A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.

Chez les plantes à fleurs, l’ovaire est l’organe reproducteur femelle et il interagit de façon importante avec les gamètes mâles durant la croissance, le guidage, la réception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamètes. Le processus débute lorsque de nombreux gènes de l’ovule sont activés à longue distance lors de la réception du pollen sur le stigmate. Afin d’explorer les signaux provenant de l’ovule ayant un impact important sur les interactions pollen–pistil, particulièrement les molécules sécrétées impliquées dans la signalisation espècespécifique, l’expression génique des ovules sous forme d’ARNm ainsi et la sécrétion protéique ont été étudiées chez Solanum chacoense, une espèce diploïde de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup d’hybridation interspécifique avec d’autres espèces sympathiques de solanacées, facilitant ainsi grandement l’étude des interactions pollen–ovule de façon espècespécifique ainsi que leur évolution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions différentes ont été comparés: des ovules matures de type sauvage, des ovules légèrement immatures, récoltés deux jours avant l’anthèse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un séquençage d’ARN à haut débit a d’abord été effectué sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de générer un assemblage de référence comprenant 33852 séquences codantes. D’autres séquençages ont été effectués sur les trois conditions d’ovules et sur les feuilles afin de faire une analyse d’expression différentielle des gènes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gènes sont réprimés dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gènes, étaient également sous-exprimés dans les ovules légèrement immatures, suggérant un rôle spécifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de développent FG6 à FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux légèrement immatures ne sont capables d’attirer les tubes polliniques lors d’essais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gènes sont des peptides riches en cystéines (CRPs). En utilisant un transcriptome assemblé de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse d’orthologie a été effectuée sur ces CRPs, révélant une grande variabilité et une évolution rapide chez les solanacées. De nouveaux motifs de cystéine uniques à cette famille ont également été découverts. En comparant avec des études similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulièrement en en ce qui a trait à la catégorisation fonctionnelle des gènes et de la similarité entre les gènes orthologues. De plus,même si la glycosylation n’est pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le maïs, des extraits d’ovules glycosylés de S. chacoense sont capables d’augmenter la capacité de guidage de 18%. Cette étude est donc la première à montrer une corrélation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par l’ovule. En complément à l’approche transcriptomique, une approche protéomique portant sur les protéine sécrétées par l’ovule (le secrétome) a été utilisée afin d’identifier des protéines impliquées dans l’interaction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats d’ovules matures (capables d’attirer le tube pollinique) et d’ovules immatures (incapables d’attirer le tube pollinique) ont été récoltés en utilisant une nouvelle méthode d’extraction par gravité permettant de réduire efficacement les contaminants cytosoliques à moins de 1% de l’échantillon. Un total de 305 protéines sécrétées par les ovules (OSPs) ont été identifiées par spectrométrie de masse, parmi lesquelles 58% étaient spécifiques aux ovules lorsque comparées avec des données de protéines sécrétées par des tissus végétatifs. De plus, la sécrétion de 128 OSPs est augmentée dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protéines sont donc considérées en tant que candidates potentiellement impliquées dans la maturation tardive de l’ovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette étude a également montré que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de sécrétion de 44% du sécrétome total de l’ovule. De façon surprenante, la grande majorité (83%) de ces protéines n’est pas régulée au niveau de l’ARN, soulignant ainsi l’importance de cette approche dans l’étude du guidage du tube pollinique comme complément essentiel aux études transcriptomiques. Parmi tous les signaux sécrétés par l’ovule et reliés au guidage, obtenus à partir des approches transcriptomiques et protéomiques décrites ci-haut, nous avons spécifiquement évalué l’implication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par l’ovule chez S. chacoense, vu l’implication de ce type de protéine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez d’autres espèces. Au total, 28 CRPs étaient présentes dans les ovules capables d’attirer le tube pollinique tout en étant absentes dans les ovules incapables de l’attirer, et ce, soit au niveau de l’ARNm et/ou au niveau du sécrétome. De celles-ci, 17 CRPs ont été exprimées dans un système bactérien et purifiées en quantité suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats d’ovules ont été utilisés avec succès pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprimés dans les bactéries n’ont quant à eux pas été capables d’attirer les tubes polliniques. Comme l’utilisation de systèmes d’expression hétérologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activité des protéines, les candidats restants seront de nouveau exprimés, cette fois dans un système de levure ainsi que dans un système végétal pour produire les peptides sécrétés. Ceux-ci seront ensuite utilisés lors d’essais fonctionnels pour évaluer leur capacité à guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanacées comme S. chacoense. / In flowering plants, the ovary is the female reproductive organ that interacts extensively with the male gametophyte during pollen tube (PT) growth, guidance, reception, discharge and gamete fusion. The process begins when numerous ovule-expressed genes are activated when pollen lands on the stigma. To explore the ovular signals that have a great impact on successful pollen–pistil interactions, especially the secreted molecules that mediate species-specific signalling events, ovule mRNA expression and protein secretion profiles were studied in Solanum chacoense, a wild diploid potato species. Solanum chacoense has undergone extensive interspecific hybridization with sympatric solanaceous species that greatly facilitates the study of species-specific pollen–ovule interactions and evolution. In this project, three ovule conditions were studied: wild-type mature ovules, slightly immature ovules at two days before anthesis (2DBA), and frk1 mutant ovules that lack an embryo sac (ES). RNA-seq was performed on S. chacoense ovules to provide a scaffold assembly comprising 33852 CDS-containing sequences, then to provide read counts for differential gene expression analyses on three ovule conditions as well as on leaf. Compared to wild-type ovules, 818 genes were downregulated in frk1 ovules. A subset of 284 genes was concurrently under-expressed in 2DBA ovules, suggestive of their specific involvement in late stages of ES maturation (female gametophyte (FG), FG6 to FG7 developmental stage), as well as in PT guidance processes, as neither frk1 nor 2DBA ovules attract semi in vivo-grown PTs. Of these 284, 21% encoded cysteine-rich peptides (CRPs). Using de novo assembled ovule transcriptomes of two close relatives, S. gandarillasii and S. tarijense, an orthology survey was conducted on these CRPs, revealing their highly polymorphic nature among species and rapid evolution. Interestingly, novel cysteine motifs unique to this family were also uncovered. As compared to parallel studies in Arabidopsis, S. chacoense was found to possess a highly divergent ES transcriptome, in terms of both functional categories and individual ortholog similarities. Although glycosylation is not required for micropylar guidance cues to attract PTs in Arabidopsis, Torenia or maize, glycosylated ovule extracts from S. chacoense showed enhanced PT guidance competency by 18%. This is the first time a positive regulation between glycosylation and ovular PT guidance has been observed. As a complement to the transcriptomic approach, a proteomic approach using secreted proteins from the ovule (secretome) was employed to identify proteins involved in pollen–pistil interactions. Ovule exudates were collected from mature ovules (PT attracting) and immature ovules at 2DBA (PT nonattracting), using a novel tissue free-gravity extraction method (tf-GEM), which efficiently reduced the cytosolic contamination to less than 1%. Through mass spectrometry analyses, a total of 305 ovule-secreted proteins (OSPs) were identified, of which 58% were considered ovule-specific when compared to secretome studies conducted in other plant tissues. The secretion of 128 OSPs was upregulated in mature ovules vs. immature ovules. These OSPs were considered as candidate proteins involved in late ovule maturation and PT guidance. This study demonstrated that the ES maturation from FG6 to FG7 stages influenced the secretion status of 44% of ovule secretome. Surprisingly, the majority (83%) of these proteins were not regulated at the RNA level, vindicating this novel approach in the study of PT guidance as a robust complement to transcriptomic studies. Among all identified guidance-related ovular signals from the transcriptomic and proteomic approaches described above, we focused on the evaluation of the involvement of CRPs in ovular PT guidance of S. chacoense, due to the implication of various CRPs in pollen–pistil interactions and, especially, in PT guidance. A total of 28 CRPs were present in PT attracting ovules while being low or absent in nonattracting ovules, at the mRNA and/or protein secretion levels. Of these, 17 CRPs were expressed in bacteria and purified in sufficient amount for PT guidance assays. However, while ovule exudates were shown to induce PT chemotropism in the bead assay, refolded candidates did not show guidance competency. Since the use of eukaryotic protein expression systems might lead to better refolding and higher protein activity, the remaining candidates will be expressed in both yeast and plant-based expression systems and tested for their ability to attract PTs in a semi in-vivo assay, in order to lead us toward the isolation of PT guidance chemoattractants in solanaceous species like S. chacoense.

A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular. / The biology of plant reproduction is a field of great interest, since most of the food consumed by humans is composed of reproductive parts of plants (fruits and seeds). The pistil is the female reproductive organ, composed of stigma, style and ovary. Due to the central importance of the pistil in the success of plant reproduction, a better knowledge of the genes and processes that regulate pistil development and function is necessary. Comparative studies of gene expression in vegetative and reproductive organs of Nicotiana tabacum have revealed genes preferentially expressed in the reproductive organs, among them some encoding proteins of unknown function. One of these genes was characterized and denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), since it has an important role in stigma/style development, acting as a tissue-specific cell-cycle inhibitor (DePaoli et al., 2011). The objective of the present work was to study the molecular mechanisms through which NtSCI1 regulates the cell cycle investigating its interaction partners. In a pull-down assay, using nuclear protein extracts from N. tabacum stigmas/styles, several putative cell cycle regulators were identified. Among them, the interaction between NtSCI1 and NtCDKG;2 was confirmed by BiFC and localized in the nucleolus. A N. tabacum stigma/style cDNA library in the yeast two-hybrid system was successfully constructed. The screening of this library, using BD-NtSCI1 as bait, allowed the identification of several NtSCI1 interaction partners, among them: a DEAD-BOX RNA helicase; the 14-3-3D2 protein; two transcription factors (HOMEOBOX-22 and STOREKEEPER); a splicing factor containing a SWAP domain; an adenosine kinase; and a transposase. The interactions between NtSCI1 and the first three mentioned partners have already been confirmed by BiFC (observed in the nucleus and nucleolus) and the interaction between NtSCI1 and Nt14-3-3D2 was also wconfirmed by co-immunoprecipitation. The NtSCI1 involvement in cell cycle regulation was corroborated by the interaction between NtSCI1 and the NtCYCLIN-L1 (a regulatory subunit of CDKG;2), which was confirmed by two-hybrid and BiFC in the nucleolus. The interaction between NtSCI1 and NtCYCLIN-RELATED was also confirmed by BiFC. To understand the dynamics of NtSCI1 in the nucleolus, the subcellular localization of the fusion protein NtSCI1-GFP was studied during the different cell cycle phases. NtSCI1-GFP was observed in the nucleolus of BY-2 cells at interphase and prophase, disappearing at metaphase and anaphase and reappearing in the nucleolus at the end of telophase, showing that NtSCI1 presence in the cell is controlled by the cell cycle. The construction of the first version of NtSCI1 interactome showed its direct and indirect involvement with proteins related to RNA metabolism, transcription control and cell cycle regulation. These results suggest that NtSCI1 may act in cell cycle control in a non-canonical way, through multiple parallel processes interconnecting aspects of transcription regulation, RNA processing and cell cycle control.

A eficiência da reprodução sexual de plantas depende do correto desenvolvimento dos órgãos sexuais: estame e pistilo. Mecanismos moleculares complexos controlam a proliferação e expansão celular que resultam no correto desenvolvimento destes órgãos. Em nosso laboratório foi identificado um gene preferencialmente expresso no pistilo de Nicotiana tabacum, o gene 092H06. Este gene codifica uma pequena proteína de 68 aminoácidos, e função desconhecida. Análises anteriores sugerem que o produto proteico do gene 092H06 seja responsável por inibir o processo de expansão celular nos órgãos reprodutivos (Brito,2010). Para compreender o papel deste gene, no desenvolvimento do pistilo, foram realizados experimentos de qRT-PCR para determinar se os níveis de expressão de genes para -expansina, -expansina, ciclina B1.2 e actina, ligados aos processos de divisão e expansão celular, em plantas transgênicas de silenciamento e superexpressão do gene 092H06. Foram realizadas análises morfológicas nos estigmas/estiletes e ovários das plantas transgênicas de segunda geração (T2), por microscopia óptica. Os resultados mostram uma tendência de aumento no volume das células tanto nas plantas transgênicas de silenciamento, como nas de superexpressão. Entretanto, nas plantas de silenciamento ocorreu um aumento visível das estruturas reprodutivas, o que não foi observado nas plantas de superexpressão. Adicionalmente, foram realizados experimentos de citometria de fluxo, para verificar a ocorrência de endorreduplicação. Os resultados mostraram que não ocorreu endorreduplicação nas células das plantas transgênicas. No screening de uma biblioteca de duplo híbrido, usando 092H06 como isca, foram encontrados 4 candidatos a parceiros de interação: 1) biotin/lipolyl attachmente domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor e 4) RING/U-box. Para auxiliar no estudo da função do gene 092H06, a proteína recombinante 092H06-Histag foi produzida com sucesso, na forma solúvel, em E. coli. Os resultados alcançados neste trabalho contribuem para avançar o conhecimento sobre este novo gene expresso nos órgãos reprodutivos das plantas. / The efficiency of plant sexual reproduction depends on the correct development of the sexual organs: stamen and pistil. Complex molecular mechanisms control cell proliferation and expansion that result in the correct development of these organs. In our laboratory a gene preferentially expressed in Nicotiana tabacum pistil has identified, the 092H06 gene. This gene encodes a small protein of 68 amino acids of unknown function. Previous analyzes suggest that the protein product of the gene 092H06 is responsible for inhibiting the cell expansion process in the reproductive organs (Brito, 2010). To understand the role of this gene in pistil development, experiments of qRT-PCR to determinate the expression levels of the -expansins, -expansins, cyclin B1.2 and actin, genes which connected to the cell division and expansion processes, were carried out on transgenic plants silencing and overexpressing the 092H06 gene. Morphological analyzes on stigmas/styles and ovaries of second generation (T2) transgenic plants were performed by optical microscopy. The results show a tendency to increased cellular volume on the silencing transgenic plants, as well as on the overexpressing plants. However, in the silencing plants there was a visible increase of the reproductive structures, what has not been observed on the overexpressing plants. Additionally, flow cytometry experiments were carried out to verify the occurrence of endoreduplication. The results showed that no endoreduplication has occurred on the cells of the transgenic plants. The screening of a yeast two-hybrid assays, using 092H06 as bait, has found 4 interaction partners candidates: 1) biotin/lipolyl attachment domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor and 4) RING/U-box. To assist the study of the 092H06 function, the recombinant 092H06-HIStag protein has been produced with success, in the soluble form, in E.col. The results obtained in this work contribute to advance the knowledge of this novel gene expressed on the plant reproductive organs.

Pequenos peptídeos são importantes sinalizadores celulares e estão envolvidos na comunicação célula-a-célula em diversos aspectos do desenvolvimento da planta. Durante a reprodução sexual, moléculas sinalizadoras atuam na interação entre o gametófito feminino e o masculino, controlando processos como germinação do grão de pólen, alongamento do tubo polínico e liberação das células espermáticas, entre outros. RALF é um peptídeo de sinalização codificado por genes de expressão ubíqua ou tecido-especifica e que regulam negativamente a expansão celular. Em arabidopsis, peptídeos AtRALFs podem ser agrupados em uma família de 39 membros e, interessantemente, os maiores níveis de expressão gênica dessa família são encontrados nos AtRALFs expressos em tecidos reprodutivos. / Small peptides are important cell signaling involved in several aspects of plant development. During sexual reproduction, signaling molecules act in the interaction between female and male gametophyte, controlling processes such as pollen grains germination, pollen tube elongation and sperm cells release. RALF is a signaling peptide ubiquitous or tissuespecific that negatively regulates cell growth. In arabidopsis, AtRALFs peptides can be grouped into a family of 39 members and, interestingly, the highest levels of gene expression of this family are found in AtRALFs expressed in reproductive tissues.

A eficiência da reprodução sexual de plantas depende do correto desenvolvimento dos órgãos sexuais: estame e pistilo. Mecanismos moleculares complexos controlam a proliferação e expansão celular que resultam no correto desenvolvimento destes órgãos. Em nosso laboratório foi identificado um gene preferencialmente expresso no pistilo de Nicotiana tabacum, o gene 092H06. Este gene codifica uma pequena proteína de 68 aminoácidos, e função desconhecida. Análises anteriores sugerem que o produto proteico do gene 092H06 seja responsável por inibir o processo de expansão celular nos órgãos reprodutivos (Brito,2010). Para compreender o papel deste gene, no desenvolvimento do pistilo, foram realizados experimentos de qRT-PCR para determinar se os níveis de expressão de genes para -expansina, -expansina, ciclina B1.2 e actina, ligados aos processos de divisão e expansão celular, em plantas transgênicas de silenciamento e superexpressão do gene 092H06. Foram realizadas análises morfológicas nos estigmas/estiletes e ovários das plantas transgênicas de segunda geração (T2), por microscopia óptica. Os resultados mostram uma tendência de aumento no volume das células tanto nas plantas transgênicas de silenciamento, como nas de superexpressão. Entretanto, nas plantas de silenciamento ocorreu um aumento visível das estruturas reprodutivas, o que não foi observado nas plantas de superexpressão. Adicionalmente, foram realizados experimentos de citometria de fluxo, para verificar a ocorrência de endorreduplicação. Os resultados mostraram que não ocorreu endorreduplicação nas células das plantas transgênicas. No screening de uma biblioteca de duplo híbrido, usando 092H06 como isca, foram encontrados 4 candidatos a parceiros de interação: 1) biotin/lipolyl attachmente domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor e 4) RING/U-box. Para auxiliar no estudo da função do gene 092H06, a proteína recombinante 092H06-Histag foi produzida com sucesso, na forma solúvel, em E. coli. Os resultados alcançados neste trabalho contribuem para avançar o conhecimento sobre este novo gene expresso nos órgãos reprodutivos das plantas. / The efficiency of plant sexual reproduction depends on the correct development of the sexual organs: stamen and pistil. Complex molecular mechanisms control cell proliferation and expansion that result in the correct development of these organs. In our laboratory a gene preferentially expressed in Nicotiana tabacum pistil has identified, the 092H06 gene. This gene encodes a small protein of 68 amino acids of unknown function. Previous analyzes suggest that the protein product of the gene 092H06 is responsible for inhibiting the cell expansion process in the reproductive organs (Brito, 2010). To understand the role of this gene in pistil development, experiments of qRT-PCR to determinate the expression levels of the -expansins, -expansins, cyclin B1.2 and actin, genes which connected to the cell division and expansion processes, were carried out on transgenic plants silencing and overexpressing the 092H06 gene. Morphological analyzes on stigmas/styles and ovaries of second generation (T2) transgenic plants were performed by optical microscopy. The results show a tendency to increased cellular volume on the silencing transgenic plants, as well as on the overexpressing plants. However, in the silencing plants there was a visible increase of the reproductive structures, what has not been observed on the overexpressing plants. Additionally, flow cytometry experiments were carried out to verify the occurrence of endoreduplication. The results showed that no endoreduplication has occurred on the cells of the transgenic plants. The screening of a yeast two-hybrid assays, using 092H06 as bait, has found 4 interaction partners candidates: 1) biotin/lipolyl attachment domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor and 4) RING/U-box. To assist the study of the 092H06 function, the recombinant 092H06-HIStag protein has been produced with success, in the soluble form, in E.col. The results obtained in this work contribute to advance the knowledge of this novel gene expressed on the plant reproductive organs.

A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular. / The biology of plant reproduction is a field of great interest, since most of the food consumed by humans is composed of reproductive parts of plants (fruits and seeds). The pistil is the female reproductive organ, composed of stigma, style and ovary. Due to the central importance of the pistil in the success of plant reproduction, a better knowledge of the genes and processes that regulate pistil development and function is necessary. Comparative studies of gene expression in vegetative and reproductive organs of Nicotiana tabacum have revealed genes preferentially expressed in the reproductive organs, among them some encoding proteins of unknown function. One of these genes was characterized and denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), since it has an important role in stigma/style development, acting as a tissue-specific cell-cycle inhibitor (DePaoli et al., 2011). The objective of the present work was to study the molecular mechanisms through which NtSCI1 regulates the cell cycle investigating its interaction partners. In a pull-down assay, using nuclear protein extracts from N. tabacum stigmas/styles, several putative cell cycle regulators were identified. Among them, the interaction between NtSCI1 and NtCDKG;2 was confirmed by BiFC and localized in the nucleolus. A N. tabacum stigma/style cDNA library in the yeast two-hybrid system was successfully constructed. The screening of this library, using BD-NtSCI1 as bait, allowed the identification of several NtSCI1 interaction partners, among them: a DEAD-BOX RNA helicase; the 14-3-3D2 protein; two transcription factors (HOMEOBOX-22 and STOREKEEPER); a splicing factor containing a SWAP domain; an adenosine kinase; and a transposase. The interactions between NtSCI1 and the first three mentioned partners have already been confirmed by BiFC (observed in the nucleus and nucleolus) and the interaction between NtSCI1 and Nt14-3-3D2 was also wconfirmed by co-immunoprecipitation. The NtSCI1 involvement in cell cycle regulation was corroborated by the interaction between NtSCI1 and the NtCYCLIN-L1 (a regulatory subunit of CDKG;2), which was confirmed by two-hybrid and BiFC in the nucleolus. The interaction between NtSCI1 and NtCYCLIN-RELATED was also confirmed by BiFC. To understand the dynamics of NtSCI1 in the nucleolus, the subcellular localization of the fusion protein NtSCI1-GFP was studied during the different cell cycle phases. NtSCI1-GFP was observed in the nucleolus of BY-2 cells at interphase and prophase, disappearing at metaphase and anaphase and reappearing in the nucleolus at the end of telophase, showing that NtSCI1 presence in the cell is controlled by the cell cycle. The construction of the first version of NtSCI1 interactome showed its direct and indirect involvement with proteins related to RNA metabolism, transcription control and cell cycle regulation. These results suggest that NtSCI1 may act in cell cycle control in a non-canonical way, through multiple parallel processes interconnecting aspects of transcription regulation, RNA processing and cell cycle control.

Pequenos peptídeos são importantes sinalizadores celulares e estão envolvidos na comunicação célula-a-célula em diversos aspectos do desenvolvimento da planta. Durante a reprodução sexual, moléculas sinalizadoras atuam na interação entre o gametófito feminino e o masculino, controlando processos como germinação do grão de pólen, alongamento do tubo polínico e liberação das células espermáticas, entre outros. RALF é um peptídeo de sinalização codificado por genes de expressão ubíqua ou tecido-especifica e que regulam negativamente a expansão celular. Em arabidopsis, peptídeos AtRALFs podem ser agrupados em uma família de 39 membros e, interessantemente, os maiores níveis de expressão gênica dessa família são encontrados nos AtRALFs expressos em tecidos reprodutivos. / Small peptides are important cell signaling involved in several aspects of plant development. During sexual reproduction, signaling molecules act in the interaction between female and male gametophyte, controlling processes such as pollen grains germination, pollen tube elongation and sperm cells release. RALF is a signaling peptide ubiquitous or tissuespecific that negatively regulates cell growth. In arabidopsis, AtRALFs peptides can be grouped into a family of 39 members and, interestingly, the highest levels of gene expression of this family are found in AtRALFs expressed in reproductive tissues.