FONTENELE, A. V. de. Defesa antioxidativa em plantas de arroz duplamente silenciadas nas APXs citosólicas e expostas a estresses abióticos. 93 f. 2011. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T17:21:05Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Rejected by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br), reason: descrição on 2013-05-20T19:16:48Z (GMT) / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:16Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to characterize physiological and biochemical aspects that show if rice plants (Oryza sativa) knockdown on cytosolic ascorbate peroxidase enzyme (cAPX) are more susceptible to oxidative stress than the wild type plants. APX is an important enzyme from oxidative metabolism of plants, acting on regulation of the endogenous levels of hydrogen peroxide (H2O2). For this, rice plants knockdown on cAPX (Apx1/2s) and wild type (WT) were used for the experimentation. The plants were silenced by interference RNA technical (iRNA) and were grown for 35 days into 1.5 L pots containing nutritive solution under greenhouse conditions. The experiment I was performed with leaves segments immersed in methyl viologen (MV) 50 μM for 24h and the experiment II was performed by application of the following treatments: salt stress, high light and MV. The results from experiment I shown Apx1/2s plants have a higher level of H2O2 high than the levels found on WT rice plants, suggesting that Apx1/2s plants present a level of H2O2 near a level of cell signaling. The fact of WT plants had accumulated H2O2 1h after the treatment suggest the necessity of a signaling H2O2 level for stimulate defense systems. Apx1/2s plants unlike of WT plants presented a constant decline on H2O2 content, indicating a likely H2O2 scavenging excess. After 3h of treatment the chloroplastic enzymes SOD, APX and PHGPx presented upper active in Apx1/2s plants, in control and stress, compared with WT plants. These results suggest the existence of an antioxidant system quite active in the Apx1/2s plants. In experiment II the Apx1/2s plants presented no differences in the photochemical parameters when compared with WT plants, even possessing a smaller photosynthesis under controlled conditions. The energy dissipation (NPQ) in the Apx1/2s plants under high light was, in average, higher than WT plants, suggesting better energy dissipation. Even with efficient energy dissipation, the plants could not avoid the excess of energy in the photosystem and they suffered photoinhibition and damage in photosynthetic apparatus (Fv/Fm). In relation the WT plants, Apx1/2s plants presented a higher activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and PHGPx under controlled conditions, probably intending compensate the lack of cAPX. In the MV treatment the chloroplastic PHGPx was stimulated above 100% in the Apx1/2s plants, indicating that these plants can repair oxidative damage faster than the WT plants. The results suggest that Apx1/2s plants, despite the absence of cAPX, activated additional security systems to compensate the lack of cAPX and respond quickly and efficiently to stress situations. / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar aspectos fisiológicos e bioquímicos que mostrem se plantas de arroz (Oryza sativa) deficientes da enzima citosólica peroxidase do ascorbato (cAPX) são mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que as plantas com cAPX. A APX é uma importante enzima do metabolismo oxidativo de plantas, atuando na regulação dos níveis endógenos do peróxido de hidrogênio (H2O2). Para isso, plantas deficientes em cAPX (Apx1/2s) e plantas não transformadas (WT) foram utilizadas para a experimentação. As plantas foram silenciadas pela técnica do RNA de interferência (iRNA) e cultivadas por 35 dias em vasos de 1.5 L contendo solução nutritiva sob condições de casa de vegetação. O experimento I foi realizado com segmentos de folhas imersos em metil-viologênio (MV) 50 M durante 24h, e o experimento II foi realizado pela aplicação dos seguintes estresses abióticos: salinidade, alta luminosidade e MV. Os resultados do experimento I mostraram que as plantas Apx1/2s possuem um nível basal de H2O2 maior do que os níveis encontrados nas plantas WT, sugerindo que as plantas Apx1/2s apresentam um nível de H2O2 próximo de um nível de sinalização celular. O fato das plantas WT terem acumulado H2O2 após 1h de tratamento sugere a necessidade de um nível sinalizador de H2O2 para ativação dos sistemas de defesa. As plantas Apx1/2s ao contrario das WT apresentaram uma queda constante no conteúdo de H2O2, indicando uma provável remoção do excesso de H2O2. Após 3h de tratamento as enzimas SOD, APX e PHGPx de cloroplasto apresentaram atividade superior nas plantas Apx1/2s, tanto no controle quanto no estresse, comparadas com as plantas WT. Esses resultados sugerem existência de um sistema antioxidante bastante ativado nas plantas Apx1/2s. No experimento II as plantas Apx1/2s não apresentaram diferenças nos parâmetros fotoquímicos quando comparadas com as plantas WT, mesmo possuindo uma menor fotossíntese em condições controle. A dissipação do excesso de energia (NPQ) nas plantas Apx1/2s tratadas com luz foi, em média, maior que das plantas WT, indicando uma possível maior eficiência na dissipação de energia. Mesmo com eficiente dissipação de energia ambas as plantas não conseguiram evitar energia excessiva no fotossistema e acabaram sofrendo fotoinibição e danos no aparato fotossintético (Fv/Fm). Em relação às plantas WT, as Apx1/2s apresentaram maior atividade das enzimas antioxidativas SOD, CAT e PHGPx nas condições controle, na provável tentativa de compensar a ausência da cAPX. No tratamento com MV a isoforma cloroplástica da PHGPx foi estimulada em mais de 100% nas plantas Apx1/2s, indicando que essas plantas podem reparar danos oxidativos com mais rapidez que as WT. Os dados sugerem que as plantas Apx1/2s, apesar da ausência da cAPX, ativam sistemas adicionais de proteção antioxidativa para compensar essa ausência e responder mais rápida e eficientemente a situações de estresse.

LIMA, A.B.de. Respostas Oxidativas em Plantas de Arroz Duplamente Silenciadas em APX Citosólica Submetidas a Estresses Abióticos. 117 f. 2011. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T18:54:07Z No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) Previous issue date: 2011 / O H2O2 é tido como molécula sinalizadora de vários eventos celulares e seu nível endógeno é controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estão distribuídas na célula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosólicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas são as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinação de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulação positiva da atividade de APX associada com menor acúmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosólica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condições controle. Em condições estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatório mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosólica e cloroplástica juntamente com antioxidantes não enzimáticos. Além disso, as APx1/2s submetidas a inibição irreversível de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintético e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosólica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatórios foram ativados para mitigar os possíveis efeitos negativos do acúmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosólicas de APX não são as enzimas mais importantes no controle dos níveis de H2O2, visto que plantas com ausência destas isoformas completam o ciclo de vida e são capazes de enfrentar situações de estresse. Além disso, é possível afirmar que a ação coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsáveis pela manutenção do equilíbrio redox celular em condições estressantes em plantas de arroz, diferente do que é noticiado para a planta-modelo Arabdopsis.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O H2O2 à tido como molÃcula sinalizadora de vÃrios eventos celulares e seu nÃvel endÃgeno à controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estÃo distribuÃdas na cÃlula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosÃlicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas sÃo as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinaÃÃo de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulaÃÃo positiva da atividade de APX associada com menor acÃmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosÃlica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condiÃÃes controle. Em condiÃÃes estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatÃrio mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosÃlica e cloroplÃstica juntamente com antioxidantes nÃo enzimÃticos. AlÃm disso, as APx1/2s submetidas a inibiÃÃo irreversÃvel de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintÃtico e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosÃlica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatÃrios foram ativados para mitigar os possÃveis efeitos negativos do acÃmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosÃlicas de APX nÃo sÃo as enzimas mais importantes no controle dos nÃveis de H2O2, visto que plantas com ausÃncia destas isoformas completam o ciclo de vida e sÃo capazes de enfrentar situaÃÃes de estresse. AlÃm disso, à possÃvel afirmar que a aÃÃo coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsÃveis pela manutenÃÃo do equilÃbrio redox celular em condiÃÃes estressantes em plantas de arroz, diferente do que à noticiado para a planta-modelo Arabdopsis. / Plants in the field are exposed to multiple stresses, such as salinity, drought, high light, heat/cold and others, resulting in different physiological responses. T o evaluate the consequences of some of these stresses to the photosynthetic apparatus and an tioxidative metabolism, 30 day old rice plants , were submitted to the following treatments: control (without NaCl and at 27 ÂC), heat stress (without NaCl and at 42 ÂC), salt stress (with 100 mM NaCl and at 27 ÂC) and combined stress (salt+heat). The contr ol and salt stress treatments lasted 8 days and the heat and combined stress treatments lasted 6 hours. At the end of the experimental period, gas exchange, chlorophyll fluorescence and electrolyte leakage were measured and the leaves were collected for bi ochemical determinations. I solated salt and heat stress es were not sufficient to cause damage in the photochemical apparatus and heat stress only modifie d stomatal aperture. In combined heat and salt stress , the results indicate that photosynthetic process es were affected at the level of CO 2 assimilation and quantum efficiency. E lectrolyte leakage, TBARS and H 2 O 2 content were elevated in sal t +heat treatment, but in isolate d heat stress the TBARS was decreased. Reduced ascorbate and glutathione were similarly decrease d in plants exposed to the combination of salt and heat. A ll enzymes examin ed here were differently modulated in experimental treatment s . Taken together, the data indicates more intense impairment of photosynthesis in rice plants in the c ombination of the salt and heat, however the effective modulation of the antioxidative system was eff ective in establishing a new redox homeostasis and providing tolerance to abiotic stress.

FONTENELE, A. V. Defesa antioxidativa em plantas de arroz duplamente silenciadas nas APXs citosólicas e expostas a estresses abióticos. 2011. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-03T18:51:13Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_avfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-08T19:11:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_avfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-08T19:11:46Z (GMT). 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The experiment I was performed with leaves segments immersed in methyl viologen (MV) 50 μM for 24h and the experiment II was performed by application of the following treatments: salt stress, high light and MV. The results from experiment I shown Apx1/2s plants have a higher level of H2O2 high than the levels found on WT rice plants, suggesting that Apx1/2s plants present a level of H2O2 near a level of cell signaling. The fact of WT plants had accumulated H2O2 1h after the treatment suggest the necessity of a signaling H2O2 level for stimulate defense systems. Apx1/2s plants unlike of WT plants presented a constant decline on H2O2 content, indicating a likely H2O2 scavenging excess. After 3h of treatment the chloroplastic enzymes SOD, APX and PHGPx presented upper active in Apx1/2s plants, in control and stress, compared with WT plants. These results suggest the existence of an antioxidant system quite active in the Apx1/2s plants. In experiment II the Apx1/2s plants presented no differences in the photochemical parameters when compared with WT plants, even possessing a smaller photosynthesis under controlled conditions. The energy dissipation (NPQ) in the Apx1/2s plants under high light was, in average, higher than WT plants, suggesting better energy dissipation. Even with efficient energy dissipation, the plants could not avoid the excess of energy in the photosystem and they suffered photoinhibition and damage in photosynthetic apparatus (Fv/Fm). In relation the WT plants, Apx1/2s plants presented a higher activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and PHGPx under controlled conditions, probably intending compensate the lack of cAPX. In the MV treatment the chloroplastic PHGPx was stimulated above 100% in the Apx1/2s plants, indicating that these plants can repair oxidative damage faster than the WT plants. The results suggest that Apx1/2s plants, despite the absence of cAPX, activated additional security systems to compensate the lack of cAPX and respond quickly and efficiently to stress situations. / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar aspectos fisiológicos e bioquímicos que mostrem se plantas de arroz (Oryza sativa) deficientes da enzima citosólica peroxidase do ascorbato (cAPX) são mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que as plantas com cAPX. A APX é uma importante enzima do metabolismo oxidativo de plantas, atuando na regulação dos níveis endógenos do peróxido de hidrogênio (H2O2). Para isso, plantas deficientes em cAPX (Apx1/2s) e plantas não transformadas (WT) foram utilizadas para a experimentação. As plantas foram silenciadas pela técnica do RNA de interferência (iRNA) e cultivadas por 35 dias em vasos de 1.5 L contendo solução nutritiva sob condições de casa de vegetação. O experimento I foi realizado com segmentos de folhas imersos em metil-viologênio (MV) 50 M durante 24h, e o experimento II foi realizado pela aplicação dos seguintes estresses abióticos: salinidade, alta luminosidade e MV. Os resultados do experimento I mostraram que as plantas Apx1/2s possuem um nível basal de H2O2 maior do que os níveis encontrados nas plantas WT, sugerindo que as plantas Apx1/2s apresentam um nível de H2O2 próximo de um nível de sinalização celular. O fato das plantas WT terem acumulado H2O2 após 1h de tratamento sugere a necessidade de um nível sinalizador de H2O2 para ativação dos sistemas de defesa. As plantas Apx1/2s ao contrario das WT apresentaram uma queda constante no conteúdo de H2O2, indicando uma provável remoção do excesso de H2O2. Após 3h de tratamento as enzimas SOD, APX e PHGPx de cloroplasto apresentaram atividade superior nas plantas Apx1/2s, tanto no controle quanto no estresse, comparadas com as plantas WT. Esses resultados sugerem existência de um sistema antioxidante bastante ativado nas plantas Apx1/2s. No experimento II as plantas Apx1/2s não apresentaram diferenças nos parâmetros fotoquímicos quando comparadas com as plantas WT, mesmo possuindo uma menor fotossíntese em condições controle. A dissipação do excesso de energia (NPQ) nas plantas Apx1/2s tratadas com luz foi, em média, maior que das plantas WT, indicando uma possível maior eficiência na dissipação de energia. Mesmo com eficiente dissipação de energia ambas as plantas não conseguiram evitar energia excessiva no fotossistema e acabaram sofrendo fotoinibição e danos no aparato fotossintético (Fv/Fm). Em relação às plantas WT, as Apx1/2s apresentaram maior atividade das enzimas antioxidativas SOD, CAT e PHGPx nas condições controle, na provável tentativa de compensar a ausência da cAPX. No tratamento com MV a isoforma cloroplástica da PHGPx foi estimulada em mais de 100% nas plantas Apx1/2s, indicando que essas plantas podem reparar danos oxidativos com mais rapidez que as WT. Os dados sugerem que as plantas Apx1/2s, apesar da ausência da cAPX, ativam sistemas adicionais de proteção antioxidativa para compensar essa ausência e responder mais rápida e eficientemente a situações de estresse.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar aspectos fisiolÃgicos e bioquÃmicos que mostrem se plantas de arroz (Oryza sativa) deficientes da enzima citosÃlica peroxidase do ascorbato (cAPX) sÃo mais suscetÃveis ao estresse oxidativo do que as plantas com cAPX. A APX Ã uma importante enzima do metabolismo oxidativo de plantas, atuando na regulaÃÃo dos nÃveis endÃgenos do perÃxido de hidrogÃnio (H2O2). Para isso, plantas deficientes em cAPX (Apx1/2s) e plantas nÃo transformadas (WT) foram utilizadas para a experimentaÃÃo. As plantas foram silenciadas pela tÃcnica do RNA de interferÃncia (iRNA) e cultivadas por 35 dias em vasos de 1.5 L contendo soluÃÃo nutritiva sob condiÃÃes de casa de vegetaÃÃo. O experimento I foi realizado com segmentos de folhas imersos em metil-viologÃnio (MV) 50 M durante 24h, e o experimento II foi realizado pela aplicaÃÃo dos seguintes estresses abiÃticos: salinidade, alta luminosidade e MV. Os resultados do experimento I mostraram que as plantas Apx1/2s possuem um nÃvel basal de H2O2 maior do que os nÃveis encontrados nas plantas WT, sugerindo que as plantas Apx1/2s apresentam um nÃvel de H2O2 prÃximo de um nÃvel de sinalizaÃÃo celular. O fato das plantas WT terem acumulado H2O2 apÃs 1h de tratamento sugere a necessidade de um nÃvel sinalizador de H2O2 para ativaÃÃo dos sistemas de defesa. As plantas Apx1/2s ao contrario das WT apresentaram uma queda constante no conteÃdo de H2O2, indicando uma provÃvel remoÃÃo do excesso de H2O2. ApÃs 3h de tratamento as enzimas SOD, APX e PHGPx de cloroplasto apresentaram atividade superior nas plantas Apx1/2s, tanto no controle quanto no estresse, comparadas com as plantas WT. Esses resultados sugerem existÃncia de um sistema antioxidante bastante ativado nas plantas Apx1/2s. No experimento II as plantas Apx1/2s nÃo apresentaram diferenÃas nos parÃmetros fotoquÃmicos quando comparadas com as plantas WT, mesmo possuindo uma menor fotossÃntese em condiÃÃes controle. A dissipaÃÃo do excesso de energia (NPQ) nas plantas Apx1/2s tratadas com luz foi, em mÃdia, maior que das plantas WT, indicando uma possÃvel maior eficiÃncia na dissipaÃÃo de energia. Mesmo com eficiente dissipaÃÃo de energia ambas as plantas nÃo conseguiram evitar energia excessiva no fotossistema e acabaram sofrendo fotoinibiÃÃo e danos no aparato fotossintÃtico (Fv/Fm). Em relaÃÃo Ãs plantas WT, as Apx1/2s apresentaram maior atividade das enzimas antioxidativas SOD, CAT e PHGPx nas condiÃÃes controle, na provÃvel tentativa de compensar a ausÃncia da cAPX. No tratamento com MV a isoforma cloroplÃstica da PHGPx foi estimulada em mais de 100% nas plantas Apx1/2s, indicando que essas plantas podem reparar danos oxidativos com mais rapidez que as WT. Os dados sugerem que as plantas Apx1/2s, apesar da ausÃncia da cAPX, ativam sistemas adicionais de proteÃÃo antioxidativa para compensar essa ausÃncia e responder mais rÃpida e eficientemente a situaÃÃes de estresse. / The aim of this study was to characterize physiological and biochemical aspects that show if rice plants (Oryza sativa) knockdown on cytosolic ascorbate peroxidase enzyme (cAPX) are more susceptible to oxidative stress than the wild type plants. APX is an important enzyme from oxidative metabolism of plants, acting on regulation of the endogenous levels of hydrogen peroxide (H2O2). For this, rice plants knockdown on cAPX (Apx1/2s) and wild type (WT) were used for the experimentation. The plants were silenced by interference RNA technical (iRNA) and were grown for 35 days into 1.5 L pots containing nutritive solution under greenhouse conditions. The experiment I was performed with leaves segments immersed in methyl viologen (MV) 50 μM for 24h and the experiment II was performed by application of the following treatments: salt stress, high light and MV. The results from experiment I shown Apx1/2s plants have a higher level of H2O2 high than the levels found on WT rice plants, suggesting that Apx1/2s plants present a level of H2O2 near a level of cell signaling. The fact of WT plants had accumulated H2O2 1h after the treatment suggest the necessity of a signaling H2O2 level for stimulate defense systems. Apx1/2s plants unlike of WT plants presented a constant decline on H2O2 content, indicating a likely H2O2 scavenging excess. After 3h of treatment the chloroplastic enzymes SOD, APX and PHGPx presented upper active in Apx1/2s plants, in control and stress, compared with WT plants. These results suggest the existence of an antioxidant system quite active in the Apx1/2s plants. In experiment II the Apx1/2s plants presented no differences in the photochemical parameters when compared with WT plants, even possessing a smaller photosynthesis under controlled conditions. The energy dissipation (NPQ) in the Apx1/2s plants under high light was, in average, higher than WT plants, suggesting better energy dissipation. Even with efficient energy dissipation, the plants could not avoid the excess of energy in the photosystem and they suffered photoinhibition and damage in photosynthetic apparatus (Fv/Fm). In relation the WT plants, Apx1/2s plants presented a higher activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and PHGPx under controlled conditions, probably intending compensate the lack of cAPX. In the MV treatment the chloroplastic PHGPx was stimulated above 100% in the Apx1/2s plants, indicating that these plants can repair oxidative damage faster than the WT plants. The results suggest that Apx1/2s plants, despite the absence of cAPX, activated additional security systems to compensate the lack of cAPX and respond quickly and efficiently to stress situations.