L'activité électrique des neurones dépend de la l’expression et de l'activité des canaux ioniques, dont le canal de fuite de sodique récemment décrit, appelé NALCN. Dans les neurones, NALCN est un canal activé par un récepteur couplé aux protéines G qui conduit un courant de fuite de sodium résistant à la TTX et résistant à Cs + et contribue à la mise en place du potentiel de la membrane du repos. Chez l'homme, des mutations récessives et dominantes de NALCN ont récemment été décrites dans des troubles neurologiques complexes tels que la Dystrophie Neuroaxonale Infantile (syndrome INAD) et l'Arthrogryposis Distal de Type 2A (syndrome CLIFHADD). Ces troubles partagent des symptômes communs tels que l'ataxie, les crises épileptiques, l'hypotonie, le retard cognitif et le retard de développement. Les conséquences fonctionnelles de ces mutations NALCN ne sont toutefois pas connues principalement en raison de l'absence d'un modèle cellulaire reproductible pour réaliser une analyse électrophysiologique du courant NALCN. Dans la présente étude, nous décrivons les propriétés des canaux NALCN recombinants dans la lignée cellulaire neuronale, NG108-15. Ces cellules, qui expriment les sous-unités auxiliaires UNC79 et UNC80 de NALCN, ont été transfectées avec des constructions encodant NALCN (type sauvage ou mutants) et sa sous-unité NLF-1. Après la transfection du NALCN de type sauvage, les enregistrements par la technique de patch-clamp ont révélé la présence d'un courant de fuite entrant dans des cellules différenciées. A noter que la transfection des mutants CLIFHADD a entraîné l'expression d'un courant de fuite de sodium significativement plus élevé, comparé aux cellules exprimant des canaux NALCN de type sauvage. Au contraire, aucun courant de ce genre n'a été observé dans les cellules exprimant le mutant INAD. Ces résultats confirment fortement l'hypothèse selon laquelle les mutations dominantes CLIFHADD est un gain de fonction, alors que l'INAD est une mutation de perte de fonction. En conclusion, nos données démontrent que la lignée cellulaire NG108-15 est un modèle cellulaire fiable pour étudier l'activité électrophysiologique des canaux NALCN de type sauvage et mutant. / Electrical activity of neurons is critically dependent on the presence and activity of ion channels, including the recently described “sodium-leak channel” named NALCN. In neurons, NALCN is a G protein-coupled receptor-activated channel that conducts a TTX-resistant and Cs+-resistant sodium-leak current and contributes to setting-up the resting’s membrane potential. In humans, both recessive and dominant mutations of NALCN were recently described in complex neurological disorders such as Infantile Neuroaxonal Dystrophy (INAD) and Type 2A Distal Arthrogryposis (CLIFHADD). These disorders share common symptoms such as ataxia, epileptic seizures, hypotonia, cognitive delay and developmental retardation. The functional consequences of these NALCN mutations are however not known mainly because of the lack of a reliable cellular model to achieve electrophysiological analysis of the NALCN current. In the present study, we describe the properties of recombinant NALCN channels in the neuronal cell line, NG108-15. These cells, which express the NALCN’s ancillary subunits Unc79 and Unc80, were transfected with constructs encoding NALCN (wild-type or mutants) and its NLF-1 subunit. Following transfection of the wild-type NALCN, patch-clamp recordings revealed the presence of an inward background current in differentiated cells. Importantly, transfection of the CLIFHADD mutants resulted in the expression of a significantly larger sodium-leak current, compared to cells expressing wild-type NALCN channels. On the contrary, no such current was observed in cells expressing the INAD mutant. These results strongly support the hypothesis that CLIFHADD are gain-of-function, while INAD are loss-of-function mutations. Altogether, our data demonstrate that the NG108-15 cell line is a reliable cellular model to study electrophysiological activity of wild-type and mutant NALCN channels

Le paludisme est responsable de plus de 438 000 morts en 2015. L’apparition et la propagation de P. falciparum résistants à l’artémisinine, l’antipaludique le plus puissant, est un problème majeur en Asie du Sud-Est. Un besoin impérieux de nouveaux médicaments présentant une action rapide et conservée vis-à-vis de ces parasites résistants se fait sentir pour remplacer l’artémisinine. Cette thèse porte sur le développement d’une nouvelle série chimique inspirée d’un biflavonoïde naturel, la lanaroflavone. Le composé tête-de-série MR27770 présente des propriétés intéressantes : il agit de façon plus rapide que l’artémisinine tout au long du cycle érythrocytaire du parasite, ses propriétés pharmacocinétiques sont prometteuses et il est partiellement actif chez la souris impaludée. De plus, il ne présente pas de résistances croisées avec l’artémisinine ou les autres antipaludiques. Son mécanisme d’action n’est pas connu mais pourrait impliquer un stress osmotique. Ce composé prometteur présente néanmoins une activité moyenne in vitro ce qui a motivé l’étude topologique de sa structure et mené à des dérivés optimisés. / Malaria was responsible for 438.000 deaths in 2015. The increasing proportion of P. falciparum parasites resistant to artemisinin, the most potent antimalarial, is a major concern in Southeast Asia. Fast acting drugs with unaltered activity versus the current multi-drug resistant strains are urgently needed to replace artemisinin. This thesis deals with a new antimalarial series based on the structure of an active natural biflavonoid called lanaroflavone. The lead compound, MR27770, displays interesting properties: it acts throughout the blood cycle faster than artemisinin, its pharmacokinetic properties are promising, and it exhibits a partial in vivo antimalarial activity. Plus, it has no cross-resistance with artemisinin or other antimalarials. Its mode of action is unknown and could imply an osmotic stress. This promising compound has however a mild in vitro activity which motivated the topological study of its structure and led to optimized derivatives.

La mesure d’interaction entre une molécule candidate et sa cible biologique est d’un intérêt majeur dans la recherche de nouveaux composés thérapeutiques. A l’heure actuelle, le marquage radioactif est la méthode de référence pour ce type d’étude pharmacologique, permettant une détection spécifique et extrêmement sensible de la molécule d’intérêt dans des matrices biologiques complexes. Cependant l’utilisation de la radioactivité présente de nombreux inconvénients, principalement en termes de sécurité pour les utilisateurs et problématiques environnementales induites par le stockage de déchets radioactifs. Au regard de ces limitations, des technologies alternatives ont été développées principalement basées sur une détection de fluorescence. Toutefois, l’incorporation de groupements encombrants tels que les fluorophores peut potentiellement perturber les propriétés physico-chimiques de la molécule et ainsi altérer son affinité envers le récepteur, ce qui limite l’application de ce type de stratégie pour les ligands de faible poids moléculaire. Dans ce contexte, nous souhaitons développer une méthodologie alternative pour quantifier les interactions récepteur-ligands. La spectrométrie de masse présente de remarquables capacités en termes de sensibilité et de spécificité d’analyse. Parmi les technologies existantes, l’ICP-MS est une technique extrêmement sensible permettant la quantification absolue d’hétéroéléments indépendamment de la matrice dans laquelle se trouve l’échantillon. Cette technique associée à un marquage approprié de la molécule d’intérêt a donc été évaluée. Le sélénium a été sélectionné comme un bon compromis entre la réponse obtenue en ICP-MS et la possibilité d’introduire ce marqueur au sein de la molécule d’intérêt selon des protocoles de chimie conventionnelle, sans perturbation de l’affinité pour le récepteur. La preuve de concept a été illustrée sur le récepteur à la vasopressine V1A impliquant des ligands de nature peptidique. Différentes stratégies ont été appliquées pour la conception de ligands marqués au sélénium basées sur la substitution d’acides aminés par leurs analogues séléniés (ex : remplacement de la cystéine (Cys) par la sélénocystéine (Sec) et de la proline (Pro) par la sélénazolidine (Sez)) ainsi que la dérivatisation en position N-terminale du peptide avec une petite molécule organique. La méthodologie analytique par ICP-MS a été développée de manière à obtenir une mesure du sélénium à la fois sensible et fiable. La forte proportion de sels inorganiques contenus dans la matrice pharmacologique a nécessité le recours à une séparation chromatographique et à une cellule de collision en amont de la détection par ICP-MS. Le protocole pharmacologique a également été adapté aux exigences analytiques. Ces modifications ont notamment porté sur la récupération de l’échantillon pour procéder à son injection ainsi que sur la quantité de cellules utilisées. La robustesse des expériences pharmacologiques ainsi conçues a été évaluée par la mesure de la constante d’affinité (Ki) de ligands caractéristiques du récepteur V1A présentant des affinités élevées et faibles pour ce dernier. Les résultats obtenus ont présenté une très bonne corrélation avec les valeurs de référence indiquées dans la littérature, permettant ainsi de valider la preuve de concept de cette méthodologie et de proposer une alternative viable au marquage radioactif. / Measuring interactions between a drug candidate and its specific target constitutes a parameter of upmost importance in drug discovery process. Because of its robustness and very high sensitivity, radio-isotopic labeling represents up to now the reference method for these pharmacological studies. However, the use of radioactivity confers several constraints about security, health hazards and environmental issues involved by radioactive waste storage. Regarding such limitations, non-radioactive technologies have been developed principally based on fluorescence detection. But the cost of such assay as well as the fact that incorporation of a bulky fluorescent block can affect the affinity for small ligand limit their use. In this context, we aim to develop a new methodology to quantify receptor-ligands interactions. Mass spectrometry (MS) presents very interesting features in terms of detection sensitivity and specificity, making this technique a challenging analytical tool to replace radioactivity and fluorescence measurements commonly used in pharmacology. Among all MS technologies, the capacity of inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) to provide metallic and hetero elements absolute quantification, whatever the nature of the sample medium, prompted us to investigate this technique in combination with an appropriate labeling of the molecule of interest. Selenium was selected as a good compromise between ICP-MS response and chemical tagging ability through the creation of covalent bonds using conventional organic sulfur chemistry without disturbance of the affinity toward targeted receptor. Proof of concept was illustrated on the vasopressin receptor (V1A), a GPCR involved in vasoconstriction and emotional behavior and implying peptide as native ligand. Different strategies were applied to design selenium labeled peptides relying in either conventional amino acid substitution by corresponding selenium containing residue into peptide sequence such as cysteine (Cys) replacement by selenocysteine (Sec) as well as proline (Pro) by selenazolidine (Sez), or N-terminal peptide derivatization with a selenium containing small organic entity. ICP-MS analytical methodology was carefully investigated to provide sensitive and reliable selenium signal measurement. High inorganic salts contents of pharmacological buffer along with polyatomic interferences from plasma interfering selenium detection necessitate chromatographic separation and collision reaction cell equipment before ICP-MS detection. The pharmacological protocol was also adapted to the analytical requirements, in particular quantity of cells and sample handling. Robustness of the designed competitive binding assay was evaluated through the affinity constant (Ki) measurement of several known V1A-R ligands exhibiting either high or poor affinity for the receptor. Experimental values were strongly correlated to literature data, enabling to validate the proof of concept of such methodology and to propose a suitable alternative to radioactive labeling.

La dilution isotopique, SID pour « Stable Isotope Dilution », est une méthode largement utilisée pour la quantification de peptides et protéines en spectrométrie de masse, généralement associée aux techniques d’ionisation ambiante. Les travaux de cette thèse sont donc consacrés à l’application de la méthodologie de la dilution isotopique (SID) en spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) pour la mesure d’interaction récepteur/ligand en pharmacologie. En effet, un nombre important de pathologies mettent en jeu des récepteurs membranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en interaction avec différents ligands, souvent peptidiques. En particulier, le récepteur V1A est impliqué dans l’activité vasoconstrictrice de l’hormone peptidique AVP (Arginine VasoPressine) et la contraction de cellules musculaires ainsi que dans certains comportements sociaux. Ce récepteur a été choisi comme modèle d’étude nécessitant le marquage par voie chimique du ligand Homo-HO-LVA (pour « Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist »), sélectionné pour sa forte affinité envers le récepteur V1A afin d’introduire l’entité permettant le dosage en SID/MALDI. Cette méthodologie est mise en œuvre via la génération d’une liaison covalente de la matrice HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid), couramment utilisée pour l’analyse peptidique pour obtenir le peptide modifié (JMV4854) par acylation en position N-terminale. Le but est alors de tirer profit de l’utilisation conjointe de ce marquage et de la matrice neutre HCCE (4-hydroxy-α-cyanocinnamate de méthyle) pour la détection spécifique et sensible de composés jusqu’à des concentrations picomolaires. L’étape stratégique de quantification par dilution isotopique nécessite un étalonnage et une validation statistique avant de pouvoir passer à l’application pharmacologique. Celle-ci consiste à mesurer l’affinité du JMV4854 pour le récepteur V1A par des expériences thermodynamiques de mesure de constantes de dissociation (Kd) afin de déterminer par la suite des constantes de dissociation de molécules non marquées via des expériences de compétition. Un second modèle de récepteur, le CCKB-R (cholecystokinine B receptor), a ensuite été étudié pour valider la méthodologie de quantification. Devant le regain d’intérêt des laboratoires pharmaceutiques pour les expériences cinétiques de mesure de constantes de dissociation, il serait intéressant d’y appliquer cette méthodologie. Celle-ci présente un potentiel intéressant en tant qu’alternative aux méthodologies actuellement incontournables que sont la radioactivité et la fluorescence. Un second d’axe d’étude a été initié avec un marquage conçu pour diriger la fragmentation de peptides pour des mesures en spectrométrie de masse en tandem par ionisation Electrospray (ESI-MS/MS). Des modifications par introduction en position N-terminale des peptides d’une charge fixe ont été envisagées. Des études préliminaires (synthèse d’ions préformés par incorporation d’une entité pyridinium) ont montré un comportement prometteur en fragmentation ouvrant de nouvelles perspectives de quantification. / The SID methodology, for Stable Isotope Dilution, is a widely applied methodology for peptides and proteins analysis in mass spectrometry, usually associated with atmospheric pressure ionisation techniques. This thesis is consequently devoted to the application of SID methodology in matrix assisted laser desorption/ionisation (MALDI) mass spectrometry to quantify receptor/ligand interaction in pharmacology. Indeed, a great number of pathologies involve membrane receptors like G protein coupled receptors (GPCR) in interaction with several ligands, frequently peptides. Particularly, the V1A receptor, is related to vasoconstriction activity of the peptide hormone AVP (arginine vasopressine) and contraction of muscular cells as well as many social behaviors. This receptor was chosen as model, requiring the chemical labelling of the ligand Homo-HO-LVA (Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist), selected for its high affinity towards the V1A receptor in order to introduce the entity on which relies the quantification in SID/MALDI. This methodology is applied through the covalent binding of HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid) matrix, usually encountered in peptide analysis, to obtain the modified peptide (JMV4854) through N-terminal acylation. The objective is to take advantage of the use of both HCCA tagging and HCCE (4-hydroxy-α-cinnamic methyl ester) matrix for the specific and sensitive detection of compounds down to picomolar concentrations. Importantly, quantification with SID requires a calibration protocol and a statistical validation before pharmacological assays. This consists in the measurement of JMV4854 affinity towards V1A-R through thermodynamic experiments in order to quantify the dissociation constant (Kd) and determine afterwards constants for untagged molecules by competitive binding assays. Furthermore, a second receptor model, CCKB-R (cholecystokinine B receptor), was then studied to validate the quantification methodology. Facing the renewed interest in pharmaceutic industry of kinetic experiments for dissociation constant measurement, it would be interesting to apply this new methodology to drug discovery, representing a relevant alternative to current “gold-standard” methodologies such as radioactivity and fluorescence. A second field of research has been initiated with a covalent labelling designed to enhance peptide fragmentation for electrospray-based (ESI-MS/MS) tandem mass spectrometry measurements. Preliminary studies with the synthesis of pre-formed ions like N-terminal substitution with pyridinium entities gave very promising results opening the way of other quantification strategies.

Les récepteurs métabotropes du glutamate (mGluR) sont des récepteurs couplés aux protéines G qui régulent la transmission synaptique. Ce sont des cibles de choix pour le traitement de maladies neurologiques et psychiatriques telles que la maladie de Parkinson et la schizophrénie.J'ai développé une stratégie d'étude de l'assemblage multimérique des protéines membranaires dans des cellules vivantes, à l'aide de techniques de marquage orthogonal et de FRET en temps-résolu. De façon inattendue, j'ai montré que certaines sous-unités de mGluR, en plus de former des récepteurs homodimériques, peuvent former des récepteurs hétérodimériques fonctionnels. D'autre part, j'ai appliqué ces techniques à l'étude du mécanisme d'activation des mGluR et de leur régulation allostérique. J'ai démontré qu'un mouvement relatif des domaines extracellulaires au sein du dimère était responsable de l'action du glutamate.Ce travail a permis de mieux comprendre le fonctionnement des mGluR, et permet la conception de nouveaux tests de criblage. / Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are G protein-coupled receptors that regulate synaptic transmission. They are relevant therapeutic targets for neurological and psychiatric disorders, such as Parkinson disease and schizophrenia.I developed a strategy to study the multimeric assembly of membrane proteins in living cells, through a combination of orthogonal labeling and time-resolved FRET. Unexpectedly, some subunits of mGluRs, in addition to forming homodimeric receptors, were found capable of forming functional heterodimeric receptors. Then, I applied these techniques to study the activation mechanism of mGluRs and their allosteric regulation. I demonstrated that a conformational change of the dimeric extracellular domain is responsible for the action of glutamate.In addition to increase our understandings of how mGluRs function, this work opens new avenues for the design of drug screening tests.

L'hypercholestérolémie familiale autosomique dominante (ADH) est un trouble génétique caractérisé par des taux élevés de lipoprotéine de basse densité (LDL) plasmatique. Un niveau élevé de LDL plasmatique est connu pour contribuer au développement de l’athérosclérose, une cause majeure des crises cardiaques et des accidents vasculaires cérébraux. Le récepteur des LDL (LDLR) est la principale voie d’élimination des particules de LDL. En revanche, la proprotéine convertase subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une glycoprotéine sécrétée par le foie, se lie au LDLR et augmente sa dégradation dans les lysosomes, ce qui entraîne une augmentation de LDL plasmatique et un risque plus élevé de maladie cardiovasculaire. En outre, des mutations de-perte-de fonction de PCSK9 peuvent considérablement réduire les niveaux de LDL plasmatiques et réduire le risque de maladie coronarienne jusqu'à ~ 88%. Toutes ces découvertes ont fait de PCSK9 une cible importante pour le traitement de l'hypercholestérolémie. Des anomalies génétiques du LDLR, de PCSK9 ou de l’apolipoprotéine B (apoB), le ligand du LDLR, peuvent provoquer l'ADH, mais dans certaines familles ADH il n'a pas été possible d'identifier de mutation de ces gènes, suggérant que d'autres anomalies génétiques pourraient également être impliquées dans la maladie. Dans la présente thèse, qui repose sur deux études (articles), nous avons étudié les protéines d’interaction de PCSK9 (premier article, chapitre 2) et l'effet de PCSK9 sur l'athérosclérose (deuxième article, chapitre 3). Dans notre première étude, l'analyse par spectrométrie de masse des protéines interagissant avec PCSK9 a révélé que la Golgi glycoprotéine 1 (GLG1) est une nouvelle protéine d’interaction de PCSK9. Leur co-immunoprécipitation révélée par immunobuvardage et leur co-localisation par microscopie confocale par immunofluorescence ont confirmé que GLG1 est un partenaire de PCSK9. De plus, nos résultats ont montré que GLG1 interagit aussi avec le LDLR et l'apoB. En utilisant un modèle murin, nous avons montré des taux sanguins plus faibles de PCSK9, de cholestérol et de triglycérides chez les souris knockdown GLG1. De plus, le déficit en GLG1 a réduit l'activité de la protéine de transfert des triglycérides microsomales (MTP) et induit l'agrégation périnucléaire de l'apoB, réduisant ainsi la sécrétion d'apoB. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d'athérosclérose chez la souris pour étudier l'effet de l'absence de PCSK9 sur les plaques d’athérosclérose. Nous avons montré que la surexpression d'un mutant gain-de-fonction de PCSK9 dans le foie de souris a accéléré le développement de plaques d'athérosclérose dans la racine aortique et que celles-ci ont ensuite été réduites en induisant la régulation négative de PCSK9 en utilisant le système Tet-on. En conclusion, nous avons contribué à l'identification d'une nouvelle protéine interagissant avec PCSK9, GLG1, qui régule le taux plasmatique de cholestérol et représente une cible potentielle pour le traitement de l'hypercholestérolémie. Nous avons également démontré que la modulation du gène PCSK9 régule directement le niveau de plaques d'athérosclérose dans la racine de l'aorte. Ces études aideront à développer des thérapies efficaces pour réduire l'hypercholestérolémie et le risque de maladie cardiovasculaire / Autosomal dominant hypercholesterolemia (ADH) is a genetic disorder characterized by high plasma low-density lipoprotein (LDL) cholesterol levels. Elevated plasma LDL level is known to contribute to the development of atherosclerosis, a leading cause of heart attack and stroke. Liver LDL receptor (LDLR) acts as a primary pathway for endocytosis and clearance of LDL particles. In contrast, PCSK9, a liver-secreted glycoprotein, binds to LDLR and enhances its lysosomal degradation, resulting in increased plasma LDL concentrations and a higher risk of cardiovascular disease. Genetic defects in LDLR, PCSK9, and apolipoprotein B (apoB), the ligand of LDLR, can cause ADH, but in some ADH-families no mutations can be found in these genes, suggesting that other gene defects may also be involved in ADH. Furthermore, loss-of-function mutations in PCSK9 can greatly reduce plasma LDL levels and lower risk of coronary heart disease by up to ~88%. All these findings have made PCSK9 an attractive target for the treatment of hypercholesterolemia. In the present thesis, which is based on two studies (articles), we investigated protein interactors of PCSK9 (first article, chapter 2) and the effect of PCSK9 on atherosclerosis (Second article, chapter 3). In our first study, mass spectrometry analysis of PCSK9 interacting proteins revealed that Golgi glycoprotein 1 (GLG1) is a novel PCSK9 interactor. Co-immunoprecipitation, Western blotting, and colocalization by confocal immunofluorescence microscopy confirmed that GLG1 is an endogenous PCSK9 binding partner. We also demonstrated that LDLR and apoB interact with GLG1. Using a mouse model, we found lower levels of circulating PCSK9, cholesterol, and triglycerides in Glg1 knockdown mice. Moreover, GLG1 deficiency reduced microsomal triglyceride transfer protein (MTP) activity and induced perinuclear aggregation of apoB, thereby, reducing apoB secretion. In our second study, we developed a mouse model of atherosclerosis to investigate the effect of PCSK9 modulation on the regression of atherosclerotic plaques. We showed that overexpression of a PCSK9 gain-of-function in mouse liver accelerated the development of atherosclerotic lesions in the aortic root, which were then reduced by inducing PCSK9 downregulation using a Tet-on system. In conclusion, we have contributed to the identification of a novel PCSK9 interacting protein, GLG1, which regulates plasma level of cholesterol and represents a potential target for hypercholesterolemia treatment. We also demonstrated that PCSK9 gene modulation directly regulates the level of atherosclerotic plaques in the aortic root. We showed in our study that the wild-type mice, overexpressing PCSK9-D377Y in an inducible manner, is a useful mouse model for understanding the molecular role of PCSK9 on atherosclerotic plaques development. These studies will help to develop effective therapies to reduce hypercholesterolemia and the risk of cardiovascular disease.

Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude des récepteurs CXCR4 et ACKR3, deux récepteurs aux chimiokines. Ceux-ci jouent des rôles majeurs dans différentes fonctions physiologiques notamment le chimiotactisme des cellules immunitaires. Le dérèglement de leur activité est souvent associé à différents pathologies, notamment des cancers. Outre le fait que ces récepteurs lient tous les deux la même chimiokine, CXCL12, il a été montré qu’ils étaient capables d’exercer l’un sur l’autre des régulations croisées. Les mécanismes sous-tendant celles-ci sont très mal connus. Ils pourraient être liés à une compétition entre les récepteurs pour lier le même ligand CXCL12 ou à des régulations au niveau des voies de signalisation activées lors de la liaison d’une chimiokine. Ces régulations croisées pourraient également résulter de la formation de complexes de récepteurs appelés oligomères, complexes qui disposeraient de propriétés pharmacologiques particulières. De tels complexes ont été décrits dès les années 1990 dans des systèmes d’expression hétérologues mais leur existence et leurs rôles dans des systèmes natifs reste très largement débattus. Une des raisons est la difficulté à élaborer des outils moléculaires permettant l’étude de ces oligomères dans les tissus natifs.Le premier objectif de ma thèse a été l’élaboration d’outils permettant d’étudier l’existence de ces oligomères dans les systèmes natifs. En collaboration avec des laboratoires d’Amsterdam, j’ai développé des nanobodies fluorescents, petits anticorps produits par le lama, afin de marquer spécifiquement les récepteurs endogènes exprimés à la surface des cellules. Pour rendre fluorescent ces nanobodies, nous avons utilisé une technique originale permettant de greffer un fluorophore sur l’extrémité C-terminale de la molécule. Ces nanobodies conservent des propriétés pharmacologiques remarquables puisqu’ils conservent de hautes affinité et spécificité pour leur cible. J’ai ainsi pu utiliser ces molécules et démontrer l’existence des oligomères CXCR4 dans des lignées cellulaires exprimant de façon endogène le récepteur CXCR4. Des analyses similaires sont en cours sur le récepteur ACKR3.Le second objectif de ma thèse a été de définir les rôles potentiels de ces oligomères. J’ai pu montrer que les hétéro-oligomères CXCR4 /ACKR3, complexes associant les deux types de récepteurs, possèdent des propriétés de liaison particulière. Ceux-ci semblent ne lier la chimiokine CXCL12 que sur le récepteur ACKR3 au sein du complexe. Cette asymétrie de liaison est très étonnante car le récepteur CXCR4 est capable de lier CXCL12 avec une cinétique bien supérieure à celle de ACKR3 pour ce même ligand. J’ai étudié les conséquences d’une telle asymétrie de liaison sur les propriétés de signalisation de ces récepteurs. Une analyse des différentes voies de couplage activées lors de la liaison de CXCL12 a été réalisée sur les récepteurs exprimés de façon isolée ou co-exprimés au sein d’une même cellule. Les résultats ne montrent pas de modifications majeures de leur propriété de couplage.Nous avons par ailleurs analysé la capacité de ces récepteurs à internaliser en absence ou en présence de ligand CXCL12. J’ai pu observer que les hétéro-oligomères CXCR4 / ACKR3 restaient vraisemblablement bloquer à la surface des cellules.Ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes dans la mesure où elles constituent la première démonstration de l’existence d’oligomères CXCR4 dans des systèmes natifs.Par ailleurs l’observation d’une régulation différente de l’internalisation des hétéro-oligomères constitue une première piste conférant à ces complexes un rôle particulier dans les régulations croisées de l’activité que ces récepteurs exercent l’un sur l’autre. / During my PhD, I focused on two chemokine receptors, CXCR4 and ACKR3. They have several important physiological functions, such as chemotaxis of immune cells. However, on the other hand, when their function is disturbed, they are involved in different immunological pathologies and cancer. Both receptors recognise the same chemokine, CXCL12 and many studies have reported a crosstalk between CXCR4 and ACKR3. However, the mechanisms behind this crosstalk are still poorly understood. This crosstalk can occur because both receptors are competing for CXCL12, at the level of signalling pathways or due to the formation of complexes between CXCR4 and ACKR3 receptors, called oligomers. The oligomers might have specific pharmacological properties different from the receptor monomers. Oligomeric complexes have been described since the nineties. Most of the studies on these oligomers were performed on heterologous expression systems, but still a lot of debate exists about their existence and their role in native tissues. One of the reasons behind this controversy is that studying oligomers in a native context is complicated, especially because we often lack the molecular tools for these studies.The first objective of my PhD was to generate efficient tools to study the existence of CXCR4 and ACKR3 oligomers in native systems. In collaboration with laboratories from Amsterdam and Ghent, we have developed fluorescent nanobodies, small antibodies produced by llamas. These specific tools allow the detection of receptors endogenously expressed at the cell surface. In order to fluorescently label these nanobodies, we have used an original strategy that can specifically attach the fluorophore to the C-terminus of the nanobody. Interestingly, the fluorescent nanobodies retain high affinity and specificity for their target. With these nanobodies, I have demonstrated the existence of CXCR4 oligomers in cell lines that endogenously express CXCR4. We are currently investigating the existence of ACKR3 oligomers.The second objective of my PhD consists of defining the functional roles of these oligomers. I have shown that CXCR4/ACKR3 hetero-oligomers have specific binding characteristics. It seems that CXCL12 is binding only to ACKR3 within this hetero-oligomer and that ACKR3 impairs the CXCL12 binding to CXCR4 within the hetero-oligomer. This is interesting, since we also have demonstrated that CXCL12 is binding much faster on CXCR4 than on ACKR3.In addition, I have studied the consequences of this negative cooperativity within the CXCR4/ACKR3 hetero-oligomer on different signalling pathways. We have compared conditions where the receptor was expressed alone or when receptors were co-expressed. No major modifications have been found on their signalling properties. However, when investigating the internalisation of CXCR4 and ACKR3, it seems that CXCR4/ACKR3 hetero-oligomers remain blocked on the cellular surface.This opens interesting perspectives, since it is the first time CXCR4 oligomers have been detected at an endogenous level. Moreover, the observation of a different internalisation pattern of the hetero-oligomer is a first step to further investigate the specific roles of these oligomers in the crosstalk between the receptors.

Les canaux ioniques sont exprimés dans tous les types cellulaires, des plantes à l’Homme, où ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques. Parmi ces canaux, les canaux potassiques à deux domaines pore ou K2P forment des dimères qui produisent des courants de fond, contrôlant le potentiel de repos de la membrane et ainsi l’excitabilité cellulaire. De ce fait, ils jouent un rôle dans de nombreuses fonctions physiologiques et pathophysiologiques telles que la respiration, la nociception ou la dépression et sont de plus en plus considérés comme des cibles thérapeutiques intéressantes pour le traitement de ces pathologies. La structure de ces canaux est une caractéristique importante à considérer pour le développement de nouveaux médicaments mais les mécanismes et les régulations qui contrôlent leur activité sont peu connus.Durant mon doctorat, nous avons démontré que les canaux K2P, en particulier les sous-familles THIK et TREK, peuvent s’assembler avec un autre canal de la même sous-famille pour former un hétérodimère fonctionnel. Nous avons tout d’abord prouvé que les canaux interagissent physiquement en combinant biochimie, immunocytochimie, FRET ainsi que l’électrophysiologie. De manière intéressante, les hétérodimères ont des conductances, des régulations et une sensibilité aux agents pharmacologiques différentes de celles des canaux homodimères.Ces études montrent que la famille des canaux K2P est plus étendue et diversifiée que ce qu’il avait été attendu. La combinaison de ces canaux au sein de la même sous-famille permet de créer de nouveaux canaux fonctionnels aux propriétés originales et donc de nouvelles cibles thérapeutiques / Potassium channels are highly conserved among organisms, from plants to humans, where they are involved in several functions. Among them, the two pore domain potassium channels or K2P channels are dimers that produce background channels to control membrane resting potential and thus cell excitability. They are involved in physiological functions and diseases such as breathing, nociception or depression. They are now more and more considered as important therapeutic targets for the development of new drugs targeting these diseases. Structure-function relationship of ion channels is an important feature for the drug design but we only know little about mechanisms and regulations that control the activity of K2P channels.During my PhD, we showed that K2P channels and particularly subunits of THIK and TREK subfamilies channels can also form functional heterodimers with other subunits of the same subfamily. We first proved that subunits physically interact combining biochemistry, immunocytochemistry, FRET and electrophysiology. Interestingly, heterodimers display specific conductances, regulations and pharmacology compared to homodimers.These studies showed that the diversity and number of K2P channel conductances are larger than expected. In conclusion, mixing among subunits from the same subfamily form new channels with unique properties and so new therapeutic targets

La mambaquarétine-1 (MQ-1), une toxine du mamba vert, est le tout premier peptide Kunitz à bloquer sélectivement l’activité du récepteur de type 2 à la vasopressine (V2R). Celui-ci contrôle la concentration finale des urines dans le rein. Impliqué dans plusieurs pathologies, son inhibition est actuellement considérée comme la meilleure stratégie thérapeutique dans le traitement de la polykystose rénale, une maladie génétique héréditaire. L’étude pharmacodynamique de MQ-1 sur des rats sains a confirmé son activité in vivo qui se traduit par un effet aquarétique dépendant de la dose. L’effet maximum est atteint 2 heures après injection intrapéritonéale et disparait avec un temps de demi-vie biologique variant de 1 à 4 heures selon la dose. L’administration quotidienne d’une faible dose a montré une accumulation de l’effet les trois premiers jours, avant un plateau, suggérant une activité résiduelle au-delà de 24 heures. Le criblage des trois autres venins de mambas ainsi qu’une analyse comparée des séquences peptidiques les plus proches dans les bases de données ont révélé l’existence d’un groupe phylogénétique de onze toxines Kunitz antagonistes de V2R. Une approche innovante, combinant tests de liaison de variants de MQ-1 et modélisation du complexe MQ-1-V2R, a permis de décrypter une partie du pharmacophore de la toxine. Les deux partenaires partagent une importante complémentarité ionique impliquant plusieurs boucles extracellulaires du récepteur, et une région hydrophobe de MQ-1 interagit au cœur de V2R à proximité de son site orthostérique supposé. Enfin, une première collaboration avec une industrie pharmaceutique a mis en évidence les points critiques à approfondir pour aboutir au développement thérapeutique de MQ-1. / Mambaquaretin-1 (MQ-1), a green mamba toxin, is the very first Kunitz peptide to selectively hinder the vasopressin type 2 receptor (V2R) activation. This receptor controls the final concentration of urine in kidneys. Involved in a number of pathologies, its inhibition is currently considered as the best therapeutic strategy in the treatment of polycystic kidney disease, a hereditary genetic disease. Pharmacodynamic study of MQ-1 carried out on healthy rats confirmed its in vivo activity which consists in inducing a dose-dependent aquaretic effect. Maximum effect is reached 2 hours after an intraperitoneal injection and disappears in a biological half-life ranging from 1 to 4 hours according to the dose. The daily injection of small quantities pointed to a cumulative effect over the first three days, leading to a plateau, which suggests a residual activity exceeding 24 hours. The screening of the three other mamba venoms along with a comparative analysis of the closest peptide sequences reported in databases revealed the existence of a phylogenetic group of eleven V2R antagonist Kunitz toxins. An innovative approach combining binding assays on MQ-1 variants and the modelling of the MQ-1-V2R complex has led to a partial deciphering of the pharmacophore of the toxin. The two partners share a significant ionic complementarity involving a number of extracellular loops of the receptor, and a hydrophobic region of MQ-1 interacts within V2R in the vicinity of its supposed orthosteric site. Lastly, a collaboration initiated with a pharmaceutical company brought out the need for the closer scrutiny of some crucial points to succeed in a therapeutic development of MQ-1.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished