INTRODUCTION Des réponses thérapeutiques variables aux glucocorticoïdes (GCs) sont observées parmi les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Les protéines Bax et Bim ont déjà montré un rôle important dans l’apoptose des cellules leucémiques. L’expression de Bax était plus basse chez les patients leucémiques résistants au médicament, de même une sensibilité diminuée aux GCs a été associée avec une expression réduite de Bim. La différence dans l’expression pourrait être due à des polymorphismes présents dans ces gènes et donc être associés avec la résistance aux GCs. MÉTHODE Dix-huit polymorphismes en régions régulatrices, 2 polymorphismes exoniques et 7 polymorphismes en région 3’UTR de ces gènes ont été analysés chez les témoins (n=50) et ont permis de déterminer un nombre minimal de polymorphismes suffisants pour définir les haplotypes (tagSNPs). Ces 8 polymorphismes ont ensuite été génotypés chez 286 enfants atteints de la LLA et ont été testés pour l’issue de la maladie par l’analyse de survie. RÉSULTATS Une survie sans évènement et une survie sans rechute diminuées ont été observées pour l’haplotype 3 (p=0,03 et p=0,02). Une survie globale diminuée a été associée avec l’homozygotie pour l’allèle exonique T298C>T (p=0,03), de même que pour les haplotypes 1 et 4 (p=0,04 et p=0,02) du gène Bim. CONCLUSION Les polymorphismes ont été associés avec une survie diminuée chez des enfants atteints de LLA. Il reste à tester d’autres polymorphismes présents dans ces deux gènes ainsi qu’à définir leurs fonctions afin de comprendre leurs rôles dans la réponse aux GCs. / INTRODUCTION Variable therapeutic responses to glucocorticoids (GCs) are observed for acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. Proteins Bax and Bim have already shown to play a major role in mediating GC-induced apoptosis in leukemia cells. Bax expression was lower in drug-resistant leukemia samples; likewise lower sensitivity to GC was associated with reduced Bim expression. The difference in the expression can be due to polymorphisms in these genes and therefore associated to GC resistance. METHOD Eighteen polymorphisms in the regulatory region, two exonic polymorphisms and seven polymorphisms in 3’UTR of these genes were analysed in controls (n=50) and have permitted to determine a minimal number of polymorphisms sufficient to define haplotypes (tagSNPs). These 8 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were then genotyped in 286 LLA children and were tested for disease outcome by survival analysis. RESULTS A diminished event free survival and a diminished relapse free survival were observed for haplotype 3 (p=0,03 and p=0,02). A diminished overall survival was associated with the exonic T298C>T allele (p=0,03) and with haplotypes 1 and 4 (p=004 and p=0,02) of Bim gene. CONCLUSION Bax and Bim were associated with a diminished survival in LLA children. We still have to test other polymorphisms located in these genes and to define their functions in order to understand their roles in GC response.

Au niveau clinique, il a été observé que de 15 à 30 % des patients qui ont subi un infarctus du myocarde développent une dépression majeure. De plus, la population atteinte de dépression post-infarctus présente un risque de mortalité de trois à quatre fois plus élevé, et ce, en comparaison avec la population non dépressive post-infarctus. Dans un modèle de rat développé pour étudier la dépression post-infarctus, des cellules apoptotiques ont été retrouvées au niveau du système limbique. Il apparaît que les cytokines seraient en partie responsables de cette mort cellulaire qui relie le cœur en ischémie et le système nerveux central. Donc, les objectifs de cette thèse sont : 1) de caractériser spatialement et temporellement la survenue de la mort cellulaire par apoptose dans les structures du système limbique du rat, à la suite d’un infarctus du myocarde ; 2) de déterminer l’effet de l’anti-inflammatoire celecoxib sur cette apoptose observée au niveau de l’amygdale et de déterminer l’implication de l’enzyme COX-2 ; 3) de déterminer l’implication de la cytokine pro-inflammatoire TNF-α dans l’apoptose observée au niveau des structures du système limbique du rat, à la suite d’un infarctus du myocarde. Afin d’atteindre ces objectifs, les rats ont subi une ischémie de 40 minutes, suivi d’une période de reperfusion qui varie d’un protocole à l’autre (15 minutes, 24, 48, 72 heures ou 7 jours). De plus, en fonction du protocole, ces rats ont été traités avec soit du célécoxib (inhibiteur sélectif de la COX-2), soit avec du PEG sTNF-R1 (inhibiteur du TNF-α). À la suite de ces protocoles, les rats ont été sacrifiés, la taille de l’infarctus a été déterminée et les différentes structures cérébrales du système limbique prélevées. Des tests biochimiques propres à chaque protocole ont été réalisés afin de documenter l'apoptose. Il a alors été observé qu’aucun des deux traitements ne présentait d’effet sur la taille de l’infarctus. L’étude de l’apoptose dans le système limbique a révélé que : 1) le processus apoptotique se mettait en place dans l’hippocampe dès les 15 premières minutes de reperfusion suivant l’infarctus du myocarde et que ce processus était spatialement dynamique dans le système limbique jusqu’au septième jour postreperfusion ; 2) il est apparu que la COX-2 était impliquée dans l'apoptose du système limbique ; 3) il a été observé que le TNF-α périphérique était impliqué dans ce processus apoptotique après 72 heures de reperfusion en activant la voie extrinsèque de l'apoptose. Ces résultats ont permis de caractériser la survenue de l’apoptose au niveau du système limbique chez le rat à la suite d’un infarctus du myocarde et de documenter l'implication de la COX-2 et du TNF-α dans ce processus. Bien que ces résultats n’apportent pas de schémas thérapeutiques clairs ou de mécanismes physiopathologiques globaux ces derniers permettent une meilleure compréhension de la relation existante entre le cœur et le système nerveux central dans le cadre de l’infarctus du myocarde. De manière moins spécifique ils précisent la relation entre le système inflammatoire et le système nerveux central. / About 15 to 30% of clinical patients with myocardial infarction develop major depression. This population is three to four times more vulnerable to fatalities such as death when compared to the non depressed post-myocardial population. In a rat model, developed in order to study post myocardial infarct depression, apoptotic cells within the limbic system have been found. It has been shown that cytokines could be responsible for the cell death linking the ischemic heart to the central nervous system. Thus, the aims of this thesis are: 1) to characterize the spatial time course of the apoptotic cell death within the limbic system, following a myocardial infarct, in a rat model; 2) to determine the effect of the anti-inflammatory celecoxib on this apoptosis in the amygdala and determine the COX-2 enzyme’s implication; 3) to determine the implication of the pro-inflammatory cytokine TNF-α in the apoptosis observed within the limbic system, following a myocardial infarct, in a rat model. In order to achieve these goals, rats were submitted to 40 minutes of myocardial ischemia followed by a variable reperfusion period (15 minutes, 24, 48, 72 hours or 7 days). Moreover, depending on the protocol, rats were treated with celecoxib (COX-2 selective inhibitor), or with PEG sTNF-R1 (TNF-α inhibitor). At the end of each respective reperfusion period, rats were sacrificed, infarct size was determined and the different structures of the limbic system were dissected for further analysis. Biochemical tests, specific to each protocol were performed in order to characterize this apoptosis. With respect to obtained results, we observed that the infarct size was impacted by none of the two treatments. Apoptosis study within the limbic system revealed that: 1) the apoptotic process was activated in the hippocampus area within the first 15 minutes of reperfusion and this process was spatially dynamic in the limbic system until the seventh day of reperfusion; 2) it appeared that COX-2 was implicated in the apoptosis in the limbic system; 3) peripheral TNF-α was implicated in the apoptotic process after 72 hours of reperfusion by activating the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis. These results allowed characterization of apoptosis within the limbic system, in a rat model, following a myocardial infarct and the establishment of the implication of COX-2 and TNF-α in this process. Although these results do not provide any clear therapeutic schemas or global physiopathological mechanisms, they allow a better comprehension of the existing relationship between the heart and the central nervous system within the myocardial infarct context. To a less specific extent these results bring more information on the relationship between the inflammatory system and the central nervous system.

Le projet porte sur l’étude de l’effet de l’eugénol, composant principal du clou de girofle, sur la douleur neuropathique. L’objectif principal du projet était de déterminer la contribution du système nerveux central dans l’effet analgésique de l’eugénol. Lors d’une étude préliminaire, la pénétrabilité de l’eugénol a été évaluée dans le système nerveux central du rat. Des échantillons de sang, de cerveau et de moelle épinière ont été prélevés et les concentrations d’eugénol dans ces différents tissus ont été analysées à l’aide d’un spectromètre de masse. Les résultats ont montré que l’eugénol pénètre bien le système nerveux central avec une distribution plus importante dans la moelle épinière. Après l’induction de la douleur neuropathique à des rats Sprague-Dawley par le modèle de ligatures du nerf sciatique, des injections intrathécales d’eugénol furent réalisées afin d’évaluer l’effet central de l’eugénol. La plus forte dose d’eugénol a atténué l’allodynie secondaire après 15min, 2h et 4h et a aussi amélioré l’hyperalgésie thermique après 2h et 4h. Ces résultats confirment l’hypothèse que l’eugénol atténue les deux aspects de la douleur neuropathique que sont l’allodynie et l’hyperalgésie. Les injections au niveau lombaire permettent de penser que l’eugénol, un agoniste/antagoniste des récepteurs vanilloïdes pourrait diminuer la douleur neuropathique en agissant notamment au niveau des récepteurs vanilloïdes situés dans la corne dorsale de la moelle épinière. / The project is based on the study of the effects of eugenol, the main component of clove oil, on neuropathic pain. The main objective was to determine the central effect of eugenol. In a preliminary study we evaluated the penetrability of eugenol in the central nervous system of rats. Blood, brain and spinal cord samples were collected and concentrations were determined by mass spectrometry. Brain-toplasma and spinal cord-to-plasma ratios suggest that eugenol penetrates the central nervous system of rats relatively well, with a preferential distribution in the spinal cord. Following the induction of neuropathic pain in male Sprague-Dawley rats using the sciatic nerve ligation model, intrathecal injections of eugenol were done to evaluate the central effect of eugenol. Treatment with the high dose of eugenol significantly decreased secondary mechanical allodynia measured by the Von Frey test after 15min, 2h and 4h and improved thermal hyperalgesia measured by the Hargreaves device after 2h and 4h. Results support the hypothesis that eugenol may alleviate neuropathic pain, both allodynia and hyperalgesia. Eugenol, a vanilloid agonist/antagonist may therefore reduce neuropathic pain by acting on vanilloid receptors at the level of the dorsal horn of the spinal cord.

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA. / Natriuretic peptide receptor-A (NPRA) is a member of the particulate guanylate cyclase family. NPRA activation by natural agonists, ANP and BNP, leads to cGMP production, which is responsible for their role in cardiovascular homeostasis, cardiac hypertrophy and fibrosis inhibition and lipolysis regulation. NPRA is a non covalent dimer composed of an extracellular domain (ECD) with a ligand binding site, a single transmembrane region (TM), a kinase homology domain, and a guanylyl cyclase domain. Although NPRA plays an important physiologic role, molecular mecanisms driving its activation process are yet unknown. We thus analysed the first steps of NPRA’s activation process. First, we studied the role of ECD dimerization in receptor activation and determined the sequential steps of this dimerization process. We used radioligand binding, FRET and molecular modeling to characterize the interaction of ECD with natural agonists, a superagonist and an antagonist. ANP binds to preformed ECD dimers and spontaneous dimerization is the rate-limiting step of the ligand binding process. Furthermore, like demonstrated with fluorescence homoquenching, all the studied peptides, including A71915 antagonist, stabilize a dimeric form of the receptor. However, A71915 stabilizes the ECD dimer in a conformation distinct from those induced by ANP. Thus, ECD dimerization is necessary but not sufficient for NPRA activation. The activation state of NPRA seems to depend on the orientation of the receptor subunits within the dimer. Then, we tried to identify the molecular mechanism of signal transduction through the plasma membrane. Previous studies have shown that activation of NPRA involves a conformational change of the juxtamembrane domain (JM). However, crystallographic study of the soluble ECD of NPRA has failed to document JM structure, and the conformational change involved in transmembrane signal transduction is still unknown. To analyse this conformational change, we first sequentially substituted nine amino acids of JM by a cysteine residue. By studying the mutant’s capacity to form ANP-induced or constitutive covalent disulfide dimers, we evaluated the relative proximity of JM residues, before and after NPRA activation. These results demonstrate a high proximity of specific JM residues and are in disagreement with crystallography data. We also demonstrated that intracellular domain imposes a conformational constraint on JM at basal state, which becomes relaxed upon ANP binding. We finally confirmed, with a full-length receptor, that A71915 stabilizes NPRA in a dimeric form where JM are in a conformation distinct from the basal state. By introducing 1 to 5 alanine residues in the transmembrane α-helix, we showed that a TM rotation of 40° leads to constitutive NPRA activation. Activation signal could thus be transmitted through the membrane by a TM rotation mechanism. We finally studied the role of the TM in NPRA dimerization. By using the ToxR system, we demonstrated that the last JM residues are required to stabilize the TM dimer. Using these experimental data, we generated the first molecular model illustrating the active conformation of NPRA, where JM and TM are depicted. In summary, this study allows a better understanding of molecular mecanisms driving the first steps of NPRA’s complex activation process.

Drs Dandachli and Arzamendi contributed equally to this work. / L’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes représentent les étapes initiales dans la formation du thrombus aux sites des lésions vasculaires. Malgré l’utilisation des médicaments antiplaquettaires comme l’Aspirine, le Plavix et les inhibiteurs de la glycoprotéine IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), l’incidence de thrombus dans la maladie coronarienne aigue reste élevée. Le dommage aux artères coronaires induit l’exposition du collagène de la matrice sous-endothéliale et sa liaison au facteur Von-Willebrand (vWF). Ceci contribue au recrutement et à l’adhésion des plaquettes via la liaison du domaine A1 du vWF à la GPIb des plaquettes. Nous avons postulé que l’inhibition de la liaison vWF/GPIb pourra représenter une stratégie efficace pour inhiber l’adhésion initiale des plaquettes et ainsi réduire la propagation du thrombus. L’objectif de notre étude était de déterminer le potentiel anti-thrombotique d’un inhibiteur du vWF. L’aptamère dirigé contre le domaine A1 du vWF (ARC1779) a été développé et fourni par la compagnie Archemix. Son effet et celui du Reopro (abciximab, inhibiteur de la GPIIb/IIIa comme témoin positif) ont été testés en utilisant du sang provenant de 5 volontaires sains et de 27 patients coronariens traités avec l’Aspirine (inhibiteur du cyclo-oxygénase ou COX) et le Plavix (anti-récepteur de l’adénosine diphosphate ou ADP), en accord avec le comité d’éthique de l’ICM. Les plaquettes ont été marquées avec l’Indium-111 afin de pouvoir quantifier leur adhésion dans le sang complet sur des surfaces artérielles porcines dénudées. L’adhésion des plaquettes a été effectuée dans des chambres de perfusion sous des forces de cisaillement de 6974/sec pendant 15 minutes à 37 °C. L’activation plaquettaire, suite à l’étude de l’adhésion, a été évaluée par l’expression de la P-sélectine et du vWF par la cytométrie en flux. L’effet de l’ARC1779 a été également déterminé sur l’agrégation plaquettaire, dans le sang complet par impédance, induite par l’acide arachidonique (AA), l’ADP, la Ristocétine et le peptide agoniste du récepteur de la thrombine-1 (TRAP-1). L’adhésion des plaquettes a été également observée par microscopie électronique à balayage. Dans un premier temps, nous avons trouvé que l’adhésion des plaquettes des volontaires sains à l’artère endommagée était élevée (80 x 106/cm2). Cette adhésion a été réduite significativement de plus que 90% par l’abciximab (100 nM) et d’une façon dose dépendante avec l’ARC1779 (25-250 nM). La perfusion du sang avec ou sans ARC1779 n’entraine pas une activation plaquettaire, telle que déterminée par l’expression de la P-sélectine et du vWF à la surface des plaquettes. Suite à ces résultats, l’étude avec le sang des patients a été poursuivie avec des doses de 25, 83 et 250 nM d’ARC1779. L’agrégation plaquettaire du sang des patients a été complètement inhibée en réponse à l’AA et à l’ADP, ce qui confirme que ces patients étaient bien traités avec l’Aspirine et le Plavix. L’adhésion des plaquettes aux surfaces artérielles endommagées a été réduite, chez les volontaires sains et les patients, d’une manière dépendante de la dose d’ARC1779, lorsqu’il était incubé avant la perfusion. Cependant, l’ARC1779 et aussi l’abciximab étaient sans effets significatifs sur l’adhésion plaquettaire, lorsqu’ils étaient ajoutés 10 minutes après la perfusion. L’inhibition de l’adhésion avec 25 nM d’ARC1779 était comparable à celle obtenue avec l’abciximab. Cependant, l’agrégation plaquettaire en réponse au TRAP-1 n’était pas affectée par l’ARC1779, alors qu’elle était complètement inhibée par l’abciximab. L’ARC1779 est un inhibiteur spécifique de la liaison du vWF au GPIb des plaquettes. Il inhibe l’adhésion plaquettaire aux surfaces artérielles endommagées sans affecter l’agrégation plaquettaire et confère une protection anti-thrombotique similaire à l’abciximab. L’ARC1779 pourra être considéré comme un nouvel antiplaquettaire qui possède des propriétés anti-thrombotiques plus intéressantes que l’abciximab. / Anti-platelet therapy in coronary artery disease (CAD) patients reduces recurrent athero-thrombosis, but at the cost of increased risk of bleeding. Because von Willebrand factor (vWF) functions predominantly in a high-shear environment, the vWF-specific aptamer, ARC1779 that blocks the binding of vWF A1-domain to platelet glycoprotein Ib, may deliver a site-specific anti-thrombotic effect while minimizing bleeding risk. We investigated the efficiency of ARC1779 on platelet activation, adhesion, and aggregation in CAD patients on double anti-platelet therapy. Blood from 27 patients taking aspirin and clopidogrel and 5 normal volunteers was labeled with 111In-autologous platelets and perfused over denuded porcine arteries at high shear rate for 15 minutes. Blood was treated with either 25, 83 and 250 nM ARC1779; 100nM abciximab or placebo, 5 min before (upstream therapy) or 10 min after (downstream therapy) beginning the perfusion. Under upstream, but not downstream therapy, platelet adhesion was significantly reduced by ARC1779 at 83 and 250 nM and by abciximab vs. placebo (4.8, 3.8 and 2.9 vs. 7.3 platelets x 106/cm2, p <0.05). In contrast to abciximab, ARC1779 did not significantly affect platelet aggregation in response to thrombin receptor activating peptide-1, arachidonic acid and adenosine diphosphate. In addition, ARC1779 was without any effect on P-selectin expression and platelet-leukocyte binding. In conclusion, ARC1779 has comparable anti-thrombotic efficacy to abciximab among CAD patients receiving aspirin and clopidogrel, but with lesser systemic effects on platelet activation and aggregation. These important proof-of-concept data form the framework for randomized clinical investigations of this novel anti-platelet therapy among CAD patients.

La grossesse est un état physiologique particulier où de nombreux changements fonctionnels et structuraux surviennent. Chez la rate, pour répondre aux besoins grandissants du fœtus, l’artère utérine se développe pour atteindre le double de son diamètre original avant parturition. Par conséquent, le débit sanguin utérin augmente d’environ vingt fois. Pour ce faire, les vaisseaux utérins sont l’objet d’un remodelage caractérisé par une hypertrophie et une hyperplasie des différentes composantes de la paroi. De plus, ce remodelage est complètement réversible après la parturition, par opposition au remodelage vasculaire « pathologique » qui affecte les artères systémiques, dans l’hypertension chronique, par exemple. La grossesse s’accompagne aussi de modifications hormonales importantes, comme les œstrogènes dont la concentration s’accroît progressivement au cours de cette période. Elle atteindra une concentration trois cents fois plus élevée avant terme que chez une femme non gravide. Cette hormone possède de multiples fonctions, ainsi qu’un mode d’action à la fois génomique et non génomique. Considérant l’ensemble de ces éléments, nous avons formulé l’hypothèse que l’œstradiol serait responsable de modifier la circulation utérine durant la grossesse, par son action vasorelaxante, mais aussi en influençant le remodelage de la vasculature utérine. Nous avons montré que le 17β-Estradiol (17β-E2) produit une relaxation due à un effet non génomique des artères utérines en agissant directement sur le muscle lisse par un mécanisme indépendant du monoxyde d’azote et des récepteurs classiques aux œstrogènes (ERα, ERβ). De plus, la relaxation induite par le 17β-E2 dans l’artère utérine durant la gestation est réduite par rapport à celle des artères des rates non gestantes. Ceci serait attribuable à une diminution de monoxyde d’azote provenant de la synthase de NO neuronale dans les muscles lisses des artères utérines. Nos résultats démontrent que le récepteur à l’œstrogène couplé aux protéines G (GPER), la protéine kinase A (PKA) et la protéine kinase G (PKG) ne sont pas impliqués dans la signalisation intracellulaire associée à l’effet vasorelaxant induit par le 17β-E2. Cependant, nous avons montré une implication probable des canaux potassiques sensibles au voltage, ainsi qu’un rôle possible des canaux potassiques de grande conductance activés par le potentiel et le calcium (BKCa). En effet, le penitrem A, un antagoniste présumé des canaux potassiques à grande conductance, réduit la réponse vasoralaxante du 17β-E2. Toutefois, une autre action du penitrem A n’est pas exclue, car l’ibériotoxine, reconnue pour inhiber les mêmes canaux, n’a pas d’effet sur cette relaxation. Quoi qu’il en soit, d’autres études sont nécessaires pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la relaxation non génomique sur le muscle lisse des artères utérines. Quant à l’implication de l’œstrogène sur le remodelage des artères utérines durant la gestation, nous avons tenté d’inhiber la synthèse d’œstrogènes durant la gestation en utilisant un inhibiteur de l’aromatase. Plusieurs paramètres ont été évalués (paramètres sanguins, réactivité vasculaire, pression artérielle) sans changements significatifs entre le groupe contrôle et celui traité avec l’inhibiteur. Le même constat a été fait pour le dosage plasmatique de l’œstradiol, ce qui suggère l’inefficacité du blocage de l’aromatase dans ces expériences. Ainsi, notre protocole expérimental n’a pas réussi à inhiber la synthèse d’œstrogène durant la grossesse chez le rat et, ce faisant, nous n’avons pas pu vérifier notre hypothèse. En conclusion, nous avons démontré que le 17β-E2 agit de façon non génomique sur les muscles lisses des artères utérines qui implique une action sur les canaux potassiques de la membrane cellulaire. Toutefois, notre protocole expérimental n’a pas été en mesure d’évaluer les effets génomiques associés au remodelage vasculaire utérin durant la gestation et d’autres études devront être effectuées. / Pregnancy is a peculiar physiological state in which many structural and functional changes occur. In rats, to meet the growing needs of the fetus, uterine artery expands to reach twice its original diameter before parturition. Therefore, uterine blood flow increases by about twenty times. To do this, the uterine vessels undergo substantial remodelling characterized by hypertrophy and hyperplasia of the various components of the wall. Furthermore, this remodelling is completely reversible after parturition, as opposed to “pathological vascular remodelling” that affects systemic arteries in chronic hypertension, for instance. Pregnancy is also accompanied by significant hormonal changes, such as estrogens whose concentration in the blood increases progressively during this period. It reaches concentrations three hundred times higher before term than in non-pregnant women. This hormone has multiple functions and mediates its effects by genomic and non-genomic pathways. Considering these elements, we hypothesized that estradiol would be responsible for remodeling the uterine circulation during pregnancy, by its vasorelaxant action, but also by influencing the remodeling of the uterine vasculature. We have shown that 17β-Estradiol (17β-E2) produced non-genomic relaxation of uterine arteries by acting directly on smooth muscle using a mechanism independent of nitric oxide and classical estrogen receptors (ERα, ERβ). Moreover, the relaxation induced by 17β-E2 in the uterine artery during pregnancy is reduced compared to that of arteries from non-pregnant animals. This is the result of decrease of nitric oxide derived from neuronal NO synthase in smooth muscle of uterine arteries. Our results also show that the estrogen receptor coupled to G proteins (GPER), protein kinase A (PKA) and protein kinase G (PKG) are NOT involved in intracellular signaling associated with the vasorelaxant effect induced by the 17β-E2. Moreover, we have shown a possible involvement of potassium channels sensitive to voltage and a possible involvement of large conductance calcium-activated potassium channels (BKCa). Indeed, the penitrem A, a suspected antagonist of BKCa, reduced the vasoralaxant responses of 17β-E2. However, some other actions of penitrem A are not excluded because iberiotoxin, known to inhibit the same channels, had no effect on this relaxation. However, further studies are needed to obtain a better understanding of the mechanisms involved in the relaxation non-genomics on the smooth muscle of uterine arteries. As for the involvement of estrogen on the remodeling of uterine arteries during pregnancy, we attempted to inhibit the synthesis of estrogen during pregnancy using an aromatase inhibitor. Several parameters were evaluated (plasma values, vascular reactivity, blood pressure) without significant changes between the control group and those treated with the inhibitor. The same observation was made for the determination of plasma estradiol, suggesting the uneffectiveness of aromatase blocking in these experiments. Thus, our experimental protocol failed to inhibit the synthesis of estrogen in rats during pregnancy and, in so doing, we cannot confirm or refute our hypothesis. In conclusion, we demonstrated that 17β-E2 acts on smooth muscle of the uterine arteries by a non-genomic pathway by apparently acting on potassium channels. However, our experimental protocol was not able to assess the genomic effects associated with uterine vascular remodeling during pregnancy and further studies are required to ascertain this aspect of our work.

Introduction: Le principal objectif de cette étude est de mesurer l’effet du GDF-5 sur l’homéostasie du cartilage. Le GDF-5 est un gène de susceptibilité de l’OA faisant partie de la famille des BMPs et qui favorise la synthèse du cartilage. Le but de notre étude a été de déterminer l’effet du GDF-5 sur le métabolisme catabolique ainsi que sur l’équilibre global des chondrocytes, principalement au niveau de l’Aggrécan. Méthode : Des chondrocytes arthrosiques canins et humains OA ont été exposés au GDF-5. L’expression des ARNm et des protéines a été analysée afin d’évaluer la production de l’Aggrécan et le ratio Col-II/Col-I au niveau des facteurs anaboliques et du phénotype. Pour le catabolisme, l’expression et l’activité des aggrécanases ADAMTS-4 et ADAMTS-5 ont été mesurées. Les épitopes NITEGE et CTX-II ont aussi été quantifiés dans le liquide synovial canin après des injections intraarticulaires de GDF-5. Résultats : Le GDF-5 provoque une augmentation de l’activité cellulaire des chondrocytes canins et humains. Pour les ARNm et l’expression protéique, le GDF-5 augmente l’expression de l’Aggrécan alors que les facteurs cataboliques le diminuent. Le phénotype reste inchangé en présence du produit, sauf à haute dose où on augmente le ColI. L’activité des aggrécanases diminue puisque l’épitope NITEGE diminue alors que le CTX-II augmente dans l’articulation. Conclusion : En somme, les facteurs anaboliques du cartilage sont favorisés, alors que les facteurs cataboliques sont diminués par le GDF-5. Cette action double permet d’illustrer l’effet du GDF-5, le classant comme un potentiel médicament modifiant la maladie de l’OA qui mérite d’être étudiée. / Purpose: The objective of this study is to assess the effect of GDF-5 on cartilage homeostasis. GDF-5 is a susceptibility gene for OA and member of the BMP super family. Studies have shown that it can increase expression of anabolic factors in chondrocytes. Therefore, our study indentifies how GDF-5 influences this metabolism and the global homeostasis of chondrocytes, aiming mainly towards Aggrecan. Methods : Osteoarthritic (OA) chondrocytes from canine and human models were exposed to GDF-5. Protein expressions, along with mRNA expression were assessed in order to investigate Aggrecan production and the ratio of Col-II/Col-I, for the anabolic phenotype markers. The aggrecanases ADAMTS-4 and ADAMTS-5 and their global activity were assed for the catabolic factors. The NITEGE and CTX-II epitope were also measured in synovial fluid of Pond-Nuki dogs that received intraarticular GDF-5 injections. Results : GDF-5 increases chondrocyte cellular activity, in our canine and human models. Both mRNA and protein expression of the chondrocytes Aggrecan were increased and the aggrecanases expression and activity were decreased. Collagen ratio did not show a phenotype, except et high dosage where the Col-I production is induced. Aggrecanase activity was lowered while CTX-II was increased. Conclusion : In conclusion, the anabolic cellular activity of OA chondrocytes increases while the catabolic factors decrease in presence of GDF-5. This double action illustrates the global effect of GDF-5, identifying it as a potential disease modifying factor of OA that should be further investigated.

L’administration systémique d’atorvastatine s’est montrée neuroprotective suivant un traumatisme médullaire, en diminuant la réponse inflammatoire au site de la lésion ainsi qu’en réduisant l’apoptose des oligodendrocytes. Ce dernier épargne la matière blanche au site de l’insulte et améliore la locomotion. Le but de cette étude était de confirmer l’efficacité neuroprotective de l’atorvastatine ainsi que son action précoce, lorsqu’administré post-trauma, sur la limitation de l’apoptose. Des rats Sprague-Dawley femelles ont reçu une injection intrapéritonéale de : (1) statine/saline (5 mg/kg) 2 h après une lésion contusive; (2) saline physiologique 2 h post-contusion; ou (3) saline physiologique sans lésion. Les rats traités à la statine ont montré une amélioration significative (p<0.05) de leur locomotion après 4 semaines post-trauma, comparée au groupe « véhicule » lésé. Expliquant cette observation, l’activité de la caspase-3 fut diminuée de 50% (p<0.05) et la méthode de TUNEL révéla une diminution d’approximativement 20% du nombre de cellules apoptotiques au site lésionnel (p<0.01) 4 h après l’insulte contusive chez le groupe traité en comparaison aux groupes « véhicules ». Ces résultats démontrent que l’atorvastatine est efficace dans la prévention de l’apoptose précoce au site lésionnel dans un modèle expérimental de traumatisme médullaire après seulement 2 h post-traumatisme. / The systemic administration of atorvastatin has been shown to be neuroprotective after spinal cord injury (SCI), by decreasing the inflammatory response at the lesion site and by reducing neuronal and oligodendrocyte apoptosis. The latter effect spares white matter at the injury site and improves locomotion. The aim of this study was to confirm the neuroprotective efficacy of atorvastatin as well as its early action in limiting apoptosis with its administration post-SCI. Female Sprague-Dawley rats received an intra peritoneal injection of: (1) statin/saline (5 mg/kg) at 2 h after the contusion injury; (2) physiological saline at 2 h post-SCI; or (3) physiological saline without injury. Statin-treated rats showed significant (p<0.05) improvement in locomotion at week 4 post-SCI compared to vehicle-treated animals. Explaining this outcome, caspase-3 activity decreased by 50% (p<0.05), and the histological TUNEL method revealed a decrease of approximately 20% in apoptotic cells at the injury site (p<0.01) at 4 h post-SCI in atorvastatin-treated rats in comparison to vehicle-treated controls. These data demonstrate that atorvastatin is effective after experimental spinal cord contusion injury in preventing early apoptosis at the injury site within 2 h post-administration.

Effet positif de la N-acétylcystéine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à une hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin A. A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT INSTITUT DE CARDIOLOGIE DE MONTRÉAL, MONTRÉAL, CANADA, Objectif : Il a été démontré dans le laboratoire que dans notre modèle d’hypertrophie ventriculaire gauche, la dysfonction endothéliale est secondaire à une diminution de la biodisponibilité du NO, celle-ci étant causée par une augmentation du stress oxydant tel que démontré par Malo et al. (2003) et Aubin et al. (2006). Le but de la présente étude est d’étudier l’effet d’un traitement chronique de la N-acétylcystéine (NAC) (un antioxydant) sur la dysfonction endothéliale associée à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Méthodologie: L’HVG a été induite par cerclage aortique (CA) chez vingt-et-un porcelets âgés de deux mois qui furent divisés aléatoirement en quatre groupes expérimentaux. Le groupe témoin (groupe 1) a été soumis à une thoracotomie antérolatérale gauche sans cerclage aortique (n=3). Le groupe 2 a été soumis à un cerclage aortique pour une période de 60 jours (n=6). Le groupe 3 a subi un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine de 1000 mg/jour per os pendant 60 jours commençant le jour de la chirurgie (n=6). Le groupe 4 a été soumis à un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine : 1000 mg/par jour pendant 30 jours commençant le jour 30 (post-chirurgie) (n=6). L’hypertrophie fut évaluée par échocardiographie. La réactivité vasculaire fut étudiée à l’aide de chambres d’organes par la construction des courbes concentration-réponse à la sérotonine (5-HT: relaxations induites par les récepteurs 5-HT1D, couplés aux protéines Gi) et à la bradykinine (BK: relaxations induites par les récepteurs B2, couplés aux protéines Gq). Les quantités de nitrites/nitrates et la production basale de GMPc ont été mesurées pour évaluer la fonction endothéliale. Le stress oxydant a été étudié en quantifiant les concentrations plasmatiques d’hydroperoxydes lipidiques et de glutathion réduit, ainsi que l’activité plasmatique des enzymes antioxydantes peroxydase du glutathion et dismutase du superoxyde. Résultats: Le rapport masse ventricule gauche/masse corporelle était significativement plus élevé pour le groupe 2 comparativement au groupe 1 (p<0,05) confirmant la présence d’une HVG. Le développement de l’HVG dans le groupe 3 a pu être prévenu par la NAC et sa progression fut atténuée dans le groupe 4 (p<0,05 versus groupe 2). La présence de la dysfonction endothéliale a été confirmée chez le groupe 2, tel qu’illustré par une diminution significative des relaxations maximales à la 5-HT et à la BK comparativement au groupe témoin. Le traitement à la NAC a significativement potentialisé les relaxations maximales (p<0,05) induites par la sérotonine et par la bradykinine, chez les deux groupes traités. Cette amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium peut être la conséquence d’une augmentation significative (p<0,05) de la biodisponibilité du monoxyde d’azote pour les cellules musculaires lisses, tel que suggéré par l’augmentation du ratio nitrites/nitrates et de la production basale de GMPc chez les groupes 3 et 4 comparativement au groupe 2. Cette augmentation du facteur relaxant peut résulter d’une augmentation de sa production par les cellules endothéliales ou d’une diminution de sa neutralisation par les espèces réactives oxygénées. De fait, les concentrations d’hydroperoxydes lipidiques étaient significativement inférieures (p<0,05) et associées à une augmentation des concentrations de l’antioxydant glutathion réduit et de l’activité de la peroxydase du glutathion chez les deux groupes traités par rapport au groupe 2. Conclusion: Le traitement à la NAC prévient le développement de la dysfonction endothéliale coronaire ainsi que l’HVG qui lui est associée. / Beneficial effect of N-acetylcysteine on endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries associated with left ventricular hypertrophy in a porcine model A.A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT MONTREAL HEART INSTITUTE, MONTREAL, CANADA Objective : In our left ventricular hypertrophy (LVH) model, endothelial dysfunction is secondary to a reduced bioavailability of NO caused by increased oxidative stress demonstrated by Malo and al. (2003) and Aubin and al. (2006). The aim of this study was to investigate the potential effect of chronic administration of N-acetylcysteine (NAC), a thiol drug with antioxidant properties, on the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. Design and method: LVH was induced by aortic banding (AB) on swine for a two-month period. Twenty-one 8-week-old Landrace male swine were randomly divided into 4 experimental groups. The sham group (group 1) was submitted to a thoracotomy without aortic banding (AB). The untreated aortic banded group (group 2) was kept for 60 days. The first AB treated group (group 3) received 1000mg/day of NAC per os for 60 days starting on the day of the surgery. The second AB treated group (group 4) received the same oral dose of NAC for 30 days starting on day 30. Hypertrophy was assessed by echocardiography. Coronary vascular reactivity was evaluated in organ chambers, by the construction of concentration-response curves to serotonin (5-HT: relaxations mediated by 5-HT1D receptors, coupled to Gi proteins) and bradykinin (BK: relaxations mediated by B2 receptors, coupled to Gq proteins). Levels of nitrite/nitrate and basal cGMP levels were measured to evaluate endothelial dysfunction. Finally, to assess oxidative stress, plasma lipid hydroperoxide levels (LPO), reduced glutathione as well as the activity of antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase were measured. Results: The LV mass/ body weight ratio was significantly higher in group 2 compared to group 1 confirming the development of LVH (p<0.05). The latter was found to be associated with a significant endothelial dysfunction. NAC did prevent LVH development in group 3 and attenuated its progression in group 4 (p<0.05). Concentration response curves to NAC showed improvement in endothelium-dependent relaxations to serotonin and to bradykinin (p<0.05). NAC treatment markedly improved maximal relaxations mediated by serotonin and bradykinin in both treated groups (p<0.05). The observed improvement in endothelium-dependent relaxations was supported by the increase of the bioavailability of NO for smooth muscle cells as suggested by the increase of the nitrite/nitrate ratio and the basal production of cGMP in groups 3 and 4 in comparison to group 2 (p<0.05). The increase of this relaxing factor could result from an increase of its production by endothelial cells or by a decrease of its neutralization by reactive oxygenated species. The lowering of LPO levels was accompanied by a higher glutathione concentration and glutathione peroxidase activity in both NAC treated groups compared to group 2 (p<0.05). Conclusions: NAC treatment demonstrated potent antioxidant properties in this porcine LVH model by slowing LVH development and restoring coronary endothelium-dependent relaxations.

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3. / G protein-coupled receptors form multimeric complexes comprising G protein and effectors. We want to characterize such complexes comprising delta opioid receptors (DOR) and Kir3 channels, which interest us due to their involvement in opioid analgesia. Immunopurification, BRET and GTPgS binding experiments were done in transfected HEK293 cells. Kir3 channels were co-immunopurified with DOR, implying a spontaneous interaction between the receptor and effector. BRET assays corroborated the presence of this interaction in living cells and allowed us to identify a spontaneous and specific interaction between DOR/Gg and Gg/Kir3, indicating their co-existence within the same complex. Since the activation of the receptor implies it undergoes conformational changes, we were interested in evaluating if the conformational information flows from the ligand-bound receptor until the downstream effector. Hence, we determined the effect of different ligands on the BRET signal that was generated by the following pairs: DOR/Gbg, DOR/Kir3 and Kir3/Gbg. We noticed a modulation of the DOR/Gbg and Gbg/Kir3 interactions that followed the order of efficacy of the ligands to activate the G protein, which we did not observe between DOR and Kir3. Therefore, we concluded that the conformational information flows from the receptor to the Kir3 channel via the Gbg protein. These results allowed us to develop a BRET biosensor (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc), which could be used in high throughput screening to detect new molecules that activate Kir3 channels with high efficacy.