Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion de lipides ainsi que des protéines. L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. / After the genome, the new challenge is the proteome. We have progressed toward electrophoretic separation of membrane proteins in a medium that they love, a supported lipid bilayer. The main parameter, measured by FRAPP, was the diffusion coefficient of different objects (lipids, proteins). Studying bilayer behaviour has showed that, on particular supports and in a given temperature range, ripple phase can exist, despite the proximity of the support. Adding salt decreases coulombic interactions which turns to increase the diffusion coefficient over several orders of magnitude, reaching the value for a free-standing bilayer in the fluid phase, meanwhile the main characteristic steps of the global gel/fluid transition are still observed. Estimation of the value of the interaction energy has been made and compared to results of a preliminary DSC study. α-Hémolysin self-inserts spontaneously as an heptameric pore in supported bilayers and diffuses freely. Incubating in a gel/fluid mixture leads to protein complex formation. Diffusion varies with size as 1/R2, R being the equivalent radius of the inserted part of the object. Applying an electric field results in an electrophoretic motion where direction and magnitude are modulated by the charge of the object. Electrophoretic mobility varies also as 1/R2. Size dependence, magnitude of mobilities and a simple building protocol allow to hope carrying out soon a real electrophoretic separation of a protein mixture.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Prozessen der Lipidanreicherung in der Gallenflüssigkeit. Leberzellen (Hepatozyten) sind polare Zellen, die für die Sekretion der Gallenflüssigkeit verantwortlich sind. Die Anbindung an den Blutkreislauf besteht über die basolaterale Membran. Durch die gegenüberliegende, sogenannte apikale Membran werden zwischen benachbarten Leberzellen tubuläre Stukturen (bile canaliculi, BC) gebildet, in die die Gallenflüssigkeit abgesondert wird. Daher wird diese Membran auch als Canalicularmembran (CM) bezeichnet. Die Gallenflüssigkeit besitzt hinsichtlich ihrer Lipidzusammensetzung eine bemerkenswerte Spezifität. Obwohl der Anteil von Phosphatidylcholin (PC) an den Phospholipiden der CM nur 35% beträgt, macht es 95% der Phospholipide der Gallenflüssigkeit aus. Mögliche Mechanismen, die zur Spezifität der Lipidsekretion in die Gallenflüssigkeit führen, werden untersucht und diskutiert. Phospholipide werden aus der äußeren Lamelle der CM durch Gallensalze herausgelöst. Die Wechselwirkung von Gallensalzen mit Phospholipiden ist kopfgruppenunspezifisch. Eine Solubilisierung von Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) durch Gallensalze könnte durch die Wirkung einer Aminophospholipidtranslokase (APLT) verhindert werden, die diese Lipide aktiv auf die zytoplasmatische Seite der Membran pumpt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Versuche durchgeführt, um die Aktivität einer APLT in der CM nachzuweisen. Dabei wurde die Hepatomazelllinie HepG2 eingesetzt, die in der Lage ist, Canalicularvakuolen (BC) zu bilden. Zunächst wurde die Einwärtsbewegung einer Reihe fluoreszierender Lipidanaloga mit unterschiedlicher Affinität zur APLT charakterisiert. Dies geschah an der basolateralen Membran von HepG2 Zellen, wo eine APLT-Aktivität bereits bekannt ist. Die Aufnahme geeigneter APLT-Substrate konnte durch den APLT-Inhibitor Suramin reduziert werden. Ebenso wurde die Affinität eines Paares von PS-Analoga bestätigt, von denen Diether PS ein "schlechtes" und Diacyl PS ein "gutes" APLT-Substrat darstellt. Im zweiten Schritt wurde die Anreicherung der gleichen Analoga in BC von HepG2 Zellen untersucht. Es ergab sich eine auffallende Korrelation zwischen einer APLT vermittelten Aufnahme von Phospholipidanaloga an der basolateralen Membran und dem Fehlen dieser Analoga im Lumen der BC. Wenn Zellen mit Phospholipiden markiert wurden, die keine oder nur "schlechte" APLT-Substrate darstellen, erschienen die BC stark fluoreszierend. Diese Beobachtungen zeigen, dass eine APLT-Aktivität in der CM von Hepatozyten vorhanden ist, welche das Fehlen der Aminophospholipide in der Gallenflüssigkeit erklärt. Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von MDR-Proteinen (wie MDR3) bei der Lipidsekretion in die Gallenflüssigkeit. Aufgrund bisheriger Arbeiten wird vermutet, dass MDR3 daran als spezifischer Membrantransporter für PC beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene MDR-Inhibitoren die Anreicherung fluoreszierender Phospholipidanaloga in den BC von HepG2 Zellen nur wenig reduzieren. Diese Beobachtung kann unter der Annahme erklärt werden, dass MDR3 eher für die Exposition von PC an der lumenalen Seite der CM verantwortlich ist, als für den Tranport von PC über die Membran. Solche "Liftase"-Aktivität von MDR3 könnte endogenes PC der Detergenzwirkung von Gallensalzen zugänglich machen, ein Prozess, der für die hydrophileren fluoreszierenden PC-Analoga nicht nötig ist. Im dritten Teil wird die Rolle von Sphingolipiden und die Bildung von "Rafts" in der CM behandelt. Solche Membrandomänen sollten die Solubilisierung von Spingolipiden in die Gallenflüssigkeit verhindern. Eine Anreicherung fluoreszierender Sphingolipidanaloga in den BC wurde jedoch nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die verwendeten Analoga das Verhalten endogener Sphingolipide in der CM nicht korrekt wiederspiegeln. Im abschließenden Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine Methode zur Aufklärung der physikochemischen Prozesse der Lipidsekretion an der Canalicularmembran gelegt. Die starke Umgebungsabhängigkeit der Fluoreszenzlebensdauer für verschiedene fluoreszierende Lipidanaloga wurde in einer Reihe von Modellumgebungen analysiert und deren Nutzbarkeit für die Vorhersage der Lipidorganisation geprüft. Insbesondere wurde die Wechselwirkung verschiedener Gallensalze mit Lipidanaloga und der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen verschiedenen Lipidanaloga charakterisiert. Diese Daten sind Ausgangsbasis für die mikroskopische Charakterisierung der Organisation von Lipidanaloga in den BC in vivo. / This thesis addresses the molecular processes which are important in the formation of bile fluid. The polar liver cells (hepatocytes) secrete the bile fluid at their apical (canalicular) membrane into tubular bile canaliculi (BC) which are formed between adjacent cells. The basolateral membrane of hepatocytes faces the blood vessel. Bile fluid possesses a remarkable specificity regarding its lipid composition. Even though phosphatidylcholine (PC) contributes to only 35% of the phospholipids in the canalicular membrane, it constitutes 95% of biliary phospholipids. In this thesis possible mechanism that might lead to the specificity in biliary lipid secretion are analysed and discussed. Phospholipids are secreted from the outer leaflet of the canalicular membrane into bile by the effect of bile salts. The interaction of bile salts with phospholipids was shown to be independent of the phospholipid headgroup. Solubilisation of phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) by bile salts could be prevented by the action of an aminophospholipid translocase (APLT) which actively pumps these lipids to the cytoplasmic leaflet of the membrane. Experiments to demonstrate a canalicular APLT activity were performed to proof this hypothesis. For this, the hepatoma cell line HepG2 which is able to polarise and to form a canalicular vacuole (BC) was utilised. A panel of fluorescent lipid analogues with different affinities to this transporter was used and first characterised at the basolateral membrane of HepG2 cells, where an APLT activity was already demonstrated. The rapid APLT mediated uptake of aminophospholipid analogues representing appropriate substrates of APLT was reduced by applying the inhibitor suramin. The affinity of a pair of PS analogues with diether NBD-PS as a poor APLT substrate and diacyl NBD-PS representing a suitable substrate was confirmed. In a next step the enrichment of the same phospholipid analogues in the BC was investigated. There was a striking correlation between APLT mediated uptake of phospholipid analogues at the basolateral membrane and absence of these analogues from the BC. In the case of phospholipid analogues that were no or poor substrates of APLT the BC appeared highly fluorescent, indicating that indeed a canalicular APLT is responsible and sufficient for biliary absence of aminophospholipids. Further experiments were aimed on the investigation of the role of MDR proteins (as MDR3) in biliary lipid secretion. It has been proposed that MDR3, which is crucial for biliary phospholipid secretion, acts as a specific flippase for PC. However, different MDR inhibitors did not completely abolish the enrichment of fluorescent phospholipid analogues in the BC in this study. This observation can be explained assuming that MDR3 is responsible for the exposure of PC at the lumenal side of the canalicular membrane rather than for its transport across the membrane. Such a "liftase" activity of MDR could make endogenous PC accessible to the detergent bile salts which is not necessary for its more hydrophilic fluorescent analogues. The third part of this thesis addressed the role of sphingolipids and the formation of detergent resistant rafts in the canalicular membrane. Rafts are thought to prevent sphingolipid solubilisation into bile. Fluorescent sphingolipid analogues were found to enrich in the BC even at low temperatures, however. These experiments suggest that the applied analogues might not suitably represent the majority of sphingolipids in the canalicular membrane. The final part of this study provides the basis for a method to investigate the physico-chemical processes occurring during lipid secretion at the canalicular membrane. The sensitivity of fluorescence life times on environmental changes was analysed using fluorescent lipid analogues in a set of model environments and its utility for predicting biliary lipid organisation is discussed. Especially the interaction of different bile salts with lipid analogues and fluorescence energy transfer between distinct lipid analogues was characterised. These data can be utilised for characterisation of the organisation of biliary enriched lipid analogues in vivo at a microscopic level in future.

Cette thèse concerne l’auto-assemblage d'alcanes semi-fluorés (FnHm) et de fluorocarbures (FCs) aux interfaces et leurs interactions avec des phospholipides (PLs) en 2D et 3D. Nous avons étudié les sphérulites formées dans des films de diblocs FnHm. La morphologie de ces sphérulites, concentrique ou radiale, est contrôlée par la longueur des blocs Fn et Hm et la vitesse de refroidissement. Les nanodomaines de diblocs FnHm dans les monocouches de Langmuir sont incompressibles et forment des gels physiques 2D, même à pression nulle. Les blocs Hm sont cristallisés et inclinés d’ ~30°C par rapport à la normale à la surface. La réflectivité de neutrons a montré que l’albumine adsorbée sur des monocouches de PL est désorbée par un FC gazeux. Ce résultat pourrait permettre de lutter contre l’inactivation du surfactant pulmonaire par les protéines sériques. L’ajout de diblocs à des films de PLs accroit l'élasticité des monocouches. Nous avons préparé des microbulles stables à parois de PLs/FnHm, les diblocs agissant en co-surfactants. / This thesis focuses on the self-assembly of semi-fluorinated alkanes (FnHm) and fluorocarbons (FCs) at interfaces and their interactions with phospholipids (PLs) in 2D and 3D. 2D Spherulites were identified in FnHm films for the first time. Their morphology, ring-banded or radial, was controlled by varying block lengths and cooling rate. Nanodomains of FnHm in monolayers formed incompressible 2D physical gels, even at zero surface pressure. The Hm segments are crystalline and titled by 30°C to the normal to the surface. Neutron reflectivity showed that albumin adsorbed on PLs monolayers is desorbed by exposure to FC gas, which opens the potential use of FCs to treat the inactivation of the lung surfactant by serum proteins. Incorporating FnHm into PL monolayers increases their elasticity. Small, stable microbubbles of PLs/FnHm were obtained. FnHm diblocks function as co-surfactants for stabilizing microbubbles.

Cette thèse est une étude théorique et expérimentale sur la formation de liposomes par des procédés utilisant le dioxyde de carbone (CO2) supercritique. Les liposomes sont des vésicules sphériques nano- ou micrométriques dont la paroi est composée d'une ou plusieurs bicouches concentriques de phospholipides séparant un milieu aqueux d'un autre. L'efficacité des procédés supercritiques, comme alternative aux méthodes conventionnelles pour former des liposomes, a déjà été démontrée. Une synthèse critique des résultats de la littérature a été réalisée au cours de ce travail. Parallèlement, une étude fondamentale sur le comportement des systèmes ternaires CO2/eau/surfactant sous pression a été menée et il a été démontré qu'en fonction du type d'émulsions formées au cours du procédé sous pression, les caractéristiques des liposomes produits lors de la dépressurisation sont différentes. Le procédé Supercritical Anti-Solvent a été utilisé pour microniser des phospholipides. Des liposomes sphériques, multilamellaires et de tailles comprises entre 0,1 et 1µm ont ensuite été formés de manière reproductible par hydratation des phospholipides micronisés. Dans les mêmes conditions (même solvant), la méthode conventionnelle de Bangham n'a pas donné des résultats reproductibles et les liposomes formés n'étaient pas tous sphériques. Le résultat majeur de ce travail est la mise au point d'un procédé supercritique innovant. Innovant car continu et en une seule étape, le procédé Continuous Anti-Solvent permet de former de manière reproductible des liposomes sphériques, multilamellaires et de tailles comprises entre 10 et 100µm.

Les aliments riches en acides gras polyinsaturés (AGPI) à longue chaîne (LC) de la série n-3 sont recommandés pour leurs effets bénéfiques sur la santé humaine et en particulier dans la prevention du développement des maladies métaboliques. Or, la biodisponibilité de ces AGPI et leur impact métabolique pourraient être modulés par la nature chimique des molécules qui les véhiculent dans les aliments (triacylglycérols, TG ou phospholipides, PL). De plus, ces AGPI sont sensibles à la peroxydation lipidique. S'ils ne sont pas protégés de l'oxydation, ils peuvent former des espèces réactives toxiques comme le 4-hydroxy-hexénal (4-HHE). Dans ce contexte, le but de notre étude a été d'évaluer l'impact de l'enrichissement de régimes hyperlipidiques en AGPI n-3 (i) portés par des TG ou des PL et (ii) sous forme non-oxydée ou oxydée, sur l'inflammation et le stress oxydant métaboliques et d'en comprendre certains mécanismes liés à l'absorption intestinale et la réactivité du 4-HHE. D'une part, notre étude a confirmé que la consommation d'AGPI-LC n-3 empêche l'induction du stress oxydant et de l'inflammation lors d'un régime hyperlipidique chez la souris. Cependant, par rapport aux TG, les PL vecteurs d'AGPI n-3 permettent de réduire la taille des adipocytes et de stimuler le système antioxydant. D'autre part, notre étude a montré que la consommation d'AGPI n-3 oxydés de manière modérée aboutit à une élévation des concentrations plasmatiques de 4-HHE et des marqueurs inflammatoires. De plus, une activation des voies inflammatoires ainsi que du stress du réticulum endoplasmique ont été détectées au niveau de l'intestin grêle. Nos résultats in vivo et in vitro sur cellules intestinales Caco-2/TC7 indiquent que cela peut être dû en partie à une absorption au niveau intestinal du 4-HHE, produit d'oxydations des AGPI n-3. Dans le contexte du développement des aliments contenant des AGPI-LC n-3, nos résultats contribuent à identifier les structures vectrices de ces acides gras les plus efficaces du point de vue métabolique. En santé publique et en pratique clinique, nos résultats constituent une nouvelle base de réflexion pour la mise en place de bonnes pratiques de production et de conservation des aliments et des compléments nutritionnels enrichis en AGPI-LC n-3 pour éviter leur oxydation et ses possibles effets délétères.

Les fonctions physiologiques spécifiques de la voie de N-méthylation de la phosphatidyléthanolamine (PE), une des deux voies de biosynthèse de la phosphatidylcholine (PC), restent relativement énigmatiques. Il a été démontré chez les poissons euryhalins qu’un stress hyperosmotique induisait une activation de cette voie métabolique au niveau hépatique. L’objectif de notre travail était de vérifier si ce phénomène se produit aussi chez d’autres animaux euryhalins. Les études réalisées in vivo sur deux espèces de crâbes, Eriocheir sinensis et Carcinus maenas, nous ont permis de montrer que l’acclimatation en eau de mer de ces animaux active la synthèse de PC par N-méthylation de la PE dans l’hépatopancréas. Les marquages radioisotopiques montrent aussi que cette PC est échangée avec le plasma et que ce phénomène est amplifié chez les animaux en eau de mer. Ce pool de PC est utilisé comme précurseur de la bétaïne, un osmoeffecteur organique important chez ces animaux. Nous avons ensuite caractérisé la voie de N-méthylation de la PE chez un animal osmoconformeur, la moule Mytilus galloprovincialis. Les résultats, obtenus in vivo et in vitro sur les tissus isolés, démontrent qu’une activité de N-méthylation de la PE en PC est exprimée dans la glande digestive et les hémocytes circulant de M. galloprovincialis. La PC ainsi synthétisée dans ces tissus est échangée avec l’hémolymphe de l’animal. De l’ensemble de ces observations, nous pouvons conclure que la synthèse de PC par N-méthylation est largement exprimée chez les animaux marins euryhalins et qu’une des fonctions physiologiques de cette voie métabolique est de synthétisée des osmolytes organiques comme la bétaïne / The specific physiological functions of the N-methylation of phosphatidylethanolamine (PE), one of the two biosynthetic pathways of phosphatidylcholine (PC), remain relatively mysterious. It has been demonstrated in euryhaline fish that hyperosmotic stress induced activation of this pathway in the liver. The aim of our work was to verify whether this phenomenon also occurs in other euryhaline animals. In vivo studies on two species of crabs, Eriocheir sinensis and Carcinus maenas, showed that seawater acclimation activates PC synthesis by N-methylation of PE in the hepatopancreas. Radioisotopic labelling also showed that PC is exchanged with the plasma and that this phenomenon is amplified in animals in seawater. This pool of PC is used as a precursor of betaine, an important organic osmoeffector in these animals. We then characterized the process of PE N-methylation in an osmoconforming animal, the mussel Mytilus galloprovincialis. The results, obtained in vivo and in vitro on isolated tissues, show that N-methylation of PE to PC is expressed in the digestive gland and circulating haemocytes in M. galloprovincialis. The PC synthesized in these tissues is exchanged with hemolymph of the animal. From all these observations, we conclude that the synthesis of PC by N-methylation is widely expressed in marine euryhaline animals and that a physiological function of this pathway is to provide organic osmolytes such as betaine

Les fluorocarbures ont un fort potentiel en médecine. Cependant, et en dépit du fait que certaines formulations employant des fluorocarbures sont utilisées en clinique, il n'existe que relativement peu d'études visant à déterminer les interactions entre un fluorocarbure et une membrane de phospholipides. Notre étude concentre à l'interface fluorocarbure/phospholipide, qui représente d'une part un modèle simplifié du surfactant pulmonaire natif dont le composant majoritaire est la dipalmitoylphosphatiylcholine (DPPC), et d'autre part la paroi de microbulles développées comme nouveaux agents théranostiques.Tout d'abord, nous montrons que les fluorocarbures abaissent considérablement la tension interfaciale d'équilibre d'une série de phospholipides et accélèrent fortement leur adsorption. Nous montrons que des oscillations périodiques appliquées à la bulle induisent une transition du film de DPPC vers un état d'organisation plus dense. L'application d'oscillations périodiques permet aussi à la DPPC d'expulser du film interfacial une protéine, l'albumine, dont la présence est souvent liée aux troubles dus au mauvais fonctionnement du surfactant pulmonaire. L'effet des fluorocarbures, qui accélère considérablement l'expulsion de l'albumine par la DPPC, est également étudié. D'autre part, nous avons obtenu des microbulles exceptionnellement stables grâce à une série homologue de phosphates perfluoroalkylés. Nous avons également réussi à former des microbulles couvertes par des nanoparticules magnétiques, tout en gardant les propriétés échogènes des bulles. De telles microbulles offrent un potentiel comme des agents de contraste bimodaux pour l'IRM et l'échosonographie.

Le but de ce projet est d'étudier les propriétés mécaniques et électriques d'une monocouche de phospholipide supportée sur silicium en vue de son utilisation comme diélectrique de grille dans un biocapteur à transistor à effet de champ. Ces monocouches de 3nm sont formées par fusion de vésicules. Les lipides utilisés possèdent des triples liaisons dans leurs chaînes alkyles permettant une polymérisation radicalaire. Nous montrons que la polymérisation stabilise la monocouche à l'air et améliore sa résistance mécanique. Les mesures ont été réalisées par mesure de force par AFM, la force de ‘rupture' de la monocouche par la pointe AFM augmentant après polymérisation. L'étude de la force en fonction de la vitesse d'approche de la pointe nous a permis de montrer que la rupture de la couche est un phénomène activé qui dépend de la vitesse. Nous avons pu ainsi déterminer pour chacune des deux surfaces, polymérisées ou pas, l'énergie d'activation de rupture de la couche du système couche/pointe et une estimation du module de Young. Ces grandeurs qui augmentent après polymérisation montrent une amélioration des propriétés mécaniques. Nous nous intéressons également aux propriétés électriques de ces monocouches. Nous avons réalisé des mesures Courant-Tension I(V) à partir desquelles nous avons pu déterminer la résistance de la couche, les densités de courant de fuite et la tension de claquage. Les résultats obtenus démontrent que ces monocouches ultrafines possèdent de très bonnes propriétés isolantes. De plus nous avons révélé la propriété très intéressante d'auto-régénération de la monocouche isolante après claquage à l'air, à température ambiante en quelques minutes seulement. / The main goal of this project was to study the electrical and mechanical properties of a solid supported lipid monolayer in order to use it as a dielectric insulator in a Field Effect Transistor based biosensor. The 3 nm lipid monolayer supported on silicon was obtained by the vesicle fusion method. DC8,9PC phospholipids containing acetylenic moiesties were selected. The lipid monolayer was stabilized on the substrate by two-dimensional polymerization in the plane of the layer. We demonstrate that this polymerization stabilizes the monolayer in air. Force measurements realized by AFM on both polymerized and non-polymerized layers demonstrated a net improvement of the nano-mechanical resistance of the layer after polymerization with a net increase of the force required to rupture the layer. Measurements realized at different loading rates have evidenced the fact that the monolayer rupture is an activated process that depends on the loading rate. For both types of layers, we have determined the intrinsic rupture activation energy of the tip–layer system as well as their Young modulus. These two physical quantities increase after polymerization and demonstrate a net improvement of the mechanical properties of the polymerized monolayer. The electrical properties of these layers have also been investigated. Current-Voltage measurements were done on the monolayer in the air at room temperature. The differential resistance, the leakage current, the breakdown voltages were measured and showed that the polymerized monolayer behaves as a good electric insulator. In addition, we demonstrated a very interesting property of autonomic self-healing after electrical breakdown.

Eine wichtige Eigenschaft der Plasmamembran eukaryotischer Zellen ist die stabile transversale Asymmetrie der Phospholipide. Sie wird energieabhängig durch die Aktivität einer Aminophospholipidtranslokase aufrechterhalten und gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis der Zellen. Die Plasmamembran einiger Säugerzellen weist zudem laterale Lipiddomänen auf, denen eine wesentliche Bedeutung bei der Signaltransduktion zugeschrieben wird. Während der Genese durchlaufen die Membranen der Säugerspermien intensive Veränderungen. Um die Bedeutung der Phospholipidasymmetrie für die Funktion der Spermien zu untersuchen, wurde die Lokalisation und Dynamik von Phosphatidylserin in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien im Verlauf von Kapazitation und Akrosomreaktion betrachtet. Unter Ausnutzung der selektiven, kalziumabhängigen Bindung von AnnexinV an endogenes Phosphatidylserin konnte dessen Lokalisation an morphologisch differenzierten Zellen verfolgt werden. Eine Markierung der Zellen mit NBD-markierten Phospholipidanaloga lieferte zudem Informationen zur Dynamik der Phospholipide in der Plasmamembran. Die Differenzierung der Zellen erfolgte entweder am Durchflusszytometer oder fluoreszenz- bzw. elektronenmikroskopisch. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen sowohl auf eine transversale als auch laterale Ungleichverteilung der Lipide in der Zell- und Akrosommembran während der Genese der Spermien hin. Neben der stabilen transversalen Phospholipidasymmetrie der Plasmamembran konnte erstmals eine zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin auf der äußeren Akrosommembran nachgewiesen werden. Somit akkumulieren die beiden einander zugewandten zytoplasmatischen Monolayer von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran Phosphatidylserin. Kapazitationsbedingt kommt es zu einer engen Wechselwirkung zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran. Die Ausbildung lateraler Membrandomänen, in denen Phosphatidylserin zytoplasmatisch akkumuliert, wird als Voraussetzung für diese enge Assoziation diskutiert. Weitere Hinweise auf eine funktionelle Bedeutung lateraler Membrandomänen lieferten die Arbeiten zur Isolation Triton-unlöslicher Lipiddomänen aus der Plasmamembran von Forellenspermien. / One of the essential qualities of cell membranes in Eucaryotae is a stable transverse phospholipid asymmetry. It is regulated and maintained by ATP-dependent action of an aminophospholipid translocase and is a major prerequisite for cell homeostasis. The plasma membranes of several mammalian cells show moreover lateral lipid domains, which are imputed to play a significant role in signal transduction. The membranes of mammalian spermatozoa undergo significant changes during genesis. The localisation and dynamics of phosphatidylserine in the cell as well as acrosome membranes of boar sperm cells was studied during capacitation and acrosome reaction to assess the relevance of lipid asymmetry for sperm function. The localisation of endogenous phosphatidylserine in morphologically differentiated cells was followed using the selective calcium depending binding of annexinV. Information on the transverse dynamics of phospholipids in the plasma membrane was obtained by labelling the cells with a NBD-phospholipid analogues. The morphological status of the cells was assessed by flow cytometry, fluorescence and electron microscopy. The results of this study indicate both a transversal and lateral inhomogenous distribution of lipids in the cell membrane as well as in the outer acrosome membrane during sperm genesis. The plasma membrane of boar sperm shows a stable transversal lipid asymmetry characterised by an accumulation of phosphatidylserine in the cytoplasmic monolayer. Moreover a cytoplasmic localisation of phosphatidylserine on the outer acrosome membrane could be detected for the first time. Therefore the two facing cytoplasmic leaflets of the outer acrosome and cell membrane contain phosphatidylserine. Applying microscopy substantiated the hypothesis that there are close interactions between the cell membrane and the outer layer of the acrosome membrane because of capacitation. The cytoplasmic accumulation of phosphatidylserine in lateral lipid domains is probably essential for the strong association of plasma and outer acrosome membrane finally leading to local fusions of both membranes. An indication for the functional meaning of lateral membrane domains in sperm cells was futher deduced from the isolation of Triton-insoluble lipid domains from membranes of trout sperm cells.

Der Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung von organischen Filmen und deren Interaktion mit membranaktiven Substanzen mit der Raskraftmikroskopie. Begleitend zur Durchführung dieser Aufgabe wurde ein Rasterkraftmikroskop entwickelt, dessen technische Ausführung es gestattete, Aspekte der Abbildung und der gezielten Modifikation organischer Filme mit dem Rasterkraftmikroskop eingehender zu untersuchen. Als organische Filme fanden Phospholipidfilme aus DMPC, DPPC, POPC, PC und Mischungen aus ihnen Verwendung, welche als Modell für biologische Membrane betrachtet werden können. Durch Mischungen der Phospholipide ließen sich Modellmembrane herstellen, welche einerseits für die Untersuchungsmethode ausreichend stabil erwiesen und eine Gel-Flüssigphasenseparation zeigten. Zwei Herstellungsmethoden für die Filme, die Vesikelfusion und eine Technik, welche als „solution spreading“ bekannt ist, wurden angewandt. Die letztgenannte Methode konnte für die in-situ Abbildung mit dem Rasterkraftmikroskop in Flüssigkeiten adaptiert werden. An den hergestellten Lipidfilmen sind Veränderungen der Oberfläche durch die Interaktion mit Peptiden und weiteren Substanzen beobachtet und deren Einfluss auf die Topographie der Modelloberfläche im zeitlichen Verlauf mit dem Rasterkraftmikroskop abgebildet worden. Die Beobachtungen zeigten, dass die Interaktion der verwendeten Peptide zu einer in den flüssigen Regionen des Filmes beginnenden Veränderung führen, welche sich auch von den Rändern her in die Bereiche im Gelzustand fortsetzt. Mit Hilfe einer Simulation konnten ausgewählte Aspekte der untersuchten Wechselwirkung der Peptide mit der Modellmembran nachvollzogen werden. / The object of this work was the investigation of organic films and their interaction with membrane active substances by scanning force microscopy. In addition to this objective a scanning force microscope was also developed. The specifications of the device permitted a more detailed investigation of aspects of the mapping process and the direct modification of organic films with the scanning force microscope. As organic films the phospholipids DMPC, DPPC, POPC, PC and mixtures of them were used. These can be considered as model for biological membranes. Mixtures of phospholipids allow the preparation of model membranes which show a gel-liquid-phase separation and which are sufficiently stable for the application to the investigation method. Two different preparation methods -- vesicle fusion and solution spreading -- were used. The latter method could be adapted for scanning force microscopy in liquids. For the prepared films alterations of the surface due to interaction with petides and other substances were observed and their influence on the topography of the model surface was time dependently mapped. The observations show that the alterations due to interaction with the peptides starts in the liquid phase regions and propagates over the border regions into the gel-state areas. By means of a computer simulation selected aspects of the investigated peptide interaction could be verified.