Submitted by Eduarda Figueiredo (eduarda.ffigueiredo@ufpe.br) on 2015-03-12T14:19:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_oceanografia.pdf: 1445279 bytes, checksum: 3027171fff7f9f76800597b9c4f442b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_oceanografia.pdf: 1445279 bytes, checksum: 3027171fff7f9f76800597b9c4f442b7 (MD5) Previous issue date: 2012-02 / CAPES / As microalgas estão dentre os organismos mais recomendados para avaliação de toxicidade aquática, pois fornecem informações sobre possíveis alterações qualitativas e quantitativas das populações, tornando-se importantes em monitoramento ambiental. Este estudo teve por objetivo avaliar a sensibilidade da microalga Thalassiosira weissflogii à possível toxicidade das águas do complexo portuário de Suape e ao dicromato de potássio durante os meses de julho, setembro e novembro de 2010 e janeiro e setembro de 2011, além de comparar com os resultados obtidos para o ouriço do mar Lytechinus variegatus. Os testes de toxicidade crônica para as duas espécies seguiram normas padronizadas, onde após o período de exposição, foi avaliado o crescimento populacional da microalga, através de dados de densidade celular e taxas de crescimento, tendo sido avaliado, também, o percentual de larvas pluteus de L. variegatus apresentando desenvolvimento normal e anômalo. Os resultados, baseados no crescimento algal e no percentual de pluteus, evidenciaram que a toxicidade nos pontos analisados variou de acordo com os meses. O estudo verificou que o melhor momento para encerramento do teste com a microalga T. weissflogii foi com 72 horas de exposição. Os resultados baseados na densidade celular da microalga, em 72 horas, foram eficientes para avaliação da toxicidade de amostras de águas superficiais e foram mais significativos do que para as taxas de crescimento. A microalga T. weissflogii demonstrou ser um organismo-teste sensível ao tóxico de referência. Setembro foi o mês mais comprometido, nos dois anos estudados.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-23T16:29:21Z No. of bitstreams: 1 Yrlania de Lira Guerra.pdf: 709734 bytes, checksum: 3d0f17731c8fae1c2730d371c8128560 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T16:29:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yrlania de Lira Guerra.pdf: 709734 bytes, checksum: 3d0f17731c8fae1c2730d371c8128560 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Brazil is a major producer of world agricultural production is limited by pests and diseases. Among the diseases Sclerotium rolfsii Sacc. is a fungus that causes major losses in agriculture by presenting more than 500 hosts and is present in all tropical regions. The effect of essential oils in control of wilt sclerotia, culture as having reference to the peanut crop, with subsequent recommendation in agricultural management, with a segment phytopathological. Using four different isolates of S. rolfsii was conducted mycelial growth rate, followed by the pathogenicity test in the peanut plants (cultivar BR 1), the SR5 was isolated which had the highest growth rate and more aggressive. The seven essential oils were selected for bioassay of inhibition at concentrations previously established, with the reference dosage of 1000 ppm. Being selected again at low concentrations, from 500 ppm, Palmarosa oil which was showed the highest inhibition rate of formation of sclerotia, the lowest dose tested that was 300 ppm. In the test of suppression of diffusion of oxalic acid was performed with the more aggressive isolated (SR5) with palmarosa oil at 400 ppm, which reduced the rate of mycelial growth by 55%. The bioassay establishment of the pathogen in the substrate and pathogenicity in peanut genotypes in a greenhouse with two genotypes, BR 1 and Senegal. The assay was performed with substrate Baseplant being added 40 g de P2O5 + 15 g KCl + 200 g de humus/kg substrate fertilized. BR Genotype 1 was more susceptible than Senegal, isolated SR5 was more aggressive, leading to higher rates of disease when grown only in substrate. In the validation assay of the oil against S. rolfsii in the greenhouse, was held with seven treatments and at the end of the cycle there was a weight gain of 54% of the pods, 57% in the number of pods/plant and harvest index of 40%. / O Brasil é um dos maiores produtores agrícolas mundiais do amendoim e sua produção é limitada por pragas e doenças. Dentre as doenças, destaca-se a murcha de esclerócio que causa grandes perdas na agricultura por apresentar mais de 500 hospedeiros e estar presente em todas as regiões tropicais. Avaliou-se o efeito dos óleos essenciais no controle da murcha de esclerócio tendo como cultura de referência ao amendoim. Foram testados quatro isolados de Sclerotium rolfsii avaliando-se a sua taxa de crescimento micelial em BDA (batata, dextrose e ágar) e patogenicidade no amendoim (cv. BR 1). O isolado SR5 foi o que apresentou a maior taxa de crescimento e o mais agressivo. Os sete óleos essenciais foram selecionados pela realização do bioensaio de inibição, com concentrações previamente estabelecidas, tendo como dosagem referencial 1000 ppm. Sendo novamente selecionados a baixas concentrações, a partir de 500 ppm. O óleo de Palmarosa foi o que apresentou a maior taxa de inibição de formação de esclerócios, na menor dose testada (300 ppm). O teste de supressão da difusão do ácido oxálico, foi realizado com o isolado mais agressivo (SR5), com o óleo de Palmarosa a 400 ppm, o qual reduziu a taxa de crescimento micelial em 55%. Para o teste de estabelecimento do patógeno no substrato Baseplant e de patogenicidade nos genótipos de amendoim em casa de vegetação utilizou-se dois genótipos, BR 1 e Senegal. O ensaio realizado com substrato recebeu adição de 40 g de P2O5 + 15 g KCl + 200 g de húmus/Kg como adubação básica. O genótipo BR 1, foi mais suscetível que Senegal, o isolado SR5 mostrou-se mais agressivo, provocando maior índice de doença quando cultivado apenas em substrato. O ensaio de validação do óleo contra S. rolfsii em casa de vegetação, foi realizado com sete tratamentos e ao final do ciclo da cultura observou-se um ganho de 54% no peso das vagens, 57% no número de vagens/planta e 40% no índice de colheita.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.

Os peptídeos da estaterina (DR9) e da histatina 3 (RR14), que ocorrem naturalmente na película in vivo, amplificam o efeito inibitório do crescimento de cristais de hidroxiapatita, função relacionada à remineralizarão do esmalte e formação de cálculos dentários. A hipótese da duplicação/hibridação de domínios funcionais dos peptídeos DR9 da estaterina e RR14 da histatina 3 foi testada. Para isto, os peptídeos peptidomiméticos (DR9-DR9, DR9-RR14), além deles individualmente e suas proteínas intactas (DR9, RR14, estaterina e histatina 3) foram estudados em sete concentrações diferentes para avaliar o efeito da inibição do crescimento de cristais de hidroxiapatita. Foi utilizado um ensaio colorimétrico de microplaca para quantificar o crescimento de cristais de hidroxiapatita. As experiências foram feitas em triplicata e a concentração inibitória (IC50) foi estabelecida para cada grupo. A IC50 foi calculada para todos os peptídeos e proteínas testados. A histatina 3 e o RR14 não atingiram o valor de IC50. O DR9- RR14 atingiu o valor de IC50 a 3,80 M. Como esperado, DR9 e DR9-DR9 demonstraram um efeito inibitório significativo na atividade de crescimento de cristais, atingindo o valor de IC50 a 2,82 M e 1,07 M, respectivamente. A estaterina atingiu o valor de IC50 a 2,50 M. Na análise estatística, foram aplicados os testes ANOVA e Student-Newman-Keuls para comparações por pares, para comparar os valores entre os grupos. O DR9-DR9 amplificou o efeito inibitório do crescimento de cristais de hidroxiapatita quando comparado com DR9 único (p <0,05), demonstrando que a multiplicação do domínio funcional é uma forte tendência evolutiva da proteína. De forma interessante, o peptídeo híbrido DR9-RR14 demonstrou um efeito inibitório intermediário quando comparado com outros dois grupos: DR9 único e DR9-DR9. Este estudo utilizou a abordagem peptidomimética para investigar uma via potencial de evolução da proteína relacionada com a duplicação/hibridação dos constituintes peptídicos naturais da película adquirida de esmalte. O conhecimento obtido por meio dos resultados deste trabalho pode fornecer uma base para o desenvolvimento de peptídeos sintéticos para uso terapêutico, tanto contra cárie dentária, como para a doença periodontal. / The statherin and histatin 3 peptides (DR9 and RR14 respectively), which occur naturally in the film in vivo, amplify the inhibitory effect for the growth of hydroxyapatite crystals, a function related to remineralization of the enamel and formation of dental calculi. The hypothesis of duplication/hybridization of functional domains of the DR9 peptides of the statherin and RR14 of histatin 3 was tested. For this, the peptidomimetic peptides (DR9-DR9, DR9-RR14), in addition to them individually and their intact proteins (DR9, RR14, statherin and histatin 3) were studied at seven different concentrations to evaluate the effect of growth inhibition of hydroxyapatite crystals. A colorimetric assay of microplate was used to quantify the growth of hydroxyapatite crystals. The experiments were done in triplicate and the inhibitory concentration (IC50) was established for each group. The IC50 was calculated for all peptides and proteins tested. Histatin 3 and RR14 did not reach the IC50 value. DR9-RR14 reached the IC50 value at 3.80 M. As expected, DR9 and DR9-DR9 demonstrated a significant inhibitory effect on crystal growth activity, reaching the IC50 value at 2.82 M and 1.07 M, respectively. Statherin reached the IC50 value at 2.50 M. ANOVA and Student-Newman-Keuls tests for paired comparisons were applied to compare the values between the groups. DR9-DR9 amplified the inhibitory effect of hydroxyapatite crystal growth when compared to single DR9 (p <0.05), demonstrating that the multiplication of the functional domain is a strong protein evolution pathway. Interestingly, the hybrid peptide DR9-RR14 demonstrated an intermediate inhibitory effect when compared to other two groups: single DR9 and DR9-DR9. This study utilized the peptidomimetic approach to investigate a potential pathway of protein evolution related to duplication/hybridization of the natural peptidic constituents of the acquired enamel film. The knowledge obtained through the results of this work can provide a basis for the development of synthetic peptides for therapeutic use, both against dental caries and for periodontal disease.

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. / Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.

O controle da eficiência de bacterinas antileptospirose de uso animal é o teste de potência com desafio em hamsters, contudo, na atualidade, tem sido estimulada a busca de alternativas que dispensem o uso de animais de laboratório. O teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICLIV) tem sido proposto como possível alternativa. O presente trabalho empregou os testes de ICLIV, soroaglutinação microscópica (SAM) e ELISA anti IgG para avaliar a intensidade e a duração da imunidade passiva em leitões em aleitamento e ativa em matrizes suínas e leitões desmamados imunizados com bacterina experimental antileptospirose aprovada no teste de potência em hamster. Foi produzida uma bacterina experimental antileptospirose com estirpe patogênica de Leptospira interrogans, sorovar Kennewicki, estirpe Pomona Fromm (LPF), padronizada para conter 109 leptospiras por mL e associada ao adjuvante de hidróxido de alumínio na proporção de 10% do volume da dose final. Para a avaliação da eficácia da concentração mínima de leptospiras a ser utilizada na bacterina, diluições seriadas de razão dez de cultivo de leptospiras variando de 105 a 109 leptospiras/mL, foram submetidas ao teste de potência com desafio em hamsters (Experimento A), apenas a bacterina produzida na concentração de 109 leptospiras/mL foi capaz de proteger os hamsters contra a infecção induzida pela estirpe LPF, quando a vacina foi testada na diluição de 1:800, critério internacional de aprovação. A bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi submetida ao teste de potência em hamsters (Experimento B), imunizados com a vacina pura e em diluições seriadas de razão dois (200 a 25600). A bacterina foi aprovada no teste de desafio em hamster até a diluição de 1:6400. O controle do inóculo de desafio foi constituído por 100 DL50. Fêmeas suínas que nunca haviam sido vacinadas contra a leptospirose e que foram não reagentes no teste de soroaglutinação microscópica aplicado a leptospirose efetuado com 24 estirpes de referência e no teste ICLIV com a estirpe LPF (Experimento 1), receberam duas aplicações intervaladas de 30 dias e um reforço aos 210 da primeira dose da bacterina pura e em diluições seriadas de razão dois (400 a 3200). Estes animais foram 16 monitorados com colheitas de sangue efetuadas a cada 30 dias. Os picos máximos de anticorpos avaliados pelos testes de SAM e de ICLIV foram observados aos 30 dias da segunda aplicação da vacina, com maior magnitude para a vacina pura, contudo aos 120 dias da segunda aplicação da vacina houve um declínio acentuado nos níveis de anticorpos. Para encontrar um melhor intervalo entre as imunizações (Experimento 2), fêmeas suínas receberam duas aplicações da bacterina pura intervaladas de 30 dias e o reforço aos 150 da primeira dose. A redução do intervalo de revacinação após as duas doses iniciais determinou a persistência dos títulos de aglutininas e de anticorpos neutralizantes com níveis sempre superiores a 0,4 log. Nos leitões em aleitamento filhos das matrizes imunizadas com bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi constatada a transferência de imunidade passiva, confirmada pelos títulos de anticorpos aglutinantes detectáveis no quinto dia de vida e de neutralizantes no quinto e décimo dia de vida. Nos ensaios realizados em leitões desmamados imunizados com uma série de diluições de razão dez variando de a 109 leptospiras/mL os picos máximos de anticorpos foram observados aos 30 dias da segunda imunização, com maior magnitude para a bacterina testada na concentração de 109 leptospiras/mL. Os parâmetros finalmente obtidos foram que matrizes suínas e leitões desmamados, primovacinados com duas aplicações intervaladas de 30 dias da bacterina aprovada no teste de potência com desafio em hamster, apresentaram no teste de ICLIV efetuado aos 60 dias da primo-vacinação, intervalos de títulos de anticorpos (95%) expressos em log variando, respectivamente de (0,87 a 1,35) e de (1,22 a 1,58). Os valores máximos (12.800) para o teste de ELISA anti IgG das matrizes suínas foram obtidos após o reforço efetuado aos 210 dias. / The potency of antileptospirosis bacterins is controlled by in vivo experimental assay performed in hamsters; however, nowadays the search for in vitro methodologies that could replace the use of laboratory animals has been stimulated. For this purpose, the In vitro leptospiral growth inhibition test (IVLGIT) has been proposed as an alternative test. In this work, the intensity and duration of the passive immunity in suckling piglets and active immunity in weaned piglets and adult sows were evaluated, after vaccination with an experimental leptospirosis bacterin, which had been approved previously on the potency test in hamsters. The in vitro tests applied to swine sera were the growth inhibition test (IVLGIT), microscopic agglutination (MAT) and anti-IgG ELISA. The bacterin was produced with a pathogenic Leptospira interrogans serovar Kennewicki strain identified as Pomona Fromm (LPF), and added with aluminum hydroxide as adjuvant at a concentration of 10% of the final volume dose. In order to evaluate the efficacy of the minimum concentration of the leptospires to be used in the bacterin, ten-fold serial dilutions of a culture of leptospira varying from 105 to 109 leptospires/mL were submitted to potency-challenge test in hamsters (Trial A). Only the bacterin produced at the concentration of 109 leptospires/mL protected the hamsters against the infection by LPF strain, when the vaccine was tested at the dilution of 1:800, which is the international criterion for the approval. The bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL was submitted to the potency test in hamsters (Trial B), which had been immunized with an undiluted and with two-fold serially diluted bacterin (from 1:200 to 1:25,600). In the challenge test in hamsters, the bacterin has passed till the dilution of 1:6,400. The control of the challenge inoculum presented a titer of 100 LD50. Adult sows, never been vaccinated against leptospirosis, and that showed negative MAT results using 24 reference serovars and with negative IVLGIT with the LPF strain (Trial 1) had administered two doses of bacterin with 30 day interval and a booster dose at 210th day after the first application of the undiluted bacterin and the two-fold diluted ones (1:400 to :3,200). The animals were 18 monitored with bleeding performed each 30 days. The levels of antibodies evaluated by MAT and IVLGIT showed the maximum peak at the 30th day after the second vaccination of the bacterin, with high magnitude found with the undiluted bacterin, however, at the 120th day after the second vaccination there were found a marked decline in antibodies levels. To find a better immunization scheme (Trial 2), the sows received two doses of undiluted bacterin with 30 day interval and the booster dose at the 150th day after the first dose. The reduction on the interval of revaccination after the two initial doses determined the persistence of a higher levels agglutinins and neutralizing antibodies with titers 0.4 log. In suckling piglets born from sows immunized with the bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL, the passive transference of antibodies was confirmed by MAT titers detected on the fifth day, and by IVLGIT titers, at the fifth and tenth days after birth. In the study of weaned piglets immunized with the bacterin at the concentrations of 106, 107, 108 and 109 leptospires/mL (Trial 3), the highest antibodies levels were observed at the 30th day after the second immunization, with greater magnitude for the bacterin tested at the concentration of 109 leptospires/mL. The final results indicate that sows and weaned piglets, primo-vaccinated and revaccinated with 30 day interval with bacterin that had passed in the potency-challenge test in hamsters, presented the IVLGIT results varying (95% CI) from 0.87 log to 1.35 log for sows and 1.22 to 1.58 log for weaned piglets, at the 60th day after the first vaccination. In adult sows the highest anti-IgG ELISA titer reached 12,800, obtained after the booster vaccine dose performed at 210th day from the first vaccination.

Foi investigada a existência da correlação entre o teste padrão de potência de bacterinas antileptospiras e o teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro. Os ensaios foram realizados, em hamsters machos, isoladamente segundo a bacterina comercial (A ou B) antileptospirose empregada. Foram comparados a proteção conferida pelas bacterinas e os níveis de anticorpos neutralizantes, respectivamente obtidos nos teste de desafio e inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICL). O protocolo de imunização adotou duas aplicações de 0,25 mL das bacterinas, puras e suas diluições, pela via subcutânea com o intervalo de 15 dias. Os desafios foram realizados após 15 dias da segunda dose com 0,2 mL de culturas vivas dos sorovares Canicola (bacterina A e B) ou Pomona (somente bacterina A), os óbitos por leptospirose foram registrados e, os animais sobreviventes foram submetidos a eutanásia no 21° dia de observação e a condição de portador renal foi investigada por cultivos de tecido renal em meio de Fletcher. Os animais destinados ao teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro foram sacrificados no mesmo dia em que se realizou o desafio dos animais submetidos ao teste de potência. As colheitas de sangue foram efetuadas assepticamente por punção intracardíaca. Constatada individualmente a esterilidade dos soros foram constituídos os pools com quantidades iguais de soro por animal e subgrupo (n=5). No teste de potência de bacterinas para ambas as estirpes a DL50 foi superior a diluição 10-9 do controle do inóculo de desafio, os animais foram desafiados com a diluição 10-6. O número de animais sobreviventes ao desafio e a proteção contra a infecção renal variou de acordo com a bacterina empregada e sua concentração. Os resultados do teste de desafio com as bacterinas antileptospirose A e B situaram-se dentro dos parâmetros exigidos, sendo as bacterinas aprovadas segundo o critério de avaliação internacional. A diluição 1:800 das duas bacterinas testadas recomendada pelas normas internacionais não foi capaz de proteger contra o estado de portador renal de leptospiras. Os hamsters imunizados com as bacterinas apresentaram anticorpos neutralizantes em níveis superiores ao de aglutininas. A comparação do desempenho das bacterinas testadas para os sorovares Canicola e/ou Pomona, segundo sua concentração, por meio das proporções de animais sobreviventes ao teste de desafio e a média dos títulos de anticorpos neutralizantes, estabeleceu que o título de anticorpos neutralizantes igual ou superior a 1,0log10 como correspondente ao nível de aprovação de bacterinas no teste de potência. / It was investigated the existence in hamsters of correlation between the standard potency test of bacterins antileptospires and the in vitro leptospires growth inhibition test. The assays were performed, in male hamsters, separately according to the commercial (A and B) animal antileptospirosis bacterin used. The quality of the bacterins and the level of neutralizing antibodies were compared, respectively obtained in the challenge test and the in vitro leptospires growth inhibition test (ICL). The potency test with challenge, performed with serovars Pomona and Canicola, was modified from the protocol of The United States Agriculture Department. The immunization schedule employed two 0,25 mL of bacterins, pure and with dilutions, by subcutaneous route with 15-day interval. The challenge was performed after 15 days from the second dose with 0,2 mL of alive cultures from serovars Canicola (bacterins A and B) or Pomona (only bacterin A), the deaths by leptospirosis were registered and on the 21st observation day the survivors were sacrificed and the condition of renal carrier was investigated by culture of renal tissue for leptospires isolation in Fletcher medium. The animals destined to the in vitro leptospire growth inhibition test were sacrificed on the same day the potency assay with challenge was performed on the other group of hamsters. The blood samples were collected aseptically by intracardiac puncture. Once the sterility of each serum was verified the pools were formed with equal amounts of serum per animal and subgroup (n=5). The bacterins potency tests, for both strains, resulted in a higher DL50 for the dilution 10-9 of the challenge inoculum control, the animals were challenged with the dilution 10-6. The number of surviving animals to the challenge and the protection against renal infection varied according to the bacterin used and its concentration. The results of the potency tests with challenge using the bacterins antileptospirosis A and B were within the required standards, being therefore approved according to the international evaluation criteria. The dilution 1:800, for both bacterins tested, which is recommended by international criteria was not capable of protecting against the condition of leptospires renal carrier. Hamsters immunized with the bacterins showed neutralizing antibodies in higher titers in comparison to agglutinating antibodies. The comparison of the performance of the tested bacterins with the sorovars Canicola and/or Pomona, according to its concentration, by the proportions of surviving animals to the challenge assay and the average of the neutralizing antibodies titers, established a neutralizing antibodies titer equal or higher than 1,0log10 corresponding with the bacterins level of approval in the potency assay.

O controle da eficiência de bacterinas antileptospirose de uso animal é o teste de potência com desafio em hamsters, contudo, na atualidade, tem sido estimulada a busca de alternativas que dispensem o uso de animais de laboratório. O teste de inibição de crescimento de leptospiras in vitro (ICLIV) tem sido proposto como possível alternativa. O presente trabalho empregou os testes de ICLIV, soroaglutinação microscópica (SAM) e ELISA anti IgG para avaliar a intensidade e a duração da imunidade passiva em leitões em aleitamento e ativa em matrizes suínas e leitões desmamados imunizados com bacterina experimental antileptospirose aprovada no teste de potência em hamster. Foi produzida uma bacterina experimental antileptospirose com estirpe patogênica de Leptospira interrogans, sorovar Kennewicki, estirpe Pomona Fromm (LPF), padronizada para conter 109 leptospiras por mL e associada ao adjuvante de hidróxido de alumínio na proporção de 10% do volume da dose final. Para a avaliação da eficácia da concentração mínima de leptospiras a ser utilizada na bacterina, diluições seriadas de razão dez de cultivo de leptospiras variando de 105 a 109 leptospiras/mL, foram submetidas ao teste de potência com desafio em hamsters (Experimento A), apenas a bacterina produzida na concentração de 109 leptospiras/mL foi capaz de proteger os hamsters contra a infecção induzida pela estirpe LPF, quando a vacina foi testada na diluição de 1:800, critério internacional de aprovação. A bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi submetida ao teste de potência em hamsters (Experimento B), imunizados com a vacina pura e em diluições seriadas de razão dois (200 a 25600). A bacterina foi aprovada no teste de desafio em hamster até a diluição de 1:6400. O controle do inóculo de desafio foi constituído por 100 DL50. Fêmeas suínas que nunca haviam sido vacinadas contra a leptospirose e que foram não reagentes no teste de soroaglutinação microscópica aplicado a leptospirose efetuado com 24 estirpes de referência e no teste ICLIV com a estirpe LPF (Experimento 1), receberam duas aplicações intervaladas de 30 dias e um reforço aos 210 da primeira dose da bacterina pura e em diluições seriadas de razão dois (400 a 3200). Estes animais foram 16 monitorados com colheitas de sangue efetuadas a cada 30 dias. Os picos máximos de anticorpos avaliados pelos testes de SAM e de ICLIV foram observados aos 30 dias da segunda aplicação da vacina, com maior magnitude para a vacina pura, contudo aos 120 dias da segunda aplicação da vacina houve um declínio acentuado nos níveis de anticorpos. Para encontrar um melhor intervalo entre as imunizações (Experimento 2), fêmeas suínas receberam duas aplicações da bacterina pura intervaladas de 30 dias e o reforço aos 150 da primeira dose. A redução do intervalo de revacinação após as duas doses iniciais determinou a persistência dos títulos de aglutininas e de anticorpos neutralizantes com níveis sempre superiores a 0,4 log. Nos leitões em aleitamento filhos das matrizes imunizadas com bacterina na concentração de 109 leptospiras/mL foi constatada a transferência de imunidade passiva, confirmada pelos títulos de anticorpos aglutinantes detectáveis no quinto dia de vida e de neutralizantes no quinto e décimo dia de vida. Nos ensaios realizados em leitões desmamados imunizados com uma série de diluições de razão dez variando de a 109 leptospiras/mL os picos máximos de anticorpos foram observados aos 30 dias da segunda imunização, com maior magnitude para a bacterina testada na concentração de 109 leptospiras/mL. Os parâmetros finalmente obtidos foram que matrizes suínas e leitões desmamados, primovacinados com duas aplicações intervaladas de 30 dias da bacterina aprovada no teste de potência com desafio em hamster, apresentaram no teste de ICLIV efetuado aos 60 dias da primo-vacinação, intervalos de títulos de anticorpos (95%) expressos em log variando, respectivamente de (0,87 a 1,35) e de (1,22 a 1,58). Os valores máximos (12.800) para o teste de ELISA anti IgG das matrizes suínas foram obtidos após o reforço efetuado aos 210 dias. / The potency of antileptospirosis bacterins is controlled by in vivo experimental assay performed in hamsters; however, nowadays the search for in vitro methodologies that could replace the use of laboratory animals has been stimulated. For this purpose, the In vitro leptospiral growth inhibition test (IVLGIT) has been proposed as an alternative test. In this work, the intensity and duration of the passive immunity in suckling piglets and active immunity in weaned piglets and adult sows were evaluated, after vaccination with an experimental leptospirosis bacterin, which had been approved previously on the potency test in hamsters. The in vitro tests applied to swine sera were the growth inhibition test (IVLGIT), microscopic agglutination (MAT) and anti-IgG ELISA. The bacterin was produced with a pathogenic Leptospira interrogans serovar Kennewicki strain identified as Pomona Fromm (LPF), and added with aluminum hydroxide as adjuvant at a concentration of 10% of the final volume dose. In order to evaluate the efficacy of the minimum concentration of the leptospires to be used in the bacterin, ten-fold serial dilutions of a culture of leptospira varying from 105 to 109 leptospires/mL were submitted to potency-challenge test in hamsters (Trial A). Only the bacterin produced at the concentration of 109 leptospires/mL protected the hamsters against the infection by LPF strain, when the vaccine was tested at the dilution of 1:800, which is the international criterion for the approval. The bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL was submitted to the potency test in hamsters (Trial B), which had been immunized with an undiluted and with two-fold serially diluted bacterin (from 1:200 to 1:25,600). In the challenge test in hamsters, the bacterin has passed till the dilution of 1:6,400. The control of the challenge inoculum presented a titer of 100 LD50. Adult sows, never been vaccinated against leptospirosis, and that showed negative MAT results using 24 reference serovars and with negative IVLGIT with the LPF strain (Trial 1) had administered two doses of bacterin with 30 day interval and a booster dose at 210th day after the first application of the undiluted bacterin and the two-fold diluted ones (1:400 to :3,200). The animals were 18 monitored with bleeding performed each 30 days. The levels of antibodies evaluated by MAT and IVLGIT showed the maximum peak at the 30th day after the second vaccination of the bacterin, with high magnitude found with the undiluted bacterin, however, at the 120th day after the second vaccination there were found a marked decline in antibodies levels. To find a better immunization scheme (Trial 2), the sows received two doses of undiluted bacterin with 30 day interval and the booster dose at the 150th day after the first dose. The reduction on the interval of revaccination after the two initial doses determined the persistence of a higher levels agglutinins and neutralizing antibodies with titers 0.4 log. In suckling piglets born from sows immunized with the bacterin at the concentration of 109 leptospires/mL, the passive transference of antibodies was confirmed by MAT titers detected on the fifth day, and by IVLGIT titers, at the fifth and tenth days after birth. In the study of weaned piglets immunized with the bacterin at the concentrations of 106, 107, 108 and 109 leptospires/mL (Trial 3), the highest antibodies levels were observed at the 30th day after the second immunization, with greater magnitude for the bacterin tested at the concentration of 109 leptospires/mL. The final results indicate that sows and weaned piglets, primo-vaccinated and revaccinated with 30 day interval with bacterin that had passed in the potency-challenge test in hamsters, presented the IVLGIT results varying (95% CI) from 0.87 log to 1.35 log for sows and 1.22 to 1.58 log for weaned piglets, at the 60th day after the first vaccination. In adult sows the highest anti-IgG ELISA titer reached 12,800, obtained after the booster vaccine dose performed at 210th day from the first vaccination.

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. / Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.