La dopamine (DA) est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de fonctions essentielles du cerveau telles que le contrôle des mouvements volontaires, le système de récompense et certains aspects de la cognition. Depuis sa découverte, la DA a attiré énormément d'attention scientifique en partie à cause des pathologies majeures associées aux dysfonctions du système DAergique, comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie. On retrouve la majorité des neurones qui synthétisent la DA au niveau du mésencéphale ventral, dans les noyaux de la substance noire compacte (SNc) et de l'aire tegmentaire ventrale (ATV). Ces neurones projettent leurs axones dans un très dense réseau de fibres qui s'organisent en trois voies DAergiques classiques: la voie nigrostriée, la voie mésolimbique et la voie mésocorticale. La transmission DAergique s'effectue par l'activation de récepteurs de la DA qui font partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Les récepteurs de la DA sont abondamment exprimés aussi bien par les neurones DAergiques que par les neurones des régions cibles, ce qui implique que la compréhension de la signalisation et des fonctions particulières des récepteurs de la DA pré- et postsynaptiques représente un enjeu crucial dans l'étude du système DAergique. Cette thèse de doctorat se sépare donc en deux volets distincts: le premier s'intéresse à la régulation du récepteur D2 présynaptique par la neurotensine (NT), un neuropeptide intimement lié à la modulation du système DAergique; le deuxième s'intéresse au côté postsynaptique du système DAergique, plus particulièrement à la ségrégation de l'expression des récepteurs de la DA dans le striatum et aux fonctions de ces récepteurs dans l'établissement des circuits neuronaux excitateurs prenant place dans cette région. Dans la première partie de cette thèse, nous démontrons que l'activation du récepteur à haute affinité de la NT, le NTR1, provoque une internalisation hétérologue du récepteur D2, avec une amplitude et une cinétique différente selon l'isoforme D2 observé. Cette internalisation hétérologue dépend de la protéine kinase C (PKC), et nous montrons que la surexpression d'un récepteur D2 muté sur des sites de phosphorylation par la PKC ii ainsi que l'inhibition de l'expression de β-arrestine1 par ARNs interférents dans des neurones DAergiques bloquent complètement l'interaction fonctionnelle entre le NTR1 et le D2. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous démontrons d'abord que la ségrégation de l'expression des récepteurs D1 et D2 dans le striatum est déjà bien établie dès le 18e jour embryonnaire, bien qu'elle progresse encore significativement aux jours 0 et 14 postnataux. Nos résultats témoignent aussi d'un maintien complet de cette ségrégation lorsque les neurones striataux sont mis en culture aussi bien en présence ou en absence de neurones corticaux et/ou mésencéphaliques. Ensuite, nous montrons que la présence de neurones mésencéphaliques stimule la formation d’épines et de synapses excitatrices sur les neurones striataux épineux exprimant le récepteur D2 (MSN-D2). Le co-phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques semble nécessaire à une grande partie de cet effet. Par ailleurs, le nombre total de terminaisons excitatrices formées sur les MSN-D2 par les neurones corticaux et mésencéphaliques apparaît être régit par un équilibre dynamique. Finalement, nous démontrons que le blocage de la signalisation des récepteurs D1 et D2 de la DA n'est pas nécessaire pour la formation des synapses excitatrices des MSN-D2, alors que l'antagonisme des récepteurs glutamatergiques ionotropes diminue la densité d'épines dendritiques et contrôle de façon opposée le nombre de terminaisons excitatrices corticales et mésencéphaliques. Globalement, ce travail représente une contribution significative pour une meilleure compréhension du fonctionnement normal du système DAergique. Ces découvertes sont susceptibles d’être utiles pour mieux comprendre les dysfonctions de ce système dans le cadre de pathologies du cerveau comme la maladie de Parkinson. / Dopamine (DA) is a neurotransmitter involved in the modulation of essential brain functions such as control of voluntary movements, the reward system and certain aspects of cognition. Since its discovery, DA has attracted a lot of attention, in part because of the severe pathologies associated with dysfunctions in the DAergic system such as Parkinson's disease, schizophrenia and substance abuse. In the brain, the majority of DAergic neurons are found in the substantia nigra pars compacta (SNc) and the ventral tegmental area (VTA), two nuclei of the ventral mesencephalon. These neurons project theirs axons in a dense network of DAergic fibers that form three major pathways: the nigrostriatal, mesolimbic and mesocortical pathways. DAergic transmission is accomplished by the activation of DAergic receptors that are part of the G protein-coupled receptor family. These receptors are abundantly expressed by DAergic target neurons and DAergic neurons themselves, which implicates that the comprehension of DAergic signaling and specific receptor function pre- and postsynaptically is a crucial aspect in the study of DA. This thesis is thus divided into two distinct parts: the first part addresses the regulation of presynaptic D2 receptor function by neurotensin, a neuropeptide intimately associated with the modulation of the DAergic system; the second part addresses the postsynaptic influences of DA, looking specifically at the segregation of DAergic receptor expression in the developing striatum and the function of these receptors in the establishment of neuronal excitatory connections in this region. In the first part of this thesis, we demonstrate that the activation of the high affinity neurotensin receptor, NTR1, induces heterologous D2 receptor internalization, with some particular differences in the amplitude and kinetics between the two D2 isoforms. This internalization is dependent on protein kinase C activity (PKC), and we demonstrate that overexpression of a D2 receptor with mutations on PKC phosphorylation sites and the knockdown of β-arrestin1 by interfering RNAs in cultured DAergic neurons completely abrogates the functional interaction between the NTR1 and the D2. iv In the second part of this thesis, we first demonstrate that D1 and D2 DAergic receptor segregation is already well established in the striatum by embryonic day 18, even if it still progresses significantly through postnatal days 0 and 14. Our results also show complete maintenance of this segregation in cultured MSNs either with or without cortical and/or mesencephalic neurons. Next, we demonstrate that the presence of mesencephalic neurons stimulates excitatory synapse formation on D2-expressing striatal medium spiny neurons (D2-MSNs). The conditional genetic deletion of the glutamatergic co-phenotype of DA neurons prevents much of this effect, and thus glutamate corelease by DA neurons seems to play an important role in excitatory synapse formation in the striatum. We also find that the establishment of excitatory terminals by cortical and mesencephalic neurons is regulated by a dynamic equilibrium. Finally, we show that chronic DA receptor blockade is not required for D2-MSN synaptogenesis, but chronic glutamatergic receptor blockade decreases dendritic spine formation and regulates cortical and mesencephalic glutamatergic synapses in an opposite manner. Globally, this work represents a significant contribution to a better understanding of the normal functioning of the DAergic system. These discoveries could prove useful to better understand the dysfunctions of this system in the context of brain pathologies such as Parkinson’s disease.

L'exploration des propriétés santé des riz de Camargue intègre des techniques de pharmacologie in vivo et in vitro, des techniques de fractionnement précises du riz complet et un procédé d'extraction chimique permettant un isolement bio-dirigé des composés bio-actifs.Les résultats du projet de recherche sont confidentiels. / The exploration of health properties of Camargue French rice necessited (a) in vivo and in vitro pharmacological methods,(b) an accurate technology of rice fractionation and (c) the capacity to perform and characterize chemically-extracted bioactive compounds.Results of the research project are confidential.

L'unité de recherche EA4612 de l'Université Claude Bernard Lyon 1 s'intéresse à la physiopathologie des troubles du rythme cardiaque, en particulier d'origine héréditaire. Nous avons étudié des mutations de gène de canaux ioniques découvertes chez des patients hétérozygotes atteints d'un syndrome du QT long ou de bradycardie sinusale et de fibrillation atriale. La mutation R148W du gène hERG diminue le courant maximal de 29%. Dans un modèle mathématique, ceci allonge la durée du potentiel d'action ventriculaire, ce qui pourrait rendre compte du phénotype QT long des porteurs. La mutation F627L du gène hERG se situe au centre du motif de sélectivité ionique (GFG) de la protéine hERG. Elle cause une perte de la sélectivité ionique du courant, de la propriété d'inactivation et de la sensibilité aux bloqueurs spécifiques. Ainsi, la présence du groupement aromatique de la chaîne latérale semble essentielle au maintien des propriétés du canal. La mutation Q1476R du gène SCN5A provoque un gain de fonction du courant sodique persistant. Dans un modèle de cellule cardiaque ventriculaire humaine, nous montrons une surcharge sodique intracellulaire pouvant protéger de l'allongement de la durée du potentiel d'action ventriculaire. La mutation D600E du gène HCN4 accélère la désactivation, ce qui pourrait causer une bradycardie. Par ailleurs, la mutation abolit la réponse à la suppression de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) intracellulaire. La mutation V501M du gène HCN4 cause une perte totale de courant à l'état homozygote. A l'état hétérozygote, l'amplitude moyenne du courant est inchangée par rapport au WT. Cependant, un décalage négatif de la courbe d'activation rendrait compte de la bradycardie des patients porteurs / The EA4612 unit of the University Lyon 1 focuses on the pathophysiology of heart rhythm disorders, especially hereditary. We studied ion channel gene mutations discovered in heterozygote patients with long QT syndrome or sinus bradycardia and atrial fibrillation.The R148W mutation of the hERG gene decreases the maximum current by 29%. In a mathematical model, this lengthens the duration of the ventricular action potential, which could account for long QT phenotype of the patients. The F627L mutation of the hERG gene is in the center of the ion selectivity filter (GFG) of the hERG protein. It causes a loss of the ionic selectivity of the current, the inactivating property and sensitivity to specific blockers. Thus, the presence of this aromatic group of the side chain seems to be essential to the maintenance of the channel properties. The mutation Q1476R in the SCN5A gene causes a gain-of-function of the persistent sodium current. In a model of human ventricular heart cells, we show an intracellular sodium overload that can protect against the lengthening of the duration of the ventricular action potential. The D600E mutation of the HCN4 gene accelerates deactivation, which could cause bradycardia. Moreover, the mutation abolishes the response to the suppression of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The V501M mutation of the HCN4 gene causes a total loss of current in the homozygous state. In the heterozygous state, the average amplitude of the current is unchanged from the WT. However, a negative shift of the activation curve would account for bradycardia in patients

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Le placenta est l’organe central de la grossesse et son bon fonctionnement est essentiel pour mener à une grossesse à terme sans complication. L’inflammation joue un rôle très important dans les différentes étapes de la grossesse, de l’implantation à l’accouchement. Lorsque cette inflammation est débalancée au niveau du placenta, cela peut causer plusieurs altérations de ses fonctions. L’inflammation peut être induite par deux différents stimuli, soient par une intervention externe, donc infectieux (via les Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) ou de façon endogène (via les Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs). L’augmentation de l’inflammation est aussi associée avec les complications de la grossesse, qui touchent 5-12% de toutes les grossesses et qui peuvent mener à des conséquences dévastatrices sur la santé de la mère et du nouveau-né. Ces complications comprennent la prééclampsie (PE), l’accouchement prématuré (AP) et le retard de croissance intra-utérin (RCIU). Malgré que ces pathologies aient des étiologies différentes, elles partagent un facteur commun qui joue un rôle essentiel soit, l’inflammation. Dans le but de mieux comprendre le rôle et les effets de l’inflammation sur le placenta humain et dans les complications de la grossesse, nous avons évalué les effets d’un PAMP (LPS) et d’un DAMP (IL-1) classiques dans un modèle d’explants placentaires humains et nous avons réalisé une étude transcriptomique non biaisée de placentas issus de chaque pathologie. Tout d’abord, nous avons démontré que le LPS induisait une plus grande quantité de cytokines pro-inflammatoire comparativement à l’IL-1 et que l’inhibition de la voie de signalisation de l’IL-1 par son antagoniste (IL-1Ra) diminuait leur expression et leur sécrétion. De plus, le LPS induisait une augmentation de la mort cellulaire dans les explants et la prolifération des cellules de Hofbauer, macrophages placentaires. Par la suite, l’étude du transcriptome de placentas provenant de complications de la grossesse (PE, AP et RCIU) a permis de constater que les pathologies ne forment pas de groupes (clusters) basés sur l’expression globale des gènes comparativement placentas issus de grossesses sans complication qui se regroupaient majoritairement ensemble. Il a été possible d’identifier les gènes significativement différents dans chaque pathologie et l’ontologie génique de ceux-ci. Nous avons identifié 198 gènes communs à toutes les complications de la grossesse qui sont majoritairement associés à des processus inflammatoires tels que l’interaction entre les cellules lymphoïdes et non lymphoïdes, l’activation leucocytaire et la régulation de la production de cytokines. Enfin, en plus de confirmer les modulations connues de certains gènes dans chaque complication de la grossesse, nous avons été en mesure d’identifier de nouveaux gènes qui n’avaient jamais été associés avec les pathologies, tels que FUT9, SLAMF7 et TGM3. En conclusion, les travaux présentés dans cette thèse démontrent que l’inflammation induite par le LPS et l’IL-1 n’a pas les mêmes effets au niveau du placenta. L’inflammation est une composante commune aux différentes complications de la grossesse et une meilleure compréhension des processus inflammatoires modulés dans chaque pathologie pourrait permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Des travaux futurs pourraient s’intéresser au potentiel prolifératif des cellules de Hofbauer et à l’investigation des nouveaux gènes identifiés par les résultats transcriptomiques. / The placenta is the central organ of pregnancy and its adequate functioning is essential to ensure term delivery without complications. Inflammation plays a key role in every step of pregnancy, from implantation to delivery. When this inflammation is unbalanced in the placenta, it can alter its functions. Inflammation can be induced by two different stimuli, either by external intervention like an infection (with Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs), or endogenously (with Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs). Increased inflammation is also associated with pregnancy complications and they affect 5-12% of all pregnancies and can have deleterious effects on maternal and infant health. These complications include preeclampsia (PE), preterm birth (PTB) and intrauterine growth restriction (IUGR). Even if these pathologies have different etiologies, they share a common factor that plays an essential role, inflammation. In order to better understand the role and the effects of inflammation on the human placenta and in pregnancy complications, we have evaluated the effects of classical PAMP (LPS) and DAMP (IL-1) on human placental explant model and we have realized an unbiased transcriptomic study of the placentas from each pregnancy complication. First of all, we demonstrated that LPS induced a higher production of pro-inflammatory cytokines compared to IL-1 and by inhibiting the IL-1 pathway using its antagonist (IL-1Ra), we decreased their expression and their secretion. Moreover, LPS treatment induced more cell death in the explants and proliferation of Hofbauer cells, macrophages of the placenta. Thereafter, transcriptomic study of placentas from pregnancy complications (PE, PTB and IUGR) allowed us to demonstrate that the pathologies were not clustering together based on their global gene expression compared to placentas from uncomplicated pregnancies which the majority of them were clustering together. It was possible to identify genes that were significantly modulated in each pathology and their gene ontology. We identified 198 genes common to all pregnancy complications and they were mostly related to inflammatory processes like interaction between lymphoid and non-lymphoid cells, leukocyte activation and regulation of cytokine production. Finally, in addition to confirming gene modulations previously known in each pregnancy complications, we were able to identify new genes that have never been associated with the pathologies such as FUT9, SLAMF7 and TGM3. To conclude, the work presented in this thesis show that inflammation induced by LPS and IL-1 did not have the same effect on the placenta. Inflammation is a key component to pregnancy complications and a better understanding of the inflammatory processes modulated in every pathology could help the development of new therapeutic strategies. Future work could investigate the proliferative potential of the Hofbauer cells and explore the new genes identified by the transcriptomic results.

Les thérapies ciblées ont amélioré la survie des patients atteints de mélanome cutané métastatique, toutefois certains patients échappent au traitement. La réponse au traitement met en jeu des paramètres dépendants du patient, de la biologie de la tumeur, et de la survenue de mécanismes de résistance largement étudiés.Le but de ce travail est d’étudier deux marqueurs mesurables en pratique clinique lors du suivi des patients, pour leur potentiel prédictif de réponse aux inhibiteurs de BRAF en monothérapie, l’un biologique et l’autre pharmacologique : la charge allélique mutée (CAM), définie par le rapport muté/total, des oncogènes BRAF et NRAS, et la concentration plasmatique de vemurafenib (CPV).Nous rapportons pour la première fois la prévalence et les mécanismes du déséquilibre allélique des oncogènes BRAF et NRAS, défini par une CAM élevée (>60%) ou faible (≤30%), par opposition à une CAM « hétérozygote » équilibrée (entre 30 et 60%). Des arguments in vitro et in vivo soutiennent l’hypothèse qu’une CAM BRAFV600E >60% puisse être associée à une meilleure réponse aux inhibiteurs de BRAF. La CAM de NRAS ne semble pas être un marqueur pronostique au moment du diagnostic de mélanome, toutefois sa valeur prédictive sur la réponse aux inhibiteurs de MEK sera intéressante à étudier.Nous montrons pour la première fois l’impact du dosage de la CPV lors du suivi des patients traités en monothérapie. Une CPV basse serait prédictive d’une progression ; ainsi, la CPV semble être un marqueur prédictif original de réponse, pour lequel la valeur seuil ainsi que les mécanismes pharmacogénétiques impliqués restent à déterminer. / Targeted therapies have improved survival in patients with metastatic cutaneous melanoma, but some patients escape treatment. Response to treatment involves parameters dependent of the patient, the tumor biology, and the occurrence of resistance mechanisms extensively investigated. The aim of this work is to study two measurable markers in clinical practice in patient monitoring, for their predictive potential of response to BRAF inhibitors monotherapy; the first one is biological and the other one is pharmacological: mutant allele burden (MAB), defined by the ratio mutant/total, of BRAF and NRAS oncogenes, and plasma vemurafenib concentration (PVC).We report for the first time the prevalence and the mechanisms of BRAF and NRAS oncogenic allelic imbalance, defined by a high (>60%) or a low (≤30%) MAB, as opposed to a balanced “heterozygous” MAB (30 to 60%). In vitro experiments and in vivo data support the hypothesis that a BRAFV600E MAB >60% may be associated with a better response to BRAF inhibitors. NRAS MAB does not seem to be a baseline prognostic marker, but its predictive value of response to MEK inhibitors will be interesting to investigate.We demonstrated for the first time the impact of CPV assay during the monitoring of patients treated with monotherapy. A low CPV would be predictive of progression; thus, CPV appears to be an original predictive marker of response, for which the threshold value and the involved pharmacogenetic mechanisms remain to be determined.

Le cancer du poumon est l’un des cancers les plus fréquents dans le monde et reste le plus meurtrier actuellement en terme d’incidence absolue. Les traitements employés chez les patients atteints d’un cancer du poumon consistent en une combinaison de chirurgie, de radiothérapie et de chimiothérapie. Alors qu’il y a quelques années, les guidelines de traitement étaient principalement basées sur le stade clinique de la maladie, le développement de nouvelles thérapies a mené à une classification plus appropriée des cancers du poumon. Cette nouvelle classification se base, en plus du stade clinique de la maladie, sur l’expression de différents biomarqueurs exprimés chez des sous-populations bien définies de patients. Ces biomarqueurs sont par exemple la mutation d’un gène ou l’expression d’une protéine. Au cours de ces dix dernières années, la recherche a été très active dans ce domaine avec l’arrivée de nouveaux traitements plus spécifiques pour ces sous-populations de patients. Des exemples concrets de ces nouvelles thérapies sont les chimiothérapies dites ciblées et l’immunothérapie. L’arrivée de tels traitements a parmi d’augmenter significativement le pronostic de la maladie et également de réduire considérablement les graves effets secondaires des chimiothérapies conventionnelles. Toutefois, le bénéfice en termes de survie reste modéré. Le taux de survie des patients à cinq ans est actuellement de 15%. Il y a donc toujours un besoin urgent de mettre au point de nouvelles stratégie de traitement.La chimiothérapie inhalée constitue une perspective de traitement adjuvant du cancer du poumon très intéressante, comparée à la chimiothérapie conventionnelle. En effet, elle permettrait d’administrer des doses d’anticancéreux plus importantes directement au niveau du site tumoral tout en limitant l’exposition systémique du médicament dans l’organisme, et donc, les toxicités importantes s’y rapportant. Toutefois, aucun médicament suivant cette approche n’est actuellement disponible sur le marché et ce, malgré quelques études cliniques de Phase I/II. Cela peut principalement s’expliquer par (i) l’incapacité d’administrer des doses inhalées efficaces d’agent anticancéreux avec les dispositifs d’inhalation utilisés (les nébuliseurs), (ii) les inquiétudes quant à une possible augmentation des toxicités pulmonaires des agents anticancéreux administrés par inhalation, (iii) les moyens devant être mis en place afin d’assurer la non-contamination de l’environnement et du personnel soignant lors d’une séance d’inhalation. Basée sur de nouvelles technologies pharmaceutiques (l’inhalation sous forme de poudre sèche, les nanomédecines, les thérapies ciblées, etc.) et sur une meilleure connaissance de la biologie des cancers, la stratégie scientifique que nous proposons pourrait permettre d’apporter une solution aux problématiques précitées. Ce travail décrit le développement de nouvelles formulations de poudre sèche pour inhalation (« dry powder for inhalation », DPI) à base de nanovecteurs ciblés contre le récepteur au folate (« folate receptor », FR) pour le traitement sélectif de cancers du poumon FR-positifs. Ces formulations permettraient le ciblage (i) du site tumoral par l’utilisation de l’administration pulmonaire et (ii) spécifique des cellules cancéreuses du poumon par les nanovecteurs ciblés. Trois parties constituent ce travail.Dans la première partie, deux nouveaux excipients folatés (c.à.d. sur lesquels ont été greffés des groupements folates) ont été synthétisés en trois étapes principales par une méthode de synthèse faisant appel à des dérivés de carbodiimide. Ces excipients comportent trois types de composants majeures relatifs à leur fonction :un ligand, le groupement folate, pour le ciblage des FRs ;un composé de charge, un polysaccharide, capable d’interagir avec l’agent anticancéreux ou une structure contenant celui-ci ;et un spacer, le poly(éthylène glycol), afin d’assurer une bonne flexibilité du folate et ainsi permettre une bonne interaction avec le FR. Ces nouveaux excipients folatés ont été caractérisés par RMN du proton, par spectrométrie de masse et par analyse thermique. L’excipient F-PEG-HMD (« folate-poly(ethylene glycol)-hydrophobically-modified dextran ») était capable de former des micelles caractérisées par une distribution de taille particulaire bimodale dans l’eau, avec un diamètre moyen d’environ 80 nm. F-PEG-HMD était caractérisé par une concentration micellaire critique de 4 x 10-7 M. L’excipient F-PEG-HTCC (« Folate-poly(ethylene glycol)-(N-[(2-hydroxy- 3-trimethylammonium)propyl] chitosan ») présentait des charges positives permettant de se solubiliser en milieu aqueux, indépendamment du pH.Dans la deuxième partie du travail, des formulations DPI ont été développées à base de l’agent anticancéreux témozolomide (TMZ). Celui-ci a été choisi comme premier modèle de principe actif pour son mécanisme d’action particulier qui lui confère une activité dans les cancers apopto-résistants, comme c’est le cas de beaucoup de cancers du poumon. De plus, l’administration d’une formulation de TMZ sous forme de nanovecteur permettrait de considérablement augmenter son activité en augmentant, par exemple, sa stabilité in vivo, ou encore son incorporation intracellulaire spécifique dans les cellules cancéreuses. Toutefois, le TMZ est caractérisé par des propriétés physicochimiques ne permettant que très difficilement son encapsulation dans des nanovecteurs. Le TMZ est une petite molécule, faiblement soluble dans l’eau sans toutefois être lipophile. Comme type de nanovecteur, les micelles polymériques pourraient présenter un bon profil pour encapsuler le TMZ. Des micelles composées de F-PEG-HMD et de TMZ ont été préparées par solubilisation de ces deux composés en présence. La solubilité dans l’eau du TMZ a pu ainsi être doublée en présence de F-PEG-HMD, ce qui pourrait mener à des concentrations de TMZ augmentées au sein du site tumoral. Les micelles polymériques présentaient un diamètre moyen de 50-60 nm, en fonction de la concentration en F-PEG-HMD utilisée. Les formulations DPI ont été préparées par spray-drying des micelles en présence de mannitol et de leucine. Le TMZ est resté stable durant l’étape de spray-drying, ainsi confirmé par des propriétés antiprolifératives in vitro des formulations DPI semblables à une solution de TMZ. Deux des formulations DPI développées présentaient de bonnes propriétés aérodynamiques, avec des fractions en particule fine jusqu’à 50%, et étaient capable de libérer les micelles polymériques rapidement en milieu aqueux. Toutefois, les taux d’encapsulation obtenus étaient relativement bas (inférieurs à 10%). Le travail s’est donc poursuivi avec un autre agent anticancéreux, le paclitaxel.Dans la troisième partie du travail, des formulations DPI à base de nanovecteurs chargés en paclitaxel (PTX). Le PTX a été choisi comme deuxième modèle d’agent anticancéreux car il s’agit d’une des molécules les plus couramment utilisées dans le traitement du cancer du poumon, et ce malgré les graves effets secondaires systémiques engendrés par l’administration intraveineuse de ce médicament. L’utilisation de la voie pulmonaire pourrait permettre d’optimiser les traitements à base de PTX, et ainsi, la qualité de vie des patients (réductions conséquentes des graves effets secondaires systémiques et meilleure réponse thérapeutique). Deux types de nanovecteurs ont été préparés avec des taux d’encapsulation en PTX d’approximativement 100%. Des micelles polymériques à base de F-PEG-HMD et de PTX ont été préparées par une méthode de dialyse avec un diamètre moyen de 50 nm et un potentiel zêta d’environ -4 mV dans le PBS. Des nanoparticules lipidiques solides (« solid lipid nanoparticle », SLN) chargées en PTX ont été préparées par une méthode de nanoprécipitation et les SLNs ont ensuite été enrobées par F-PEG-HTCC. La présence de l’enrobage a été confirmée par la taille et la charge des particules (diamètre moyen de 160 nm à 230 nm et potentiel zêta de -20 mV à + 30 mV, avant et après enrobage, respectivement). Les nanovecteurs étaient capables d’être incorporés, in vitro, dans les cellules HeLa et M109-HiFR, deux lignées de cellules cancéreuses exprimant le FR, et in vivo, après administration par inhalation sur un modèle orthotopique de cancer pulmonaire murin Ce modèle, le modèle M109, a été développé dans le cadre de ce travail à partir de la lignée M109-HiFR. Après administration par inhalation, les SLNs restaient enrobées dans les tissus pulmonaires et tumoraux. Les nanovecteurs ont montré une activité antiproliférative in vitro sur les deux lignées précitées. De plus, cette activité était significativement plus grande avec les SLNs enrobées chargées en PTX qu’avec la formulation commerciale contenant le paclitaxel, le Taxol®, avec des concentrations inhibitrices médianes de 60 et 340 nM, respectivement. L’activité anti-cancéreuse in vivo des SLNs enrobées, qui présentaient un meilleur profil que les micelles polymériques pour être étudiées in vivo (plus haute teneur en PTX, plus grande activité antiproliférative, et meilleure profil de libération du PTX in vitro), a été évaluée sur le modèle M109. Les SLNs enrobées, administrées par inhalation, seules ou en association avec le Taxol par intraveineuse, ont été comparées au Taxol®, administré par inhalation, par intraveineuse ou les deux, à la même dose de PTX totale. Les traitements à base des SLNs enrobées, en particulier en association avec le Taxol® en intraveineuse, ont menés un allongement significatif de la survie des souris M109, par rapport au Taxol en intraveineuse seul (survie médiane de 38 et 27 jours, respectivement). De plus, la mort de la dernière souris M109 a été observé au jour 61 pour le traitement SLN/Taxol en association, comparé au jour 33 pour le Taxol en intraveineuse, seul, à la même dose totale en PTX (10-8-8-8 mg/kg), et au jour 29 pour le contrôle négatif (c.à.d. les souris n’ayant pas reçu de traitement). Des études supplémentaires sont toutefois requises pour conclure une potentielle augmentation de l’activité anticancéreuse des SLNs inhalées par rapport au Taxol®. En effet, les doses de PTX en inhalation étaient trop grandes pour le modèle M109 menant à la mort d’une partie non négligeable des souris M109. Nous pouvons toutefois conclure que le traitement à base des SLNs inhalées en association avec le Taxol® en intraveineuse semble prometteur pour la suite du projet. Des formulations DPI ont ensuite été produites à partir des nanovecteurs chargés en PTX par spray-drying. Les formulations obtenues présentaient une large déposition in vitro dans les poumons, avec des fractions en particule fine allant jusqu’à 50% et de bonnes propriétés de libération des nanovecteurs en milieu aqueux. Quel que soit le principe actif ou le nanovecteur utilisé, les formulations DPI développées ont montré une large déposition pulmonaire in vitro dans les voies aériennes inférieures, où les adénocarcinomes pulmonaires sont le plus souvent trouvés. De plus, les formulations ne contenant que les excipients étaient bien tolérées in vivo après inhalation chez la souris saine. Cela a été vérifié par analyse des fluides bronchoalvéolaires en termes de concentration totale en protéine, de population de cellules, et de concentration en cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α. Ce travail montre dès lors également que les formulations DPI pourraient constituer un système de délivrance de médicament intéressant pour amener des nanovecteurs dans le tractus respiratoire où la tumeur réside. Toutefois, alors que de nombreuses caractéristiques intéressantes des formulations ont été démontrées (la tolérance des excipients, les profils de libération du PTX obtenus, l’incorporation intracellulaire des nanovecteur ainsi que leur bonne distribution dans du tissu tumoral in vivo et leur activité anticancéreuse, etc.), l’implication des FRs pour expliquer ces caractéristiques n’a pas pu être établie clairement. / Lung cancer is one of the most frequent cancers in the world, and remains the most deadly. Lung cancer therapy involves the combination of surgery, radiotherapy and chemotherapy. Whereas the treatment guidelines used to be related mainly to the stage of the disease, more recent treatments have introduced the concept of treating lung cancers according not only to the stage, but also to the specific characteristics of the tumors, i.e. a gene mutation, expression of a protein, etc. In the last decade, scientific and clinical research has been very active in this field, with recurrent introduction of new treatments, including new chemotherapies (e.g. targeted chemotherapies and immunotherapies). Many of these new treatments certainly induce better therapeutic responses and a sharp reduction in the adverse effects of conventional chemotherapies for well-defined subpopulations of patients. However, the benefit in terms of survival rates is only moderate. The five-year survival rate is currently ~15%. There is therefore no doubt that new treatment approaches and strategies are needed. One interesting approach is aerosolized chemotherapy. The pulmonary delivery of anti-cancer drugs could potentially be an interesting alternative to conventional adjuvant chemotherapy in lung cancer treatment, for many reasons. Among them, it could enhance the therapeutic ratio significantly by decreasing systemic severe toxicities and increasing anti-tumour efficacy. However, despite interesting clinical trial reports, all the strategies describing an aerosolized anti-cancer treatment have failed to bring new medicine on the market so far. The failures have been related mainly to (i) the inability to deliver proper and efficient drug doses in the lungs with the inhalation devices used in clinical trials (i.e. nebulizers), (ii) concerns about potential increase in lung toxicities engendered by these anti-cancer drug-based aerosols, and (iii) the requirement for adapted facilities to perform the inhalation procedure safely. Based on new pharmaceutical technologies (i.e. dry powder for inhalation (DPI) technology, nanomedicine, drug targeting, etc.) and on a better knowledge of cancer biology, a plausible and feasible answer to the aforementioned causes of failure was proposed. In this work, new nanomedicine-based DPI formulations were designed and developed for proposal as adjuvant chemotherapy for lung cancer treatment, especially for folate receptor (FR)-positive adenocarcinomas. These formulations would potentiate chemotherapy by means of a dual-targeting approach, i.e. the targeting of (i) lung tumor site(s) with pulmonary delivery and (ii) lung cancer cells with FR-targeted nanocarriers. To set up this approach, the work included three parts.In the first part, two new folate-grafted excipients were synthesized using carbodiimide-mediated chemistry in three main steps. These excipients consisted of three main components with a defined function: a ligand bringing selectivity, i.e. folate groups; a loading compound able to interact non-covalently with the anti-cancer drug or a drug delivery system, i.e. polysaccharides; and a spacer ensuring good flexibility of the ligand to allow its binding to the target, i.e. poly(ethylene glycol). The excipients were characterized by 1H-NMR, mass spectrometry and thermal analysis. Folate-polyethylene glycol-hydrophobically-modified dextran (F-PEG-HMD), a new folate-grafted self-assembling copolymer, presented a critical micellar concentration in water of 4 x 10-7 M. F-PEG-HMD micelles were characterized by a trimodal particle size distribution with a Z-average diameter of about 80 nm in water. Folate-polyethylene glycol-(N-[(2-hydroxy- 3-trimethylammonium)propyl] chitosan) (F-PEG-HTCC) presented positive charges and was easily dissolved in water, regardless of the pH.In the second part, dry powders were developed with the anti-cancer drug temozolomide (TMZ). TMZ was chosen as the first anti-cancer drug model due to its interesting anti-cancer activity in poor prognosis, apopto-resistant cancers, as is the case for many lung cancers. In addition, TMZ delivery via a nanocarrier might present many advantages such as prolonged lifetime and specific improved intracellular delivery into cancer cells. However, TMZ is characterized by poor properties for encapsulation into nanocarriers. It presents poor water solubility and low lipophilicity. Because of these properties, polymeric micelles presented the best profile for entrapping TMZ. TMZ-loaded F-PEG-HMD micelles were prepared by co-dissolution of TMZ and F-PEG-HMD. TMZ solubility in water was increased in the presence of F-PEG-HMD (a two-fold increase in molar solubility) which could potentially lead to increased local concentrations in the tumor site. The TMZ-loaded F-PEG-HMD micelles were characterized by Z-average diameters in the range of 50-60 nm, depending on the F-PEG-HMD concentration used. The micelles were spray dried to produce dry powders. TMZ remained stable during all the formulation steps, confirmed by similar in vitro anti-proliferative properties for the DPI formulations and a TMZ solution. Two of the developed DPI formulations were characterized by good aerodynamic properties (with a fine particle fraction of up to 50%) and were able to release the F-PEG-HMD micelles quickly in aqueous media. However, as presumed, poor entrapment efficiency values were obtained (less than 10%). A second anti-cancer compound was therefore chosen to pursue in the study, the lipophilic paclitaxel.In the third part, nanocarrier-loaded dry powders were developed with the poorly water-soluble anti-cancer drug paclitaxel (PTX) and the new folate-grafted excipients. PTX was chosen as a model drug because it is an effective anti-cancer drug currently used in lung cancer therapy and it causes severe systemic toxicities when delivered by the conventional intravenous route. Pulmonary delivery of PTX might therefore optimize treatment efficacy and/or quality of life in lung cancer patients. Two types of PTX-loaded nanocarrier were prepared with an encapsulation efficiency of approximatively 100%. PTX-loaded F-PEG-HMD micelles were prepared by a dialysis method. These had a Z-average diameter of about 50 nm and a zeta potential of about -4 mV in PBS. F-PEG-HTCC-coated solid lipid nanoparticles (SLNs) loaded with PTX were prepared in two main steps. PTX-loaded SLNs were first prepared using a nanoprecipitation method and the SLNs were then coated with F-PEG-HTCC. Efficient coating was confirmed by particle size and zeta potential (Z-average diameter of 160 nm to 230 nm and zeta potential of -20 mV to +30 mV before and after F-PEG-HTCC coating, respectively). The nanocarriers were able to enter HeLa and M109-HiFR, two FR-expressing cancer cell lines, in vitro, and in vivo after administration by inhalation to orthotopic M109-HiFR lung tumor grafted mice. This orthotopic model, i.e. the M109 model, was developed in the study. The SLNs remained coated with F-PEG-HTCC in lung tissues and tumors after inhalation. The PTX contained in the nanocarriers remained active against HeLa and M109-HiFR in vitro, as observed by means of the colorimetric MTT assays. Moreover, PTX-loaded SLNs were characterized by significantly higher anti-proliferative properties than Taxol®, with half-maximal inhibitory concentrations of 60 and 340 nM, respectively. Afterwards, the in vivo anti-cancer activity of the coated SLNs, which led to better profile than the polymeric micelles to be studied in vivo (i.e. higher PTX loading, higher anti-proliferative properties, and better release profile of PTX in vitro), was evaluated using the M109 model. The coated SLNs, administered by inhalation, alone or combined with intravenous Taxol®, were compared with Taxol®, administered by inhalation, IV or both, at the same PTX-relative doses. Interestingly, we observed much longer survivals for the SLN inhaled treatments, especially when combined with intravenous Taxol®, than for intravenous Taxol alone (median survivals of 38 and 27 days, respectively). Moreover, the last tumor-bearing mouse death occurred at day 61 for the SLN combined therapy, compared with day 33 for the intravenous therapy alone, at the same total PTX-relative dose (i.e. 10-8-8-8 mg/kg), and with day 29 for negative control (i.e. non-treated mice). However, further evaluations are needed to conclude that there is any improvement in terms of therapeutic response compared with intravenous Taxol®. Indeed, bias related to the fact that the aerosolized PTX doses were too high was included in the survival rate analysis and was revealed by unacceptable treatment-related deaths. Nevertheless, the combination of aerosolized, loaded SLNs and intravenous Taxol seemed to be an interesting strategy of treatment to follow. Dry powders embedding the PTX-loaded nanocarriers were developed by spray-drying. In vitro, good deposition profiles were obtained, with a fine particle fraction of up to 50% and good ability to re-disperse the nanocarriers in aqueous media.Whatever the drug or the nanocarrier adopted, the developed DPI formulations showed wide in vitro pulmonary deposition in the lower respiratory tract, where adenocarcinomas are more often found. Moreover, nanocarrier-based dry powders without drugs were well-tolerated in vivo, as assessed in healthy mice by determination of total protein content, cell count, and cytokine IL-1β, IL-6, and TNF-α concentration in bronchoalveolar lavage fluids. The present work therefore also shows that dry powders for inhalation could constitute an interesting drug delivery system able to release nanocarriers in the respiratory tract where the tumor is growing and spreading. However, in contrast to the undeniable improvements in terms of drug delivery system (e.g. safety of the excipients, drug release profile, the cell binding and uptake of the nanocarriers and their distribution into tumor in vivo, anti-cancer activity), no substantial effect linked to an implication of the FRs was observed to explain the aforesaid improvements. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Initialement découvert au cerveau, le Brain-derived neutrophic factor (BDNF) est un facteur de croissance dont les mécanismes de relâche et la signalisation ont été bien étudiés dans le système nerveux central. Il est aussi retrouvé en concentrations importantes dans la circulation où il est emmagasiné dans les plaquettes avec des niveaux pouvant atteindre 100 à 1000 fois ceux des neurones. Malgré l’abondance du BDNF dans les plaquettes, sa fonction dans la physiologie plaquettaire n’a jamais été étudiée. Le but de ce projet était donc d’investiguer le rôle du BDNF dans la fonction plaquettaire et les mécanismes de signalisation impliqués dans la réponse plaquettaire au BDNF. Lorsque les plaquettes sont isolées et re-suspendues dans un tampon physiologique dépourvu de protéines plasmatiques, le BDNF induit une agrégation plaquettaire complète et biphasique qui dépend des voies secondaires de l’agrégation. La neurotrophine NT4 ainsi qu’un anticorps activateur du récepteur TrkB ont tous les deux induit une agrégation plaquettaire similaire à celle du BDNF suggérant un récepteur commun, le TrkB. Par immunobuvardage, cytométrie en flux et microscopie électronique, nous avons pu confirmer que les plaquettes expriment une forme tronquée du récepteur TrkB, au niveau intracellulaire et à leur surface. Les tests fonctionnels nous ont mené à impliquer les voies de rhoGTPase Rac1, la protéine kinase C (PKC) et la voie phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt dans l’agrégation plaquettaire induite par le BDNF. Une fois activées par le BDNF, les plaquettes relâchent plusieurs cytokines proinflammatoires et proangiogéniques qui peuvent jouer un rôle important dans le maintien et la réparation de l’intégrité vasculaire. Parmi les agents relâchés, on retrouve des facteurs de croissances comme le PDGF et le VEGF, mais aussi des chimiokines comme l’IL8 et ENA-78. Finalement, lorsque les expériences d’agrégation ont été répétées en plasma riche en plaquettes, l’effet pro-agrégant du BDNF était perdu, possiblement via une liaison de BDNF avec la protéine plasmatique α2-macroglobuline (α2M). Cette liaison à α2M, suggérée par des expériences de co-immunoprécipitation, réduit la biodisponibilité du BDNF et pourrait aider à contenir la réponse plaquettaire au BDNF aux sites de lésions vasculaires. / The Brain-Derived Neutrophic Factor (BDNF) is a growth factor that was initially discovered in the brain. BDNF has both an autocrine and a paracrine role in neurons and its release and signaling mechanisms have been extensively studied in the central nervous system. Surprisingly, large quantities of BDNF have been reported in circulation, where it is essentially stored in platelets with concentrations reaching 100-1000-fold those of neurons. Despite this abundance, the function of BDNF in platelet biology has not been explored. Thus, this project sought to investigate the effect of BDNF on platelet function and the mechanisms underlying platelet responses to BDNF. In washed platelets, BDNF induced complete biphasic platelet aggregation that in part relied on amplification from secondary mediators. The low-affinity agonist neurotrophin-4 and an activating antibody raised against the canonical BDNF receptor TrkB induced similar platelet responses, implicating TrkB. Platelets express, both at their surface and in their intracellular compartment, a truncated form of TrkB lacking a tyrosine kinase domain. The BDNF-induced aggregation of washed platelets was prevented by inhibitors of the Rac1, PKC, and PI3K/Akt. Platelets exposed to BDNF secreted pro-angiogenic and pro-inflammatory cytokines, which may play a role in maintaining vascular homeostasis. Finally, in platelet-rich plasma, exogenous BDNF failed to induce aggregation and BDNF immunoprecipitates contained α2-macroglobulin immunoreactivity. Hence, platelets are rich in BDNF, which induce platelet aggregation via TrkB activation. The restriction of BDNF bioavailablility by plasma protein binding may serve to target BDNF-mediated platelet activation to sites of vascular injury.

Introduction : La surveillance analgésique est essentielle pour préserver le confort des patients sédationnés non-communicants après un traumatisme craniocérébral (TCC). Bien que le réflexe de dilatation pupillaire (RDP) et les comportements puissent être utilisés pour évaluer l'analgésie, ils nécessitent l'application de stimulus nociceptifs. Récemment, le réflexe photomoteur (RPM) élicité via un flash lumineux non douloureux s’est montré utile pour prédire l’état analgésique des patients sans TCC. Nous avons examiné si le RPM peut prédire l’état analgésique et la réponse comportementale des patients TCC non-communicants. Méthode : Quinze patients TCC ventilés mécaniquement (11 hommes; 54±20 ans) ont été évalués avec un vidéo-pupillomètre et une échelle comportementale (BPS) dans les 72 heures suivant l’admission aux soins intensifs. À chaque évaluation, le diamètre pupillaire au repos et le RPM ont été enregistrés, suivis immédiatement du RDP et des comportements pendant un stimulus nociceptif calibré. Les concentrations sanguines d’analgésiques/sédatifs ont été mesurées. Résultats : 103 évaluations ont été réalisées. Lorsque les réflexes pupillaires ont été élicités, le diamètre pupillaire a varié de -19 % en moyenne pour le RPM et de +10 % en moyenne pour le RDP. Les variations du RPM et du RDP étaient plus prononcées chez les participants qui présentaient un score BPS > 3 (un signe reconnu de sous-analgésie) par rapport à ceux avec un score BPS = 3. Les analyses de régression multiple montrent un chevauchement significatif entre les fluctuations des réflexes pupillaires et la concentration sanguine de fentanyl, mais pas celle du propofol. Conclusion : Le RPM pourrait être utile pour évaluer les besoins analgésiques avant une procédure nociceptive chez les patients TCC sédationnés non-communicants. / Background: Analgesia monitoring is essential to preserve comfort in critically ill sedated patients with traumatic brain injury (TBI). While pupil dilation (PD) and pain behaviors can be used to assess analgesia, these indicators require application of noxious stimulations. Recently, the pupillary light reflex (PLR) has emerged as a non-noxious parameter that may be used to predict analgesia requirements in non-brain-injured patients. Here, we investigated whether PLR can be used for the purpose of analgesia monitoring in critically ill sedated TBI patients. Methods: Fifteen mechanically ventilated TBI patients (11 men; 54±20 years) under perfusions of analgesia and sedation were assessed at predefined time within 72 hours of intensive care unit admission. Data collection was performed using video-pupillometry and the Behavioral Pain Scale (BPS). At each assessment, pupil size and PLR at rest were recorded followed immediately by the documentation of PD and pain behaviors elicited by a calibrated noxious stimulation. Blood concentrations of analgesics/sedatives were monitored. Results: 103 assessments were completed. PLR resulted in an average decrease of -19% in pupil diameter and PD resulted in average increase of +10%. Variations in PLR and PD were more pronounced in participants who showed a BPS score > 3 (a recognized sign of sub analgesia) compared to those with no behavioral reaction. Multiple regression analyzes showed a significant overlap between fluctuations in pupillary reflexes and blood levels of fentanyl, not propofol. Conclusions: PLR may be useful to assess analgesia requirements before a nociceptive procedure in critically ill sedated patients with TBI.

De plus en plus d’évidences suggèrent que la composition du microbiote intestinal pourrait jouer un rôle dans certaines pathologies comme l’hypertension, l’obésité, le diabète et plusieurs autres. Le but de cette étude est de démontrer que le microbiote intestinal modulé par des diètes enrichies en acide gras oméga-3 (w-3) ou en acide gras oméga-6 (w-6) avec un supplément ou non en probiotiques, pourrait influencer différemment la taille de l’infarctus du myocarde. Pour ce faire, des transplantations de microbiote provenant de rats nourris avec une diète w-3 ou w-6 combiné avec la prise ou non probiotiques ont été effectuées pendant 10 jours sur des rats dont le microbiote a été supprimé antérieurement par antibiothérapie. Ensuite, l’artère coronaire antérieure a été occluse pendant 30 minutes sur les rats transplantés et la taille de leur infarctus a été mesurée après 24 heures de reperfusion. La résistance intestinale, la concentration plasmatique de LPS (lipopolysaccharides), l’accumulation myocardique des neutrophiles, l’activation de la voie NF-kB (nuclear factor-kappa B), l’activation de la voie de cardioprotection RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) et la composition du microbiote sont les autres paramètres qui ont été mesurés. Nos résultats démontrent une taille d’infarctus plus importante chez les animaux transplantés avec le microbiote w-6 sans probiotiques comparativement aux autres groupes incluant le groupe ayant reçu le microbiote w-6 avec probiotiques. Ces résultats indiquent qu’un microbiote provenant d’une diète enrichie en w-6 produit des effets délétères qui augmentent la taille de l’infarctus du myocarde comparativement à un microbiote provenant d’une diète enrichie en w-3 et que la prise de probiotiques permet de diminuer la taille de l’infarctus. / A lot of evidences suggest that the composition of the gut microbiota may play a role in certain conditions such as hypertension, obesity, diabetes and many others. The aim of our experiment is to demonstrate that the intestinal microbiota modulated by diets enriched in omega-3 fatty acid (w-3) or in omega-6 fatty acid (w-6) with or without a supplement in probiotics, could influence differently the size of a myocardial infarction. To do this, microbiota transplants from rats fed a w-3 or w-6 diet combined or not with intake of probiotics were performed for 10 days on rats whose microbiota had previously been suppressed by antibiotic therapy. Then, the anterior coronary artery was occluded for 30 minutes in the transplanted rats and the size of their infarction was measured after 24 hours of reperfusion. Intestinal resistance, plasma LPS (lipopolysaccharides) concentration, myocardial accumulation of neutrophils, activation of the NF-kB (nuclear factor-kappa B) pathway, activation of the RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) cardioprotection pathway and microbiota composition are the other parameters that were measured. Our results demonstrate a larger infarct size in animals transplanted with the w-6 microbiota without probiotics compared to other groups (including the w-6 microbiota with probiotics group. These results indicate that a microbiota from a diet enriched in w-6 produces deleterious effects that increase the size of the myocardial infarction compared to a microbiota from a diet enriched in w-3 and taking probiotics can reduce the size of the myocardial infarction.