguns se encontram em fase de avaliação clínica. Anticorpos contra a proteína p24 do HIV-1 foram detectados no soro de pacientes HIV-positivos, e estes reconhecem pequenas seqüências peptídicas desta proteína. Neste trabalho foi analisada a interação entre uma seqüência peptídica correspondente aos aminoácidos 196-224 (AAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIA) da proteína p24, denominado p24- 1, com sistemas biomiméticos. Os sistemas utilizados foram filmes de Langmuir (monocamadas) de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e vesículas multilamelares (MLVs) de DPPC. O p24-1 encontra-se desorganizado em solução aquosa, mas com a interação com as MLVs de DPPC teve induzido uma conformação hélice ?, de acordo com o espectro de dicroísmo circular (CD). Esta característica foi confirmada pela predição de hélice a seguida por uma estrutura não ordenada contendo 11 resíduos do p24-1. As isotermas de pressão e potencial de superfície das monocamadas de DPPC foram afetadas com a presença de 0,05% mo1 de p24-1, com uma expansão de aproximadamente 5%. Para concentrações acima de 0,5% mo1 de p24-1 a expansão foi de 20%, com saturação do efeito da concentração. O efeito de expansão foi acompanhado por uma alteração na morfologia das monocamadas, estudados com microscopia no ângulo de Brewster (BAM). A incorporação do p24-1 impede a formação de grandes domínios de DPPC. O efeito cooperativo causado na monocamada de fosfolipídios pelo p24-1 sugere que esse tem um potencial na atividade antiviral por participar da expansão da membrana da célula hospedeira. / The investigation of the interaction mechanisms between the viruses and the host cells brings relevant information for the identification of targets on the development of drugs to prevent the penetration and/or development of the viruses. Peptides designed from viral proteins have been developed and tested on its capacities of inhibiting the merging process of the virus with the host cell. Some of them are in clinical evaluation. Antibodies against the protein p24 of the HIV-1 have been detected in the serum of HIV-positive patients, and they are able to recognize short peptide sequences of this protein. In this work, it was analyzed the interaction between a peptide sequence corresponding to amino acids 196-224 (AAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIA) of the protein p24, called p24- 1, and biomimetic systems. The systems used were Langmuir films (monolayers) of dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC) and dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG) and multilamelar vesicles (MLVs) of DPPC. p24-1 is found disorganized in watery solution, but with the interaction with the MLVs of DPPC it had induced a conformation ?-helix, according to the circular dichoism spectra (CD). This characteristic was confirmed by the prediction of ?-helix followed by an unordered structure with 11 residues of p24-1. The isotherms of pressure and potential of surface of the DPPC monolayers were affected by the presence of 0,05% mo1 of p24-1, with an expansion of approximately 5%. For concentrations above 0,5% mol of p24-1 the expansion was 20%, with saturation of the concentration effect. The expansion effect was followed by a morphologic alteration of the monolayers, studied with microscopy of the Brewster angle (BAM). The incorporation of p24-1 prevents the formation of large domains of DPPC. The cooperative effect caused in the phospholipid monolayer by p24-1 suggests that this peptide has a potential in the antiviral activity, once its participates on the expansion of the host cell membrane.

Os microrganismos atraem considerável atenção por serem uma fonte de compostos biotecnológicos e farmacêuticos. Diversos produtos naturais peptídicos produzidos por fungos e bactérias são sintetizados por grandes enzimas, conhecidas como peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) e policetídeo sintase (PKS). A bioprospecção dos microrganismos isolados do solo de Terra Preta Antropogênica (TPA) da Amazônia Ocidental é de grande importância para o conhecimento deste bioma tropical. Este estudo correlacionou a presença de sideróforos e de compostos antimicrobianos produzidos pelos microrganismos isolados de TPA e dos solos adjacentes com a presença dos genes que codificam para NRPS e PKS. Linhagens bacterianas foram isoladas das amostras do solo coletadas de 10, 20 e 40 cm de profundidade. Os isolados foram cultivados em meio líquido específico por 2 dias a 28oC. Um total de 143 isolados foi testado para a atividade de sideróforo e para isso, as linhagens foram inoculadas em um meio com baixa concentração de ferro (MM9) contendo o complexo cromoazurol S-Fe3. Do total, 72 isolados apresentaram reação positiva para a produção de sideróforo. O DNA genômico dos isolados foi extraído e a amplificação por PCR foi realizada usando iniciadores específicos para NRPS e PKS. Os resultados mostraram que quinze isolados apresentaram o gene que codifica para NRPS, vinte isolados para PKS e somente dez isolados apresentaram ambos os genes. A presença de genes de NRPS e PKS em 31% dos isolados testados sugere que a produção dos sideróforos possa ocorrer pela via não ribossomal. Dois isolados foram selecionados para estudos de identificação e caracterização dos compostos. O isolado TP11 foi identificado como Pseudomonas putida através de seqüenciamento do 16S rRNA e apresentou resultado negativo para hidroxamato e catecol, sugerindo que o tipo de sideróforo não possui nenhum destes grupos funcionais. O isolado TP16 foi identificado como Pseudomonas putida e apresentou produção de sideróforo do tipo catecol e hidroxamato, sugerindo a produção de mais de um sideróforo. Além disso, esta linhagem produziu um composto antimicrobiano, com atividade de sideróforo identificado por espectrometria de massas como pseudomonina com massa molar de 330 Da. / Microorganisms have attracted considerable attention as a source for biotechnological and pharmaceutical agents. Several peptidic natural products synthesized by fungi and bacteria are assembled by large enzymes, referred as nonribosomal peptide synthetase (NRPS) and polyketide synthase (PKS). Bioprospection of microorganisms isolated from Anthropological Dark Earth soil of Brazilian Occidental Amazon is of great importance to the knowledge of this tropical biome. This study aimed to correlate the presence of siderophores and antimicrobial compounds produced by microorganisms isolated from Dark Earth and adjacent soils of Brazilian Amazon with the presence of genes encoding NRPS and PKS. Bacterial strains were isolated from soil samples collected at 10, 20 and 40 cm depth. The isolates were grown in specific liquid medium for 2 d at 28oC. A total of 143 isolates were screened for siderophore activity and for this, bacterial strains were inoculated on plates containing an iron-limited medium (MM9) amended with a chromeazurol S-Fe3 complex. From the total, seventy-two isolates showed positive reaction for siderophore production. Genomic DNA of the isolates was extracted and PCR amplification was carried out using specific primers for NRPS and PKS. The results showed that fifteen isolates presented NRPS, twenty isolates presented PKS and only ten isolates showed both genes. The presence of NRPS and PKS genes in 31% of the isolates tested suggests that production of siderophores may occur by a nonribosomal pathway. Two isolates were selected for further studies. Isolate TP11 was identified as Pseudomonas putida by 16S rDNA sequencing analysis and was negative for hydroxamate and catechol, suggesting that the siderophore type has no hydroxamate- or catechol-type functional groups. The isolate TP16 was identified as Pseudomonas putida and showed the production of catechol and hydroxamate siderophore-type, suggesting the production of more than one siderophore. In addition, this strain produced an antimicrobial compound, with siderophore activity identified through mass spectrometry as pseudomonine with a molar mass of 330 Da.

O melanoma cutâneo é a neoplasia de pele de maior mortalidade e grande imprevisibilidade na sua evolução. Na doença disseminada, as opções terapêuticas são pouco eficazes. A pesquisa de novos marcadores tumorais permite a melhor compreensão da patogênese do melanoma e possibilita a descoberta de alvos moleculares. A proteína Dermicidina (DCD) foi identificada entre os 9 genes de uma assinatura gênica de predição de diagnóstico clínico do melanoma humano, porém vários autores divergem sobre o papel desta na doença e os mecanismos moleculares pelos quais a DCD atua nos tumores permanecem incertos. O presente estudo teve como objetivo investigar o papel da DCD na tumorigênese do melanoma maligno e correlacionar sua expressão com dados clínicos, demográficos e patológicos dos pacientes. Através da técnica de imuno-histoquímica em lâminas de TMAs (tissue-microarray), o padrão de expressão de DCD foi analisado em tecido tumoral de duas coortes de pacientes, a primeira com 53 casos tratados no Hospital A.C. Camargo, predominantemente caucasianos, e a segunda com 48 casos, todos asiáticos, obtidos comercialmente da empresa IMGENEX. A análise in situ da Dermicidina mostrou que a proteína está expressa de forma heterogênea nas células tumorais, e pode ocorrer tanto em tumores amelanocíticos como melanocíticos. Em melanomas primários, a expressão de DCD foi mais frequente em tumores localizados nas regiões do tronco e membros superiores, já nas metástases, a proteína foi detectada predominantemente em células em transito nos linfonodos (69,23% dos casos). Analisando os resultados dos 101 pacientes das duas coortes em conjunto, pelo método de Kaplan-Meier, foi confirmado que nos indivíduos com tumores DCD-negativo, a taxa de sobrevida foi de 65,54% em 60 meses, e de 62,86% em 130 meses. Já indivíduos com tumor DCD-positivo tiveram sobrevida de 43,33% em 5 anos, e 28,12% em 130 meses, sendo a diferença significante entre os grupos (p=0,0229). A taxa de óbito dos pacientes com tumor DCD-positivo foi mais elevada, 56%, quando comparada à taxa dos indivíduos com tumor DCDnegativo, 33,33% (p=0,0281). Também foi encontrada uma tendência de tumores expressando DCD se relacionarem a pacientes com idade superior a 50 anos (p=0,1057). Em uma consulta de 4 estudos diferentes que reuniram os dados de sequenciamento de DNA de tumores de 515 pacientes, observamos que o gene DCD, em melanomas, não se encontra predominantemente amplificado, mas sim mutado. A substituição E43K foi a alteração mais frequente, correspondendo a 70% dos casos com mutação no gene. Ao relacionarmos os casos disponíveis de mutação em DCD com os genes BRAF, NRAS, MITF, CDKN2A e ERBB4, encontrou-se uma associação com a mutação BRAF V600E nos casos em que ocorria a mutação DCD E43K. Por ter alta frequência em melanomas (variando entre 45 e 54%), e ser um indicador de pior prognóstico para a neoplasia, a expressão de DCD pode ser considerada um potencial biomarcador / Cutaneous melanoma is the skin neoplasia with the highest mortality rate and great unpredictability in its evolution. In disseminated disease, the treatment options are little effective. The research for new tumor markers allows a better understanding of the pathogenesis of melanoma and enables the discovery of molecular targets. The Dermcidin protein (DCD) was identified among the nine genes of a gene signature predicting clinical diagnosis of human melanoma, although many authors differ on its role in the disease and the molecular mechanisms by which DCD acts in tumors remain unclear. The present study aimed to investigate the role of DCD in the tumorigenesis of malignant melanoma and to correlate its expression with clinical, demographic and pathologic data of patients. Using the technique of immunohistochemistry in TMA slides (tissue microarray), the expression pattern of DCD was analyzed in tumoral tissue of two cohorts of patients, the first with 53 cases treated in hospital AC Camargo, predominantly caucasians, and the second with 48 cases, all Asians, commercially obtained from IMGENEX company. The in situ analysis of Dermcidin showed that the protein is expressed in a heterogeneous manner in tumor cells, and can occur in non-melanocytic as well as in melanocytic tumors. In the primary melanoma, DCD expression was more seen in tumors located in the regions of torso and upper limbs. In the metastases, the protein was found predominantly in cells in transit in the lymph nodes (69.23% of cases). Analyzing the 101 patients of the two cohorts together, by the Kaplan-Meier method, it was confirmed that patients with DCD-negative, the survival rate was 65.54% in 60 months, and 62.86% in 130 months, while the group of patients with DCD-positive tumor had 43.33% in 5 years, and 22.12% in 130 months, knowing that a difference between the groups was significative (p=0.0229). The death rate of patients with DCD-positive tumor was higher, 56%, when compared with the death rate of individuals with DCD-negative tumor, 33.33% (p=0.0281). It was also found a trend of tumors expressing DCD related to patients older than 50 years (p=0.1057). In a search of 4 different studies grouping the DNA sequencing tumor of 515 patients we observed that the DCD gene, in melanoma, is not predominantly amplified, but mutated. The E43K substitution was the most frequent alteration, corresponding to 70% of cases of gene mutation. When comparing the available cases of mutations in DCD with the genes BRAF, NRAS, MITF, CDKN2A, ERBB4, we found an association with the BRAF V600E mutation in cases where occurred the DCD E43K. By having high frequency in melanomas (ranging between 45 and 54%) and being an indicator of poor prognosis for the neoplasia, DCD expression can be considered as a potential biomarker

Introdução: A pericardiectomia é o tratamento de escolha para pacientes com pericardite constritiva crônica sintomática, entretanto, o impacto do procedimento na capacidade cardiopulmonar e fisiologia cardiorrespiratória durante a vigília e sono é pouco estudado. Objetivo: Avaliar o impacto da cirurgia de pericardiectomia sobre a capacidade funcional de pacientes com pericardite constritiva crônica sintomática. Métodos: Trata-se de estudo observacional prospectivo com 25 pacientes consecutivos com diagnóstico de pericardite constritiva crônica submetidos à pericardiectomia. Foram realizados os seguintes procedimentos uma semana antes e seis meses após a pericardiectomia: avaliação clínica e antropométrica, avaliação da qualidade de vida e do sono, dosagem dos níveis séricos de BNP, ecocardiograma transtorácico, teste cardiopulmonar de esforço, polissonografia noturna completa. Resultados: A idade média foi 45 anos, com predomínio do sexo masculino (76%). A etiologia foi principalmente idiopática (76%), seguida por tuberculose (12%). O ecocardiograma revelou fração de ejeção do ventrículo esquerdo preservada e dilatação de veia cava inferior (92%) na maioria dos pacientes. Todos os pacientes foram submetidos à pericardiectomia de frênico a frênico via esternotomia mediana, sem circulação extracorpórea. Após a pericardiectomia, houve redução da: classe funcional III/IV (56% vs. 8%, p < 0,001), ascite (72% vs. 12%, p < 0,001) e edema de membros inferiores (88% vs. 24%, p < 0,001) em relação ao pré-operatório. O teste cardiopulmonar revelou melhora do VO2 pico (18,7 ± 5,6 vs. 25,2 ± 6,3 mL/kg/min, p < 0,001), limiar anaeróbico (13,1 ± 3 vs. 17,7 ± 5,5 mL/kg/min, p < 0,001) e velocidade na esteira rolante de 2,5 (2-2,5) para 3 (2,5-3,3) mph, p=0,001. Na análise multivariada, a idade foi o único preditor independente da variação de VO2 (r=-0,658, p=0,003). Os níveis séricos de BNP apresentaram redução significativa de 143 (83,5-209,5) pg/mL para 76 (40-117,5) pg/mL, p=0,011. A polissonografia noturna completa no pré-operatório demonstrou a presença de apneia do sono moderada/ grave (IAH >= 15 eventos/hora) em 13 pacientes, com predomínio de hipopneias. Não houve mudança significativa do índice de apneia-hipopneia após a pericardiectomia: IAH pré 15,6 (8,3-31,7) vs. IAH pós 14,6 (5,75-29,9), p=0,253; entretanto, houve melhora da qualidade do sono (Pittsburgh pré 7,8 ± 4,10 vs. Pittsburgh pós 4,7 ± 3,7, p < 0,001). O IAH apresentou correlação positiva com os níveis de BNP (r=0,418, p=0,037) e EuroSCORE (r=0,480, p=0,015) no pré-operatório. Conclusão: Pacientes com pericardite constritiva crônica sintomática apresentaram, seis meses após a cirurgia de pericardiectomia, melhora da capacidade cardiopulmonar, da classe funcional e da qualidade de vida. A apneia do sono se mostrou frequente e apresentou correlação com níveis séricos de BNP e EuroSCORE no pré-operatório. O índice de apneia-hipopneia não apresentou mudanças significativas após a pericardiectomia. A despeito disso, houve melhora da qualidade do sono / Introduction: Pericardiectomy is the treatment of choice for patients with symptomatic chronic constrictive pericarditis; however, the impact of the procedure on cardiopulmonary capacity and cardiorespiratory physiology during wakefulness and sleep has been poorly studied so far. Objective: To evaluate the impact of pericardiectomy surgery on functional capacity of patients with symptomatic chronic constrictive pericarditis. Methods: This is a prospective observational study with 25 consecutive patients diagnosed with chronic constrictive pericarditis submitted to pericardiectomy. The following procedures were performed one week before and six months after pericardiectomy: clinical and anthropometric evaluation, quality of life and sleep evaluation, serum BNP levels, transthoracic echocardiography, cardiopulmonary exercise test, complete nocturnal polysomnography. Results: The mean age was 45, with a predominance of males (76%). The etiology was mainly idiopathic (76%), followed by tuberculosis (12%). The echocardiogram revealed preserved left ventricular ejection fraction and inferior vena cava dilatation (92%) in most patients. All patients underwent phrenic to phrenic pericardiectomy via median sternotomy, without extracorporeal circulation. After pericardiectomy there was a reduction in: functional class III / IV (56% vs. 8%, p < 0.001), ascites (72% vs. 12%, p < 0.001) and lower limb edema (88% vs. 24%, p < 0.001) as compared to the preoperative period. The cardiopulmonary test revealed improvement in VO2 peak (18.7 ± 5.6 vs. 25.2 ± 6.3 mL/kg/min, p < 0.001), anaerobic threshold (13.1 ± 3 vs. 17.7 ± 5.5 mL/kg/min, p < 0.001) and velocity on the treadmill from 2.5 (2-2.5) to 3 (2.5-3.3) mph, p=0.001. In multivariate analysis, age was the only independent predictor of VO2 variation (r = -0.658, p = 0.003). Serum BNP levels showed a significant reduction from 143 (83.5-209.5) pg/mL to 76 (40-117.5) pg/mL, p=0.011. The complete nocturnal polysomnography in the preoperative period showed moderate / severe sleep apnea (AHI >= 15 events / hour) in 13 patients, predominantly hypopnea. There was no significant change in apnea-hypopnea index after pericardiectomy: AHI pre 15.6 (8.3-31.7) vs. AHI post 14.6 (5.75-29.9), p= 0.253; however, there was improvement in sleep quality (Pittsburgh pre 7.8 ± 4.10 vs. Pittsburgh post 4.7 ± 3.7, p < 0.001). AHI presented a positive correlation with BNP levels (r=0.418, p=0.037) and EuroSCORE (r=0.480; p=0.015) in the preoperative period. Conclusion: Patients with symptomatic chronic constrictive pericarditis showed improvement in cardiopulmonary capacity, functional class and quality of life six months after pericardiectomy. Sleep apnea was frequent and correlated with serum levels of BNP and EuroSCORE in the preoperative period. The apnea-hypopnea index did not show significant changes after pericardiectomy. Nevertheless, there was an improvement in sleep quality

O peptídeo natriurético tipo C (CNP) é descrito como agonista vasodilatador do músculo liso vascular de artérias e veias, podendo ser produzido e liberado do endotélio vascular frente a diversos estímulos. Este promove o relaxamento vascular através da interação com seu receptor associado à enzima guanilil ciclase particulada (GCp) de membrana, levando ao aumento dos níveis de GMPc ou pelo receptor NPR-C associado à inibição de enzima adenilil ciclase e ativação de enzima fosfolipase C e canais para K+, via proteína Gi. Esta vasodilatação é descrita envolver parcialmente a via NO-GCs-GMPc, estando relacionada com a mobilização intracelular de cálcio. O modelo de hipertensão 2R-1C está associada ao consumo de NO, no ambiente celular, via reação com espécies reativas de oxigênio (EROs), especialmente ânion superóxido (O2-), caracterizando um prejuízo na vasodilatação dependente do endotélio. Desta forma, considerando as alterações descritas no modelo de hipertensão renovascular 2R-1C quanto ao estresse oxidativo e a importância do CNP como agonista vasodilatador, a hipótese do presente trabalho foi de que na aorta torácica isolada de ratos hipertensos 2R-1C, o relaxamento vascular induzido pelo CNP estaria prejudicado devido o estresse oxidativo. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi de elucidar os mecanismos celulares envolvidos nas respostas vasculares induzidas pelo CNP. Células endoteliais isoladas de aorta de ratos 2R-1C apresentaram menor [NO]c comparadas as de 2R, sugerindo disfunção endotelial. A exposição das células endoteliais à agente sequestrador de O2- (Tiron) demonstrou a participação deste ânion em 2R-1C, mas não em 2R. CNP promoveu relaxamento de anéis de aorta de ratos 2R e 2R-1C, o qual foi mais pronunciado em preparações desprovidas de camada endotelial em 2R-1C. Hidroxicobalamina (sequestrador de NO0), mas não L-NAME (inibidor de NOS), causou redução da potência do CNP em 2R-1C. ODQ (inibidor de GCs) reduziu a potência em 2R E+, atenuando isoladamente o efeito máximo e o número de Hill em preparações E- de 2R-1C ao nível controle. Em presença do inibidor seletivo de GK (Rp-8-Br-PET-cGMPS) ocorreu atenuação da potência do CNP em todos os grupos experimentais, porém o efeito máximo do CNP somente foi reduzido daquelas preparações E-. A inibição da SERCA reduziu da potência do CNP em todos os grupos experimentais, porém o efeito máximo em 2R-1C foi reduzido ao nível controle. Sobre pré-contração induzida pela EC50 de solução de cloreto de potássio (KCl) ocorreu atenuação de potência e efeito máximo do CNP em todos os grupos experimentais. Contudo, com a utilização de inibidores seletivos de canais para K+, apenas observou-se a participação de BKCa e SKCa em 2R e 2R-1C e de KV em 2R-1C no relaxamento induzido pelo CNP. A inibição de NAD(P)H-oxidase (Apocinina) foi capaz de normalizar o efeito máximo em preparações E- de 2R-1C. A inibição de junções gap mioendoteliais (ácido 18--glicirretínico) promoveu redução da potência do CNP em 2R E+. Por fim, a inibição não-seletiva de COX (Indometacina) apenas reduziu a potência do CNP em preparações E+ de 2R. A partir da análise do conjunto de dados obtidos em estudos realizados em células endoteliais isoladas e funcionais pode-se concluir a participação do sistema de peptídeos natriuréticos sobre a modulação do tônus vascular em preparações isoladas de ratos 2R e 2R-1C. Assim, o relaxamento vascular induzido pelo CNP não se encontra prejudicado em aorta torácica isolada de 2R-1C. O endotélio vascular modula negativamente o relaxamento induzido pelo CNP em aorta de ratos 2R e 2R-1C. Embora haja disfunção endotelial em 2R-1C, esta não é suficiente para alterar a mobilização de cálcio induzida pelo CNP. O relaxamento induzido pelo peptídeo envolve a participação de metabólitos de NOS e de espécie NO0, assim como as enzimas NAD(P)H oxidase, GCs, GK e SERCA parecem estar relacionadas com o efeito vasodilatador induzido pelo CNP mais pronunciado em 2R-1C. Assim também, a sinalização desencadeada pelo CNP leva à ativação de canais para K+ em ambos os grupos, envolvendo a mediação através de junções gap mioendoteliais em 2R, mas não em 2R-1C. / C-type natriuretic peptide (CNP) acts as a vasodilator agonist that relaxes vascular smooth muscle cells from arteries and veins, and it can be produced and released from the vascular endothelium by several stimuli. This peptide induces vascular relaxation through interaction with its receptor which is associated with particulate guanylyl cylase (pGC), leading to the increase in cGMP levels or it can also can interacts with NPR-C receptor associated with the inhibition of adenylyl cyclase and the activation of phospholipase C and K+ channels, via Gi protein. This vasodilation is related to partially involves NO-sGC-cGMP and intracellular calcium mobilization. 2K-1C hypertension is related to NO consumption, in the cellular environment through reaction with reactive oxygen species (ROS), mainly superoxide anion (O2-), characterizing impaired endothelium-dependent relaxation. So, in view of the changes in renovascular hypertension 2K-1C through oxidative stress and the importance of CNP like a vasodilator agonist, the hypothesis of the present work was on thoracic aorta isolated from renal hypertensive rats (2K-1C) the vascular relaxation induced by CNP would be impaired due to oxidative stress. In this context, the study aimed to demonstrate the cellular mechanisms involved on vascular responses induced by CNP. Endothelial cells isolated from 2K-1C rat aortas showed decreased [NO]c compared to 2K, suggesting endothelial dysfunction. In the presence of O2- scavenger (Tiron) there was the participation of this anion on endothelial cells from 2K-1C, but not on 2K ones. CNP caused relaxation of aortic rings from 2K and 2K-1C rats which was enhanced on denuded rings from 2K-1C. Hydroxicobalamine (NO0 scavenger) but not L-NAME (NOS inhibitor) decreased the potency of CNP on intact aortic rings from 2K-1C. ODQ (sGC inhibitor) decreased potency in intact vascular rings from 2K, just reducing maximum effect and Hill number on denuded aortic rings from 2K-1C to a control level. In the presence of selective GK inhibitor (Rp-8-Br-PET-cGMPS) occurred an attenuation of CNP potency in all experimental groups, but the maximum effect of CNP was reduced only in aortic rings without endothelial layer. SERCA inhibition decreased CNP potency of all experimental groups, but maximum effect was reduced on 2K-1C to control levels. Under pre-contraction elicited by EC50 of potassium chloride (KCl) solution there was a decreased CNP potency and maximum effect in all experimental groups. However, the presence of selective inhibitor of K+ channels showed the contribution of BKCa and SKCa on 2K and 2K-1C and KV on 2K-1C in the CNP induced relaxation. NAD(P)H-oxidase inhibition (Apocinin) was able to normalize maximum effect of CNP on denuded vessels from 2K-1C. Myoendothelial gap junctions inhibition (18--glicirrhetinic acid) reduced CNP potency on intact aortic rings from 2K. Finally, the non-selective COX inhibition (Indometacin) induced a lower CNP potency on intact aortic rings from 2K. The analysis of the data obtained from isolated endothelial cells and functional studies allow us to conclude the participation of natriuretic peptide system in the modulation of vascular tone on aortic rings isolated from 2K and 2K-1C rats. Thus, the vascular relaxation induced by CNP is not impaired on aortic rings isolated from 2K-1C. Vascular endothelium negatively modulates the relaxation induced by CNP on 2K and 2K-1C rat aortas. Although 2K-1C exhibits endothelial dysfunction, it is not sufficient to impair calcium mobilization induced by CNP. CNP induced relaxation involves NOS metabolites and NO0 specie, as well as the activity of NAD(P)H oxidase, sGC, GK and SERCA is related to the enhanced vasodilator effect induced by CNP on 2K-1C. Similarly, CNP pathway leads to K+ channels activation in both experimental groups and the signal mediation through myoendothelial gap junctions on 2K aortas, but not on 2K-1C ones.

O diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica associada a danos, disfunção e insuficiência de diversos órgãos, sendo a fragilidade óssea apontada por estudos recentes como também associada ao DM. Os mecanismos que justificam o maior risco de fraturas em diabéticos tipo 2 não são bem compreendidos. A influência do trato gastrointestinal e seus hormônios no remodelamento ósseo tem sido comprovada em animais e em indivíduos sadios, sendo o Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) e a serotonina hormônios com produção intestinal estimulada pela ingestão de nutrientes, existindo algumas evidências de que os mesmos têm efeitos no metabolismo ósseo. O presente estudo comparou a dinâmica dos marcadores ósseos, da serotonina e do GLP-2 em resposta à refeição mista em mulheres pósmenopausadas diabéticas em relação a controles não diabéticas. Foram incluídas 43 mulheres pós-menopausadas com densidade mineral óssea (DMO) reduzida, 23 com diabetes (grupo DM) e 20 controles (grupo CO). Depois do jejum de 12 horas, essas mulheres foram submetidas ao teste de refeição padrão, e as amostras de sangue foram coletadas nos tempos 0, 30, 60, 120 e 180 minutos para a dosagem de telopeptídeo C-terminal do colágeno tipo I sérico (CTX), osteocalcina (OC), GLP-2 e serotonina. O grupo DM apresentou maior índice de massa corporal, bem como maior densidade mineral óssea (DMO) de colo de fêmur e quadril. Nos tempos basais as mulheres diabéticas apresentaram concentrações plasmáticas de LH e FSH, bem como dos marcadores ósseos osteocalcina e CTX menores que no grupo CO. Em resposta a refeição padrão houve, em ambos os grupos, diminuição na concentração do CTX e da osteocalcina, e aumento na de GLP-2, sem alteração significativa da serotonina. A resposta do CTX à refeição foi menor no grupo DM, e a da serotonina maior no grupo CO em um único tempo do teste. Em relação a OC e ao GLP-2, não houve diferença entre os grupos avaliados ao longo do teste de refeição. As mulheres diabéticas tipo 2 tiveram maior DMO de fêmur. Além disso, os resultados sugerem que o remodelamento ósseo das mulheres diabéticas está alterado, com os marcadores ósseos reduzidos. A influência da ingestão de nutrientes na reabsorção óssea também foi alterada pela DM, não se reconhecendo nesse estudo qualquer papel do GLP-2 ou da serotonina na alteração do metabolismo ósseo em mulheres diabéticas tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus is metabolic disease associated with long-term damage, dysfunction, and failure of various organs; recent studies indicate that diabetes itself is associated with bone fragility. The mechanisms underlying the increased fracture risk in type 2 diabetes are not well understood. The influence of the gastrointestinal tract and its hormones in bone remodeling has been demonstrated in animals and in healthy subjects. Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) and serotonin are enteric hormones stimulated by nutrient intake, and there is some evidence that these hormones could have some effects on bone metabolism. We studied the dynamics of bone markers, serotonin and GLP- 2 in response to a mixed meal in diabetic postmenopausal women, in comparison with nondiabetic controls. 43 post-menopausal women with reduced bone mineral density (BMD) were enrolled, 23 with diabetes (DM group) and 20 normal control (CO group). After an overnight fast (12h), subjects were submitted to a standard meal test. Blood samples were drawn for C-terminal crosslinked telopeptide (CTX), osteocalcin (OC), GLP-2 and serotonin at 0, 30, 60, 120 and 180 minutes. The DM group had higher body mass index, and higher BMD of the femoral neck and hip. The basal values of of LH and FSH as well as the bone markers osteocalcin and CTX were lower in the DM group than in the CO group. After the standard meal test, there was a decrease in the concentration of CTX and osteocalcin, and an increase in GLP-2 in both groups. No changes in concentrations of serotonin were observed over the test meal. The response of the CTX meal was lower in the DM group, and the serotonin concentration was greater in the CO group in a single test time. In relation to e OC and GLP-2, there were no differences among the groups throughout the test meal. Type 2 diabetic women had higher bone mineral density (BMD) in the femur. Furthermore, the results suggest that the bone remodeling of diabetic women is altered, with their biochemical bone markers reduced. The influence of nutrient intake on bone resorption was also altered by DM, but in this study we could not recognize the role of GLP- 2 and serotonin in influencing the bone metabolism in type 2 diabetic

The main histological feature of Alzheimer\'s disease is the presence of amyloid plaques in the patient\'s brain. The most abundant element of these plaques is the &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Initially soluble, the peptide exhibits in solution an intricate equilibrium among monomeric, oligomeric (some of which are regarded as the toxic species) and fibrillar states, which prevents its crystallization and subsequent structural determination by X-ray diffraction. High-pressure nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has been used by our group to detect rare, high-energy monomeric A&beta; (1-40) states, coexisting in equilibrium with oligomers and fibrils. This work aims to characterize the thermodynamics and the structure of the rare excited states of the A&beta; peptide through the use of high pressure NMR. A large collection of NMR spectra of the A&beta; (1-40) peptide as a function of pressure was recorded and analyzed. Secondary structure predictions revealed that the A&beta; peptide adopts extended &beta;-strand-like structures, similar to those found in amyloid-fibril structures. From the pressure curves of chemical shifts and cross-peak volumes, at least three monomeric states could be detected, which were thermodynamically characterized by the calculation of the variation of their Gibbs free energy (&Delta;Gij) and molar partial volumes (&Delta;Vij). The study of nuclear Overhauser effects (NOEs) and 3JH&alpha;-HN NMR couplings reinforces the existence of extended structures with &beta;-strand propensity, both at ambient (0.1 MPa) and high (275 MPa) pressures. The interaction between the A&beta; peptide and the D-peptides RD2 and RD2D3, D-enantiomeric fibril inhibitors, was also characterized. Our results indicate that the D-peptides recognize and bind to a more compact conformation of A&beta;. The formation of the A&beta;-D-peptide heterodimers ultimately prevents the formation of toxic oligomers, therefore representing a potential therapy against Alzheimer´s disease. Additionally, in the second chapter, we present results on the coiled-coils (CC) from group-III human septins (SEPT1, SEPT2, SEPT4 and SEPT5) also studied by NMR spectroscopy. Septins are GTP-binding proteins present in most eukaryotic organisms and capable of forming filaments, which are essential in cell division. In this study, we used 1H-1H-NOESY spectra to detect the orientation and helix pairings adopted by the C-terminal coiled-coils in solution. The NOE analysis, aided by back-calculated spectra, showed that the only sequence to show an antiparallel structure was SEPT2CC; all the others are parallel. However, the disappearance of specific peaks in the NMR spectrum of SEPT5CC caused by the attachment of a paramagnetic spin label indicates an antiparallel orientation, contrary to our other NMR result. A simple evaluation of the coiled-coil heptameric positions, based on the occurrence of each amino acid residue occupying each position, revealed that both orientations are equally stable. Despite being far less stable compared to other coiled-coils, both could exist physiologically. Other results from the group also suggest that these peptides could have the ability to form both parallel and antiparallel coiled-coils. We speculate that the antiparallel conformation might be related to cross-linking between filaments. / A principal característica histológica da doença de Alzheimer é a presença de placas amiloides no cérebro de pacientes. O constituinte mais abundante dessas placas é o peptídeo &beta;-amiloide (A&beta;). Inicialmente solúvel, o peptídeo exibe em solução um intrincado equilíbrio entre estados monoméricos, oligoméricos (alguns deles tidos como as espécies tóxicas) e fibrilares, o que impossibilita sua cristalização e posterior determinação estrutural por difração de raios-X. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de alta pressão foi utilizada por nosso grupo para detectar estados monoméricos raros e de alta energia do A&beta;(1-40), coexistindo em equilíbrio com oligômeros e fibras. Esse trabalho visa caracterizar a termodinâmica e a estrutura dos estados excitados raros do peptídeo A&beta; através do uso da RMN de alta pressão. Uma grande coleção de espectros de RMN do peptídeo A&beta;(1-40) em função da pressão foi coletada e analisada. Predições de estrutura secundária revelaram que o peptídeo A&beta; adota estruturas estendidas do tipo fitas-&beta;, similares àquelas encontradas em estruturas de fibras amiloides. A partir das curvas de deslocamento químico e volume de pico pela pressão, ao menos três estados monoméricos puderam ser detectados, os quais foram termodinamicamente caracterizados através do cálculo da variação das suas energias livres de Gibbs (&Delta;Gij) e volumes parciais molares (&Delta;Vij). O estudo de efeitos Overhauser nucleares (NOEs) e de acoplamentos 3JH&alpha;-HN de RMN reforçam a existência de estruturas estendidas com propensão a fitas-&beta;, tanto a pressão ambiente (0,1 MPa) quanto em alta pressão (275 MPa). A interação entre o peptídeo A&beta; e os D-peptídeos RD2 e RD2D3, inibidores D-enatioméricos de fibras, também foi caracterizada. Nossos resultados indicam que os D-peptídeos reconhecem e se ligam a uma conformação mais compacta de A&beta;. A formação dos heterodímeros A&beta;-D-peptídeo previne, por fim, a formação dos oligômeros tóxicos, representando uma potencial terapia contra a doença de Alzheimer. Adicionalmente, no segundo capítulo, apresentamos resultados sobre os coiled-coils (CC) das septinas humanas do grupo III (SEPT1, SEPT2, SEPT4 e SEPT5) também estudados por espectroscopia de RMN. Septinas são proteínas ligantes de GTP presentes na maioria dos organismos eucarióticos e capazes de formar filamentos, os quais são essenciais à divisão celular. Nesse estudo, utilizamos espectros 1H-1H-NOESY a fim de detectar a orientação e o pareamento de hélices adotados pelos coiled-coils em solução. A análise dos NOEs, auxiliada por espectros retrocalculados, mostrou que a única sequência a mostrar uma estrutura antiparalela foi SEPT2CC; todas as outras são paralelas. Entretanto, o desaparecimento de picos específicos no espectro de RMN de SEPT5CC causado pela presença de um marcador paramagnético de spin indica uma orientação antiparalela, contrário ao nosso outro resultado de RMN. Uma avaliação simples das posições heptaméricas dos coiled-coils, baseada na ocorrência de cada resíduo de aminoácido em ocupar cada posição, revelou que ambas as orientações são igualmente estáveis. Apesar de serem bem menos estáveis comparadas a outros coiled-coils, ambas poderiam existir fisiologicamente. Outros resultados do grupo também sugerem que esses peptídeos poderiam formar tanto coiled-coils paralelos quanto antiparalelos. Nós especulamos que a conformação antiparalela pode estar relacionada a ligações cruzadas entre filamentos.

In the last years, the interest by the bioactive peptides Spirulina sp. (Arthrospira) is increasing, because of its Generally Regarded as Safe (GRAS) status, and their potential health benefits. These peptides can be used in different functional foods, for medical purposes, cosmetic and nutraceuticals, due to biological properties such as antihypertensive, antioxidative, anti-hyaluronidase and others. In the present investigation, Spirulina maxima were produced through of three hydrolyses process. After, the peptides fractions were purified through tangential filtration (membrane of 2 μM and 10kDa), and the fragments obtained below 10 kDa were partially characterized and determinate their antioxidant (radical scavenging, iron-chelating), antimicrobial, anti-inflammatory, and anti- collagenase. The peptide fraction obtained from the first hydrolyzed (PHA) presented antioxidant activity by capturing the DPPH radicals with a value of IC50 21.25 μg/ml and ABTS with IC50 9.5 μg/ml and TEAC 465.7 Trolox μM/μg sample, iron-chelating showed inhibition of 97.3% and IC50 6.99 μg/ml. Meanwhile, the peptide fraction obtained from the second hydrolyzed (PHP) presented antimicrobial activity with the half maximal inhibitory concentration (IC50) and the minimum bactericidal concentration (MBC) 0.34 mg/ml and 0.63 mg/ml (Bacillus subtilis), IC50 and MBC 0.62 mg/ml and 0.63 mg/ml (Staphylococcus aureus), IC50 and MBC 0.99 mg/ml and 1.25 mg/ml (Salmonella typhi), IC50 and MBC 0.94 mg/ml 1.25 mg/ml (Escherichia coli). The peptide fraction obtained from the two enzymes (PHS) showed antioxidant activity by capturing the DPPH radicals with a value of IC50 17.93 μg/ml and ABTS with IC50 8.6 μg/ml and TEAC 540.7 Trolox μM/μg sample, anti-inflammatory with inhibition of 39% and IC50 0.92 mg/ml, and anti-collagenase with inhibition 92.5% and IC50 32.49 μg/ml. The results indicated that protein isolate from Spirulina maxima can be a source for obtaining of peptides fractions (PHA, PHP and PHS) with activity antioxidants, iron-chelating, antimicrobial, anti-inflammatories and anti-collagenase. / Nos últimos anos o interesse pelos peptídeos bioativos de Spirulina sp. (Arthrospira) tem aumentado enormemente devido a seu estado Geralmente reconhecido como seguro (GRAS) e seus potenciais benefícios para a saúde. Essa microalga pode ser utilizada em diferentes alimentos funcionais, para fins médicos, cosméticos e nutracêuticos devido às suas propriedades biológicas como anti-hipertensivas, antioxidantes, anti-hialuronidase e outras. No presente trabalho de investigação, as fracções de peptídeos de Spirulina maxima foram produzidas através de três processos diferentes de hidrólises, utilizando duas proteases diferentes. Em seguida os extratos foram submetidos a um processo de purificação pelo método de filtração tangencial (membranas de 2 μM e 10 kDa), e os fragmentos obtidos no permeado de 10 kDa foram parcialmente caracterizados e avaliadas suas capacidades antioxidantes (sequestro de radicais, atividade quelante de ferro, antimicrobiana, anti-inflamatória e anticolagenase. Fração de peptídeos obtido do primeiro hidrolisado (PHA) apresentou atividade antioxidante capturando aos radicais DPPH com um valor de IC50 21,25 μg/ml e ABTS com IC50 9,5 μg/ml e TEAC 465,7 Trolox μM/μg de amostra, e atividade quelante mostrou uma inibição de 97,3% e um IC50 6,99 μg/ml. Fração de peptídeos obtido do segundo hidrolisado (PHP) apresentou atividade antimicrobiana com concentração inibitória media (IC50) e concentração bactericida mínima (CBM) de 0,34 e 0,63 mg/ml (Bacillus subtilis), IC50 e CBM 0,62 e 0,63 mg/ml (Staphylococcus aureus), IC50 e CBM 0,99 e 1,25 mg/ml (Salmonella typhi), IC50 e CBM 0,94 e 1,25 mg/ml (Escherichia coli). Fração de peptídeos obtido das duas enzimas (PHS) apresentou atividade antioxidante capturando aos radicais DPPH com um valor de IC50 17,93 μg/ml e ABTS com IC50 8,6 μg/ml e TEAC 540,7 Trolox μM/μg de amostra, anti-inflamatória com inibição da enzima hialuronidase 39% e IC50 0,92 mg/ml, e anticolagenase com uma inibição 92,5% e IC50 32.49 μg/ml. Os resultados permitem concluir que isolado proteico de Spirulina pode ser uma fonte para obtenção de extratos peptídicos (PHA, PHP e PHS) com atividade antioxidante, quelante, antimicrobiana, anti-inflamatória, anticolagenase.

A hemoglobina (Hb) é uma fonte reconhecida de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 da cadeia &#945; da Hb, isolado do trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus, foi o primeiro a ser descrito com ação antimicrobiana. O seu análogo sintético amidado, Hb33-61a, mostrou-se ativo contra bactérias Gram-positivas e fungos [Fogaça et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. O estudo de análogos do Hb33-61 nas formas amidada e com carboxila livre revelou que a amidação provoca aumento significativo da atividade frente a Candida albicans. Por apresentar propriedades biológicas e estruturais idênticas às do Hb33-61a, o Hb40-61a pareceu ser a sua porção mÌnima ativa [Sforça et al. (2005) Biochemistry 44, 6440- 51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. Para comprovar tal sugestão, no presente trabalho, sintetizamos, purificamos e caracterizamos novos an·logos do Hb33-61a, bem como os avaliamos quanto às suas atividades frente a C. albicans e Micrococcus luteus. Os resultados confirmaram a sugestão apenas para a ação antifúngica. O análogo Hb40-61a também se mostrou ativo frente a C. albicans resistente a fluconazol. A sua atividade antifúngica se mostrou fortemente dependente da força iônica do meio. A sua baixa atividade hemolítica foi confirmada mesmo em meio de baixa força iônica. O peptídeo Hb40-61a não apresentou sinergismo com o fluconazol frente a C. albicans. A cinética de morte celular mostrou que ele mata a levedura de forma rápida. Portanto, esta hemocidina sintética pode apresentar valor comercial se a via de administração for tópica ou se o seu uso envolver meios de baixa força iônica. Além disso, ela é um modelo valioso para o estudo do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos com características estruturais similares e pode servir de base para o desenho de novos agentes antibiôticos. / It is well known that hemoglobin (Hb) is a source of biologically active peptides. The fragment 33-61 of bovine hemoglobin &#945;-chain, isolated from the gut contents of the tick Boophilus microplus, was the first identified with antimicrobial activity . Its amidated analogue, Hb33-61a, showed to be active against Gram-positive bacteria and fungi strains [FogaÁa et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25330-4]. The study of a series of carboxyl-free and amidated synthetic analogues of Hb33-61 revealed that C-terminus amidation enhances the activity against Candida albicans. Since Hb33-61a and Hb40-61a presented identical biological and structural properties, it seemed that Hb40-61a was Hb33-61a minimal active motif [SforÁa et al. (2005) Biochemistry 44, 6440- To test this suggestion, in the present study 51; Machado et al. (2007) Biopolymers 88, 413-26]. we synthesized, purified and characterized Hb40-61a analogues and assayed them against C. albicans and Micrococcus luteus. The results confirmed the suggestion only for the antifungal activity. When tested against fluconazole-resistant C. albicans, Hb40-61a was also active. Its antifungal activity showed to be dependent on the ionic strength of the medium. Its low hemolytic activity was confirmed even under low ionic strength conditions. Hb40-61a had no synergic effect with fluconazole on C. albicans. In vitro time-kill assays demonstrated that Hb40-61a kills the yeast rapidly. Therefore, this synthetic hemocidin may be of commercial interest for topical application or other uses involving low ionic strength medium. Moreover, it can serve as a template for the study of the mechanism of action of structurally related antimicrobial peptides or for the design of novel antibiotic drugs.

O exossomo é um complexo multiproteico conservado evolutivamente de archaea a eucariotos superiores que desempenha funções celulares essenciais tais como: atividade exoribonucleolítica 3\'&#8594;5\', regulação dos níveis de mRNA, maturação de RNAs estruturais e controle de qualidade de RNAs durante os vários estágios do mecanismo de expressão gênica. Em Archaea, o exossomo é composto por até quatro subunidades diferentes, duas com domínios de RNase PH, aRrp41 e aRrp42, e duas com domínios de ligação a RNAs, aCsl4 e aRrp4. Três cópias das proteínas aRrp4 e/ou aCsl4 se associam com o núcleo hexamérico catalítico do anel de RNase PH e completam a formação do complexo. A proteína PaNip7 é um cofator de regulação do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi e atua na inibição do complexo enzimático ligando-se simultaneamente ao exossomo e a RNAs. Neste projeto, a reconstituição in vitro do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi formado pela proteína de topo PaCsl4 foi obtida. Para tanto foram realizadas análises de interação proteica usando as técnicas de cromatografia de afinidade, gel filtração e SDS-PAGE. Em adição à formação da isoforma PaCsl4-exossomo, um fragmento peptídico correspondente à região C-terminal da PaNip7 foi sintetizado pelo método da fase sólida, purificado por RP-HPLC e o purificado foi caracterizado por LC/ESI-MS almejando realizar futuros experimentos de interação com o exossomo. / The exosome is a multiprotein complex evolutionarily conserved from archaea to higher eukaryotes that performs essential cellular functions such as: 3\'&#8594;5\' exoribonucleolytic activity, regulation of mRNA levels, maturation of structural RNAs and quality control of RNAs during the various stages of the gene expression mechanism. In Archaea, the exosome is composed of up to four different subunits, two with RNase PH domains, aRrp41 and aRrp42, and two with RNAs binding domains, aCsl4 and aRrp4. Three copies of the aRrp4 and/or aCsl4 proteins associate with the hexameric catalytic core of the RNase PH ring and complete the formation of the complex. The PaNip7 protein is a regulating cofactor of the Pyrococcus abyssi archaeal exosome and acts in the inhibition of the enzyme complex by binding simultaneously to the exosome and RNAs. In this project, the reconstitution in vitro of the Pyrococcus abyssi archaeal exosome formed by the PaCsl4 top protein was achieved. To this end protein interaction analyses were performed using affinity chromatography, gel filtration and SDS-PAGE techniques. In addition to the formation of the PaCsl4-exosome isoform, a peptide fragment corresponding to the C-terminal region of PaNip7 was synthesized by solid-phase method, purified by RP-HPLC and the purified peptide was characterized by LC/ESI-MS aiming to perform future binding experiments with the exosome.