Le cancer colorectal, historiquement de mauvais pronostique, a fait au cours des années l'objet de nombreuses recherches qui ont changé sa prises en charge notamment par l'évaluation de nouvelles thérapies, la recherche de facteurs prédictifs de sensibilité à la chimiothérapie ou de nouveaux marqueurs de pronostic. L'association des plusieurs molécules dans un protocole chimiothérapeutique représente le pilier du traitement du cancer colorectal métastatique. Elle peut être responsable d'une augmentation du taux de réponse, ainsi que d'une augmentation de la survie des patients. Les protocoles qui utilisent l'association entre l'acide L-folinique, le 5-FU et l'Irinotécan (FOLFIRI) ou l'Oxaliplatine (FOLFOX) sont devenu les protocoles les plus souvent utilisés, en première ligne chimiothérapeutique, pour traiter les cancers colorectaux. En même temps, les polymorphismes génétiques au niveau des gènes cibles des médicaments ou encore au niveau des gènes impliquées dans les voies de détoxification, ainsi qu'au niveau des gènes intervenant dans les processus de réparation de l'ADN peuvent peser sur l'activité de ces molécules chimiothérapeutiques. En conséquence nous nous sommes intéressés au cours de cette thèse à la recherche des facteurs prédictifs de l'efficacité et de la tolérance aux traitements utilisant principalement les trois molécules (5- FU, Irinotécan et Oxaliplatine). L'individualisation thérapeutique en fonction du profil pharmacogénétique du chaque patient, rendra possible, d'un côté, la diminution des toxicités et, d'un autre côté, l'augmentation de l'efficacité du traitement, accompagnée de l'amélioration de la qualité de vie des patients.

L'existence de polymorphismes génétiques codants pour des protéines de transport ou de métabolisme peut expliquer en partie la variabilité pharmacocinétique de certains médicaments. Les modèles non linéaires à effets mixtes (MNLEM) permettent de caractériser cette variabilité en analysant simultanément les données recueillies chez l'ensemble des patients et nécessitent moins de prélèvements que l'approche traditionnelle non-compartimentale. Du fait de la multiplicité des génotypes et de leur représentation déséquilibrée dans la population générale, nous nous sommes interrogés sur les propriétés des tests classiquement utilisés pour détecter un effet gène sur un paramètre pharmacocinétique dans le cadre des MNLEM. Dans ce contexte, nous avons évalué par simulation les propriétés de l'ANOVA, du test de Wald et du test du rapport de vraisemblance. L'impact de l'algorithme d'estimation a été pris en compte grâce à l'utilisation de plusieurs méthodes d'estimation. Nous avons ainsi mis en évidence une inflation de l'erreur de type I des tests asymptotiques, sur plusieurs protocoles expérimentaux. Nous avons alors proposé deux alternatives et montré que l'approche par permutation peut être utilisée dans ce contexte ainsi qu'une approche reposant sur la pondération de la variance d'estimation, moins coûteuse en temps de calcul. Ces résultats ont été appliqués à l'analyse de trois études pharmacogénétiques, explorant l'influence de polymorphismes génétiques sur la pharmacocinétique de l'indinavir dans l'essai COPHAR2-ANRS 111, sur la pharmacocinétique d'un antipsychotique en développement et sur la pharmacocinétique de la névirapine dans l'essai PECAN-ANRS 12154.

Au cours de la dernière décennie, la pharmacogénomique est devenue le mantra révolutionnaire de nombreux chercheurs et de certains porte-paroles de l'industrie. L'intérêt que porteront les compagnies bio-pharmaceutiques du secteur privé à la recherche et au développement de nouveaux médicaments pharmacogénomiques sera déterminé par la facilité à obtenir du financement et les perspectives de retombées économiques. Dans cette perspective, le droit de la propriété intellectuelle (plus spécifiquement le droit des brevets) a toujours été l'instrument de prédilection pour motiver la recherche et le développement des produits pharmaceutiques. Cependant, l'extension de ce droit au domaine de la pharmacogénomique est controversé. Cette étude évalue l'applicabilité du système international des brevets au domaine de la pharmacogénomique. Suite à une analyse comparative du droit et des principaux textes normatifs, applicables aux brevets pharmaceutiques et biotechnologiques, ainsi qu'à une revue de la doctrine, l'étude soutient que le système de brevets reste une solution viable pour encourager la recherche et le développement dans le domaine de la pharmacogénomique. Cependant, certains ajustements sont nécessaires pour empêcher que des brevets trop larges, ayant des fondements juridiques douteux, ne soient octroyés sur des nouveaux tests de diagnostic pharmacogénomiques et sur des nouveaux outils de diagnostic pharmacogénomiques, ce qui serait néfaste à la recherche et limiterait l'accès aux soins de santé. Plusieurs stratégies sont proposées pour promouvoir un système de brevets applicable au domaine des biotechnologies qui, tout en donnant la motivation nécessaire aux inventeurs et à l'industrie, protégerait nos valeurs humaines fondamentales. / In the last decade, pharmacogenomics has become the "revolution" mantra for numerous researchers and industry representatives. The research interest of the industry for pharmacogenomics will be determined by financing possibilities and prospective economic benefits. In this perspective, the intellectual property system (more specifically patents), has always been the privileged tool to motivate research and development of pharmaceutical products. However, its application to pharmacogenomics is controversial. This study evaluates the applicability of the international patent system to the area of pharmacogenomics. A comparative review and analysis of international laws and guidelines applicable to biotechnology and pharmaceutical patents as well as a review of the literature was carried out. Our study found that the patent system remains a viable solution to promote research and development of pharmacogenomics. However, some adjustments are needed to ensure that overbroad patent having a weak legal basis are not granted on both new pharmacogenomic research tools and diagnostic tests since this could be detrimental to research and limit access to healthcare. Strategies are suggested to promote a patent system, applicable to the field of biotechnology, that will give the necessary incentive to inventors and industry while protecting our fundamental human values. / "Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (LL.M.) Option droit, Biotechnologies et société" / Texte du mémoire également publié dans Lex Electronica, vol. 10 n°2 (Été/Automne 2005)

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L'objectif de cette thèse a été d'explorer l'association entre des variants génétiques impliqués dans la variabilité interindividuelle de la réponse au traitement par les opioïdes et la survenue d'effets secondaires. Nous avons recherché si des facteurs génétiques influençaient la réponse à la morphine dans le traitement de la douleur aigüe. L'allèle T du polymorphisme c.3435C>T d'ABCB1 est significativement associé aux doses de morphine et à la survenue de nausées dans une étude pilote chez des patients libanais en post-opératoire. Ensuite, l'étude de la réponse à la morphine chez des patients présentant une obésité morbide a montré que la fréquence de l'allèle 118G d'OPRM1 et le seuil de sensibilité à la douleur sont plus élevés que chez les patients à poids normal. La recherche des facteurs influençant la variabilité de la réponse à la méthadone chez des patients toxicomanes traités pour substitution a mis en évidence deux polymorphismes (TaqIA de DRD2/ANKK1 et c.118A>G d'OPRM1) significativement associés à la dose maximale de méthadone administrée. Trois facteurs sont associés au phénotype CYP3A, impliqué dans le métabolisme de la méthadone: la prise de benzodiazépines, l'infection par le VIH et un polymorphisme de POR, gène qui code une oxydoréductase. De plus, le travail mené sur les effets secondaires cardiaques de la méthadone a permis de mettre en évidence trois facteurs corrélés à l'allongement de l'espace QT : la dose, l'infection par le VIH et le polymorphisme p.Lys897Thr de KCNH2 codant pour le canal potassique hERG. Ces travaux contribuent à démontrer l'intérêt d'intégrer des données cliniques et génétiques dans la prescription personnalisée des opioïdes.

Ce travail de thèse reposait sur l’hypothèse que la variabilité génétique des protéines « cibles » des médicaments immunosuppresseurs de la famille des inhibiteurs de la calcineurine (ICN ; ciclosporine et tacrolimus) pourrait expliquer une partie de la variabilité observée dans leur efficacité et toxicité. Une revue de la littérature nous a permis de lister un panel de variants génétiques au sein de la voie de la calcineurine, considérés comme étant de bons candidats pour des études en transplantation. Ces variants n’ont pas été associés au risque de rejet aigu ou d’infection grave dans une étude incluant 381 patients transplantés rénaux suivis durant un an après la transplantation. La variabilité pharmacodynamique des ICN a ensuite été explorée au travers des régulations épigénétiques. Une analyse de la méthylation de l’ADN après exposition médicamenteuse a été menée sur deux modèles. Premièrement, la lignée cellulaire JURKAT a été utilisée pour développer la méthode d’immunoprécipitation de l’ADN méthylé (MeDIP). Chez des souris traitées par ciclosporine et tacrolimus durant 3 mois, nous avons ensuite isolé les cellules cibles des médicaments, les lymphocytes T CD4 puis, après immunoprécipitation de l’ADN méthylé et analyse par séquençage pangénomique haut débit (MeDIP-seq, séquençeur Ion Proton), nous avons recherché les régions du génome présentant des différences de méthylation induites par le traitement. L’analyse différentielle bio-informatique a été menée à l’aide des outils SAMtools (Li et col., 2009), BEDtools (Quinlan and Hall, 2010), MACS2 (Zhang et col., 2008) et Diffbind (Stark and Brown, 2011 - Bioconductor). Sur l’ensemble du génome, nous n’avons identifié que 24 régions présentant un niveau de méthylation modifié par l’exposition au tacrolimus. Le promoteur du gène Calm2, codant pour l’isoforme 2 de la calmoduline, semble être davantage méthylé chez les souris traitées. Ces résultats préliminaires semblent prometteurs pour la découverte de biomarqueurs épigénétiques de la réponse thérapeutique aux immunosuppresseurs. / Inter-individual genetic variation might account for diverse efficacy and toxicity of calcineurin inhibitors (cyclosporin and tacrolimus). In particular, some variants located within genes coding for proteins of the calcineurin pathway can explain part of this variability. In this manuscript, a panel of candidate genes was selected based on bibliographic review and tested in a pharmacogenetics study encompassing 381 renal transplants followed for one year after surgery. None of these candidates was associated with the acute rejection or serious infection risks. Furthermore, the pharmacodynamic variability of these drugs was also investigated, exploring the use of epigenomics profiling as proximal readout of the calcineurin inhibition treatment. In particular, we investigated the impact of drug exposure on DNA methylation in two experimental models. Methylated DNA immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (MeDIP-seq, Ion Proton technology) was deployed in JURKAT cell line, used as in vitro model, and in CD4 T lymphocytes isolated from mice treated with either cyclosporin or tacrolimus for three months. After sequencing, the differentiated methylated regions caused by drug exposure were analyzed. Bioinformatics analyses were performed using SAMtools (Li et al., 2009), BEDtools (Quinlan and Hall, 2010), MACS2 (Zhang et al., 2008) and Diffbind (Stark and Brown, 2011 - Bioconductor). Overall, the genome-wide analysis revealed only 24 regions with a differentiated enrichment in DNA methylation after three month-tacrolimus treatment, indicating a targeted effect of these treatments on a subset of key genes. Of note, CALM2 promoter, coding for the calmodulin isoform 2 protein, showed significant hypermethylation in tacrolimus-treated mice. These preliminary results corroborate the interest in using DNA methylation as promising approach to identify candidate biomarkers for therapeutic drug monitoring in calcineurin inhibitor treatments.

Durant la dernière décennie, les inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK) ont radicalement changé l’évolution de certains cancers comme la leucémie myéloïde chronique (LMC) ou les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST). Ils sont aujourd’hui largement utilisés dans le traitement de diverses pathologies malignes, permettant un allongement de la survie globale. Cependant, certains patients ne montrent pas d’amélioration au cours du traitement par ITK. Les mécanismes évoqués sont multifactoriels et possèdent une origine pharmacocinétique, pharmacodynamique ou pharmacogénétique. En effet, l’une des causes majeures de variabilité commune à tous ces ITK réside dans un métabolisme impliquant le cytochrome 3A4, dont l’expression est soumise à de nombreux facteurs. L’objectif de cette thèse a été d’approfondir ces mécanismes et d’évaluer certaines stratégies afin d’augmenter l’efficacité de ces médicaments. Ce travail a consisté en premier lieu à développer une méthode chromatographique sensible et rapide permettant le dosage de neufs ITK commercialisés ou en phase avancée de développement. Cet outil, à la base du suivi thérapeutique pharmacologique, a été utilisé dans le cadre de la LMC pour mesurer les concentrations plasmatiques d’imatinib de plus de 3000 patients. Les informations cliniques de ces patients ont été saisies dans une base de données servant de support à l’évaluation de la réponse en fonction de la concentration. Nous avons ainsi confirmé que les patients présentant des concentrations supérieures au seuil d’efficacité de 1000 ng/mL avaient une plus grande probabilité de réponse. Dans la continuité de ce projet, nous avons évalué la relation concentration-efficacité de l’imatinib dans les GIST et trouvé un seuil d’efficacité voisin de 800 ng/mL. Tous les facteurs de variabilités ne sont cependant pas maitrisables avec un dosage plasmatique. La littérature rapporte en effet que certains ITK sont des substrats de transporteurs cellulaires potentiellement impliqués dans la résistance au traitement. Nous avons donc entrepris de doser ces ITK à l’intérieur même des cellules, d’abord in vitro afin d’évaluer ces mécanismes de transport, puis in vivo dans les cellules de patients traités par ces ITK. Un lien a ainsi été montré entre la capacité d’incorporation des molécules et la réponse au traitement. Enfin, le versant pharmacogénétique de l’un de ces transporteurs (MDR1) a été étudié, indiquant une relation entre certains haplotypes ou polymorphismes et la concentration plasmatique d’une part et la réponse à l’imatinib d’autre part. En conclusion, ces différentes stratégies basées sur le dosage plasmatique ou intracellulaire et sur la pharmacogénétique semblent apporter des éléments permettant l’amélioration de la réponse au ITK ou la détection précoce de mauvaise réponse. / During the last decade, tyrosine kinases inhibitors (TKI) have dramatically changed the prognosis of several cancers such as chronic myeloid leukaemia (CML) or gastro-intestinal stromal tumours (GIST). They are widely used in the treatment of various malignant pathologies, leading to a prolonged overall survival. However, some patients do not show improvement when treated with TKI. The supposed mechanisms are multifactorial and could have an origin in pharmacokinetics, pharmacodynamics or pharmacogenomics. Indeed, one of the major reasons of common variability of these TKI involves their metabolism by cytochrome 3A4, whose expression is subjected to many factors. The aim of this thesis was to deepen these mechanisms and to assess some strategies to increase the efficacy of these drugs. This work consisted first in developing a rapid and sensitive chromatographic method allowing determination of nine commercialised (or in advanced clinical development) TKI. Serving as a basis for therapeutic drug monitoring, this was used as part of CML management to measure imatinib plasmatic concentration of more than 3000 patients. The clinical information of these patients was recorded in a database and used as support for the evaluation of the response according to concentration. Thus, we confirmed that patients having concentration higher than the effectiveness threshold of 1000 ng/mL got higher probability of response. In the same way, we assessed relationship between imatinib concentration and efficacy in GIST and found an effectiveness threshold closed to 800 ng/mL. However, several factors of variability remain unmanageable with only plasmatic determination. Indeed, literature reported that some TKI were substrates of cellular transporters, potentially involved in the resistance to treatment. We therefore decided to determine concentration of these TKI into the cells, first in vitro to assess these mechanisms of transport, and then in vivo into the cells of patients treated by these TKI. A link was shown between the incorporation ability of molecules and the response to the treatment. Finally, a pharmacogenetic approach showed a relationship between some haplotypes or polymorphisms of a transporter (MDR1) and plasmatic concentration on one hand, and response to the imatinib on the other hand. In conclusion, these different strategies based on plasmatic or intracellular determination of TKI and on pharmacogenomics contribute to improvement of the response to TKI or early detection of non-response.

La prise en charge du cancer reste dépendante de l’utilisation des agents cytotoxiques, avec les analogues nucléosidiques. Au-delà de leur similarité structurelle, certains de ces composés partagent une voie métabolique commune, où la cytidine déaminase apparaît comme enzyme majeure. L’existence d’une variabilité génétique et/ou phénotypique de la CDA nous a mené à nous intéresser aux relations entre le statut CDA et l’issue clinique des patients afin de déterminer si la CDA pouvait être considérée comme biomarqueur d’issue clinique chez les patients.Nos travaux personnels ont consisté à évaluer deux techniques permettant de mesurer l’activité de la CDA. Nous avons publié le premier cas mondial de toxicités mortelles sous azacytidine chez un patient CDA-déficient, ainsi que le premier cas de déficience en CDA et de toxicités sous cytarabine causées par la présence d’une variation génétique du gène CDA chez une patiente transplantée hépatique. L’influence du statut CDA a également été étudiée chez deux patients traités par azacytidine. Concernant la gemcitabine, nous avons démontré l’impact délétère en terme d’efficacité de l’augmentation de l’activité CDA chez les patients, ainsi que les résultats d’une étude multicentrique prospective dont le but était de déterminer si la CDA pouvait être un marqueur prédictif de l’apparition des toxicités sous gemcitabine, avec une étude pharmacocinétique en support. Les travaux préliminaires du pyroséquençage partiel de la CDA sur technologie Roche® sont présentés. L’ensemble de ces travaux de thèse confirme l’intérêt d’évaluer le statut CDA chez les patients susceptibles de recevoir une thérapie à base d’analogues nucléosidiques. / Nowadays, the management of cancer pathology remains largely dependent on the use of cytotoxic agents, including nucleoside analogs, used in a variety of settings. Beyond their structural similarity, some of these compounds also share a common metabolic pathway, wherein the cytidine deaminase (CDA) plays a pivotal role. The existence of constitutional genetic and / or phenotypic variability in CDA prompted us to study the relationships between the CDA status and clinical outcome in patients, and to determine if the constitutional CDA could be considered as a biomarker of efficacy and toxicity in patients treated with this class of drugs.Our personal work first consisted in evaluating two methods to measure the CDA enzymatic activity, in terms of robustness and cost. Then we published the first case-report of life-threatening toxicities in a CDA-deficient patient treated with azacytidine, and the first case of CDA deficiency and cytarabine-caused toxicities correlated with presence of a genetic variation in CDA gene in a liver-transplant patient. The influence of CDA status was also assessed in two patients treated with azacytidine. Regarding gemcitabine, we present the impact of an increase in CDA activity on loss of efficacy in patients, and the results of a prospective multicenter study whose purpose was to determine whether the CDA could be a predictive marker of the occurrence of gemcitabine-toxicities, with a pharmacokinetic study support. Finally, preliminary data on partial Roche®-pyrosequencing of CDA, also presented.All these thesis work confirms the interest to evaluate the CDA status in patients likely to receive a nucleosidic analogues-based therapy.

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (LL.M.) Option droit, Biotechnologies et société" / [À l'origine dans / Was originally part of : CRDP - Droit, biotechnologie et rapport au milieu] / Texte du mémoire également publié dans Lex Electronica ; vol. 10, no 2 (Été/Automne 2005) / Au cours de la dernière décennie, la pharmacogénomique est devenue le mantra révolutionnaire de nombreux chercheurs et de certains porte-paroles de l'industrie. L'intérêt que porteront les compagnies bio-pharmaceutiques du secteur privé à la recherche et au développement de nouveaux médicaments pharmacogénomiques sera déterminé par la facilité à obtenir du financement et les perspectives de retombées économiques. Dans cette perspective, le droit de la propriété intellectuelle (plus spécifiquement le droit des brevets) a toujours été l'instrument de prédilection pour motiver la recherche et le développement des produits pharmaceutiques. Cependant, l'extension de ce droit au domaine de la pharmacogénomique est controversé. Cette étude évalue l'applicabilité du système international des brevets au domaine de la pharmacogénomique. Suite à une analyse comparative du droit et des principaux textes normatifs, applicables aux brevets pharmaceutiques et biotechnologiques, ainsi qu'à une revue de la doctrine, l'étude soutient que le système de brevets reste une solution viable pour encourager la recherche et le développement dans le domaine de la pharmacogénomique. Cependant, certains ajustements sont nécessaires pour empêcher que des brevets trop larges, ayant des fondements juridiques douteux, ne soient octroyés sur des nouveaux tests de diagnostic pharmacogénomiques et sur des nouveaux outils de diagnostic pharmacogénomiques, ce qui serait néfaste à la recherche et limiterait l'accès aux soins de santé. Plusieurs stratégies sont proposées pour promouvoir un système de brevets applicable au domaine des biotechnologies qui, tout en donnant la motivation nécessaire aux inventeurs et à l'industrie, protégerait nos valeurs humaines fondamentales. / In the last decade, pharmacogenomics has become the "revolution" mantra for numerous researchers and industry representatives. The research interest of the industry for pharmacogenomics will be determined by financing possibilities and prospective economic benefits. In this perspective, the intellectual property system (more specifically patents), has always been the privileged tool to motivate research and development of pharmaceutical products. However, its application to pharmacogenomics is controversial. This study evaluates the applicability of the international patent system to the area of pharmacogenomics. A comparative review and analysis of international laws and guidelines applicable to biotechnology and pharmaceutical patents as well as a review of the literature was carried out. Our study found that the patent system remains a viable solution to promote research and development of pharmacogenomics. However, some adjustments are needed to ensure that overbroad patent having a weak legal basis are not granted on both new pharmacogenomic research tools and diagnostic tests since this could be detrimental to research and limit access to healthcare. Strategies are suggested to promote a patent system, applicable to the field of biotechnology, that will give the necessary incentive to inventors and industry while protecting our fundamental human values.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.