Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T03:08:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AparecidaSoniade_M.pdf: 22255615 bytes, checksum: b4f416e6c5d3d387d2cf067d397f7f13 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: o presente trabalho teve como objetivo estudar o comportamento de isolados protéicos de soja (IPSs) sujeitos a diferentes tratamentos térmicos quando submetidos à hidrólise, com uso da enzima a-quimotripsina e comparar os peptídeos obtidos desta hidrólise. Para tanto, produziu-se IPS a partir da farinha desengordurada de soja (FDS). Este isolado, denominado de IPS nativo (IPSn) foi então submetido à temperaturas de 70, 80 e 90°C por 10 minutos, com objetivo de obter isolados com diferentes graus de desnaturação. Determinou-se a composição centesimal da FDS e IPSn. Para os isolados protéicos de soja nativo (IPSn) e tratados termicamente (IPSsTT) determinou-se o teor de fitato, atividade dos inibidores de tripsina (IT) e o índice de dispersibilidade de proteína (IDP). O perfil das proteínas foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e por cromatografia líquida de exclusão molecular de alta eficiência (SE-HPLC) e o grau de desnaturação, por calorimetria diferencial de varredura (DSC). A reação de hidrólise foi monitorada pelo método pH-stat e foi interrompida ao atingir 4,5% de grau de hidrólise (GH). Os hidrolisados obtidos foram analisados por eletroforese em SDS-P AGE e por SE-HPLC. O tratamento térmico não influenciou no conteúdo de fitato dos IPSsTT, mas a atividade do inibidor de tripsina e o IDP diminuíram significativamente. A análise DSC mostrou mudanças conformacionais nas proteínas das frações 7S e 11S. O comportamento eletroforético não apresentou diferenças entre o IPS nativo e os tratados termicamente ...Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: The objective of this research was to study the behaviour of heat treated soy protein isolates (SPIs) when submitted to enzymatic hydrolysis with achymotrypsin and to analyse the products of hydrolysis. Native soy protein isolate (SPIn) was produced from defatted soy flour (DSF). The SPIn was then submitted to temperatures of 70, 80 and 90°C for 10 minutes, aiming at obtaining isolates with different degrees of denaturation. The proximate compositions of the DSF and the SPIn were determined. For SPIn and the heat treated soy protein isolates (HTSPIs), the phytate content, trypsin inhibitor activity (TI) and dispersibility index (DPI) were determined. The protein profile was analysed by gel electrophoresis in polyacrylamide gel, in the presence of sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE) and by size exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC), and the degree of denaturation by differential scanning calorimetry (DSC). The heat treatment had no effect on the phytate content of the (HISPIs), but the trypsin inhibitor activity and DPI significantly decreased ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. / Mestrado / Nutrição Aplicada a Tecnologia de Alimentos / Mestre em Ciência da Nutrição

Orientador: Paulo Mazzafera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T05:16:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abreu_HellenMariliaCoutode_M.pdf: 1821270 bytes, checksum: 81de9a77b34941dbb00540666469490a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O café é uma bebida apreciada pelo seu sabor e aroma característicos, sendo a qualidade final da bebida um dos aspectos mais relevantes para atender às demandas atuais do mercado. Neste trabalho objetivou-se estudar algumas características relacionadas ao metabolismo do nitrogênio, como conteúdo de aminoácidos, proteínas e atividade de proteases em cafés em diferentes estágios de maturação provindos de regiões com temperaturas distintas. Adamantina ¿ região de temperatura mais elevada, e Mococa ¿ região de clima mais ameno foram os locais escolhidos para as coletas das amostras devido às diferenças no clima e na qualidade da bebida. A qualidade de cafés cultivados em regiões mais quentes é sabidamente inferior a de regiões mais frias. Entre diversas análises, grande atenção foi dada ao estudo de proteases, que promovem a quebra de proteínas, liberando aminoácidos que estarão envolvidos na realocação de proteínas relacionadas ao aroma e sabor do café, diminuindo, na maioria das vezes, os atributos finais de uma bebida de boa qualidade. Ensaios qualitativos de aminoácidos em HPLC foram feitos, assim como análises quantitativas de aminoácidos, fenóis e dosagem de atividade de proteases, a partir de ensaios espectrofotométricos. A dosagem de proteases indica maior atividade destas enzimas em amostras verdes de Adamantina. Uma hipótese para este fato seria a influência da temperatura no metabolismo da planta que faz com que, aparentemente, proteínas sejam quebradas em peptídeos menores, alterando o perfil protéico intimamente relacionado ao aroma e ao sabor da bebida do café. Eletroforese bidimensional foi realizada para visualização das diferenças no perfil protéico das diferentes amostras. Genes que codificam para proteases foram isolados e análise de expressão gênica foi feita com utilização da técnica de PCR em Tempo-Real, corroborando os resultados obtidos nas análises bioquímicas e confirmando a provável interação entre conteúdo bioquímico, atividade enzimática, fatores climáticos e qualidade da bebida em café / Abstract: Coffee is appreciated due to its characteristic flavor and aroma, being the final quality of the beverage one of the most relevant aspects to answer to the growing market demand. The study of some features related to nitrogen metabolism in green and mature coffee from climatologically different regions, such as Adamantina ¿ a region with high temperature means, and Mococa ¿ not such a hot region, is the aim of this study. The quality of coffee cultivated in hot regions is considered inferior when compared to the ones cultivated in slightly colder regions. Among several analyses, a lot of attention was given to the study of proteases - proteins able to breakdown other proteins, releasing amino acids involved in the reallocation of proteins related to coffee flavor and aroma. Qualitative amino acids assays were done in HPLC as well as colorimetric assays for amino acids, phenolic compounds and protease activity determination. The proteases assay indicated higher activity of these enzymes in green samples from Adamantina, what might be explained by the influence of temperature in the plant metabolism, which apparently causes the break of some proteins in smaller peptides, changing the protein profile closely related to the formation of coffee flavor and aroma. Bi-dimensional electrophoresis was applied in the visualization of differences in the protein profile of the contrasting samples. Genes codifying for proteases were isolated and analysis of gene expression was done using Real Time PCR. The results corroborated the data obtained in the biochemical assays, confirming the probable interaction among biochemical content, enzymatic activity, climate factors and beverage quality in coffee grains / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador : Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T22:08:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_IsabelCristinaJacintode_M.pdf: 13363174 bytes, checksum: edf528b509c8d559d966367c18836641 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A alfa 1 antitripsina (AIAT) é uma glicoproteína que inibe as proteases que desencadeiam as reações inflamatórias do plasma. Seu papel inibitório mais importante é o que realiza contra a elastase leucocitária, uma protease que degrada a elastina das paredes alveolares. É uma enzima polimórfica e várias variantes já foram descritas. Entre as variantes deficientes as mais importantes são os alelos S e Z. Em um estudo realizado na população do Estado de São Paulo, o alelo S alcançou a freqüência de 0,05, enquanto o alelo Z de 0,03. A deficiência de alfa 1 antitripsina (AIAT) tem sido associada com DPOC. A asma é uma doença crônica das vias aéreas caracterizada por uma obstrução do fluxo aéreo e hiperresponsividade brônquica. A asma, quanto a gravidade, é classificada em leve, moderada e grave. Este estudo teve como propósito a determinação da prevalência dos alelos S e Z do gene da AIAT, em escolares e adolescentes com asma atópica leve (Grupo 1), moderada (Grupo 2) e grave (Grupo 3) e verificar a presença de associação entre os alelos e variáveis clínicas nos diferentes grupos propostos. Foram analisados 93 pacientes do Ambulatório de Imunologia, Alergia e Pneumologia do Departamento de Pediatria da FCM- UNICAMP. A detecção dos alelos S e Z do gene da AIAT foi realizada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) associada à digestão enzimática com as enzimas TaqI e XmnI. Dos 93 pacientes asmáticos analisados, 40 apresentavam a forma grave, 23 a moderada e 30 a leve. Ao se comparar com a prevalência desses alelos em nossa região, verifica-se uma prevalência maior dos alelos S e Z. Quando se separa por gravidade, verifica-se que o alelo Z é importante na manifestação da forma grave da doença. Por meio da análise dos resultados obtidos nesse estudo pode-se sugerir que os alelos S e Z são um fator de risco adicional para o desenvolvimento da asma e que esses alelos poderiam modular a gravidade da asma / Abstract: Alpha-1-antitrypsin (AIAT) is a glycoprotein that inhibits the proteases that release inflammatory plasmatic reactions. Its most important inhibitory effect is against leukocytic elastase, a protease that degrades elastin in the alveolar walls. It is a polymorphic enzyme and has various variants that have been described. The most important deficient variants are the S and Z alleles. In Brazil, the S allele attains a frequency of 0.05 , while the Z allele a frequency is of 0.03. Alpha-1-antitrypsin (AIAT) deficiency has been associated with DPOC. Asthma is a chronic disease of the airways that is characterized by air flow obstruction and bronchial hyper-responsiveness. Acording the severity, asthma is classified as light, moderate and severe. This study was undertaken to determine the prevalence of S and Z aneles in the AIAT gene of school students and adolescents with light (Groupl), moderate (Group 2) and severe (Group 3) atopic asthma and to verify the presence of a relationship between the alleles present in these groups and the clinical variables. The study sample consisted of93 asthmatic patients ftom the Immunology, Anergy and Pneumology Ambulatory Sector of the Department of Pediatrics , FCM-UNICAMP. The polymerase cOOinreaction (PCR) and the enzymatic digestion with TaqI and XmnI enzymes were used for detecting the AIAT gene S and Z aneles. These 93 asthmatic patients were c1assified as: severe -40 patients, moderate -23 patients, light - 30 patients. When compared with the prevalence of alleles in our region, a higher prevalence of S and Z anele was observed. When the patients were classified according to severity, the importance of the Z allele was verified in the more severe manifestation ofthe disease. The results obtained in this study suggest that the S and Z aneles are an additional risk factor for the development of asthma and that hese alleles may regulate disease severity / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T22:12:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_ElisangelaJacintode_M.pdf: 13937069 bytes, checksum: 63ded0a77c1b445d973cdfbeb47cb79f (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A fibrose cística é uma alteração genética que cursa principalmente com manifestações pulmonares e pancreáticas. A correlação genótipo-fenótipo da fibrose cística é motivo de árduos estudos. Somente a correlação com a insuficiência pancreática foi encontrada. Percebeu-se, também, que o curso e a severidade da manifestação pulmonar não estão correlacionados com o genótipo CFTR. A alfaI antitripsina inibe as proteases que desencadeiam as reações inflamatórias do plasma. Seu papel inibitório mais importante é o que realiza contra a elastase leucocitária. Como a deficiência da alfaI antitripsina tem uma manifestação pulmonar relevante e é freqüente em nosso meio, acredita-se que ela possa modular a manifestação pulmonar dos pacientes fibrocísticos. Neste estudo, todos os pacientes estavam sendo avaliados clinica e radiologicamente de acordo com sua evolução clinica, aspectos radiológicos, prova de função pulmonar e saturação de oxigênio. Dos 70 pacientes avaliados, 17 tinham os dois alelos para a mutação ? F 508 , 26 pacientes tinham um alelo para ? F 508 e 27 pacientes não apresentavam a mutação ? F 508 . Destes pacientes fibrocísticos, sete apresentam um alelo S (10%), um apresenta um alelo Z (1,43%) e um apresenta os dois alelos SZ (1,43%). Os genótipos comuns MS, SS, MZ da deficiência da AIAT, que conduzem a uma deficiência leve para moderada da proteína, não estão associados com a piora da doença pulmonar em pacientes com fibrose cística / Abstract: Cystic fibrosis is a genetic disorder that during its course presents mainly pulmonary and pancreatic manifestations. Its genotype-phenotype correlation has motivated many arduous studies. The on1ycorrelation so far encountered is with pancreatic insufficiency. It has also been noted that the course of the disease as well as the severity of its pulmonary manifestations did not demonstrate correlation with CFTR genotype. Alpha 1 antitripsin inhibits the proteases that realese inflammatory reactions of the plasma. Its most important inhibitory role is it action against leukocytic elastase. As the deficiency of alpha 1 antitripsin has relevant pulmonary manifestations and is very common in the area, we believe that it may be able to modulate pulmonary manifestations in fibrocystic patients. Ali the patients in the study were clinically and radiologically evaluated in accordance with their clinical evolution, pulmonary function and oxygen saturation tests. Out of the 70 patients evaluated, 17 patients had two alleles for the ? F 508 mutation, 26 patients had one aliele for the ? F 508 mutation and 27 patients did not present the ? F 508 mutation. Among the fibrocystic patients, seven patients presented one S allele (10%), one patient presented one Z allele (1.43%) and one patient presented the two Z alleles (1.43%). The common MS, SS, MZ genotypes of A1AT deficiency that cause discreet to moderate protein deficiency are not associated with lung disease deterioration in patients with cystic fibrosis / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Mirna Lucia Gigante / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Henrique_VivianeSoccioMonteiro_D.pdf: 1578287 bytes, checksum: 701e35fa0f63acfe70512383a04328f3 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram avaliar o comportamento da fase aquosa do queijo Prato durante sua maturação e o efeito do pH sobre a proteólise, a firmeza e a capacidade de derretimento do queijo. Para avaliar o efeito do tempo de maturação sobre a fase aquosa do queijo, após a fabricação, amostras foram aleatoriamente escolhidas diariamente, até o quinto dia de maturação, e avaliadas quanto à quantidade de fase aquosa liberada por centrifugação. A fase aquosa foi avaliada quanto aos teores de sólidos totais, nitrogênio total, frações nitrogenadas e perfil eletroforético. Os resultados indicaram que a fase aquosa liberada por centrifugação diminuiu significativamente durante os primeiros 5 dias de maturação evidenciando um rápido aumento da capacidade de retenção de água da matriz protéica. Através do perfil eletroforético evidenciou-se o aumento de frações caseicas (as1-I-caseína e g-caseína) e de proteínas intactas (b-caseína e as1-caseína) na fase aquosa do queijo com 5 dias de maturação. Estes resultados sugerem que, além da proteólise, o comportamento da fase aquosa do queijo no período inicial da maturação pode ser também responsável pela melhoria da funcionalidade do queijo, uma vez que afeta a hidratação da matriz protéica. Para estudar o efeito do pH sobre a proteólise, a firmeza e a capacidade de derretimento do queijo Prato durante a maturação utilizou-se um método de alteração do pH pós-fabricação. Os queijos utilizados para a troca de pH e posterior avaliação da proteólise foram ralados e os utilizados para a avaliação da firmeza e da capacidade de derretimento foram fatiados (6,5 x 5,0 x 3,0 cm). Em ambos os casos, as amostras foram divididas em 3 porções que foram submetidas aos tratamentos de alteração do pH utilizando-se um dessecador com prateleiras. A primeira porção foi exposta a atmosfera de amônio para aumentar o pH; a segunda porção foi exposta ao vapor de ácido acético para abaixar o pH; a terceira porção serviu de controle. Após a alteração do pH as amostras foram imediatamente embaladas a vácuo e armazenadas a 12 °C. Para avaliar a proteólise amostras foram aleatoriamente escolhidas após 1, 8, 15, 22, 29, 44 e 58 dias de maturação e avaliadas quanto ao pH, sólidos totais, nitrogênio total, nitrogênio solúvel em pH 4,6, nitrogênio solúvel em TCA 12% e perfil eletroforético. A avaliação do efeito do pH sobre a firmeza e a capacidade de derretimento foi realizada após 8 dias de maturação. A melhor condição do teste de derretimento para o queijo Prato foi previamente definida como sendo 130 °C/ 10 minutos. Os resultados indicaram que os índices de extensão e profundidade de maturação aumentaram significativamente ao longo do tempo, porém, aumentaram menos para o pH mais baixo, quando, comparado aos demais tratamentos. O perfil eletroforético evidenciou que nos queijos de menor pH a degradação da *S1 e da *-caseínas ocorreu mais lentamente e menos extensivamente do que nos queijos controle e de mais alto pH. Além disso, observou-se que existe uma correlação linear positiva entre pH e a firmeza dos queijos. Não se observou associação significativa entre o pH e a capacidade de derretimento dos queijos / Abstract: The objectives of this study were to evaluate the evolution of the aqueous phase of Prato cheese in the initial stages of ripening and the independent effect of pH on proteolysis, firmness and melting ability of the cheese. To evaluate the effect of ripening time on the aqueous phase of the cheese after manufacture, samples were randomly taken every day up to the fifth day of ripening and subsequently evaluated for the amount of aqueous phase separated by centrifugation. The aqueous phase was evaluated for the level of total solids, total nitrogen, nitrogen fractions and electrophoretic profile. The results indicated that the aqueous phase separated by centrifugation significantly decreased over the first five days of ripening, thereby evidencing a rapid increase of the water binding capacity of the protein matrix. The electrophoretic profile evidenced an increase of the levels of casein fractions (as1-I-casein and g-casein) and intact proteins (b-casein and as1-casein) in the aqueous phase of cheese after 5 days ripening. These results suggest that, in addition to proteolysis, the evolution of the aqueous phase of cheese in the initial stages of ripening may also contribute to improving the functionality of cheese, as a result of the effect the aqueous phase has on the degree of hydration of the protein matrix. A post-manufacture pH change methods was used to study the independent effect of pH on proteolysis, firmness and melting ability of Prato cheese during ripening. The cheeses submitted to post-manufacture pH change and subsequent evaluation of proteolysis were grated, whereas those used for evaluation of firmness and melting ability were sliced (6,5 x 5,0 x 3,0cm). In both cases, the cheese samples were divided into 3 equal portions and submitted to pH change treatments in a desiccator with shelves. The first portion was exposed to ammonium hydroxide to raise the pH; the second portion was exposed to acetic acid to lower the pH; the third portion was used as control (no treatment). Immediately after the pH change procedure was completed, the samples were vacuum packed and stored at 12°C. To evaluate the effect on proteolysis, randomly selected samples were submitted to analysis after 1, 8, 15, 22, 29, 44 and 58 days ripening and evaluated for pH, total solids, total nitrogen, nitrogen soluble at pH 4,6, nitrogen soluble in 12% trichloroacetic acid (TCA) and electrophoretic profile. Evaluation of the effect of pH on firmness and melting capacity was performed after 8 days ripening. 130°C/10 minutes had previously been determined as the optimal temperature/time test condition for the melting test of Prato cheese. The results indicated that both the ripening extension index and the ripening depth index significantly increased with time, but the increase was less intense in the case of the low pH cheeses. The electrophoretic profile showed that degradation of *S1 and *-caseins occurred at a slower rate and less extensively in the low pH cheeses as compared to the cheese samples of the control and high pH groups. Furthermore, statistical analysis showed that there is a positive linear correlation between pH and the degree of firmness of the cheeses investigated. No significant association was found between pH and the melting ability of the cheeses / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

A hidrólise enzimática de penas residuais da indústria avícola constitui uma alternativa ao descarte irregular e uma fonte rica em aminoácidos para a produção de rações animais. A presença de queratinases em linhagens bacterianas probióticas, pode, concomitantemente, permitir um melhor aproveitamento de rações contendo queratina, devido a possibilidade de suplementação da dieta de animais monogástricos com tais microrganismos. Igualmente, proteases queratinolíticas possuem ampla utilização na indústria. Neste contexto, uma protease queratinolítica da linhagem probiótica FTC01PR01 de Bacillus subtilis foi purificada através de cromatografia líquida (Sephadex G-75 e DEAE Sepharose) e caracterizada por ensaio de proteólise em azocaseína com diversos interferentes, revelando uma serinoprotease com, aproximadamente, 31 kDa e atividade ótima a 60 °C em pH neutro e alcalino. Embora a enzima não seja termoestável, constatou-se que sua atividade é alterada na presença de íons manganês, apresentando estimulação em temperatura de 37 °C e aumento da termotolerância à 55°C. O crescimento do microrganismo em substratos queratinosos demonstrou eficiência para degradação de farinha de pena e penas brancas seguido por menor degradação de penas melânicas. Sendo constituído exclusivamente de α-queratina, o cabelo humano não sofreu proteólise. A enzima pode ser aplicada na indústria para a degradação de materiais recalcitrantes bem como a produção de ração animal. A efetividade do microrganismo in vivo para aumentar a digestibilidade da farinha de pena aliada a função probiótica, demanda mais estudos. / Enzymatic hydrolysis of waste feathers constitute an alternative to irregular disposal and a rich source of aminoacids for animal feed production. The presence of keratinases in probiotic bacterial strains may, concomitantly, allow better use of keratin-based feeds, due to the possibility of diet supplementation with beneficial microorganisms. In this context, a keratinolytic protease of Bacillus subtilis FTC01PR01 was purified by liquid chromatography (Sephadex G-75 and DEAE Sepharose) and characterized by azocasein proteolysis assay, revealing a serine protease with, approximately 31 kDa, and optimal activity at 60 ° C on neutral and alkaline pH. Although the enzyme was not thermostable, it’s activity was altered in presence of manganese ions, with stimulation at temperature of 37 °C and increased thermal tolerance at 55 °C. Microorganism growth on keratin substrates demonstrated efficiency for feather meal and white feathers degradation, followed by less degradation of melanized feathers. As a source of pure α-keratin, human hair was not degraded. The enzyme may be applied in industry for recalcitrant materials degradation and animal feed production. The effectiveness of the microorganism to increase the feather meal digestibility; ally to the probiotic function, demand further studies.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-01. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:15Z : No. of bitstreams: 1 Publico-13096a.pdf: 2003675 bytes, checksum: 7b943b5a99d94b77ff03b7af8a8f03d5 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:16Z : No. of bitstreams: 2 Publico-13096a.pdf: 2003675 bytes, checksum: 7b943b5a99d94b77ff03b7af8a8f03d5 (MD5) Publico-13096b.pdf: 2021148 bytes, checksum: db1f43adb607e0bfce131b4f141309cc (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:16Z : No. of bitstreams: 3 Publico-13096a.pdf: 2003675 bytes, checksum: 7b943b5a99d94b77ff03b7af8a8f03d5 (MD5) Publico-13096b.pdf: 2021148 bytes, checksum: db1f43adb607e0bfce131b4f141309cc (MD5) Publico-13096c.pdf: 465188 bytes, checksum: e302770e64587fa7f70b463355dc3c59 (MD5) / As enzimas proteolíticas estão amplamente distribuídas em todos os organismos e desempenham diversas funções essenciais a estes. Atualmente são reconhecidos sete grupos de proteases (serino, cisteíno, aspártico, metalo, treonino, glutâmico e a recém identificada asparagino peptídeo liases) que são classificadas de acordo com o seu mecanismo catalítico. As glutâmico peptidases são proteases carboxílicas (ou ácidas) insensíveis à pepstatina e foram reconhecidas como um grupo novo somente em 2004 (Família G1 Merops). Estas peptidases apresentam díade catalítica formada por ácido glutâmico (Glu) e glutamina (Gln) e estrutura única entre as proteases. O protótipo das glutâmico peptidases é a scytalidoglutamico peptidase (SGP), isolada do fungo decompositor de madeira Scytalidium lignicolum na década de 1970. A caracterização da estrutura das glutâmico peptidases scytalidoglutamico peptidase (SGP) e aspergiloglutamico peptidase (AGP), isolada de Aspergillus Níger, mostra que estas enzimas são praticamente idênticas, porém baseados nestes dados estruturais, dois mecanismos catalíticos diferentes foram propostos para SGP e AGP, sendo inconsistentes entre si. Com o propósito de entender o mecanismo catalítico das glutâmico peptidases, nesta tese são demonstrados (1) a caracterização bioquímica do mecanismo catalítico da SGP através da análise da dependência do pH e efeito isotópico cinético do solvente frente a peptídeos FRET e (2) a especificidade da protease para as posições P1 e P1’, descrevendo o papel das interações do subsítio S1 na catálise. Os resultados destes estudos são apresentados no artigo em anexo (Kondo, MY et al, JBC 2010). / Proteolytic enzymes are widespread in all organisms and are involved in a wide range of biological roles. There are seven distinct classes of proteases (serine, cysteine, aspartate, metalloproteases, threonine, glutamate and the newly identified asparagine peptide lyases), grouped according to their catalytic mechanism. The glutamic peptidases are carboxylic (acidic) proteases insensitive to pepstatin inhibitor and were annotated as a new group in 2004 (Family G1 Merops). These proteases have a unique catalytic dyad of residues Glu and Gln and a previously undescribed structure fold. Scytalidoglutamic peptidase (SGP), isolated from the wood-degrading fungus Scytalidium lignicolum on the 1970’s, is the forming member of glutamic peptidases. The three dimensional structures of scytalidoglutamic peptidase (SGP) and aspergilloglutamic peptidase (AGP) from Aspergillus niger revealed that the overall structure of these enzymes are almost identical, however two different catalytic mechanisms were proposed. Aiming at understanding the reaction mechanism of glutamic peptidases, in this thesis the following topics are highlighted, (1) biochemical characterization of the catalytic mechanism of SGP by use of pH rates profiles and solvent kinetic isotopic effects (SKIE) on the enzyme hydrolysis of FRET peptides and (2) specificity of the protease for P1 and P1’ positions describing the interactions of S1 subsite during catalysis. The paper showing results of these studies is attached to this thesis (Kondo, MY et al, JBC 2010). / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:48:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Mestrado_Leonardo_Lopes.pdf: 12121599 bytes, checksum: 8ada8a23679ae5a1676d7acd1fe0acc0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. / Saneantes são produtos controlados pela Vigilância Sanitária devido a sua importância para a saúde coletiva. Os detergentes são uma classe de saneantes usados para a limpeza, e alguns são formulados com adição de enzimas com a função de auxiliar na limpeza de materiais. O uso de destes produtos é uma realidade que vem apresentando contínuo crescimento. Instrumentais que entram em contato com sangue e outros fluidos corporais necessitam de uma limpeza eficiente antes de sofrer os processos de esterilização. As formulações presentes no mercado de produtos de uso em estabelecimento de assistência à saúde possuem alguns tipos de enzimas, entre elas as proteases. Atualmente, não existe nenhum protocolo oficial para a avaliação da atividade proteolítica nos detergentes enzimáticos. O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade proteolítica em detergentes enzimáticos, através da adaptação e validação de um método espectrofotométrico e verificação do desempenho destes produtos, comparando os resultados alcançados nos dois métodos. O método para determinação de atividade proteolítica demonstrou ser robusto, exato e preciso, apresentando resultados reprodutíveis e confiáveis, podendo ser empregado em laboratórios de controle da qualidade. Foram determinadas as atividades proteolíticas nas condições recomendadas pelos fabricantes em dez produtos diferentes. A verificação do desempenho destas amostras foi realizada pelo teste de triagem em detergentes descrito na Norma ASTM D 7225-06, utilizando o simulador de sujidade Tosi®. A maioria das amostras (70%) apresentou baixa atividade proteolítica, o que pode ter ocorrido em função do pH ou componentes da formulação. Na avaliação do desempenho verificou-se que amostras com baixas atividades proteolíticas não apresentaram eficiência na limpeza de sujidades nas condições recomendadas pelos fabricantes e pela ASTM. / Sanitizing are products controlled by the Vigilance Surveillance due to its importance to health. Detergents are a class of sanitizing used for cleaning, and some are formulated with addition of enzymes that assist in cleaning materials. The use of these products is a reality that is in continuous growth. Instrumental that come into contact with blood and other body fluids need to be cleaned effectively before undergoing sterilization processes. Market available formulations, for use in hospitals have some types of enzymes, including proteases. Currently there is no official protocol for proteolytic activity evaluation in enzymatic detergents. The aim of this work was evaluate proteolytic activity in enzymatic detergents, through adaptation and validation of a spectrophotometry method in ultraviolet. Detergent performance was also checked, comparing the results for both methods. Proteolytic activity method proved to be robust, accurate and precise, with reproducible and reliable results and it can be used in quality control laboratories. Proteolytic activities were determined in ten different products, under manufacturer’s conditions. The performance verification of these products was conducted by detergent screening test described in ASTM D 7225-06, using Tosi® dirt simulator. Most samples (70%) showed low proteolytic activity, may be due their pH or formulation components. Performance evaluation showed that samples with low activity didn't have cleaning efficiency, under manufacturer´s and ASTM conditions. In more active samples, ASTM conditions produced a better cleaning result. The results of this study could collaborate in the establishment of a specific normative for these products in the Brazilian market.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_almeida_ioc_dout_2014.pdf: 10914971 bytes, checksum: 979497712c5a77cc8a8934caa85ef74e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania, protozoários veiculados por insetos flebotomíneos e responsáveis pelas leishmanioses visceral e tegumentar, se encontram amplamente distribuídos pelo mundo. O potencial adaptativo destes protozoários é um reflexo da diversidade biológica do gênero Leishmania, em especial a espécie Leishmania (Viannia) braziliensis, que se encontra em diversos biomas acometendo diferentes animais e vetores de acordo com a região que se encontra. Os estudos biológicos e de expressão gênica de fatores de virulência do parasito são importantes para auxiliar na elucidação destes mecanismos de adaptação. Portanto este trabalho tem o objetivo de avaliar variações biológicas e na expressão de genes de proteinases de L. (V.) braziliensis, cepa MCAN/BR/1998/R619 e seus clones. Inicialmente foi realizada uma análise do genoma de L. (V.) braziliensis frente aos de L. (L.) infantum, L. (L.) major e L. (L.) mexicana, com o propósito de identificar características espécie-específicas que possam contribuir para compreender as diferenças fenotípicas ou de virulência entre as espécies estudadas. Foi observado que todos os cromossomos das quatro espécies apresentam genes de proteases em diferentes quantidades; alto grau de conservação entre os alelos de proteases; e as sequências dos genes de proteases dos parasitos não apresentam similaridade entre as de genes de proteases de mamíferos. Portanto, a análise dos genomas das Leishmania spp. indica uma grande diversidade de genes da protease nestas espécies Posteriormente foram obtidos clones da cepa em estudo oriundos de um único promastigota e avaliados seu comportamento in vitro e o potencial biológico destes parasitos na infecção experimental in vitro. A cepa em estudo reúne vários clones de parasitos e estas produzem padrões distintos de infecção in vitro de macrófagos de camundongos BALB/c; com produção de citocinas no sobrenadante de forma heterogênea. Algumas são menos indutoras de IL-1\03B2 e IL-6, e as citocinas TNF-\03B1 e IL-12p70, bem como o óxido nítrico, são induzidas de forma equilibrada pelos clones estudados. Uma análise de agrupamento permitiu a classificação de dois grupos distintos dos clones obtidos neste estudo. O conjunto de dados que mais influenciou para a definição destes grupos foi os relativos à infecção em macrófagos peritoneais murinos. Isto ressalta a possibilidade de haver outros marcadores, não contemplados neste estudo, que influenciam no sucesso da adaptação da cepa em estudo ao hospedeiro vertebrado. Também foi observado que os clones da cepa expressam diferentemente os genes das quatro classes de proteinases. Os amastigotas expressam mais proteinases que os promastigotas. Entre os promastigotas há maior expressão de aspártico e metaloproteinase enquanto que os amastigotas expressam mais metalo e serino proteinases. A diversidade da espécie vista entre isolados pôde ser comprovada também dentro de uma única cepa. O conjunto de resultados agrupados aqui enfatiza a capacidade da L. (V.) braziliensis utilizar a plasticidade de seu genoma para modular seu fenótipo e aumentar suas chances de sobrevivência nos hospedeiros / Parasites of the genus Leishmania are protozoans transmitted during the bite of female phlebotomines and are the causative agents of visceral or tegumentary leishmaniasis, presenting a worldwide distribution. The adaptative potential of these protozoa is a reflection of their biological diversity, especially that of the species Leishmania (Viannia) braziliensis, which is found in many biomes and affect different animals and vectors. Studies about the biology of parasites and their expression of virulence factor genes are important to help on the elucidation of their mechanisms of adaptation. Therefore, the purpose of this work is to evaluate the the biology and expression of protease genes of L. (V.) braziliensis, strain MCAN/BR/1998/R619, checking for variations among clones of this strain. Initially, we performed a comparative analysis of L. (V.) braziliensis genome against L. (L.) infantum, L. (L.) major and L. (L.) mexicana genomes to identify species-specific features that could potentially relate to characteristic phenotypic and virulence traits of the species. We could observe that protease genes are present in all chromosomes of the studied species, but in different frequencies. Additionally, a high degree of alleles conservation was noted, as well as a prominent distinction among the protease gene sequences of parasites and those of mammals, with no similarity detected. Thus, the analysis of genome of Leishmania spp. pointed to a great diversity of protease genes in these species. In an additional analysis, we obtained clones from single promastigotes isolated from L. (V.) braziliensis strain MCAN/BR/1998/R619 and evaluated their behaviors in vitro as well as their potential to cause infection in BALB/c macrophage cultures. Our results suggested that this strain is, in fact, composed by many clones with different characteristics, as they are able to promote distinct patterns of infection in macrophages in vitro, with a heterogenic production of cytokines by these cells. While some clones induced lower IL-1β or IL-6 production, TNF-α, IL-12p70 and nitric oxide production were homogeneously induced by the clones. A cluster analysis led to the classification of two distinct groups of clones in this study. Data analysis indicated that the capacity to promote infection in murine macrophages was the feature that most contributed to the clusters definition. However, the possibility remain that other features, no analyzed in the present study, could also play important roles regarding the success the studied strain’s adaptation to the vertebrate host. It was also observed that the clones differentially expressed genes related to the four main protease classes of Leishmania: cysteine, serine, metallo and aspartic-proteinases. Generally, the amastigotes expressed higher levels of proteinases-related mRNAs than promastigotes. Also, it was observed that promastigotes express more aspartic and metalloproteinases mRNAs, while amastigotes express more metallo and serine proteinases mRNAs. Therefore, a reflection of the features diversity already reported among isolates of L. (V.) braziliensis can also be noted among clones of a single strain. The results gathered herein emphasize the ability of L. (V.) braziliensis to apply its genome plasticity to modulate its phenotype and, thus, increase its odds to survive in the vertebrate host.

A hidrólise enzimática de penas residuais da indústria avícola constitui uma alternativa ao descarte irregular e uma fonte rica em aminoácidos para a produção de rações animais. A presença de queratinases em linhagens bacterianas probióticas, pode, concomitantemente, permitir um melhor aproveitamento de rações contendo queratina, devido a possibilidade de suplementação da dieta de animais monogástricos com tais microrganismos. Igualmente, proteases queratinolíticas possuem ampla utilização na indústria. Neste contexto, uma protease queratinolítica da linhagem probiótica FTC01PR01 de Bacillus subtilis foi purificada através de cromatografia líquida (Sephadex G-75 e DEAE Sepharose) e caracterizada por ensaio de proteólise em azocaseína com diversos interferentes, revelando uma serinoprotease com, aproximadamente, 31 kDa e atividade ótima a 60 °C em pH neutro e alcalino. Embora a enzima não seja termoestável, constatou-se que sua atividade é alterada na presença de íons manganês, apresentando estimulação em temperatura de 37 °C e aumento da termotolerância à 55°C. O crescimento do microrganismo em substratos queratinosos demonstrou eficiência para degradação de farinha de pena e penas brancas seguido por menor degradação de penas melânicas. Sendo constituído exclusivamente de α-queratina, o cabelo humano não sofreu proteólise. A enzima pode ser aplicada na indústria para a degradação de materiais recalcitrantes bem como a produção de ração animal. A efetividade do microrganismo in vivo para aumentar a digestibilidade da farinha de pena aliada a função probiótica, demanda mais estudos. / Enzymatic hydrolysis of waste feathers constitute an alternative to irregular disposal and a rich source of aminoacids for animal feed production. The presence of keratinases in probiotic bacterial strains may, concomitantly, allow better use of keratin-based feeds, due to the possibility of diet supplementation with beneficial microorganisms. In this context, a keratinolytic protease of Bacillus subtilis FTC01PR01 was purified by liquid chromatography (Sephadex G-75 and DEAE Sepharose) and characterized by azocasein proteolysis assay, revealing a serine protease with, approximately 31 kDa, and optimal activity at 60 ° C on neutral and alkaline pH. Although the enzyme was not thermostable, it’s activity was altered in presence of manganese ions, with stimulation at temperature of 37 °C and increased thermal tolerance at 55 °C. Microorganism growth on keratin substrates demonstrated efficiency for feather meal and white feathers degradation, followed by less degradation of melanized feathers. As a source of pure α-keratin, human hair was not degraded. The enzyme may be applied in industry for recalcitrant materials degradation and animal feed production. The effectiveness of the microorganism to increase the feather meal digestibility; ally to the probiotic function, demand further studies.