Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion (ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de 3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet, les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%. L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés. Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une longue liste complète de gènes d’ADME. / In order to better assess the inter-individual variability observed in a patient’s pharmacokinetic response to many medications, we have created a custom genotyping panel that uses unique assay designs to analyze variation present in key genes involved in the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of many therapeutic agents. These genes and pathways involved in most pharmacokinetic mechanisms are well known. However, as yet, there has been little effort to develop tools that can interrogate a large number of variations in most known drug metabolizing genes simultaneously within a single experimental tool. Pharmacogenomic research has historically been conducted using two approaches: targeted studies that screen a small number of specific functional markers to identify known metabolic status phenotypes, and genome-wide studies that identify novel genetic correlations with drug response phenotypes. Thus, a gap currently exists for a targeted ADME research tool that can evaluate a large number of key ADME genes and variants in a format that can be applicable to both types of study designs. As part of this thesis, we have developed a 3000 SNP broad based ADME genotyping panel that can address this need. Genes and markers for the genotyping panel were selected in collaboration with many groups from both academia and the pharmaceutical industry in an effort to capture all pertinent genes and metabolic pathways that have been implicated in drug metabolism. The final assay design was composed of over 3000 markers in 181 genes. Over three phases of iterative development, the assay conversion rate for the 3000 markers was improved from 83.0% to 97.4% through the incorporation of novel design strategies to overcome areas of genomic interference such as regions of homology and underlying polymorphisms. Accuracy of the assay was validated by screening more than 200 samples of known genotype with a concordance of 99%. Additionally, data from the assay has also been compared to data from different technological platforms and has an overall concordance of 99.5%. The effectiveness of the design strategy was demonstrated in the successful utilization of the assay in the screening of over 1000 samples which identified several novel pharmacogenetic associations between ADME variations and adverse drug reactions in children. Another goal of this thesis was to demonstrate what added benefit/utility the 3000 SNP ADME panel would have when compared to currently available genotyping assays. Using 150 extensively investigated liver samples, the broad based assay was not only able to detect and validate 13 previously reported cis eQTLs in ADME genes but further identified an additional 13 novel ADME cis eQTLs that had never been observed before, doubling the number previously identified using standard methods on the same samples. Finally, in support of this work, a number of bioinformatic tools had to be developed to help expedite this research. These tools have been further refined and are currently being used to assist with enrichment of genomic targets for next generation sequencing experiments. In conclusion, this work has led to a better understanding of ADME genetics and the nuances of assaying ADME genes. The content and designs of the developed assay sets it apart from currently available commercial assays that contain only functional markers in a small number of genes or do not have adequate coverage across ADME genes. The assay has the ability to play a significant role in pharmacogenomic studies to identify known and novel pharmacogenomic biomarkers. These will lead to improved biomarkers that will help better stratify pharmaceutical clinical trial populations or assist physicians to select better, more personalized, efficacious and safer therapies for their patients.

O presente estudo avaliou o perfil farmacogenômico de 338 pacientes, sob terapia antiagregante. Os pacientes foram submetidos a tratamento prévio com AAS (100mg/dia) e clopidogrel (75mg/dia) por no mínimo cinco dias antes da angioplastia coronária. Os indivíduos com resposta considerada indesejada <30% de inibição de PRU (do inglês, P2RY12 Reaction Unit) para clopidogrel e >550 ARU (do inglês, Aspirin Reaction Unit), foram considerados como não respondedores. As concentrações plasmáticas dos antiagregantes foram determinadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa do tipo triploquadrupolo (LC-MS/MS). A taxa da inibição da agregação plaquetária foi medida utilizando-se o sistema VerifyNow®. A expressão gênica global das células totais do sangue periférico foi avaliada pela tecnologia de microarranjos de DNA Human Exon ST 1.0 Array. Características genotípicas dos pacientes também foram avaliadas pelo sistema Sequenom®. Assim, foi possível obter como resultados a identificação de 64% e 10% para pacientes não respondedores ao clopidogrel e AAS respectivamente, sendo que para o primeiro foi possível identificar a associação desta não resposta a variáveis clínicas como diabetes (p = 0,003), hipertensão (p = 0,011) e hábito de fumar (p = 0,041) e sexo (p = 0,022) e idade dos pacientes (p = 0,004) em relação à resposta ao AAS. O método de quantificação simultânea do clopidogrel, seu metabólito majoritário e do AS (metabólito do AAS), apresentou limites de quantificação entre de 2 a 500 ng/mL, 2 a 2000 ng/mL e de 20 a 2000 ng/mL, respectivamente. O estudo de associação encontrou uma relação significante da presença dos SNPs presentes nos genes CYP5A1 (rs2299890) e CYP2C19 (rs4244285 e rs3758580), com a variação na resposta ao clopidogrel, obtendo um valor de p corrigido pelo teste de permutação inferior a 0,001. Como também, uma fraca associação da variação na resposta do AAS com o SNP rs9605030 do gene COMT (p = 0,009). Os resultados do microarranjos relacionaram a resposta terapêutica ao clopidogrel com os genes CA2, MKRN1, ABCC3 e MBP seguido dos genes NFIA e IGF1R para a resposta ao AAS. Concluindo que o estudo farmacogenômico apresentou todo o seu potencial para relacionar variáveis como resposta, concentração farmacológica plasmática, SNPs e expressão global de RNAm, possibilitando assim compreender melhor a variação no tratamento antiagregante. / This study investigated the pharmacogenomics profile of 338 patients under antiplatelet therapy. Patients undergoing pretreatment with ASA (100 mg/day) and clopidogrel (75mg/day) for at least five days prior to coronary angioplasty. Individuals with response <30% of PRU (P2RY12 reaction unit) were considering non responder for clopidogrel and >550 of ARU (aspirin reaction unit), were considered as non responders for ASA. Plasma concentrations of the antiagregation drugs were determined by liquid chromatography followed mass spectrometry of triple quadrupole detection (LC-MS/MS). The rate of inhibition of platelet aggregation was measured using the VerifyNow® system. The global gene expression of total cells in blood was assessed by DNA microarray technology Human Exon 1.0 ST Array. Genotypic characteristics of the patients were also evaluated by the Sequenom® system. Thus it was possible to obtain results such as identification of 64% and 10% for patients non responders to clopidogrel and aspirin respectively, and for the first could identify the association of this response to variables such as diabetes (p = 0.003), hypertension (p = 0.011) and smoking (p = 0.041) for clopidogrel and sex and age in relation to response to ASA (p = 0.022 and p = 0.004, respectively). The method of simultaneous quantification of clopidogrel and its major metabolite of AS (metabolite of ASA), had quantification limits between 200 to 500 ng/mL 2000-2000 ng/mL and 20 to 2000 ng/mL, respectively. The association study found a significant grating presence of SNPs present in genes CYP5A1 (rs2299890) and CYP2C19 (rs4244285 and rs3758580), with the variation in the response to clopidogrel, obtaining a corrected p value by permutation test below 0.001. As well, a weak association of variation in the response of ASA with the SNP rs9605030 of the gene COMT (p = 0.009). The results of microarray related therapeutic response to clopidogrel with genes CA2, MKRN1, ABCC3 and MBP followed by NFIA and IGF1R genes for response to ASA. Concluding that the pharmacogenomics study showed its potential to relate variables such as response, plasma drug concentration, SNPs and global expression of mRNA, thus enabling better understand the variation in antiplatelet treatment.

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O presente estudo avaliou o perfil farmacogenômico de 338 pacientes, sob terapia antiagregante. Os pacientes foram submetidos a tratamento prévio com AAS (100mg/dia) e clopidogrel (75mg/dia) por no mínimo cinco dias antes da angioplastia coronária. Os indivíduos com resposta considerada indesejada <30% de inibição de PRU (do inglês, P2RY12 Reaction Unit) para clopidogrel e >550 ARU (do inglês, Aspirin Reaction Unit), foram considerados como não respondedores. As concentrações plasmáticas dos antiagregantes foram determinadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa do tipo triploquadrupolo (LC-MS/MS). A taxa da inibição da agregação plaquetária foi medida utilizando-se o sistema VerifyNow®. A expressão gênica global das células totais do sangue periférico foi avaliada pela tecnologia de microarranjos de DNA Human Exon ST 1.0 Array. Características genotípicas dos pacientes também foram avaliadas pelo sistema Sequenom®. Assim, foi possível obter como resultados a identificação de 64% e 10% para pacientes não respondedores ao clopidogrel e AAS respectivamente, sendo que para o primeiro foi possível identificar a associação desta não resposta a variáveis clínicas como diabetes (p = 0,003), hipertensão (p = 0,011) e hábito de fumar (p = 0,041) e sexo (p = 0,022) e idade dos pacientes (p = 0,004) em relação à resposta ao AAS. O método de quantificação simultânea do clopidogrel, seu metabólito majoritário e do AS (metabólito do AAS), apresentou limites de quantificação entre de 2 a 500 ng/mL, 2 a 2000 ng/mL e de 20 a 2000 ng/mL, respectivamente. O estudo de associação encontrou uma relação significante da presença dos SNPs presentes nos genes CYP5A1 (rs2299890) e CYP2C19 (rs4244285 e rs3758580), com a variação na resposta ao clopidogrel, obtendo um valor de p corrigido pelo teste de permutação inferior a 0,001. Como também, uma fraca associação da variação na resposta do AAS com o SNP rs9605030 do gene COMT (p = 0,009). Os resultados do microarranjos relacionaram a resposta terapêutica ao clopidogrel com os genes CA2, MKRN1, ABCC3 e MBP seguido dos genes NFIA e IGF1R para a resposta ao AAS. Concluindo que o estudo farmacogenômico apresentou todo o seu potencial para relacionar variáveis como resposta, concentração farmacológica plasmática, SNPs e expressão global de RNAm, possibilitando assim compreender melhor a variação no tratamento antiagregante. / This study investigated the pharmacogenomics profile of 338 patients under antiplatelet therapy. Patients undergoing pretreatment with ASA (100 mg/day) and clopidogrel (75mg/day) for at least five days prior to coronary angioplasty. Individuals with response <30% of PRU (P2RY12 reaction unit) were considering non responder for clopidogrel and >550 of ARU (aspirin reaction unit), were considered as non responders for ASA. Plasma concentrations of the antiagregation drugs were determined by liquid chromatography followed mass spectrometry of triple quadrupole detection (LC-MS/MS). The rate of inhibition of platelet aggregation was measured using the VerifyNow® system. The global gene expression of total cells in blood was assessed by DNA microarray technology Human Exon 1.0 ST Array. Genotypic characteristics of the patients were also evaluated by the Sequenom® system. Thus it was possible to obtain results such as identification of 64% and 10% for patients non responders to clopidogrel and aspirin respectively, and for the first could identify the association of this response to variables such as diabetes (p = 0.003), hypertension (p = 0.011) and smoking (p = 0.041) for clopidogrel and sex and age in relation to response to ASA (p = 0.022 and p = 0.004, respectively). The method of simultaneous quantification of clopidogrel and its major metabolite of AS (metabolite of ASA), had quantification limits between 200 to 500 ng/mL 2000-2000 ng/mL and 20 to 2000 ng/mL, respectively. The association study found a significant grating presence of SNPs present in genes CYP5A1 (rs2299890) and CYP2C19 (rs4244285 and rs3758580), with the variation in the response to clopidogrel, obtaining a corrected p value by permutation test below 0.001. As well, a weak association of variation in the response of ASA with the SNP rs9605030 of the gene COMT (p = 0.009). The results of microarray related therapeutic response to clopidogrel with genes CA2, MKRN1, ABCC3 and MBP followed by NFIA and IGF1R genes for response to ASA. Concluding that the pharmacogenomics study showed its potential to relate variables such as response, plasma drug concentration, SNPs and global expression of mRNA, thus enabling better understand the variation in antiplatelet treatment.

D. Tech. Pharmaceutical Sciences. / Aims of the research project was to develop and optimise rapid quality control methods for H. gordonii raw material and products. The second aim was to determine whether the perceived active component of H. gordonii (P57) is transported across porcine intestinal and buccal mucosa.

Au cours de la dernière décennie, la pharmacogénomique est devenue le mantra révolutionnaire de nombreux chercheurs et de certains porte-paroles de l'industrie. L'intérêt que porteront les compagnies bio-pharmaceutiques du secteur privé à la recherche et au développement de nouveaux médicaments pharmacogénomiques sera déterminé par la facilité à obtenir du financement et les perspectives de retombées économiques. Dans cette perspective, le droit de la propriété intellectuelle (plus spécifiquement le droit des brevets) a toujours été l'instrument de prédilection pour motiver la recherche et le développement des produits pharmaceutiques. Cependant, l'extension de ce droit au domaine de la pharmacogénomique est controversé. Cette étude évalue l'applicabilité du système international des brevets au domaine de la pharmacogénomique. Suite à une analyse comparative du droit et des principaux textes normatifs, applicables aux brevets pharmaceutiques et biotechnologiques, ainsi qu'à une revue de la doctrine, l'étude soutient que le système de brevets reste une solution viable pour encourager la recherche et le développement dans le domaine de la pharmacogénomique. Cependant, certains ajustements sont nécessaires pour empêcher que des brevets trop larges, ayant des fondements juridiques douteux, ne soient octroyés sur des nouveaux tests de diagnostic pharmacogénomiques et sur des nouveaux outils de diagnostic pharmacogénomiques, ce qui serait néfaste à la recherche et limiterait l'accès aux soins de santé. Plusieurs stratégies sont proposées pour promouvoir un système de brevets applicable au domaine des biotechnologies qui, tout en donnant la motivation nécessaire aux inventeurs et à l'industrie, protégerait nos valeurs humaines fondamentales. / In the last decade, pharmacogenomics has become the "revolution" mantra for numerous researchers and industry representatives. The research interest of the industry for pharmacogenomics will be determined by financing possibilities and prospective economic benefits. In this perspective, the intellectual property system (more specifically patents), has always been the privileged tool to motivate research and development of pharmaceutical products. However, its application to pharmacogenomics is controversial. This study evaluates the applicability of the international patent system to the area of pharmacogenomics. A comparative review and analysis of international laws and guidelines applicable to biotechnology and pharmaceutical patents as well as a review of the literature was carried out. Our study found that the patent system remains a viable solution to promote research and development of pharmacogenomics. However, some adjustments are needed to ensure that overbroad patent having a weak legal basis are not granted on both new pharmacogenomic research tools and diagnostic tests since this could be detrimental to research and limit access to healthcare. Strategies are suggested to promote a patent system, applicable to the field of biotechnology, that will give the necessary incentive to inventors and industry while protecting our fundamental human values. / "Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (LL.M.) Option droit, Biotechnologies et société" / Texte du mémoire également publié dans Lex Electronica, vol. 10 n°2 (Été/Automne 2005)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion (ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de 3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet, les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%. L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés. Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une longue liste complète de gènes d’ADME. / In order to better assess the inter-individual variability observed in a patient’s pharmacokinetic response to many medications, we have created a custom genotyping panel that uses unique assay designs to analyze variation present in key genes involved in the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of many therapeutic agents. These genes and pathways involved in most pharmacokinetic mechanisms are well known. However, as yet, there has been little effort to develop tools that can interrogate a large number of variations in most known drug metabolizing genes simultaneously within a single experimental tool. Pharmacogenomic research has historically been conducted using two approaches: targeted studies that screen a small number of specific functional markers to identify known metabolic status phenotypes, and genome-wide studies that identify novel genetic correlations with drug response phenotypes. Thus, a gap currently exists for a targeted ADME research tool that can evaluate a large number of key ADME genes and variants in a format that can be applicable to both types of study designs. As part of this thesis, we have developed a 3000 SNP broad based ADME genotyping panel that can address this need. Genes and markers for the genotyping panel were selected in collaboration with many groups from both academia and the pharmaceutical industry in an effort to capture all pertinent genes and metabolic pathways that have been implicated in drug metabolism. The final assay design was composed of over 3000 markers in 181 genes. Over three phases of iterative development, the assay conversion rate for the 3000 markers was improved from 83.0% to 97.4% through the incorporation of novel design strategies to overcome areas of genomic interference such as regions of homology and underlying polymorphisms. Accuracy of the assay was validated by screening more than 200 samples of known genotype with a concordance of 99%. Additionally, data from the assay has also been compared to data from different technological platforms and has an overall concordance of 99.5%. The effectiveness of the design strategy was demonstrated in the successful utilization of the assay in the screening of over 1000 samples which identified several novel pharmacogenetic associations between ADME variations and adverse drug reactions in children. Another goal of this thesis was to demonstrate what added benefit/utility the 3000 SNP ADME panel would have when compared to currently available genotyping assays. Using 150 extensively investigated liver samples, the broad based assay was not only able to detect and validate 13 previously reported cis eQTLs in ADME genes but further identified an additional 13 novel ADME cis eQTLs that had never been observed before, doubling the number previously identified using standard methods on the same samples. Finally, in support of this work, a number of bioinformatic tools had to be developed to help expedite this research. These tools have been further refined and are currently being used to assist with enrichment of genomic targets for next generation sequencing experiments. In conclusion, this work has led to a better understanding of ADME genetics and the nuances of assaying ADME genes. The content and designs of the developed assay sets it apart from currently available commercial assays that contain only functional markers in a small number of genes or do not have adequate coverage across ADME genes. The assay has the ability to play a significant role in pharmacogenomic studies to identify known and novel pharmacogenomic biomarkers. These will lead to improved biomarkers that will help better stratify pharmaceutical clinical trial populations or assist physicians to select better, more personalized, efficacious and safer therapies for their patients.

Durant la dernière décennie, les inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK) ont radicalement changé l’évolution de certains cancers comme la leucémie myéloïde chronique (LMC) ou les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST). Ils sont aujourd’hui largement utilisés dans le traitement de diverses pathologies malignes, permettant un allongement de la survie globale. Cependant, certains patients ne montrent pas d’amélioration au cours du traitement par ITK. Les mécanismes évoqués sont multifactoriels et possèdent une origine pharmacocinétique, pharmacodynamique ou pharmacogénétique. En effet, l’une des causes majeures de variabilité commune à tous ces ITK réside dans un métabolisme impliquant le cytochrome 3A4, dont l’expression est soumise à de nombreux facteurs. L’objectif de cette thèse a été d’approfondir ces mécanismes et d’évaluer certaines stratégies afin d’augmenter l’efficacité de ces médicaments. Ce travail a consisté en premier lieu à développer une méthode chromatographique sensible et rapide permettant le dosage de neufs ITK commercialisés ou en phase avancée de développement. Cet outil, à la base du suivi thérapeutique pharmacologique, a été utilisé dans le cadre de la LMC pour mesurer les concentrations plasmatiques d’imatinib de plus de 3000 patients. Les informations cliniques de ces patients ont été saisies dans une base de données servant de support à l’évaluation de la réponse en fonction de la concentration. Nous avons ainsi confirmé que les patients présentant des concentrations supérieures au seuil d’efficacité de 1000 ng/mL avaient une plus grande probabilité de réponse. Dans la continuité de ce projet, nous avons évalué la relation concentration-efficacité de l’imatinib dans les GIST et trouvé un seuil d’efficacité voisin de 800 ng/mL. Tous les facteurs de variabilités ne sont cependant pas maitrisables avec un dosage plasmatique. La littérature rapporte en effet que certains ITK sont des substrats de transporteurs cellulaires potentiellement impliqués dans la résistance au traitement. Nous avons donc entrepris de doser ces ITK à l’intérieur même des cellules, d’abord in vitro afin d’évaluer ces mécanismes de transport, puis in vivo dans les cellules de patients traités par ces ITK. Un lien a ainsi été montré entre la capacité d’incorporation des molécules et la réponse au traitement. Enfin, le versant pharmacogénétique de l’un de ces transporteurs (MDR1) a été étudié, indiquant une relation entre certains haplotypes ou polymorphismes et la concentration plasmatique d’une part et la réponse à l’imatinib d’autre part. En conclusion, ces différentes stratégies basées sur le dosage plasmatique ou intracellulaire et sur la pharmacogénétique semblent apporter des éléments permettant l’amélioration de la réponse au ITK ou la détection précoce de mauvaise réponse. / During the last decade, tyrosine kinases inhibitors (TKI) have dramatically changed the prognosis of several cancers such as chronic myeloid leukaemia (CML) or gastro-intestinal stromal tumours (GIST). They are widely used in the treatment of various malignant pathologies, leading to a prolonged overall survival. However, some patients do not show improvement when treated with TKI. The supposed mechanisms are multifactorial and could have an origin in pharmacokinetics, pharmacodynamics or pharmacogenomics. Indeed, one of the major reasons of common variability of these TKI involves their metabolism by cytochrome 3A4, whose expression is subjected to many factors. The aim of this thesis was to deepen these mechanisms and to assess some strategies to increase the efficacy of these drugs. This work consisted first in developing a rapid and sensitive chromatographic method allowing determination of nine commercialised (or in advanced clinical development) TKI. Serving as a basis for therapeutic drug monitoring, this was used as part of CML management to measure imatinib plasmatic concentration of more than 3000 patients. The clinical information of these patients was recorded in a database and used as support for the evaluation of the response according to concentration. Thus, we confirmed that patients having concentration higher than the effectiveness threshold of 1000 ng/mL got higher probability of response. In the same way, we assessed relationship between imatinib concentration and efficacy in GIST and found an effectiveness threshold closed to 800 ng/mL. However, several factors of variability remain unmanageable with only plasmatic determination. Indeed, literature reported that some TKI were substrates of cellular transporters, potentially involved in the resistance to treatment. We therefore decided to determine concentration of these TKI into the cells, first in vitro to assess these mechanisms of transport, and then in vivo into the cells of patients treated by these TKI. A link was shown between the incorporation ability of molecules and the response to the treatment. Finally, a pharmacogenetic approach showed a relationship between some haplotypes or polymorphisms of a transporter (MDR1) and plasmatic concentration on one hand, and response to the imatinib on the other hand. In conclusion, these different strategies based on plasmatic or intracellular determination of TKI and on pharmacogenomics contribute to improvement of the response to TKI or early detection of non-response.